RU2743589C2 - Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина - Google Patents
Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2743589C2 RU2743589C2 RU2016139418A RU2016139418A RU2743589C2 RU 2743589 C2 RU2743589 C2 RU 2743589C2 RU 2016139418 A RU2016139418 A RU 2016139418A RU 2016139418 A RU2016139418 A RU 2016139418A RU 2743589 C2 RU2743589 C2 RU 2743589C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- human
- gene
- segment
- segments
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims description 99
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims description 99
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 title description 92
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 1203
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 101
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims abstract description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 732
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 133
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 133
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 133
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 36
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 claims description 35
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 24
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 24
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 19
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 16
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 16
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 101150025032 13 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 243
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 116
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 74
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 42
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 36
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 34
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 29
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 28
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 25
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 22
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 21
- AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N Ala-Gln-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 19
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 19
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 19
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 19
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 19
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 19
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 18
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 17
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 17
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 17
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 17
- MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 17
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 17
- SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N Met-Glu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 17
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 17
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 17
- JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 17
- OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 17
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 17
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 16
- IKFZXRLDMYWNBU-YUMQZZPRSA-N Gln-Gly-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IKFZXRLDMYWNBU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 16
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 16
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 16
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 15
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 14
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 14
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 14
- MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 14
- 108010054812 diprotin A Proteins 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 13
- JNTMAZFVYNDPLB-PEDHHIEDSA-N (2S,3S)-2-[[[(2S)-1-[(2S,3S)-2-amino-3-methyl-1-oxopentyl]-2-pyrrolidinyl]-oxomethyl]amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JNTMAZFVYNDPLB-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 12
- XQJAFSDFQZPYCU-UWJYBYFXSA-N Ala-Asn-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N XQJAFSDFQZPYCU-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 12
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 12
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 12
- WUFHZIRMAZZWRS-OSUNSFLBSA-N Val-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N WUFHZIRMAZZWRS-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 11
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 11
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 10
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 10
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 10
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 9
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 9
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 9
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 9
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 9
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 9
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 8
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 8
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- OCQUNKSFDYDXBG-QXEWZRGKSA-N Gly-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OCQUNKSFDYDXBG-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 7
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 7
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 7
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 7
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 7
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 7
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 6
- JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N Glu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N Lys-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 6
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 229940124893 Fluvirin Drugs 0.000 description 5
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 5
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 5
- BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N Phe-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N 0.000 description 5
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 5
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 5
- JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N Thr-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 5
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 5
- XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N Tyr-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 5
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 5
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N Gly-Ile-Ala Natural products NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(C)C(O)=O SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 4
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 description 4
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 4
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- USXYVSTVPHELAF-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O USXYVSTVPHELAF-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001123946 Gaga Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- WTUSRDZLLWGYAT-KCTSRDHCSA-N Gly-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)CN WTUSRDZLLWGYAT-KCTSRDHCSA-N 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 3
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 3
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 3
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 102000053391 human F Human genes 0.000 description 3
- 108700031895 human F Proteins 0.000 description 3
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 3
- FEZJJKXNPSEYEV-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FEZJJKXNPSEYEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N Arg-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- ITGFVUYOLWBPQW-KKHAAJSZSA-N Asp-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ITGFVUYOLWBPQW-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 2
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N Cys-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- UWLHDGMRWXHFFY-HPCHECBXSA-N Ile-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UWLHDGMRWXHFFY-HPCHECBXSA-N 0.000 description 2
- UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N Ile-Phe-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(O)=O UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N 0.000 description 2
- CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N Ile-Thr-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 2
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 2
- 241000102542 Kara Species 0.000 description 2
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N Phe-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- JMVQDLDPDBXAAX-YUMQZZPRSA-N Pro-Gly-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 JMVQDLDPDBXAAX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HAUVENOGHPECML-BPUTZDHNSA-N Ser-Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)=CNC2=C1 HAUVENOGHPECML-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- 241000121210 Sigmodontinae Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- NSOMQRHZMJMZIE-GVARAGBVSA-N Tyr-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NSOMQRHZMJMZIE-GVARAGBVSA-N 0.000 description 2
- XDGPTBVOSHKDFT-KKUMJFAQSA-N Tyr-Met-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XDGPTBVOSHKDFT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108700039855 mouse a Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 102000043853 ADAMTS13 Human genes 0.000 description 1
- 108091005670 ADAMTS13 Proteins 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 241001330002 Bambuseae Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000398949 Calomyscidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000398985 Cricetidae Species 0.000 description 1
- AMRLSQGGERHDHJ-FXQIFTODSA-N Cys-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMRLSQGGERHDHJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001095404 Dipodoidea Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- NXPXQIZKDOXIHH-JSGCOSHPSA-N Gln-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N NXPXQIZKDOXIHH-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N Gln-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- OSCLNNWLKKIQJM-WDSKDSINSA-N Gln-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O OSCLNNWLKKIQJM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- NGRPGJGKJMUGDM-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NGRPGJGKJMUGDM-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101000800023 Homo sapiens 4F2 cell-surface antigen heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 101000746783 Homo sapiens Cytochrome b-c1 complex subunit 6, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000595467 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035888 Immune-mediated thrombotic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 description 1
- 101710139965 Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 201000003791 MALT lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- MNNKPHGAPRUKMW-BPUTZDHNSA-N Met-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 MNNKPHGAPRUKMW-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N Met-Gly-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000398750 Muroidea Species 0.000 description 1
- 241000398990 Nesomyidae Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010029461 Nodal marginal zone B-cell lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241001338313 Platacanthomyidae Species 0.000 description 1
- 241001631648 Polyomaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000024530 Primary cutaneous B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- HVKMTOIAYDOJPL-NRPADANISA-N Ser-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HVKMTOIAYDOJPL-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 241000398956 Spalacidae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N Thr-Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- ZOCJFNXUVSGBQI-HSHDSVGOSA-N Thr-Trp-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O ZOCJFNXUVSGBQI-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000004886 acquired thrombotic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000003278 cryoglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 102000048638 human UQCRH Human genes 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010030617 leucyl-phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005309 stochastic process Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 150000003608 titanium Chemical class 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 101150109891 vn gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
- C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к грызуну для продуцирования вариабельного домена тяжелой цепи человека, к полученной из него клетке, а также к применению указанного грызуна для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи человека, и к применению указанного грызуна для получения антитела человека. Также раскрыт способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, предусматривающий амплификацию нуклеиновой кислоты, содержащей реаранжированный ген вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека из лимфоцита вышеуказанного грызуна или из гибридомы, полученной из указанного лимфоцита. Изобретение также относится к тотипотентной клетке грызуна для получения грызуна, которая продуцирует вариабельный домен тяжелой цепи человека. Изобретение позволяет эффективно продуцировать вариабельный домен тяжелой цепи человека. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 22 ил., 9 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Не относящиеся к человеку животные, которые генетически сконструированы в локусе (или в трансгене) вариабельной области (V) тяжелой цепи иммуноглобулина для получения антител из ограниченного ряда вариабельных сегментов (VH) (или одного сегмента VH) тяжелой цепи иммуноглобулинов и/или их вариантов. Не относящиеся к человеку животные, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи человека, полученный из единственного вариабельного генного сегмента тяжелой цепи иммуноглобулина, например, генного сегмента VH1-69 иммуноглобулина человека или генного сегмента VH1-2 человека. Способы получения последовательностей антител у не относящихся к человеку животных, которые применимы для связывания патогенов, включая в себя патогены человека.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Не относящиеся к человеку животные, например мыши, были генетически модифицированы, чтобы быть пригодными инструментами в способах получения последовательностей антител для использования в терапевтических средствах для людей на основе антител. Мышей с гуманизированными локусами вариабельной области (например, VH, DH и JH гены, и VL и JL гены) используют для создания родственных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи для использования в терапевтических средствах на основе антител. Доступны другие мыши, которые продуцируют полностью человеческие антитела с родственными тяжелыми и легкими цепями.
Терапевтические средства на основе антител для лечения человека разрабатывают на основе требуемых характеристик в отношении определенных заранее выбранных антигенов. Гуманизированных мышей иммунизируют предварительно выбранными антигенами, и иммунизированных мышей используют для получения популяций антител, из которых идентифицируют высокоаффинные родственные тяжелые и легкие вариабельные домены с требуемыми характеристиками связывания. Некоторые гуманизированные мыши, такие как те, у которых гуманизированы только вариабельные области в эндогенных локусах мыши, продуцируют популяции В-клеток, которые схожи по характеру и количеству с популяциями В-клеток мыши дикого типа. В результате чрезвычайно большая и разнородная популяция В-клеток доступна у тех мышей, у которых подвергают скринингу антитела, отражая большое количество различных реаранжировок иммуноглобулина для определения тяжелых и легких вариабельных доменов с наиболее необходимыми характеристиками.
Но не все антигены вызывают иммунный ответ, который проявляет очень большое количество реаранжировок из широкого выбора вариабельных сегментов (V). Другими словами, гуморальный иммунный ответ человека на определенные антигены практически ограничен. Ограничение отражается в клональной селекции В-клеток, которые экспрессируют только определенные сегменты V, связывающие определенный антиген с достаточно высокой аффинностью и специфичностью. Некоторые такие антигены клинически значимы, т.е. ряд из них представляет собой хорошо известные патогены человека. Возникает предположение, что сегмент V, экспрессированный при иммунном ответе человека, представляет собой сегмент V, который в сочетании с человеческим сегментом D и J более вероятно продуцирует применимое высоаффинное антитело, чем случайно выбранный сегмент V, который не наблюдался в ответе антитела человека на этот антиген.
Предполагается, что естественный отбор в течение тысячелетий выбрал наиболее эффективную основу или основание, из которого разрабатывается наиболее эффективное оружие для нейтрализации человеческих патогенов - клонально выбранный сегмент V. В настоящей области техники существует потребность в увеличении и улучшении антител, которые связываются и/или нейтрализуют такие антигены, как рассмотренные выше патогены. Существует потребность в более быстром получении применимых последовательностей из определенных сегментов V, включающих полиморфные и/или соматически мутированные определенные V сегменты, и в более быстром получении применимых популяций В-клеток, содержащих реаранжировки V сегментов с различными сегментами D и J, в том числе соматически мутированными их модификациями, и в частности, реаранжировки с уникальными и применимыми CDR3. Существует потребность в биологических системах, например, не относящихся к человеку животных (таких как, например, мыши, крысы, кролики и т.д.), которые могут продуцировать терапевтически применимые последовательности вариабельной области антитела из предварительно выбранных сегментов V в увеличенном количестве и разнообразии, чем, например, может быть получено у существующих модифицированных животных. Существует потребность в конструкциях биологических систем, содержащих коммитированную гуморальную иммунную систему для клонального выбора вариабельных последовательностей антител, полученных из ограниченных, заранее выбранных сегментов V, включая без ограничения родственные вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, применимые в производстве терапевтических средств на основе антител человека против определенных антигенов, включая определенные патогены человека.
В настоящей области техники существует потребность в терапевтических антителах, которые способны нейтрализовать вирусные антигены, например, ВИЧ и ВГС, включая антигенспецифические антитела, содержащие тяжелые цепи, полученные из одного вариабельного сегмента человека, и в системе, которая продуцирует разнообразный источник антител, из которых выбирают последовательности терапевтических антител. Существует также потребность в дополнительных способах и не относящихся к человеку животных для получения применимых антител, включающих антитела, которые содержат репертуар тяжелых цепей, полученных из одного VH сегмента человека, и содержащие разнообразный набор последовательностей CDR, и включая такие тяжелые цепи, которые экспрессируют с родственными вариабельными областями легкой цепи человека. Требуются способы для отбора CDR для связывающих белков на основе иммуноглобулинов, которые предусматривают повышенное разнообразие связывающих белков, из которых производят выбор, и повышенное разнообразие вариабельных доменов иммуноглобулинов, включая композиции и способы для создания соматически мутированных и клонально отобранных вариабельных доменов иммуноглобулинов, для использования, например, в получении терапевтических средств для людей.
