JP7022803B2 - 限定された免疫グロブリン重鎖のマウス - Google Patents
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Description
本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
単一のヒトVH遺伝子セグメント、1または複数のヒトDH遺伝子セグメント、および1または複数のヒトJH遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、多型のVH遺伝子セグメントである、マウス。
(項目2)
全てまたは実質的に全ての内因性VH遺伝子セグメント、内因性DH遺伝子セグメント、および内因性JH遺伝子セグメントの欠失を含む、項目1に記載のマウス。
(項目3)
上記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、およびVH3-23から選択される、項目1に記載のマウス。
(項目4)
上記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-69である、項目3に記載のマウス。
(項目5)
上記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-2である、項目3に記載のマウス。(項目6)
上記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子または非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目1に記載のマウス。
(項目7)
上記免疫グロブリン定常領域遺伝子が、マウス、ラット、またはヒトの定常領域遺伝子である、項目6に記載のマウス。
(項目8)
1または複数のヒトJL遺伝子セグメントに作動可能に連結された1または複数のヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントをさらに含む、項目1に記載のマウス。
(項目9)
上記1もしくは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび/または上記1もしくは複数のヒトJL遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される、項目8に記載のマウス。
(項目10)
上記1または複数のヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントおよび上記1または複数のヒトJL遺伝子セグメントが、非ヒト軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結されている、項目8に記載のマウス。
(項目11)
上記非ヒト軽鎖定常遺伝子が、マウスまたはラットのκ定常領域遺伝子またはλ定常領域遺伝子から選択される、項目10に記載のマウス。
(項目12)
マウスであって、上記マウスの生殖細胞系内の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性VH遺伝子セグメント、内因性DH遺伝子セグメント、および内因性JH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体、1または複数のヒトDH遺伝子セグメントおよび1または複数のヒトJH遺伝子セグメントによる置き換えを含む、マウス。
(項目13)
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性VL遺伝子セグメントおよび内因性JL遺伝子セグメントの、1または複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび1または複数のヒトJL遺伝子セグメントによる置き換えをさらに含む、項目12に記載のマウス。
(項目14)
上記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、ヒトVH1-69遺伝子セグメントおよびヒトVH1-2遺伝子セグメントから選択される、項目12に記載のマウス。
(項目15)
項目1または12に記載のマウスに由来する細胞または組織。
(項目16)
ヒトVHドメインをコードする核酸配列を作製する方法であって、上記方法は:
(a)項目1または12に記載のマウスを目的の抗原で免疫化するステップと、
(b)上記マウスに、上記目的の抗原に対する免疫反応を開始させるステップと、
(c)上記マウスからヒトVHドメインをコードする核酸配列を得るステップと
を含む、方法。
(項目17)
上記免疫グロブリンVH領域の配列が、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56または配列番号58と少なくとも75%同一である、項目16に記載の方法。
(項目18)
上記免疫グロブリンVH領域の配列が、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、またはこれらの多型変異体を含む、項目16に記載の方法。
(項目19)
上記免疫グロブリンVH領域の配列が、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57または配列番号59と少なくとも75%同一なタンパク質をコードする、項目16に記載の方法。
(項目20)
上記免疫グロブリンVH領域の配列が、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、または配列番号68と少なくとも95%同一である、項目16に記載の方法。
(項目21)
上記免疫グロブリンVH領域の配列が、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68またはこれらの多型変異体を含む、項目16に記載の方法。(項目22)
上記免疫グロブリンVH領域の配列が、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、または配列番号69と少なくとも95%同一なタンパク質をコードする、項目16に記載の方法。
(項目23)
ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための、項目1または12に記載のマウスの使用。
(項目24)
上記ヒト重鎖可変ドメインが、多型のヒトVH遺伝子セグメントに由来するヒトFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3配列を有することを特徴とする、項目23に記載の使用。