Краткое раскрытие изобретения
Предусматриваются генетически модифицированные локусы иммуноглобулинов, которые содержат некоторое ограниченное количество различных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи (т.е. генов V, генов VH, генных сегментов VH или генных сегментов V), например, не более одного, двух или трех различных генов V; или не более одного представителя семейства генных сегментов V присутствующего, например, в единственной копии или во множественных копиях и/или содержащий один или несколько полиморфизмов.
Предусматриваются локусы, которые способны к реаранжировке и образованию гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, полученного из рестриктированного репертуара генов VH, например, представляющих собой один генный сегмент VH или выбранных из множества полиморфных вариантов одного генного сегмента VH. Предусматриваются модифицированные локусы иммуноглобулинов, которые включают в себя локусы, содержащие последовательности иммуноглобулинов человека, например, сегмент V человека, функционально связанный с константной последовательностью человеческого (или химеры человеческого/не относящегося к человеку) или не относящегося к человеку иммуноглобулина (и функционально связанный, например, с сегментом D и/или J). Предусматриваются модифицированные локусы, которые содержат множественные копии одного генного сегмента VH, включая при этом одну или несколько копий, содержащих полиморфный вариант. Предусматриваются модифицированные локусы, которые включают множественные копии одного сегмента VH, функционально связанного с одним или несколькими сегментами D и одним или несколькими сегментами J, функционально связанными с константной последовательностью не относящегося к человеку иммуноглобулина, например, последовательностью мыши или крысы. Также предусматриваются не относящиеся к человеку животные, содержащие такие гуманизированные локусы.
Предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые содержат редуцированную вариабельность генного сегмента тяжелой цепи иммуноглобулина (т.е. ограниченное количество вариабельных генных сегментов тяжелой цепи или ограниченный репертуар вариабельных генов тяжелой цепи), причем редуцированная вариабельность генного сегмента тяжелой цепи иммуноглобулина характеризуется наличием не более одного или не более двух вариабельных генных сегментов тяжелой цепи, и при этом присутствующие вариабельные гены тяжелой цепи функционально связаны с человеческой или не относящейся к человеку последовательностью константной области.
Предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые содержат редуцированную вариабельность генного сегмента тяжелой цепи иммуноглобулина (например, один генный сегмент VH или ограниченное число генных сегментов VH, которые представляют собой полиморфные варианты одного генного сегмента VH), причем редуцированная вариабельность генного сегмента тяжелой цепи иммуноглобулина характеризуется наличием единственного генного сегмента VH или множества генных сегментов VH, которые представляют собой полиморфные формы единственного генного сегмента VH (например, генные сегменты VH, ассоциированные с высоким числом копий и/или полиморфизмом у людей), и при этом присутствующие вариабельные гены тяжелой цепи функционально связаны с человеческой или не относящейся к человеку последовательностью константной области. Согласно различным вариантам осуществления присутствующие вариабельные гены тяжелой цепи функционально связаны с одним или несколькими генными сегментами D и/или одним или несколькими генными сегментами J в зародышевой линии не относящегося к человеку животного.
Предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые содержат вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (например, на трансгене или в качестве вставки или замещения в эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку животного), который содержит единственный сегмент VH, функционально связанный с генным сегментом D и/или J. Согласно различным вариантам осуществления единственный сегмент VH функционально связан с одним или несколькими генными сегментами D и/или с одним или несколькими генными сегментами J в эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного.
Предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые модифицированы в локусах вариабельной области тяжелой цепи их иммуноглобулина для удаления всех или по существу всех (например, всех функциональных сегментов или практически всех функциональных сегментов) эндогенных сегментов VH иммуноглобулина и которые содержат сегмент VH1-69 человека (или сегмент VH1-2 человека), функционально связанный с сегментом D и J или сегментом J в эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного.
Также предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые модифицированы в локусах вариабельной области тяжелой цепи их иммуноглобулина для приведения эндогенных локусов вариабельной области в состояние неспособности к реаранжировке с образованием функциональной тяжелой цепи, содержащей эндогенные генные сегменты вариабельной области; при этом не относящиеся к человеку животные содержат единственный вариабельный генный сегмент человека (VH1-2 человека или генный сегмент VH1-69 человека), функционально связанный с сегментом D и J или сегментом J в эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного.
Предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые содержат ограниченное количество (например, не более одного или не более двух) генных сегментов тяжелой цепи, функционально связанных с последовательностью человеческой или не относящейся к человеку константной области. Согласно одному варианту осуществления не более одного или не более двух генных сегментов тяжелой цепи, связанных с последовательностью константной области, находятся на трансгене, например, находятся в положении, отличном от эндогенного локуса тяжелой цепи.
Предусматриваются способы получения последовательностей иммуноглобулина человека от не относящихся к человеку животных. Согласно различным вариантам осуществления последовательности иммуноглобулина человека получают из репертуара последовательностей V иммуноглобулина, которые состоят преимущественно из единственного человеческого сегмента V, например, VH1-69 или VH1-2, и одного или нескольких сегментов D и J или одного или нескольких сегментов J. Предусматриваются способы получения последовательностей иммуноглобулина человека от не относящихся к человеку животных, тканей и клеток, причем последовательности человеческого иммуноглобулина связывают патоген.
Предусматриваются способы получения мышей, характеризующихся ограниченным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина, причем ограничение касается числа генных сегментов VH иммуноглобулина. Согласно различным аспектам ограничение относится к одному или не более двум, или к единственному представителю семейства генов VH (например, к одному или нескольким аллелям VH, вариантам или их полиморфным вариантам). Согласно различным аспектам локус тяжелой цепи дополнительно содержит один или несколько генных сегментов DH и один или несколько генных сегментов JH. Согласно различным аспектам генные сегменты VH, DH и JH представляют собой генные сегменты человека. Согласно различным аспектам генные сегменты VH, DH и JH функционально связаны с не относящейся к человеку константной областью (например, IgM и/или IgG). Согласно различным аспектам константная область представляет собой константную область мыши или крысы.
Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения мыши, содержащей ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, предусматривающий введение описанной в настоящем документе конструкции нуклеиновой кислоты в эмбриональную стволовую (ES) клетку мыши и выделение или идентификацию ES клетки мыши, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты.
Согласно одному варианту осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит единственный генный сегмент VH человека, один или несколько генных сегментов DH человека, а также один или несколько генных сегментов JH человека. Согласно одному варианту осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит один или несколько сайтов сайт-специфической рекомбинации (например, сайт LoxP или Fit).
Согласно одному аспекту предусматривается мышь, полученная с использованием описанного в настоящем документе нацеливающего вектора, нуклеотидной последовательности или клетки. Согласно различным вариантам осуществления нацеливающий вектор, нуклеотидная последовательность или клетка содержит последовательность ДНК, которая содержит единственный генный сегмент VH человека (или его полиморфные варианты), один или несколько генных сегментов DH человека, и один или несколько генных сегментов JH человека, функционально связанные с не относящимся к человеку константным геном.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения мыши, содержащей ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, включающий замещение локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши человеческой геномной последовательностью, содержащей единственный генный сегмент VH человека (или его полиморфные варианты), один или несколько генных сегментов DH человека, и один или несколько генных сегментов JH человека, причем генные сегменты VH, DH и JH человека, способны к реаранжировке с формированием химерной тяжелой цепи, содержащей вариабельную область человека, функционально связанную с не относящейся к человеку константной областью. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку константная область представляет собой константную область мыши или крысы.
Согласно различным аспектам не относящиеся к человеку животные представляют собой грызунов. Согласно различным аспектам грызуны представляют собой мышей и/или крыс.
Согласно одному аспекту предусматривается модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V тяжелой цепи, ограниченный по отношению к идентичности V сегмента, и который содержит один или несколько D сегментов и один или несколько сегментов J или один или несколько сегментов J. Согласно одному варианту осуществления сегмент V тяжелой цепи представляет собой сегмент человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов D представляют собой сегменты D человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов J представляют собой сегменты J человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов D и один или несколько сегментов J представляет собой сегменты D и J человека.
Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус представляет собой не относящийся к человеку локус. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к человеку локус модифицируют по меньшей мере с одной последовательностью иммуноглобулина человека.
Согласно одному варианту осуществления ограничение касается одного представителя семейства сегментов V. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в двух или более копиях. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в виде двух или более вариантов (например, две или более полиморфные формы представителя семейства сегментов V). Согласно одному варианту осуществления один сегмент V представляет собой представителя семейства сегментов V человека. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в нескольких вариантах, как это наблюдается в человеческой популяции, по отношению к этому варианту. Согласно одному варианту осуществления представителя семейства сегментов V выбирают из таблицы 1. Согласно одному варианту осуществления представитель семейства сегментов V присутствует в нескольких вариантах, как показано для каждого сегмента V, в нескольких аллелях от одной аллели до нескольких аллелей, показанных в правой колонке таблицы 1.
Согласно одному варианту осуществления ограничение относится к генному сегменту VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 человека присутствует в двух или более копиях. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 человека присутствует в двух или более вариантах (например, две или более полиморфные формы гена VH1-69 человека). Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 человека присутствует в нескольких вариантах, как это наблюдается в человеческой популяции, по отношению к генному сегменту VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 человека выбирают из таблицы 2. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 человека присутствует в нескольких вариантах, как показано для каждого генного сегмента VH1-69, в нескольких аллелях от одной аллели до нескольких аллелей, показанных в таблице 2.
Согласно одному варианту осуществления ограничение относится к генному сегменту VH1-2 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 человека присутствует в двух или более копиях. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 человека присутствует в двух или более вариантов (например, две или более полиморфные формы гена VH1-2 человека). Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 человека присутствует в нескольких вариантах, как это наблюдается в человеческой популяции, по отношению к генному сегменту VH1-2 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 человека выбирают из таблицы 3. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 человека присутствует в нескольких вариантах, как показано для каждого генного сегмента VH1-2, в нескольких аллелях от одной аллели до нескольких аллелей, показанных в таблице 3.
Согласно одному аспекту предусматривается локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит единственный функциональный сегмент V человека. Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека выбирают из сегментов VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1 и VH7-81. Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека представляет собой сегмент VH1-69; согласно конкретному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека присутствует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 полиморфных формах, обнаруженных в человеческой популяции. Согласно одному варианту осуществления единственный функциональный сегмент V человека представляет собой сегмент VH1-2; согласно конкретному варианту осуществления один функциональный сегмент V человека присутствует в 1, 2, 3, 4 или 5 полиморфных формах, обнаруженных в человеческой популяции.
Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой модифицированный локус не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления модифицированный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина присутствует у не относящегося к человеку животного в положении в геноме, в котором находится соответствующий немодифицированный не относящийся к человеку локус у не относящегося к человеку животного дикого типа. Согласно одному варианту осуществления модифицированный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина присутствует на трансгене у не относящегося к человеку животного.
Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека представляет собой генный сегмент VH1-69. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 содержит SEQ ID NO:34. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 происходит из SEQ ID NO:34. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-69 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен SEQ ID NO:34.
Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:34.
Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека представляет собой генный сегмент VH1-2. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 содержит SEQ ID NO:60. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 происходит из SEQ ID NO:60. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH1-2 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен SEQ ID NO:60.
Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:60.
Согласно одному варианту осуществления один функциональный генный сегмент V человека функционально связан с одним или несколькими сегментами D и одним или несколькими сегментами J, или одним или несколькими сегментами J. Согласно одному варианту осуществления сегмент V и один или несколько сегментов D и/или J функционально связаны с последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбирают из последовательности CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления каждый из CH1, шарнира, CH2, CH3 или их комбинации представляет собой не относящиеся к человеку эндогенные константные последовательности. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один из CH1, шарнира, CH2, CH3 или их комбинации представляет собой последовательность человека. Согласно конкретному варианту осуществления CH1 и/или шарнир представляют собой последовательности человека.