(項目25)
上記ヒトVH遺伝子セグメントが、ヒトVH1-2遺伝子セグメント、VH1-69遺伝子セグメント、VH2-26遺伝子セグメント、VH2-70遺伝子セグメント、またはVH3-23遺伝子セグメントから選択される、項目24に記載の使用。
(項目26)
上記ヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-2である、項目25に記載の使用。
(項目27)
上記ヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-69である、項目25に記載の使用。
(項目28)
ヒト抗体を作製するための、項目1または12に記載のマウスの使用であって、上記ヒト抗体が、再配列されたヒトVH1-2遺伝子セグメント、ヒトVH1-69遺伝子セグメント、またはこれらの多型変異体に由来する重鎖可変ドメインを含む、使用。
(項目29)
上記再配列されたヒトVH1-69遺伝子セグメントが、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56または配列番号58と少なくとも75%同一である、項目28に記載の使用。
(項目30)
上記再配列されたヒトVH1-2遺伝子セグメントが、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、または配列番号68と少なくとも95%同一である、項目28に記載の使用。
それらを作製する方法およびそれらを用いる方法と同様に、限定数のVH遺伝子、ならびに1または複数のD遺伝子および1または複数のJ遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。目的の抗原で免疫化されると、非ヒト動物は、あらかじめ選択された限定VH遺伝子または限定VH遺伝子のセット(例えば、あらかじめ選択されたVH遺伝子およびその変異体)のみに由来する抗体の可変領域を伴うB細胞集団を生成させる。様々な実施形態では、ヒト重鎖可変ドメインであるヒト抗体可変ドメインを、同種のヒト軽鎖可変ドメインと共に発現させるB細胞集団を生成させる非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、非ヒト動物が、再配列されていない非ヒト可変領域の配列の、再配列されていないヒト可変領域の配列による置き換えまたは挿入を含む改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座に由来するヒト重鎖可変遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを再配列する。
range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region」、Clin. Exp. Immunol.、123巻:1~5頁を参照されたい)に部分的に起因して、多様性の制限を呈示する(したがって、有用性の制限も呈示する)。同様に、ヒトμ定常遺伝子を含有する導入遺伝子内に、ヒトDH遺伝子およびヒトJH遺伝子と共に2つのVH遺伝子(3-23および6-1)を保有し(Bruggemannら、1991年、「Human antibody production in transgenic mice: expression from 100kb of the human IgH locus」、Eur. J. Immmunol.、21巻:1323~1326頁)、マウス軽鎖を伴うヒトIgM鎖においてそれらを発現させるマウスは、誤対合によるレパートリーの制限を呈示しうる(Mackworth-Youngら、2003年、「The role
of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene」、Clin. Exp. Immunol.、134巻:420~425頁)。
in transgenic mice」、Nucleic Acids Res.、22巻(8号):1389~1393頁を参照されたい)。しかし、マウスゲノムへとランダムに組み込まれた導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現させ、内因性遺伝子座の損傷を含むトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較した免疫反応の実質的な差違であって、このようなマウスから得られる抗体可変ドメインの多様性に影響を及ぼす差違を呈示することが公知である。
VH1 gene belongs to complex set of alleles」、Journal of Clinical Investigation、91巻:2358~2367頁; Sassoら、1996年、「Expression of the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germline gene copy number」、Journal of Clinical Investigation、97巻(9号):2074~2080頁)、ヒトVH1-69遺伝子は、VH1-69遺伝子の複製を保有する少なくとも3つのハプロタイプであって、所与の遺伝子座においてこのVH遺伝子の複数のコピーを結果としてもたらすハプロタイプで存在する。これらの多型対立遺伝子は、相補性決定領域(CDR)の差違を包含し、これは、抗原の特異性に劇的に影響しうる。表2は、ヒトVH1-69について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のDNA配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。表3は、ヒトVH1-2遺伝子について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のDNA配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。
Embryonic Stem Cell Lines」も参照されたい)。一実施形態では、遺伝子改変マウスが、前述の129系統と前述のC57BL系統(例えば、C57BL/6系統)とのミックスである。別の実施形態では、マウスが、前述の129系統のミックスであるか、または前述のC57BL/6系統のミックスである。一実施形態では、これらのミックスの129系統が、129S6(129/SvEvTac)系統である。別の実施形態では、マウスが、129/SvEv由来系統とC57BL/6由来系統とのミックスである。特定の実施形態では、マウスが、Auerbachら、2000年、BioTechniques、29巻:1024~1032頁において記載される通り、129/SvEv由来系統とC57BL/6由来系統とのミックスである。別の実施形態では、マウスが、BALB系統、例えば、BALB/c系統である。別の実施形態では、マウスが、BALB系統(例えば、BALB/c系統)と、別の前述の系統とのミックスである。
VH遺伝子の抗原依存性の優先的使用を、臨床的に有意義な抗原を標的とするヒト治療剤を開発するのに利用することができる。特定のVH遺伝子を用いて抗体可変ドメインのレパートリーを生成させることができれば、ヒト治療剤において用いるための高アフィニティーの抗体可変ドメインの探索に大きな利点をもたらすことができる。ナイーブマウスおよび抗体可変ドメインにおけるヒトVH遺伝子の使用についての研究は、大半の重鎖可変ドメインが、特定の単一のVH遺伝子にも、優性で用いられるVH遺伝子にも由来しないことを明らかにする。他方、特定の抗原に対する抗体応答についての研究は、場合によって、特定の抗体応答が、免疫化後のB細胞レパートリーにおける特定のVH遺伝子の偏った使用を提示することを明らかにする。
of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte
Repertoires」、Scand. J. Immunol.、45巻:62~73頁)。初期の一研究では、VH3ファミリーの使用頻度が約0.65であるのに対し、VH1ファミリーの使用頻度は約0.15であることが推定され、これらの観察および他の観察は、ヒトVHレパートリーの生殖細胞系の複雑性が、通常の生殖細胞系VHレパートリーを有するヒトの末梢B細胞区画では正確には反映されないという、マウスにおいて観察される状況(すなわち、VH遺伝子発現は非確率論的であるという状況)と類似する状況を示唆する(ZoualiおよびThese、1991年、「Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization」、J. Immunol.、146巻(8号):2855~2864頁)。一報告によれば、ヒトにおけるVH遺伝子使用は、最大から最小の順にVH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6であり、末梢B細胞における再配列は、VH3ファミリーの使用が、生殖細胞系VH3遺伝子の相対数に基づき予測される使用より高度であることを明らかにする(Brezinschekら、1995年)。別の報告によれば、ヒトにおけるVH使用は、ヨウシュヤマゴボウのマイトジェンにより活性化させた末梢の小型免疫応答性B細胞の解析(Davidkovaら、1997年、「Selective Usage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires」、Scand. J. Immunol.、45巻:62~73頁)に基づくパターンVH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6に従う。一報告は、最も高頻度で用いられるVH3ファミリーメンバーの中には、3-23、3-30、および3-54があることを断言している(Brezinschekら、1995年)。VH4ファミリーでは、メンバー4-59および4-4b(同上)のほか、4-39および4-34(Brezinscheckら、1997年、「Analysis of the Human VH Gene Repertoire」、J. Clin. Invest.、99巻(10号):2488~2501頁)が比較的高頻度であることが見出された。他の報告は、活性化した重鎖レパートリーが、VH5の高度な発現およびVH3の低度な発現を利するように偏っていることを主張している(Van Dijk-HardおよびLundkvist、2002年、「Long-term kinetics
of adult human antibody repertoires」、Immunology、107巻:136~144頁)。他の研究は、成人ヒトレパートリーにおいて最も一般的に用いられるVH遺伝子が、VH4-59に続いて、VH3-23およびVH3-48であることを断言している(Arnaoutら、2001年、「High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans」、PLoS ONE、6巻(8号):108頁)。使用についての研究は、比較的小さな試料数に基づき、したがって、大きな分散を呈示するが、まとめると、研究は、V遺伝子の発現が、純粋に確率論的ではないことを示唆する。実際、特定の抗原による研究は、ある場合には、発現の状況が、特定の使用には全く不利であり、他の使用には有利であることを確立している。
and VH4-59 segments」、British Journal of
Dermatology、162巻:611~618頁)一方、血液障害を伴う患者における自己抗体の中では、本質的に生殖細胞系配列を伴う(すなわち、体細胞超変異がわずかである~体細胞超変異がみられない)一部のVH1-69に由来する重鎖が観察されている(Posら、2008年、「VH1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura」、Journal of Thrombosis and Haemostasis、7巻:421~428頁)。
of infection-driven lymphomagenesis」、Journal of Immunology、174巻:6532~6539頁; WangおよびPalese、2009年、「Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?」、Nature Structural & Molecular Biology、16巻(3号):233~234頁; Suiら、2009年、「Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses」、Nature Structural & Molecular Biology、16巻(3号):265~273頁; Marascaら、2001年、「Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma」、Am. J. Pathol.、159巻(1号):253~261頁)。