Согласно одному аспекту предусматривается модифицированный эндогенный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий замещение всех функциональных генных сегментов V одним генным сегментом V человека (или один генный сегмент V человека присутствует во множественных полиморфных формах или числе копий), причем локус тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина не способен к реаранжировке с образованием вариабельного гена тяжелой цепи, который происходит от генного сегмента V, отличного от единственного генного сегмента V человека (или одного из полиморфных форм или копий).
Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент V человека представляет собой VH1-69. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент V человека представляет собой VH1-2.
Согласно одному варианту осуществления локус содержит по меньшей мере один генный сегмент DH человека или не относящийся к человеку, и один генный сегмент JH человека или не относящийся к человеку. Согласно конкретному варианту осуществления локус содержит генный сегмент DH человека и генный сегмент JH человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус содержит генный сегмент JH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус содержит генный сегмент VH1-69 человека (присутствует в виде единственной копии или множественных копий различных полиморфных вариантов), все функциональные генные сегменты DH человека, и все функциональные генные сегменты JH человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус содержит генный сегмент VH1-2 человека (присутствует в виде единственной копии или множественных копий различных полиморфных форм), все функциональные генные сегменты DH человека и все функциональные генные сегменты JH человека. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты V, D и J человека (или генные сегменты V и J) функционально связаны с геном константной области в эндогенном локусе тяжелой цепи мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи мыши содержит репертуар последовательностей константной области иммуноглобулина мыши дикого типа.
Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем только функциональный генный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного выбирают из генных сегментов VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4- 30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1 и VH7-81 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент V тяжелой цепи представляет собой генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент V тяжелой цепи представляет собой генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное содержит один функциональный генный сегмент VH человека (присутствует в виде единственной копии или множественных копий различных полиморфных форм), и причем не относящееся к человеку животное по существу не способно к образованию реаранжированного гена вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, который не содержит единственного функционального генного сегмента VH человека (или одну из полиморфных форм или копий).
Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем только вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина, экспрессируемая у не относящегося к человеку животного, происходит от одного сегмента человека, выбранного из генных сегментов VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1 и VH7-81 человека. Согласно одному варианту осуществления сегмент человека представляет собой сегмент VH1-69. Согласно одному варианту осуществления сегмент человека представляет собой сегмент VH1-2. Согласно одному варианту осуществления единственный вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, экспрессируемый мышью, происходит от единственного представителя семейства сегментов V, и согласно одному варианту осуществления только вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина получают из полиморфного варианта единственного представителя семейства сегментов V.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар генных сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное дополнительно содержит один или несколько вариабельных сегментов (Vκ) легкой цепи κ иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов Vκ функционально связаны с одним или несколькими сегментами J человека. Согласно конкретному варианту осуществления сегменты J представляют собой сегменты J человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не экспрессирует легкую цепь А, иммуноглобулина. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит функциональный человеческий или функциональный эндогенный вариабельный локус легкой цепи А. иммуноглобулина.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой мышь.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном локусе Vκ не относящегося к человеку иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных сегментов Vκ одним или несколькими функциональными сегментами Vκ человека. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение представляет собой замещение всеми или по существу всеми функциональными сегментами Vκ иммуноглобулина человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном локусе Vκ не относящегося к человеку иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных генных сегментов Vκ генными сегментами Vκ человека, выбранными из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40 и их комбинации.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном локусе Jκ не относящегося к человеку иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных сегментов Jκ не относящегося к человеку иммуноглобулина одним или несколькими функциональными сегментами Jκ иммуноглобулина человека. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение представляет собой замещение всеми или по существу всеми функциональными сегментами Jκ иммуноглобулина человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном локусе Jκ не относящегося к человеку иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных генных сегментов Jκ не относящегося к человеку иммуноглобулина генными сегментами Jκ человека, выбранными из Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 и их комбинации.
Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V, состоящих преимущественно из единственного сегмента V и/или его полиморфных вариантов. Согласно конкретному варианту осуществления единственный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой VH1-69 сегмент человека, и не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов DH всеми функциональными сегментами DH человека, и дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов JH всеми функциональными сегментами JH человека, и причем локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связан с генной последовательностью константной области человека или не относящейся к человеку. Согласно конкретному варианту осуществления генная последовательность константной области представляет собой эндогенную генную последовательность не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное реаранжирует сегменты в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность VH1-69 человека, последовательность DH человека, последовательность JH человека и последовательность константной области мыши.
Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V, состоящих преимущественно из единственного сегмента V и/или его полиморфных вариантов. Согласно конкретному варианту осуществления единственный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой сегмент VH1-2 человека, и не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов DH всеми функциональными сегментами DH человека, и дополнительно содержит замещение всех не относящихся к человеку функциональных сегментов JH всеми функциональными сегментами JH человека, и причем локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулин функционально связан с генной последовательностью константной области человека или не относящейся к человеку. Согласно конкретному варианту осуществления генная последовательность константной области представляет собой эндогенную генную последовательность не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное реаранжирует сегменты в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность VH1-2 человека, последовательность DH человека, последовательность JH человека и последовательность константной области мыши.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается В-клетка, которая содержит реаранжированный ген. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка представляет собой В-клетку описанной в настоящем документе мыши которая была иммунизирована представляющим интерес антигеном, и В-клетка кодирует антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген. Согласно конкретному варианту осуществления патоген выбирают из вируса гриппа, вируса гепатита (например, вируса гепатита В или гепатита С) и вируса иммунодефицита человека. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка кодирует соматически мутированное высокоаффинное (например, приблизительно 10-9 KD или ниже) антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи человека (например, вариабельную область легкой цепи κ человека), которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное содержит один или несколько вариабельных сегментов (Vλ) легкой цепи λ человека. Согласно одному варианту осуществления один или несколько сегментов Vλ. человека функционально связаны с одним или несколькими сегментами J человека. Согласно конкретному варианту осуществления сегменты J представляют собой сегменты Jλ. человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не экспрессируют легкую цепь κ. Согласно другому конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит функциональный вариабельный локус легкой цепи κ человека или не относящегося к человеку.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных сегментов Vλ не относящегося к человеку иммуноглобулина. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение осуществляется всеми или по существу всеми функциональными сегментами Vλ иммуноглобулина человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных не относящихся к человеку сегментов Vλ фрагментом кластера А локуса легкой цепи λ человека. Согласно конкретному варианту осуществления фрагмент кластера А локуса легкой цепи λ человека содержит сегменты от Vλ3-27 до Vλ3-1 гена Vλ человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных не относящихся к человеку сегментов Vλ фрагментом кластера В локуса легкой цепи λ человека. Согласно конкретному варианту осуществления фрагмент кластера В локуса легкой цепи X человека содержит сегменты от Vλ5-52 до Vλ1-40 гена Vλ человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных не относящихся к человеку сегментов Vλ фрагментом кластера А и фрагментом кластера В локуса легкой цепи λ человека, причем в результате замещения содержит сегменты от Vλ5-52 до Vλ3-1 гена Vλ человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных не относящихся к человеку сегментов Vλ. по меньшей мере 12 генными сегментами Vλ человека, по меньшей мере 28 генными сегментами VA. человека или по меньшей мере 40 генными сегментами Vλ человека.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных генных сегментов Jλ, не относящегося к человеку иммуноглобулина. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления замещение осуществляется всеми или по существу всеми функциональными генными сегментами Jλ, иммуноглобулина человека. Согласно различным вариантам осуществления функциональные генные сегменты Jλ, человека включают в себя Jλ1, Jλ2, Jλ3 и Jλ7.
Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области (VH) тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит только единственный сегмент VH, причем единственный сегмент VH представляет собой сегмент VH1-69 человека или сегмент VH1-2 человека, и дополнительно содержит замещение всех функциональных не относящихся к человеку сегментов DH всеми функциональными сегментами DH человека, и дополнительно содержит замещение всех функциональных не относящихся к человеку сегментов JH всеми функциональными сегментами JH человека, и причем локус VH области функционально связан с генной последовательностью константной области человека или не относящейся к человеку. Согласно конкретному варианту осуществления генная последовательность константной области представляет собой генную последовательность не относящейся к человеку константной области, например, эндогенную генную последовательность не относящейся к человеку константной области. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное реаранжирует сегменты в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую последовательность VH1-69 человека (или последовательность VH1-2 человека), последовательность DH человека, последовательность JH человека и эндогенную последовательность не относящейся к человеку константной области.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается В-клетка, которая содержит реаранжированный ген. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка представляет собой клетку описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, которое иммунизировали представляющим интерес антигеном, и В-клетка кодирует антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном. Согласно одному варианту осуществления антиген представляет собой белок человека, выбранный из лиганда, рецептора клеточной поверхности и внутриклеточного белка. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген. Согласно конкретному варианту осуществления патоген выбирают из вируса гриппа, вирус гепатита (например, вируса гепатита В или гепатита С) и вируса иммунодефицита человека. Согласно конкретному варианту осуществления В-клетка кодирует соматически мутированное высокоаффинное (например, приблизительно 10-9 Kd или ниже) антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи человека (например, вариабельную область легкой цепи А, человека), которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар сегментов VH иммуноглобулина, причем не относящееся к человеку животное содержит сегмент VH1-69 человека (или сегмент VH1-2 человека) на трансгене, причем сегмент VH1-69 человека функционально связан на трансгене с сегментом DH человека или не относящимся к человеку и/или с сегментом J человека или не относящимся к человеку, и трансген дополнительно содержит ген константной области человека или не относящейся к человеку или химерную константную область человека/не относящуюся к человеку (например, CH1, шарнир, CH2, CH3 или их комбинацию, где по меньшей мере одна последовательность представляет собой не относящуюся к человеку последовательность, например, выбранную из шарнира, CH2 и CH3 и/или шарнира). Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу, и ген не относящегося к человеку D, J и/или константной области представляет собой ген мыши или крысы или химерный ген человека/мыши или крысы.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит трансген, который содержит локус вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, который содержит один или несколько генных сегментов Vλ. и генных сегментов Jλ, иммуноглобулина человека или один или несколько генных сегментов Vκ и генных сегментов Jκ иммуноглобулина человека и ген константной области легкой цепи κ или X иммуноглобулина человека, в результате чего трансген реаранжирует у не относящегося к человеку животного для образования реаранжированного гена легкой цепи κ или λ иммуноглобулина. Согласно различным вариантам осуществления генные сегменты Vκ и Jκ человека представляют собой описанные в настоящем документе сегменты. Согласно различным вариантам осуществления генные сегменты Vλ и Jλ человека представляют собой описанные в настоящем документе сегменты.
Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит трансген, содержащий вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит единственный сегмент V, представляющий собой сегмент VH1-69 человека (или сегмент VH1-2 человека), один или несколько сегментов D человека, один или несколько сегментов J человека и константный ген человека, функционально связанный с вариабельным локусом тяжелой цепи, в результате чего мышь экспрессирует с трансгена полное антитело человека, полученное из сегмента VH1-69 (или сегмента VH1-2). Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не содержит функциональный эндогенный локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит нефункциональный эндогенный локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит делецию эндогенного не относящегося к человеку сегмента DH и/или эндогенного не относящегося к человеку сегмента JH, в результате чего не относящееся к человеку животное не способно к реаранжировке локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина с образованием реаранжированного гена не относящегося к человеку антитела. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию последовательности переключения (switch sequence), функционально связанную с эндогенной константной областью тяжелой цепи мыши. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность переключения представляет собой не относящуюся к человеку (например, мыши) последовательность переключения μ. Согласно другому варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно не содержит функциональный эндогенный вариабельный локус легкой цепи, выбранный из локуса к иммуноглобулина и локуса λ иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию последовательности Jκ и/или Jλ, так что не относящееся к человеку животное не способно к реаранжировке эндогенной вариабельной области легкой цепи κ не относящегося к человеку иммуноглобулина и/или эндогенной вариабельной области легкой цепи λ не относящегося к человеку иммуноглобулина с образованием реаранжированного эндогенного гена легкой цепи κ не относящегося к человеку иммуноглобулина и/или легкой цепи λ не относящегося к человеку иммуноглобулина.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию эндогенной последовательности легкой цепи κ не относящегося к человеку иммуноглобулина, что приводит к функциональному нокауту эндогенной легкой цепи κ не относящегося к человеку иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит делецию эндогенной последовательности легкой цепи λ не относящегося к человеку иммуноглобулина, что приводит к функциональному нокауту эндогенной легкой цепи κ не относящегося к человеку иммуноглобулина.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит функционально выключенный эндогенный локус вариабельного гена тяжелой цепи иммуноглобулина, и содержит ограниченный репертуар вариабельных генных сегментов тяжелой цепи человека (например, не более одного или не более двух). Согласно одному варианту осуществления функциональное выключение содержит модификацию эндогенного локуса вариабельного гена не относящейся к человеку тяжелой цепи, выбранную из делеции, вставки, инверсии и их комбинации.
Согласно одному аспекту предусматривается грызун, который содержит репертуар VH иммуноглобулина, полученный из не более одного сегмента VH человека или одной или нескольких его полиморф, из сегмента D, выбранного из репертуара одного или нескольких сегментов D, и из сегмента J, полученного из репертуара одного или нескольких сегментов J. Согласно одному варианту осуществления грызун реаранжирует сегмент VH человека, сегмент D человека и сегмент J человека и образует реаранжированную последовательность тяжелой цепи человека, которая функционально связана с последовательностью константной области человека или грызуна. Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области человека и/или грызуна выбирают из CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления грызун экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит вариабельную область человека, причем легкая цепь состоит в родстве с доменом тяжелой цепи человека, полученным из реаранжированной последовательности тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления грызун не экспрессирует полипептидную последовательность, выбранную из вариабельного домена не относящейся к человеку тяжелой цепи, вариабельного домена не относящейся к человеку легкой цепи и их комбинации.
Согласно одному варианту осуществления сегмент VH человека присутствует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 или более полиморфных вариантах, причем каждый полиморфный вариант функционально связан с сегментом D и/или J, так что каждый полиморфный вариант способен к реаранжировке и образованию реаранжированного вариабельного домена тяжелой цепи с любым из одного или нескольких сегментов D и любым из одного или нескольких сегментов J. Согласно одному варианту осуществления грызуна представляет собой мышь или крысу. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов D содержит два или более сегмента D. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов J содержит два или более сегмента J. Согласно одному варианту осуществления сегменты D и/или J представляют собой сегменты человека.
Согласно одному аспекту предусматривается конструкция нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность, кодирующую один сегмент VH иммуноглобулина человека и/или его полиморфные варианты и одну или несколько последовательностей DH, и одну или несколько последовательностей J, причем конструкция содержит по меньшей мере одно гомологичное плечо, гомологичное вариабельному локусу тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина, или сайт рестрикции рекомбиназы (например, сайт lox). Согласно одному варианту осуществления сегмент V представляет собой сегмент VH1-69 или сегмент VH1-2.
Согласно одному аспекту предусматривается конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую единственный сегмент V тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем единственный сегмент VH представляет собой сегмент VH1-69 (или VH1-2). Согласно одному варианту осуществления конструкция содержит сайт-специфический сайт рестрикции рекомбиназы. Согласно одному варианту осуществления конструкция содержит первое мышиное гомологичное плечо выше по ходу транскрипции от сегмента VH1-69 (или VH1-2), и второе мышиное гомологичное плечо ниже по ходу транскрипции от сегмента VH1-69 (или VH1-2), и причем первое мышиное гомологичное плечо гомологично области хромосомы мыши, непосредственно выше по ходу транскрипции от вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, но не включая функциональный вариабельный сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления конструкция содержит SEQ ID NO:3. Согласно одному варианту осуществления конструкция содержит SEQ ID NO:70.
Согласно одному аспекту ограниченный единственный сегмент VH находится в не относящемся к человеку животном или ограниченный сегмент VH находится в локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина (например, in situ или в трансгене), и не относящееся к человеку животное или локус тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина выбирают из локуса или животного: мыши, крысы, кролика, свиньи, крупного рогатого скота (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мармазетки, макака-резуса). Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное или локус представляет собой локус мыши или крысы.
Согласно одному аспекту предусматривается клетка или ткань, причем клетка или ткань происходит из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного и содержит ограниченный репертуар сегментов VH. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов VH ограничивают до единственного представителя семейства сегментов VH и/или их полиморфных вариантов. Согласно конкретному варианту осуществления единственный сегмент VH представляет собой сегмент VH1-69 человека или сегмент VH1-2 человеческого. Согласно одному варианту осуществления клетку или ткань получают из селезенки, лимфатического узла или костного мозга не относящегося к человеку животного.
Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой ES клетку. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой В-клетку. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой зародышевую клетку.
Согласно одному варианту осуществления ткань выбирают из соединительной, мышечной, нервной и эпителиальной ткани. Согласно конкретному варианту осуществления ткань представляет собой репродуктивную ткань.
Согласно одному варианту осуществления клетку и/или ткань, полученные из описанной в настоящем документе мыши, изолируют для использования в одном или нескольких анализах ex vivo. Согласно различным вариантам осуществления один или несколько анализов ex vivo включают измерения физических, тепловых, электрических, механических или оптических свойств, хирургическую процедуру, измерения взаимодействий различных типов тканей, развитие техник визуализации или их комбинацию.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящийся к человеку эмбрион, содержащий ограниченные описанные в настоящем документе сегменты VH тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эмбрион содержит донорскую ES клетку, которая содержит ограниченный сегмент VH, и эмбриональные клетки-хозяева.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящаяся к человеку клетка, содержащая хромосому или ее фрагмент описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку клетка содержит ядро описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку клетка содержит хромосому или ее фрагмент в результате ядерной передачи.
Согласно одному аспекту предусматривается ядро, полученное из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления ядро представляет собой ядро из диплоидной клетки, которая представляет собой не В-клетку.
Согласно одному аспекту предусматривается плюрипотентная, индуцированная плюрипотентная или тотипотентная клетка, полученная из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку мыши.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящаяся к человеку клетка индуцированная плюрипотентная клетка, содержащая ограниченный репертуар сегментов VH. Согласно одному варианту осуществления индуцированную плюрипотентную клетку получают от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается гибридома или квадрома, полученная из клетки описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу.
Согласно одному аспекту предусматривается лимфоцит из описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит представляет собой В-клетку.
Согласно одному аспекту предусматриваются клетки мыши и мышиные эмбрионы, включая в себя без ограничения ES клетки, плюрипотентные клетки и индуцированные плюрипотентные клетки, которые содержат описанные в настоящем документе генетические модификации. Предусматриваются клетки, которые представляют собой XX и XY клетки. Также предусматриваются клетки, которые содержат ядро, содержащее описанную в настоящем документе модификацию, например, модификация, введенная в клетку путем пронуклеарной инъекции.
Согласно одному аспекту предусматривается последовательность вариабельного домена антитела, полученная у описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается терапевтическое средство для людей, содержащее вариабельный домен антитела, содержащий последовательность, полученную от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения последовательности вариабельной области антитела от не относящегося к человеку животного, причем последовательность вариабельной области антитела происходит из сегмента VH1-69 или сегмента VH1-2 человека, причем способ предусматривает (а) иммунизацию не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, причем не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех не относящихся к человеку вариабельных сегментов единственным вариабельным сегментом человека, причем единственный вариабельный сегмент человека представляет собой сегмент VH1-69 или сегмент VH1-2, и причем не относящееся к человеку животное по существу не способно к образованию последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который не происходит от VH1-69 сегмента или VH1-2 сегмента человека; (b) предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развивать иммунный ответ в отношении представляющего интерес антигена; и (с) идентификацию или выделение последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного, причем антитело связывается с представляющим интерес антигеном.
Согласно одному варианту осуществления единственный вариабельный сегмент человека представляет собой сегмент VH1-69.
Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела происходит из SEQ ID NO:34. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела идентична SEQ ID NO: 34 по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98%. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела содержит SEQ ID NO:34.
Согласно одному варианту осуществления единственный вариабельный сегмент человека представляет собой сегмент VH1-2.
Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела происходит из SEQ ID NO:60. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела идентична SEQ ID NO:60 по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98%. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области антитела содержит SEQ ID NO:60.
Согласно одному варианту осуществления иммунный ответ на антиген характеризуется титром антител, который приблизительно в 6×104-5×105 раз больше, чем двухкратный фон, как определено в анализе ELISA. Согласно конкретному варианту осуществления титр антител приблизительно в 1×105-2×105 раз больше, чем двухкратный фон, как определено в анализе ELISA. Согласно конкретному варианту осуществления титр антител приблизительно в 1,5×105 раз больше, чем двухкратный фон, как определено в анализе ELISA. Согласно одному варианту осуществления антиген представляет собой рецептор клеточной поверхности человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ для получения репертуара вариабельных областей антитела человека у не относящегося к человеку животного, причем вариабельные области тяжелой цепи человека репертуара происходят из того же представителя семейства генов VH и одного из множества сегментов DH, и одного из множества сегментов JH, причем репертуар характеризуется наличием последовательностей FR1 (каркасная область 1), CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи иммуноглобулина из единственного представителя семейства гена VH. Согласно одному варианту осуществления репертуар дополнительно характеризуется наличием множества различных последовательностей CDR3+FR4.
Согласно одному варианту осуществления единственное семейство генов VH выбирают из семейства VH 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7. Согласно конкретному варианту осуществления единственное семейство генов VH представляет собой семейство VHI. Согласно одному варианту осуществления единственное семейство генов VH выбирают из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Согласно конкретному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH представляет собой VH1-69. Согласно конкретному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH представляет собой VH1-2.
Согласно одному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, полученные из сегмента VH1-69. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, полученные из SEQ ID NO:35. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO:35.
Согласно одному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, полученные из сегмента VH1-2. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи, полученные из SEQ ID NO:61. Согласно конкретному варианту осуществления репертуар содержит последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO:61.
Согласно одному аспекту предусматривается биологическая (т.е. in vivo) система для получения множества различных последовательностей CDR3 человека, отражающая множество реаранжировок единственного генного сегмента VH человека с множеством сегментов D и J человека, причем система продуцирует вариабельные домены тяжелой цепи человека, характеризующиеся наличием последовательностей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 человека, которые идентичны, но для соматических гипермутаций, причем вариабельные домены тяжелой цепи характеризуются тем, что они соматически гипермутированы и получены из единственного генного сегмента VH человека и множества сегментов D и J человека; причем система содержит генетически модифицированное описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное (например, грызуна, например, мышь или крысу).
Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека выбирают из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-69. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека идентифицируют в таблице 1. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека идентифицируют в таблице 2. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека идентифицируют в таблице 3.
Согласно одному аспекту предусматривается способ in vivo для получения множества последовательностей CDR тяжелых цепей, полученных из реаранжировок единственного генного сегмента VH человека с множеством сегментов D и J человека, причем способ производит вариабельные домены тяжелой цепи человека, характеризующиеся наличием последовательностей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 человека, которые идентичны, но для соматических гипермутаций, причем вариабельные домены тяжелой цепи характеризуются тем, что они соматически гипермутированы и получены из единственного генного сегмента VH человека и множества сегментов D и J человека; причем система содержит генетически модифицированное описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное (например, грызуна, например, мышь или крысу).