Capsular Polysaccharide」、J. Immunol.、147巻(5号):1667~1674頁; Addersonら、1993年、「Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide」、J. Clin. Invest.、91巻:2734~2743頁)。ヒトJH遺伝子もまた、偏向性の使用を提示し、JH4およびJH6は、ヒトの末梢B細胞中の約38~41%で観察されている(Brezinschekら、1995年)。
全てのヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントの上流に配置された単一のヒトVH遺伝子セグメントを含有する、固有に操作されたヒト重鎖遺伝子座を、細菌人工染色体(BAC)DNAを用いる一連の細菌細胞内相同組換え反応(BHR)により創出した。VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作法を用いて、単一のVHを含有する重鎖遺伝子座を創出するための複数のターゲティング構築物を構築した(例えば、米国特許第6,586,251号、およびValenzuela, D.M.ら(2003年)、「High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis」、Nature Biotechnology、21巻(6号):652~659頁を参照されたい)。
フローサイトメトリーを用いて、実施例1で記載された内因性重鎖遺伝子座における単一のヒトVH遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウスを、発現およびB細胞の発生について評価した。
Star,Inc.)で解析した。脾臓区画についての結果を、図3、4A、および5~7に示す。骨髄区画についての結果を、図4Bおよび8~11Bに示す。
cDNA Synthesisキット(Invitrogen)を用いて、約200ngのmRNAをcDNAへと逆転写させた後、ABI 7900 Sequence Detection System(Applied BioSystems)を用いて、TAQMAN(登録商標)Universal PCR Master Mix(Applied BioSystems)による増幅を行った。固有のプライマー/プローブの組合せを使用して、ヒトVH1-69に由来する重鎖の発現を特異的に決定した(表5)。相対発現は、マウスκ定常領域(mCκ)に照らして正規化した。結果を、図12に示す。
ヒト細胞表面受容体(抗原A)を用いる比較免疫化により、ヒト重鎖可変遺伝子およびヒトκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座についてホモ接合性のマウス(Hκ)、ならびにマウス重鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトVH遺伝子セグメント、全てのヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス(1hVHHO)について体液性免疫反応を決定した。
ヒト細胞表面受容体(抗原A)で免疫化された、内因性重鎖遺伝子座における単一のヒトVH遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス、および内因性κ軽鎖可変遺伝子座の、ヒトκ軽鎖可変遺伝子座による置き換えについてホモ接合性のマウスから採取された脾臓細胞を、重鎖遺伝子セグメントおよび軽鎖遺伝子セグメントの使用について、脾臓B細胞に由来するmRNAに対する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により解析した。
mRNA miniキット(Qiagen)を用いて、PolyA+mRNAを、全RNAから単離した。
Claims (33)
- その生殖細胞系ゲノム内に、以下:
(i)1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメント、
(ii)1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメント、および
(iii)1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメント
の存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有する齧歯動物であって、該齧歯動物は、ラットまたはマウスであり、
ここで、(i)1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメント、(ii)1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメント、および(iii)1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメントは、少なくとも1つの内因性IgM遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、
該齧歯動物はさらに、各々が該内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に連結され、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子の多様なレパートリーを含み、
該齧歯動物はさらに、その脾臓内に成熟IgMintIgDhi B細胞集団を含み、各B細胞が該再配列された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域遺伝子のうちの1つを含む、齧歯動物。 - 前記齧歯動物が、
(i)複数の内因性VH遺伝子セグメントの、前記1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメントでの置き換え、
(ii)全ての内因性DH遺伝子セグメントの、前記1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメントでの置き換え、および
(iii)全ての内因性JH遺伝子セグメントの、前記1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメントでの置き換え