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает воздействие на описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное представляющим интерес антигеном, предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развивать иммунный ответ на антиген, причем иммунный ответ производит множество последовательностей CDR тяжелой цепи, полученные из реаранжировок единственного генного сегмента VH человека с одним из сегментов D человека и одним из сегментов J человека, и идентификацию набора CDR тяжелой цепи, которые связываются с антигеном. Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает выделение из животного последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует домен VH человека, который содержит CDR тяжелой цепи.
Согласно одному варианту осуществления последовательности CDR тяжелой цепи происходят из реаранжировки генного сегмента VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления последовательности CDR тяжелой цепи происходят из реаранжировки генного сегмента VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения множества различных последовательностей CDR3 и FR4 у не относящегося к человеку животного, предусматривающий воздействие на не относящееся к человеку животное, которое содержит локус вариабельного гена тяжелой цепи иммуноглобулина с репертуаром сегментов VH, ограниченных до единственного представителя семейства сегментов VH, представляющего интерес антигена, предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развивать иммунный ответ на антиген, причем иммунный ответ производит репертуар В-клеток, чьи вариабельные домены тяжелой цепи получены из единственного представителя семейства сегментов VH и содержат множество различных последовательностей CDR3 и FR4.
Согласно одному варианту осуществления единственный представитель семейства сегментов VH является человеческим. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное выбирают из мыши, крысы и кролика. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген выбирают из лиганда, рецептора, внутриклеточного белка и секретируемого белка. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой описанный в настоящем документе патоген человека.
Согласно одному варианту осуществления единственного представителя семейства генов VH человека выбирают из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Согласно одному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH человека представляет собой VH1-69. Согласно одному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH человека представляет собой VH1-2. Согласно одному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH человека идентифицируют в таблице 1. Согласно одному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH человека идентифицируют в таблице 2. Согласно одному варианту осуществления единственный представитель семейства генов VH человека идентифицируют в таблице 3.
Согласно одному аспекту предусматривается нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область иммуноглобулина, полученную от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, полученного от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, кодирующая вариабельную область антитела, полученного от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab, F(ab)2, scFv), полученный от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному аспекту предусматривается мышь, содержащая ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся наличием единственного генного сегмента VH человека, одного или нескольких генных сегментов DH человека и одного или нескольких генных сегментов JH человека, причем единственный генный сегмент VH человека находится в эндогенном локусе мыши и генный сегмент VH функционально связан с одним или несколькими генными сегментами DH человека, одним или несколькими генными сегментами JH человека и эндогенным константным геном тяжелой цепи иммуноглобулина.
Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или несколько генных сегментов VL человека и один или несколько генных сегментов JL человека, причем генные сегменты VL человека и генные сегменты JL человека функционально связаны с не относящимся к человеку геном константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления генные сегменты VL и JL человека находятся в эндогенном локусе легкой цепи мыши, и причем не относящийся к человеку ген константной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой ген мыши.
Согласно одному варианту осуществления гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина находится на трансгене, и ген константной области выбирают из мыши, крысы и человека.
Согласно одному варианту осуществления генные сегменты VL и JL человека представляют собой генные сегменты Vκ и Jκ. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты VL и JL человека представляют собой генные сегменты Vλ и Jλ.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное содержит репертуар В-клеток, который экспрессирует вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, полученные из единственного представителя семейства сегментов V. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% репертуара В-клеток вариабельного домена тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина, экспрессированного в репертуаре В-клеток, происходит от того же представителя семейства сегментов V. Согласно конкретному варианту осуществления процент составляет по меньшей мере 90%. Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из периферических В-клеток (крови). Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из В-клеток селезенки. Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из В-клеток костного мозга. Согласно одному варианту осуществления репертуар В-клеток состоит преимущественно из периферических В- клеток, В-клеток селезенки и В-клеток костного мозга.
Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем более 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более 90% В-клеток не относящегося к человеку животного, которые экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, полученный из единственного представителя семейства генных сегментов VH. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 75% В-клеток не относящегося к человеку животного, которые экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, экспрессируют вариабельный домен тяжелый цепи иммуноглобулина, полученный из единственного представителя семейства генных сегментов VH. Согласно конкретному варианту осуществления процент составляет по меньшей мере 90%. Согласно одному варианту осуществления все В-клетки, которые экспрессируют домен тяжелой цепи, который происходит из единственного представителя семейства гена VH.
Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированная мышь, которая продуцирует антигенспецифическую популяцию В-клеток в ответ на иммунизацию представляющим интерес антигеном, причем по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более 90% указанной антигенспецифической популяции В-клеток экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, все из которых получены из того же генного сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 75% антигенспецифической популяции В-клеток экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, полученные из того же генного сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления все антигенспецифические В-клетки экспрессируют тяжелые цепи иммуноглобулина, полученные из того же генного сегмента VH.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар генных сегментов VH, причем ограничение относится к генному сегменту VH1-69 человека или генному сегменту VH1-69, который по меньшей мере на приблизительно 75,5%, 76,5%, 86,7%, 87,8%, 94,9%, 96,9%, 98% или 99% идентичен генному сегменту VH1-69*01. Согласно конкретному варианту осуществления ограниченный репертуар выбирают из одного или нескольких вариантов VH1-69 фигуры 15.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный репертуар генных сегментов VH, причем ограничение относится к генному сегменту VH1-2 человека или генному сегменту VH1-2, который по меньшей мере на приблизительно 94,9%, 95,9%, 96,9%, 98% или 99% идентичен генному сегменту VH1-2. Согласно конкретному варианту осуществления ограниченный репертуар выбирают из одного или нескольких вариантов VH1-2 фигуры 18.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.
Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет иммунофенотип, характеризующийся более высоким соотношением зрелых В-клеток к незрелым В- клеткам, по сравнению с мышью дикого типа. Согласно конкретному варианту осуществления соотношение вычисляют у В-клеток, собранных из селезенки. Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет популяцию зрелых В-клеток размером приблизительно 1×107. Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет популяцию незрелых В-клеток размером приблизительно 0,5×107. Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет соотношение зрелых В-клеток к незрелым В-клеткам в селезенке мыши, превышающее приблизительно в 1,5-2 раза проявляемое мышью дикого типа.
Согласно одному варианту осуществления соотношение вычисляют у В-клеток, собранных из костного мозга. Согласно конкретному варианту осуществления мышь проявляет популяцию зрелых В-клеток размером приблизительно 3×105. Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет популяцию незрелых В-клеток размером приблизительно 7×105. Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет соотношение зрелых В-клеток к незрелым В-клеткам в селезенке мыши, превышающее приблизительно в 3 раза или приблизительно в 3,3 раза проявляемое мышью дикого типа.
Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет иммунофенотип, характеризующийся более высоким числом пре-В-клеток в костном мозге, по сравнению с мышью дикого типа. Согласно конкретному варианту осуществления мышь проявляет популяцию пре-В-клеток в костном мозге мыши, которая превышает от приблизительно 2,5 раз до приблизительно 3 раз проявляемую в костном мозге мыши дикого типа. Согласно конкретному варианту осуществления мышь проявляет популяцию пре-В-клеток в костном мозге мыши, которая превышает приблизительно в 2,75 раза проявляемую в костном мозге мыши дикого типа.
Согласно одному варианту осуществления мышь проявляет иммунофенотип, характеризующийся выбранным из группы, состоящей из популяции CD19+ В-клеток селезенки, составляющей приблизительно 80% В-клеток дикого типа, популяции CD3+ Т-клеток селезенки, составляющей приблизительно столько же, как и у мыши дикого типа, и их комбинации.
Согласно одному варианту осуществления мышь содержит популяцию лимфоцитов, чье количество CD19+ В-клеток в селезенке в % приблизительно такое же, как у мыши дикого типа. Согласно одному варианту осуществления количество CD19+ B-клеток в селезенке мыши составляет по меньшей мере 50% от числа CD19+ В-клеток в селезенке мыши дикого типа.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит по меньшей мере от приблизительно 75% до приблизительно 80% CD19+ В-клеток в костном мозге, по сравнению с мышью дикого типа.
Согласно одному варианту осуществления общее количество CD19+ костных клеток в бедренной кости мыши составляет не менее, чем приблизительно 30%, 40%, 50%, 60% или 75% от общего числа CD19+ клеток костного мозга у мыши дикого типа.
Согласно одному варианту осуществления мышь экспрессирует IgD и IgM приблизительно на том же уровне, который наблюдался у мыши дикого типа.
Согласно одному аспекту предусматривается мышь, содержащая ограниченный репертуар сегментов VH человека, дополнительно содержащая гуманизированный локус вариабельного сегмента легкой цепи иммуноглобулина, причем соотношение легких цепей λ к κ, экспрессируемое у мыши, приблизительно такое же, как и у мыши дикого типа.
Согласно одному аспекту предусматривается мышь, содержащая ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся наличием единственного генного сегмента VH, одного или нескольких генных сегментов DH и одного или нескольких генных сегментов JH, причем единственный генный сегмент VH представляет собой полиморфный генный сегмент VH.
Согласно одному варианту осуществления полиморфный генный сегмент VH представляет собой генный сегмент VH человека, который связан с большим числом копий в популяциях человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека выбирают из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, VH3-23 или их полиморфного варианта. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69. Согласно другому конкретному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2.
Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH функционально связан с геном константной области иммуноглобулина человека, мыши или химеры человека/мыши. Согласно конкретному варианту осуществления ген константной области иммуноглобулина представляет собой ген константной области мыши. Согласно одному варианту осуществления константный ген иммуноглобулина содержит последовательность человека, выбранную из CH1 человека, шарнира человека, CH2 человека, CH3 человека и их комбинации Согласно одному варианту осуществления константный ген мыши находится в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.
Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит генный сегмент VL иммуноглобулина человека, функционально связанный с генным сегментом J и константным геном легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент VL и/или генный сегмент J выбирают из генного сегмента к человека и генного сегмента λ человека. Согласно одному варианту осуществления генные сегменты VL и/или J представляют собой генные сегменты к человека.
Согласно различным вариантам осуществления мышь содержит делецию всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH.
Согласно различным вариантам осуществления не относящееся к человеку животное содержит инактивированный эндогенный локус вариабельного гена тяжелой цепи. Согласно различным вариантам осуществления инактивированный эндогенный локус вариабельного гена тяжелой цепи не функционально связан с эндогенным геном константной области тяжелой цепи.
Согласно одному аспекту предусматривается мышь, причем мышь характеризуется экспрессией иммуноглобулина сыворотки, причем более 80% иммуноглобулина сыворотки содержит вариабельный домен тяжелой цепи человека и родственный вариабельный домен легкой цепи человека, причем вариабельный домен тяжелой цепи человека происходит из репертуара генных сегментов VH, состоящего преимущественно из единственного генного сегмента VH человека и/или его полиморфных вариантов.
Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека и/или его полиморфные варианты. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2 человека и/или его полиморфные варианты.
Согласно одному аспекту предусматривается мышь, содержащая в своей зародышевой линии, замещение в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH единственным генным сегментом VH человека и/или его полиморфными вариантами. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека и/или его полиморфные варианты. Согласно одному варианту осуществления единственный генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2 человека и/или его полиморфные варианты.
Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит замещение в эндогенном локусе легкой цепи им всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VL одним или несколькими генными сегментами VL человека. Согласно конкретному варианту осуществления мышь дополнительно содержит один или несколько генных сегментов JL человека, функционально связанные с генными сегментами VL человека.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения нуклеотидной последовательности вариабельной области иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2.
Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична генному сегменту VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:34. Согласно различным вариантам осуществления генный сегмент VH1-69 человека идентифицируют из таблицы 2.
Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 35.
Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична генному сегменту VH1-2 человека. Согласно конкретному варианту осуществления нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:60 Согласно различным вариантам осуществления генный сегмент VH1-2 человека идентифицируют из таблицы 3.
Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:61.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения полностью человеческого Fab или полностью человеческого F(ab)2. Согласно одному варианту осуществления полностью человеческий Fab или полностью человеческий F(ab)2 содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления полностью человеческий Fab или полностью человеческий F(ab)2 содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения иммортализованной клеточной линии.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения гибридомы или квадромы.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения библиотеки фагов, содержащей вариабельные области тяжелой цепи человека и вариабельные области легкой цепи человека.
Согласно одному варианту осуществления вариабельные области тяжелой цепи человека получают из генного сегмента VH1-69 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:58.
Согласно одному варианту осуществления вариабельные области тяжелой цепи человека получают из генного сегмента VH1-69 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57 и SEQ ID NO:59.
Согласно одному варианту осуществления все вариабельные области тяжелой цепи человека получают из генного сегмента VH1-2 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:68.
Согласно одному варианту осуществления вариабельные области тяжелой цепи человека получают из генного сегмента VH1-2 человека, который содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:69.
Согласно одному аспекту предусматривается применение описанной в настоящем документе мыши для продукции последовательности вариабельной области для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение лимфоцита из иммунизированной мыши (а), (с) воздействие на лимфоцит одним или несколькими мечеными антителами, (d) идентификацию лимфоцита, который способен к связыванию с представляющим интерес антигеном и (е) амплификацию одной или нескольких последовательностей вариабельной области нуклеиновой кислоты из лимфоцита, таким образом получая последовательность вариабельной области.
Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получают или выделяют из селезенки мыши. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получают или выделяют из лимфатического узла мыши. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получают или выделяют из костного мозга мыши. Согласно одному варианту осуществления лимфоцит получают или выделяют из крови мыши.
Согласно одному варианту осуществления меченое антитело представляет собой конъюгированное с флуорофором антитело. Согласно одному варианту осуществления одно или несколько конъюгированных с флуорофором антител выбирают из IgM, IgG и/или их комбинации.
Согласно одному варианту осуществления лимфоцит представляет собой В-клетку.
Согласно одному варианту осуществления одна или несколько последовательностей вариабельной области нуклеиновой кислоты содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько последовательностей вариабельной области нуклеиновой кислоты содержит последовательность вариабельной области легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи κ иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько последовательностей вариабельной области нуклеиновой кислоты содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается применение описанной в настоящем документе мыши для продукции последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение селезенки из иммунизированной мыши (а), (с) воздействие на В-лимфоциты из селезенки одним или несколькими мечеными антителами, (d) идентификацию В-лимфоцита (с), который способен к связыванию с представляющим интерес антигеном и (е) амплификацию нуклеотидной последовательности вариабельной области тяжелой цепи и нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи κ из В-лимфоцита, таким образом получая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается применение описанной в настоящем документе мыши для продукции последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение одного или нескольких лимфатических узлов из иммунизированной мыши (а), (с) воздействие на В-лимфоциты из одного или нескольких лимфатических узлов одним или несколькими мечеными антителами, (d) идентификацию В-лимфоцита (с), который способен к связыванию с представляющим интерес антигеном и (е) амплификацию нуклеотидной последовательности вариабельной области тяжелой цепи и нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи κ из В-лимфоцита, таким образом получая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается применение описанной в настоящем документе мыши для продукции последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ для получения антитела человека, предусматривающее (а) иммунизацию описанной в настоящем документе мыши представляющим интерес антигеном, (b) выделение костного мозга из иммунизированной мыши (а), (с) воздействие на В-лимфоциты из костного мозга одним или несколькими мечеными антителами, (d) идентификацию В-лимфоцита (с), который способен к связыванию с представляющим интерес антигеном и (е) амплификацию нуклеотидной последовательности вариабельной области тяжелой цепи и нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи κ из В-лимфоцита, таким образом получая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ. Согласно различным вариантам осуществления одно или несколько меченых антител выбирают из IgM, IgG и/или их комбинации.
Согласно различным вариантам осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает людей, включающий, например, вирусный антиген. Иллюстративные вирусные патогены включают в себя, например, главным образом патогены из семейств Adenoviridae, bacteria Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae и Togaviridae. Длина таких иллюстративных вирусов обычно находится в пределах 20-300 нанометров. Согласно различным вариантам осуществления представляющий интерес антиген представляет собой вирусный антиген, выбранный из вируса гепатита (например, вируса гепатита С, вируса гепатита В и т.п.), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вируса гриппа (например, H1N1).
Согласно различным вариантам осуществления предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для продукции последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи κ для получения антитела человека, дополнительно предусматривающее слияние амплифицированных последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи с последовательностями константной области тяжелой и легкой цепи человека, экспрессию слитых последовательностей тяжелой и легкой цепи в клетке и восстановление экспрессированных последовательностей тяжелой и легкой цепи, таким образом получая антитело человека.
Согласно различным вариантам осуществления константные области тяжелой цепи человека выбирают из IgM, IgD, IgA, IgE и IgG. Согласно различным конкретным вариантам осуществления IgG выбирают из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Согласно различным вариантам осуществления константная область тяжелой цепи человека содержит CH1, шарнир, CH2, CH3, Сн4 или их комбинацию. Согласно различным вариантам осуществления константная область легкой цепи представляет собой константную область κ иммуноглобулина. Согласно различным вариантам осуществления клетку выбирают из клетки HeLa, клетки DU145, клетки Lncap, клетки MCF-7, клетки MDA-MB-438, клетки РСЗ, клетки T47D, клетки ТНР-1, клеткик U87, клетки SHSY5Y (нейробластомы человека), клетки Saos-2, клетки Vero, клетки СНО, клетки GH3, клетки PC 12, клетки сетчатки человек (например, клетки PER.C6™) и клетки МСЗТЗ. Согласно конкретному варианту осуществления клетка представляет собой клетку СНО.
Согласно одному аспекту предусматривается способ для получения обратного химерного антитела грызуна/человека, специфичного против представляющего интерес антигена, предусматривающий стадии иммунизации антигеном описанной в настоящем документе мыши, выделения по меньшей мере одной клетки от мыши, продуцирующей обратное химерное антитело мыши/человека, специфичное к антигену, культивирования по меньшей мере одной клетки, продуцирующей обратное химерное антитело мыши/человека, специфичное к антигену, а также получение указанного антитела.
Согласно одному варианту осуществления обратное химерное антитело мыши/человека содержит вариабельный домен тяжелой цепи человека, слитый с константным геном тяжелой цепи мыши или крысы, и вариабельный домен легкой цепи человека, слитый с константным геном легкой цепи мыши или крысы, или человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека или генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному варианту осуществления культивирование по меньшей мере одной клетки, продуцирующей обратное химерное антитело грызуна/человека, специфичное к антигену, проводят по меньшей мере на одной клетке гибридомы, полученной по меньшей мере из одной клетки, выделенной из мыши.
Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает описанных в настоящем документе людей.
Согласно одному аспекту предусматривается способ для получения полностью человеческого антитела, специфичного в отношении представляющего интерес антигена, предусматривающий стадии иммунизации антигеном описанной в настоящем документе мыши, выделения по меньшей мере одной клетки от мыши, продуцирующей обратное химерное человеческое/относящееся к грызуну антитело, специфичное к антигену, получения по меньшей мере одной клетки, продуцирующей полностью человеческое антитело, полученное от обратного химерного антитела грызун/человек, специфичного к антигену, и культивирования по меньшей мере одной клетки, продуцирующей полностью человеческое антитело, а также получение указанного полностью человеческого антитела.
Согласно различным вариантам осуществления по меньшей мере одна клетка, выделенная из мыши, продуцирующая обратное химерное антитело грызун/человек, специфичное к антигену, представляет собой спленоцит или В-клетку.
Согласно различным вариантам осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.
Согласно различным вариантам осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека или генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно различным вариантам осуществления иммунизацию представляющим интерес антигеном проводят белком, ДНК, комбинацией ДНК и белка или клетками, экспрессирующими антиген. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает описанных в настоящем документе людей.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или ее фрагмент. Согласно одному варианту осуществления используют последовательность нуклеиновой кислоты для получения антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента. Согласно одному варианту осуществления используют мышь для получения антигенсвязывающего белка, выбранного из антитела, мультиспецифического антитела (например, биспецифического антитела), ScFv, биспецифического ScFv, диатела, триатела, тетратела, V-NAR, VHH, VL., F(ab), F(ab)2, DVD (т.е. антигенсвязывающий белок двойного вариабельного домена), SVD (т.е. антигенсвязывающий белок единственного вариабельного домена) или биспецифические активаторы Т-клеток (BiTE).
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения антигенсвязывающего белка человека, предусматривающий воздействие на генетически модифицированное описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное представляющим интерес антигеном, предоставление генетически модифицированному не относящемуся к человеку животному возможности усилить иммунный ответ на антиген, получение из генетически модифицированного не относящегося к человеку животного последовательности нуклеиновой кислоты вариабельного домена тяжелой цепи, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи человека, который специфически связывается с представляющим интерес антигеном, клонирование последовательности нуклеиновой кислоты вариабельного домена тяжелой цепи до последовательности константной области человека, и экспрессирование в клетке млекопитающего антитела, содержащего последовательность вариабельного домена тяжелой цепи человека и последовательность константной области человека. Согласно одному варианту осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное содержит репертуар генных сегментов VH человека, который содержит преимущественно единственный генный сегмента VH человека, необязательно присутствующий в двух или более его полиморфных вариантах, функционально связанный с одним или несколькими сегментами D и/или J человека. Согласно одному варианту осуществления репертуар генных сегментов VH человека находится в эндогенном локусе не относящегося к человеку сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления репертуар генных сегментов VH человека находится в локусе, который не представляет собой эндогенный локус сегмента VH. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека реаранжирует с сегментом D человека и сегментом J человека с образованием реаранжированного гена VDJ человека, функционально связанного с последовательностью константной области, причем последовательность константной области выбирают из последовательности человека и последовательности грызуна (например, последовательности мыши или крысы, или хомяка). Согласно одному варианту осуществления последовательность константной области содержит последовательность, выбранную из CH1, шарнира, CH2, CH3 и их комбинации; согласно конкретному варианту осуществления последовательность константной области содержит CH1, шарнир, CH2 и CH3. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен человека и константная последовательность экспрессируют в клетке млекопитающего с родственным вариабельным доменом легкой цепи человека, полученным от той же мыши (например, последовательностью, полученной из той же В-клетки, что и последовательность вариабельного домена человека); согласно одному варианту осуществления последовательность, кодирующая вариабельный домен легкой цепи человека, полученную от мыши, затем сливают с последовательностью, кодирующей константную последовательность легкой цепи человека, и последовательность легкой цепи и последовательность тяжелой цепи экспрессируют в клетке млекопитающих.
Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает описанных в настоящем документе людей.
Согласно одному аспекту предусматривается способ для получения вариабельного домена тяжелой цепи антитела, которое связывается с представляющим интерес антигеном, предусматривающий экспрессию в единственной клетке (а) первой последовательности VH иммунизированного описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, причем первая последовательность VH слита с генной последовательностью CH; и (b) генной последовательности VL иммунизированного описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, причем генная последовательность VL слита с генной последовательностью CL человека; поддержание клетки в условиях, достаточных для экспрессии антитела; и выделение вариабельного домена тяжелой цепи антитела. Согласно одному варианту осуществления генная последовательность VL представляет собой родственную последовательность первой последовательности VH.
Согласно одному варианту осуществления клетка содержит вторую генную последовательность VH иммунизированного описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, причем вторая генная последовательность VH слита с генной последовательностью CH, причем первая генная последовательность VH кодирует домен VH, который специфически связывается с первым эпитопом, и вторая генная последовательность VH кодирует домен VH, который специфически связывается со вторым эпитопом, причем первый эпитоп и второй эпитоп не идентичны.