を含む、請求項1に記載の齧歯動物。 - 前記1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメントが、再配列して、1または複数のDHセグメントおよび1または複数のJHセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能な、VH3セグメントファミリーメンバーまたはその多型変異体である、請求項1または請求項2に記載の齧歯動物。
- 前記1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメントがVH3セグメントまたはその多型変異体であり、該VH3セグメントが、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73およびVH3-74から選択され、そして、該VH3セグメントまたはその多型変異体が、再配列して、1または複数のDHセグメントおよび1または複数のJHセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能である、請求項1~3のいずれか一項に記載の齧歯動物。
- 1または複数の再配列されていないヒトJL遺伝子セグメントに作動可能に連結された1または複数の再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントをさらに含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の齧歯動物。
- 前記1または複数の再配列されていないヒトVL遺伝子セグメント、および/または、前記1または複数の再配列されていないヒトJL遺伝子セグメントが、ヒトκおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される、請求項5に記載の齧歯動物。
- 前記1または複数の再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントおよび1または複数の再配列されていないヒトJL遺伝子セグメントが、内因性軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される、請求項5または請求項6に記載の齧歯動物。
- 前記齧歯動物の軽鎖定常遺伝子が、齧歯動物またはラットのκまたはλ定常領域遺伝子から選択される、請求項7に記載の齧歯動物。
- 内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における全てまたは実質的に全ての内因性VH、DHおよびJH遺伝子セグメントが、前記1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメント、前記1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメントおよび前記1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメントの存在を特徴とする前記限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座で置き換えられる、請求項1~8のいずれか一項に記載の齧歯動物。
- 内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における全てまたは実質的に全ての内因性VLおよびJL遺伝子セグメントの、1または複数の再配列されていないヒトVLおよび1または複数の再配列されていないヒトJL遺伝子セグメントでの置き換えをさらに含む、請求項9に記載の齧歯動物。
- ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製する方法であって、
(a)請求項1~10のいずれか一項に記載の齧歯動物のリンパ球、または、該リンパ球から生成されたハイブリドーマを取得するステップと、
(b)該リンパ球、または該リンパ球から生成されたハイブリドーマから、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子を含む核酸を増幅するステップ
を含み、該リンパ球が、以下:
(i)1つの再配列されていないヒトV H 遺伝子セグメント、
(ii)1または複数の再配列されていないヒトD H 遺伝子セグメント、および
(iii)1または複数の再配列されていないヒトJ H 遺伝子セグメント
を含む限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子の前記多様なレパートリーのうちの1つを含み、
ここで、(i)1つの再配列されていないヒトV H 遺伝子セグメント、(ii)1または複数の再配列されていないヒトD H 遺伝子セグメント、および(iii)1または複数の再配列されていないヒトJ H 遺伝子セグメントは、少なくとも1つの内因性IgM遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、方法。 - 前記核酸を増幅する前に、目的の抗原で前記齧歯動物を免疫化するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記再配列されたヒト免疫グロブリンVH領域遺伝子配列が、少なくとも1つの体細胞超変異を含む、請求項11または請求項12に記載の方法。
- 前記リンパ球が目的の抗原に特異的に結合する、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための、請求項1~10のいずれか一項に記載の齧歯動物の使用。
- 前記ヒト重鎖可変ドメインが、再配列して、1または複数のDHセグメントおよび1または複数のJHセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能な多型ヒトVH遺伝子セグメントに由来するヒトFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3配列を有することを特徴とする、請求項15に記載の使用。
- 前記ヒトVH遺伝子セグメントが、VH3セグメントファミリーメンバーである、請求項15または請求項16に記載の使用。
- ヒト抗体を作製するための請求項1~10のいずれか一項に記載の齧歯動物の使用であって、該ヒト抗体が、再配列されたヒトVH 3セグメントまたはその多型変異体に由来する重鎖可変ドメインを含み、該VH3セグメントが、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73およびVH3-74から選択され、そして、該VH 3セグメントまたは多型変異体が、再配列して、前記1または複数のDHセグメントおよび前記1または複数のJHセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能である、使用。
- ヒト重鎖可変ドメインを生成する齧歯動物を作製するための全能性齧歯動物細胞であって、該齧歯動物は、ラットまたはマウスであり、該全能性齧歯動物細胞は、そのゲノム内に、以下:
(i)ただ1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメント、
(ii)1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメント、および
(iii)1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメント
の存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、
ここで、(i)1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメント、(ii)1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメント、および(iii)1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメントは、少なくとも1つの齧歯動物IgM遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、
該齧歯動物全能性細胞で作製された齧歯動物は、各々が該内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に連結され、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子の多様なレパートリーを生成し、かつ、その脾臓内に成熟IgMintIgDhi B細胞集団を含み、各B細胞が該再配列された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域遺伝子のうちの1つを含む、
全能性齧歯動物細胞。 - 胚性幹細胞である、請求項19に記載の全能性齧歯動物細胞。
- ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する細胞を得る方法であって、
その生殖細胞系ゲノム内に、少なくとも1つの齧歯動物IgM遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に連結された、1つの再配列されていないヒトVH遺伝子セグメント、1または複数の再配列されていないヒトDH遺伝子セグメント、および1または複数の再配列されていないヒトJH遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む齧歯動物からリンパ球を回収するステップ
を含み、該齧歯動物は、ラットまたはマウスであり、
該リンパ球が、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する再配列されたヒト免疫グロブリンVH領域遺伝子を発現する、方法。 - 最終ステップとして、
前記リンパ球、または、該リンパ球から生成されたハイブリドーマから、前記再配列されたヒト免疫グロブリンVH領域遺伝子配列を含む第1のヌクレオチド配列を得るステップと;
宿主細胞において、該第1のヌクレオチド配列と同一または実質的に同一な配列を含む第1の核酸を発現させるステップと
をさらに含む、請求項21に記載の方法。 - 前記第1の核酸が、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞において、ヒト軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第2の核酸を発現させるステップ
をさらに含む、請求項21または請求項22に記載の方法であって、
該第2の核酸が、前記ヒト免疫グロブリンVHドメインと同種のヒト軽鎖可変(VL)ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列と同一または実質的に同一な配列を含む、方法。 - 前記細胞において、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第3の核酸を発現させるステップ
をさらに含む、請求項21~24のいずれか一項に記載の方法であって、
該第3の核酸が、前記ヒト免疫グロブリンVLドメインと同種の第2のヒト免疫グロブリンVHドメインをコードする、方法。 - 前記宿主細胞が、HeLa細胞、DU145細胞、Lncap細胞、MCF-7細胞、MDA-MB-438細胞、PC3細胞、T47D細胞、THP-1細胞、U87細胞、SHSY5y細胞、Saos-2細胞、Vero細胞、CHO細胞、GH3細胞、PC12細胞、ヒト網膜細胞およびMC3T3細胞から選択される、請求項21~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記回収したリンパ球からハイブリドーマを生成するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 前記齧歯動物がさらに、齧歯動物軽鎖定常領域に作動可能に連結された、1または複数のヒト免疫グロブリンVLおよび1または複数のヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントを含む、請求項21~27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記齧歯動物が、
(a)内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の欠失と、内因性κ軽鎖可変遺伝子座の欠失、または
(b)内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の欠失と、内因性λ軽鎖可変遺伝子座の欠失
を含む、請求項21~28のいずれか一項に記載の方法。 - 前記齧歯動物がマウスである、請求項1~10のいずれか一項に記載の齧歯動物。
- 前記齧歯動物がマウスである、請求項11~14または21~29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記齧歯動物がマウスである、請求項15~18のいずれか一項に記載の使用。
- 前記齧歯動物がマウスである、請求項19~20のいずれか一項に記載の全能性齧歯動物細胞。
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