Согласно одному варианту осуществления все последовательности константной области представляют собой последовательности константной области человека. Согласно одному варианту осуществления представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает описанных в настоящем документе людей.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения биспецифического антитела человека, предусматривающий получение биспецифического антитела с использованием генных последовательностей вариабельной области человека из В-клеток описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает (а) идентификацию клонально выбранного лимфоцита не относящегося к человеку животного, причем не относящееся к человеку животное подвергли воздействию представляющим интерес антигеном и позволили развить иммунный ответ на представляющий интерес антиген, и причем лимфоцит экспрессирует антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном, (b) получение из лимфоцита или антитела нуклеотидной последовательности, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи человека, которая специфически связывается с представляющим интерес антигеном, и (с) использование нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи человека, которая специфически связывается с представляющим интерес антигеном, в создании биспецифического антитела. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 или VH1-69.
Согласно одному варианту осуществления стадии от (а) до (с) выполняют в первый раз для первого представляющего интерес антигена для получения первой последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, и стадии от (а) до (с) выполняют второй раз для второго представляющего интерес антигена для получения второй последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, и причем первую последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека экспрессируют слитой с первой константной областью тяжелой цепи человека с образованием первой тяжелой цепи человека, вторую последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека экспрессируют слитой с константной областью тяжелой цепи человека с образованием второй тяжелой цепи человека, причем первая и вторая тяжелые цепи человека экспрессируют в присутствии единственной легкой цепи человека, экспрессированной из реаранжированного генного сегмента Vκ1-39 или Vκ3-20 человека. Согласно конкретному варианту осуществления единственная легкая цепь человека содержит последовательность зародышевой линии.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает (а) клонирование вариабельных областей тяжелой цепи из В-клеток описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного, на которое воздействовали первым представляющим интерес антигеном, и того же животного или другого не относящегося к человеку животного, которое является генетически таким же и на которое воздействовали вторым представляющим интерес антигеном; и (b) экспрессирование в клетке вариабельных областей тяжелой цепи (а) с той же константной областью тяжелой цепи и той же легкой цепью для получения биспецифического антитела.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения клетки, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи человека содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения вариабельного домена антитела человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 и VH1-69.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения антитела человека, предусматривающее получение антитела с использованием генной последовательности вариабельной области человека из В-клеток описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления антитело человека представляет собой биспецифическое антитело человека. Согласно конкретному варианту осуществления биспецифическое антитело содержит один вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из реаранжированного генного сегмента VH1-2 или VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генные последовательности вариабельной области человека содержат реаранжированный генный сегмент VH1-2 или VH1-69 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается использования описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для выбора вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2 или VH1-69.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для производства лекарственного средства (например, антигенсвязывающего белка) или для продукции последовательности, кодирующей вариабельную последовательность лекарственного средства (например, антигенсвязывающего белка), для лечения заболевания или нарушения человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность лекарственного средства содержит полиморфный генный сегмент VH человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность лекарственного средства содержит генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность лекарственного средства содержит генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующий вариабельный домен иммуноглобулина, полученный у описанной в настоящем документе мыши. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH человека, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23. Согласно другому конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека.
Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи κ, который родственен вариабельному домену тяжелой цепи человека, который содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи κ, который родственен вариабельному домену тяжелой цепи человека, который содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующего вариабельный домен иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи κ, который содержит реаранжированный генный сегмент Vκ человека, выбранный из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3- 15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 и Vκ2-40.
Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается использование описанной в настоящем документе мыши для получения вариабельного домена иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи κ, который содержит реаранжированный генный сегмент Vκ человека, выбранный из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39 и Vκ2-40.
Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH, выбранный из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи человека характеризуется наличием последовательностей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 человека, полученных из полиморфного генного сегмента VH человека. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент VH человека выбирают из генного сегмента VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH человека, способ, предусматривающий иммунизацию описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, позволяя не относящемуся к человеку животному развивать иммунный ответ на представляющий интерес антиген, и получение из него последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH человека, который связывается с представляющим интерес антигеном. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает получение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VL человека, который родственен домену VH человека, предусматривающий выделение В-клетки, кодирующей домен VH человека и домен VL человека, и получение из него последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи. Согласно различным вариантам осуществления домен VH человека получают от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека. Согласно различным вариантам осуществления домен VL человека выбирают из домена Vκ или Vλ. человека.
Согласно одному аспекту предусматривается применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения терапевтического средства для людей, предусматривающее иммунизацию не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развивать иммунный ответ, и получение из животного последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина, который связывается с представляющим интерес антигеном, а также применение вариабельного домена иммуноглобулина в терапевтическом средстве для людей. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи получают от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен легкой цепи получают из реаранжированного генного сегмента Vκ или Vλ. человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения терапевтического средства для людей, предусматривающий иммунизацию описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, предоставление не относящемуся к человеку животному возможности развивать иммунный ответ, и получение из животного последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина, который связывается с представляющим интерес антигеном, а также применение вариабельного домена иммуноглобулина в терапевтическом средстве для людей. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен тяжелой цепи получают от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен легкой цепи получают из реаранжированного генного сегмента Vκ или VA. человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения антигенсвязывающего белка человека, предусматривающий иммунизацию описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, позволяя не относящемуся к человеку животному развивать иммунный ответ, получение из мыши последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с представляющим интерес антигеном, клонирование последовательности нуклеиновой кислоты в вектор, подходящий для экспрессии нуклеиновой кислоты, причем последовательность нуклеиновой кислоты клонируют в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область иммуноглобулина человека или ее функциональный фрагмент, и внедрение вектора в клетку млекопитающего, и поддержание клетки в условиях, подходящих для экспрессии антигенсвязывающего белка, который содержит вариабельный домен иммуноглобулина и константную область иммуноглобулина или его функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой антитело человека. Согласно конкретному варианту осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, полученные от описанной в настоящем документе мыши. Согласно конкретному варианту осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, полученный от описанной в настоящем документе мыши. Согласно различным вариантам осуществления вариабельный домен тяжелой цепи происходит от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антигенсвязывающий домен человека, полученный от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты кодирует домен VH иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты кодирует домен VH иммуноглобулина человека и родственный домен VL человека. Согласно различным вариантам осуществления домен VH человека происходит от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения антитела человека, предусматривающий иммунизацию описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, позволяя не относящемуся к человеку животному развивать иммунный ответ, сбор лимфоцита (например, В-клетки) из иммунизированного животного, слияние лимфоцита с клеткой миеломы с образованием клетки гибридомы, получение из клетки гибридомы последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует домен VH человека и домен VL человека, клонирование последовательности нуклеиновой кислоты в рамке считывания (т.е. в функциональной связи) с последовательностью константной области человека для создания тяжелой цепи иммуноглобулина и легкой цепи иммуноглобулина, и экспрессию тяжелой и легкой цепей в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой клетку СНО. Согласно различным вариантам осуществления VH домен человека происходит от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения антитела человека, предусматривающий иммунизацию описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, позволяя не относящемуся к человеку животному развивать иммунный ответ, сбор лимфоцита (например, В-клетки) из иммунизированного животного, получение из лимфоцита последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует домен VH человека и домен VL человека, клонирование последовательности нуклеиновой кислоты в рамке считывания (т.е. в функциональной связи) с последовательностью константной области человека для создания тяжелой цепи иммуноглобулина и легкой цепи иммуноглобулина, и экспрессия тяжелой и легкой цепей в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой клетку СНО. Согласно различным вариантам осуществления VH домен человека происходит от реаранжированного генного сегмента VH1-69 или VH1-2 человека.
Согласно различным аспектам представляющий интерес антиген представляет собой патоген, который поражает описанных в настоящем документе людей. Согласно различным аспектам представляющий интерес антиген представляет собой вирус, который способен инфицировать человека. Иллюстративные антигены, которые могут быть использованы в описанных в настоящем документе способах и применениях включают микробы или микроорганизмы, такие как вирус, бактерия, прион или грибок или любой другой патоген, вызывающий заболевание у людей. Специалисту в настоящей области техники после прочтения раскрытия будут понятны те патогены человека, которые будут применимы для описанных в настоящем документе способов и применений. Различные аспекты и варианты осуществлений могут быть использованы совместно, если специально не указано иное или контекст ясно запрещает совместное использование.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано общее изображение, без соблюдения масштаба, серии стадий нацеливания и молекулярного конструирования, используемые для создания нацеливающего вектора для конструкции модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH1-69 человека, двадцать семь генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.
На фиг. 2 показано общее изображение, без соблюдения масштаба, серии стадий нацеливания и молекулярного конструирования, используемые для создания нацеливающего вектора для конструкции модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего единственный генный сегмент VH1-2 человека, двадцать семь генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.
На фиг. 3 показаны контурные графики спленоцитов, гейтированных по отдельным лимфоцитам и окрашенных на наличие CD 19 (В-клетка) и CD3 (Т-клетка), от мыши дикого типа (WT) и мыши, гомозиготной по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 4А слева показан процент CD19+В-клеток в селезенках, собранных от мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО). Справа показано количество CD19+ В-клеток на селезенку как для мышей дикого типа (WT), так и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 4В слева показан процент CD19+ В-клеток в костном мозге, собранном из бедренных костей мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО). Справа показано количество CD19+ В-клеток на бедренную кость как для мышей дикого типа (WT), так и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 5 показаны контурные графики спленоцитов, гейтированных по CD19+ В-клеткам и окрашенных на экспрессию Igλ+ и Igκ+, от мыши дикого типа (WT) и мыши, гомозиготной по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 6 показаны контурные графики спленоцитов, гейтированных по CD19+ В-клеткам и окрашенных на наличие иммуноглобулина D (IgD) и иммуноглобулина М (IgM), от мыши дикого типа (WT) и мыши, гомозиготной по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 7 показано общее количество промежуточных В-клеток (CD19+IgMhiIgDint), зрелых В-клеток (CD19+IgMintIgDhi) и соотношение количества зрелых и незрелых В-клеток в собранных селезенках от мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 8 показаны контурные графики клеток костного мозга, гейтированных по синглетам, окрашенным на наличие иммуноглобулина М (IgM) и В220, от мыши дикого типа (WT) и мыши, гомозиготной по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 9 показано общее количество незрелых (B220intIgM+) и зрелых В-клеток (B220hiIgM+) в костном мозге, выделенном из бедренной кости мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 10 показаны контурные графики клеток костного мозга, гейтированных по CD19+ В-клеткам и окрашенных на наличие ckit+ и CD43+, от мыши дикого типа (WT) и мыши, гомозиготной по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 11А показан процент CD19+ В-клеток в популяциях про-В-клеток (CD19+CD43+ckit+) и пре-В-клеток (CD19+CD43-ckit-) из костного мозга, собранного из бедренных костей мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 11В показано абсолютное количество клеток на бедренную кость в популяциях про-В-клеток (CD19+CD43+ckit+) и пре-В-клеток (CD19+CD43-ckit-) из костного мозга, собранного из мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО).
На фиг. 12 показана относительная экспрессия мРНК (у-ось) VH1-69, полученных из тяжелых цепей очищенных В-клеток селезенки с помощью количественного ПЦР анализа с использованием зонда, специфичного к генному сегменту VH1-69 человека у мышей, гомозиготных по замещению эндогенных VH, DH, JH тяжелой цепи, а также по замещению эндогенных генных сегментов Vκ и Jκ легкой цепи генными сегментами VH, DH, JH, Vκ и Jκ человека (Нκ), мышей дикого типа (WT), мышей гетерозиготных по единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НЕТ) и мышей, гомозиготных единственному генному сегменту VH человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VH НО). Сигналы нормируются по отношению к экспрессии мыши Сκ.
На фиг. 13 показано выравнивание нуклеотидов второго экзона для каждого из тринадцати представленных аллелей для гена VH1-69 человека. Основания строчными буквами обозначают различия нуклеотидов зародышевой линии среди аллелей.
Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-69*01 (SEQ ID NO:34); VH1-69*02 (SEQ ID NO:36); VH1-69*03 (SEQ ID NO:38); VH1-69*04 (SEQ ID NO:40); VH1-69*05 (SEQ ID NO:42); VH1-69*06 (SEQ ID NO:44); VH1-69*07 (SEQ ID NO:46); VH1-69*08 (SEQ ID NO:48); VH1-69*09 (SEQ ID NO:50); VH1-69*10 (SEQ ID NO:52); VH1-69*11 (SEQ ID NO:54); VH1-69*12 (SEQ ID NO:56); VH1-69*13 (SEQ ID NO:58).
На фиг. 14 показано выравнивание белка в зрелой последовательности вариабельного гена тяжелой цепи для каждого из тринадцати представленных аллелей для гена VH1-69 человека. Аминокислоты строчными буквами обозначают различия зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-69*01 (SEQ ID NO:35); VH1-69*02 (SEQ ID NO:37); VH1-69*03 (SEQ ID NO:39); VH1-69*04 (SEQ ID NO:41); VH1-69*05 (SEQ ID NO:43); VH1-69*06 (SEQ ID NO:45); VH1-69*07 (SEQ ID NO:47); VH1-69*08 (SEQ ID NO:49); VH1-69*09 (SEQ ID NO:51); VH1-69*10 (SEQ ID NO:53); VH1-69*11 (SEQ ID NO:55); VH1-69*12 (SEQ ID NO:57); VH1-69*13 (SEQ ID NO:59).
На фиг. 15 показан процент идентичности/процент сходства матрицы для выровненных белковых последовательностей зрелого вариабельного гена для каждого из тринадцати представленных аллелей для гена VH1-69 человека. Процент идентичности среди аллелей VH1-69 указан над затемненными прямоугольниками, и процент сходства указан под затемненными прямоугольниками. Значения процента идентичности и процента сходства определяли с помощью инструмента выравнивания ClustalW (v1.83), используя программное обеспечение Mac Vector (Mac Vector, Inc, Северная Каролина).
На фиг. 16 показано выравнивание нуклеотидов второго экзона для каждого из пяти представленных аллелей гена для гена VH1-2 человека. Основания строчными буквами обозначают различия нуклеотидов зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-2*01 (SEQ ID NO:60); VH1-2*02 (SEQ ID NO:62); VH1-2*03 (SEQ ID NO:64); VH1-2*04 (SEQ ID NO:66); VH1-2*05 (SEQ ID NO:68)
На фиг. 17 показано выравнивание белка в зрелой последовательности вариабельного гена тяжелой цепи для каждого из пяти представленных аллелей для гена VH1-2 человека. Аминокислоты строчными буквами обозначают различия зародышевой линии среди аллелей. Определяющие комплементарность области (CDR) обозначены прямоугольниками вокруг последовательности. Тире обозначают искусственные пробелы для правильного выравнивания последовательностей. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 61); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 63); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 65); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 67); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 69).
На фиг. 18 показан процент идентичности/процент сходства матрицы для выровненных белковых последовательностей зрелого вариабельного гена для каждого из пяти представленных аллелей для гена VH1-2 человека. Процент идентичности среди аллелей VH1-2 указан над затемненными прямоугольниками, и процент сходства указан под затемненными прямоугольниками. Значения процента идентичности и процента сходства определяли по инструменту выравнивания ClustalW (v1.83), используя программное обеспечение Mac Vector (Mac Vector, Inc, Северная Каролина).
На фиг. 19 показан титр антител от мышей, гомозиготных по локусам вариабельных генов тяжелой и легкой цепи κ человека (Нκ, n=4), и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH1-69 человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VHHO; n=10), которые были иммунизированы рецептором клеточной поверхности человека (антиген А).
На фиг. 20 показан титр антител от мышей, гомозиготных по локусам вариабельных генов тяжелой и легкой цепи κ человека (Нκ, n=5), и мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH1-69 человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (1 г VHHO; n=5), которые были иммунизированы двумя различными вакцинами против гриппа.
На фиг. 21 показан процент (у-ось) примированных IgM тяжелых цепей, характеризующихся заданной аминокислотной длиной для области VH CDR3 (х-ось), от мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH1-69 человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина и гомозиготных по замещению эндогенных вариабельных локусов легкой цепи κ вариабельными локусами легкой цепи κ человека, которые были иммунизированны рецептором клеточной поверхности человека (антиген А).
На фиг. 22 показан процент (у-ось) примированных IgG тяжелых цепей, характеризующихся заданной аминокислотной длиной для области VH CDR3 (х-ось), от мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH1-69 человека, двадцати семи генным сегментам DH человека и шести генным сегментам JH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина и гомозиготных по замещению эндогенных вариабельных локусов легкой цепи κ вариабельными локусами легкой цепи κ человека, которые были иммунизированны рецептором клеточной поверхности человека (антиген А).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьироваться. Кроме того, следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предусматривается для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.
Если не указано иное, все используемые в настоящем документе термины и фразы, включают в себя те значения, которые термины и фразы имеют в настоящей области техники, если иное прямо не указано или явно не следует из контекста, в котором используется термин или фраза. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения, теперь будут описаны конкретные способы и материалы. Все упомянутые публикации включены в настоящий документ посредством ссылки.
Фраза "существенный" или "по существу" при использовании для обозначения количества генных сегментов (например, "по существу все" генные сегменты V) включает в себя как функциональные, так и не функциональные генные сегменты и включает в себя, согласно различным вариантам осуществления, например, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более всех генных сегментов; согласно различным вариантам осуществления "по существу все" генные сегменты включают в себя, например, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% функциональных (т.е. не псевдогенов) генных сегментов.
[0001] Термин "замещение" включает в себя помещение последовательности ДНК в геном клетки таким образом, чтобы заменить последовательность в геноме гетерологичной последовательностью (например, последовательность человека у мыши) в локусе геномной последовательности. Помещенная таким образом последовательность ДНК может включать в себя один или несколько регуляторных последовательностей, которые представляют собой часть исходной ДНК, используемой для получения помещенной таким образом последовательности (например, промоторы, энхансеры, 5'- или 3'-нетранслируемые области, соответствующие последовательности сигналов рекомбинации и т.п.). Например, согласно различным вариантам осуществления замещение представляет собой замену эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, что приводит к производству генного продукта из таким образом помещенной последовательности ДНК (содержащей гетерологичную последовательность), но не экспрессии эндогенной последовательности; замещение эндогенной геномной последовательности последовательностью ДНК, которая кодирует белок, который характеризуется аналогичной функцией, что и белок, кодируемый эндогенной геномной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует ген иммуноглобулина или домен, и фрагмент ДНК кодирует один или несколько генов иммуноглобулина человека или доменов). Согласно различным вариантам осуществления эндогенный ген или его фрагмент заменяют соответствующим человеческим геном или его фрагментом. Соответствующий человеческий ген или его фрагмент представляет собой человеческий ген или фрагмент, который представляет собой ортолог, гомолог или по существу идентичный или такой же по структуре и/или функции, как эндогенный ген или его фрагмент, который заменен.
Было выполнено точное замещение in situ шести миллионов пар оснований вариабельных областей мышиных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина (VH-DH-JH) ограниченным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина человека при сохранении окружающих последовательностей мыши интактными и функциональными в гибридных локусах, включая все гены константной цепи мыши и регионы транскрипционного контроля локуса (фиг. 1 и фиг. 2). В частности, единственный генный сегмент VH, 27 генных сегментов DH и шесть генных сегментов JH человека были введены посредством химерных основанных на ВАС нацеливающих векторов в ES клетки мыши с использованием технологии генетической инженерии VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США №6586251 и Valenzuela, D.M., et al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659).
He относящиеся к человеку животные с ограниченными генными сегментами VH иммуноглобулина
Предусматриваются не относящиеся к человеку животные, содержащие локусы иммуноглобулина, которые содержат ограниченное количество генов VH и один или несколько генов D, и один или несколько генов J, а также способы их получения и использования. После иммунизации представляющим интерес антигеном не относящиеся к человеку животные генерируют популяции В-клеток с вариабельными областями антител, полученными только от ограниченного, заранее выбранного гена VH или набора генов VH (например, заранее выбранный ген VH и его варианты). Согласно различным вариантам осуществления предусматриваются не относящиеся к человеку животные, которые генерируют популяции В-клеток, которые экспрессируют вариабельные домены человеческих антител, которые представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи человека, вместе с родственными вариабельными доменами легкой цепи человека. Согласно различным вариантам осуществления не относящиеся к человеку животные реаранжируют вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека и вариабельные генные сегменты легкой цепи человека из модифицированных эндогенных локусов иммуноглобулина мыши, которые включают замещение или вставку нереаранжированных не относящихся к человеку последовательностей вариабельной области переаранжированными последовательностей вариабельной области человека.
Ранняя работа по организации, структуре и функции генов иммуноглобулина была проведена частично на мышах с недееспособными эндогенными локусами и сконструированными для получения трансгенных локусов (помещенных в случайном порядке) с частичными генами иммуноглобулина человека, например, частичный репертуар генов тяжелой цепи человека, связанный с константным геном человека, случайным образом вставленным в геном в присутствии или в отсутствие трансгена легкой цепи человека. Хотя этих мышей было несколько меньше, чем оптимально для получения применимых высокоаффинных антител, они способствовали определенным функциональным анализам локусов иммуноглобулина. Некоторые из этих мышей содержали всего лишь два или три, или даже всего лишь единственный вариабельный ген тяжелой цепи.
Сообщалось о мышах, которые экспрессируют полностью человеческие тяжелые цепи иммуноглобулина, полученные из единственного гена VH5-51 человека и 10 генов DH человека, и шести генов JH человека, с константными генами μ и γ1 человека, на случайно вставленном трансгене (и недееспособных эндогенных локусах иммуноглобулина) (Xu and Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37-45). Полностью человеческие тяжелые цепи иммуноглобулина этих мышей в основном экспрессируются с одной из всего двух полностью мышиных легких цепей X, полученных из эндогенного локуса легкой цепи X мыши (только Vλ1-Jλ1 или Vλ2-Jλ2), и не могут экспрессировать легкую цепь κ (мыши представляют собой Igκ-/-). Эти мыши проявляют строго ненормальную дисфункцию в развитии В-клеток и экспрессии антител. Количество В-клеток, как сообщается, составляет 5-10% от дикого типа, содержание IgM 5-10% от дикого типа и содержание IgG1 только 0,1-1% от дикого типа. Наблюдаемый репертуар IgM выявил крайне ограниченную множественность J-сегментов. Полностью человеческие тяжелые цепи отображают в основном одинаковую длину CDR3 по антигенам, одну и ту же частоту использования JH (JH2) в антигенах и начальный остаток Q множественности сегментов J, таким образом отражая определенную нехватку разнообразия CDR3. Почти у всех полностью мышиных легких цепей λ были замены W96L в Jλ1 в качестве начального остатка множественности сегментов J. Как сообщается, мыши не в состоянии продуцировать любые антитела против бактериального полисахарида. Поскольку вариабельные домены человека образуют пару с легкими цепями мыши, применимость вариабельных областей человека сильно ограничена.
Сообщалось о других мышах, у которых есть только единственный ген VH3-23 человека, гены DH и JH человека и гены легкой цепи мыши, но они проявляют ограниченное разнообразие (и, следовательно, ограниченную применимость) отчасти из-за потенциала ошибочного спаривания между доменами VH человека и VL мыши (смотрите, например, Mageed et al, 2001, Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Clin. Exp. Immunol. 123: 1-5). Аналогичным образом, мыши, которые несут два гена VH (3-23 и 6-1) вместе с генами DH и JH человека в трансгене, содержащем константный ген μ человека (Bruggemann et al, 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326), и экспрессируют их в цепи IgM человека с легкими цепями мыши, могут проявлять репертуар, ограниченный ошибочным спариванием (Mackworth-Young et al, 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420-425).
Также сообщалось о других трансгенных мышах, которые экспрессируют ограниченные VH полностью человеческие тяжелые цепи с трансгена человека, случайным образом вставленном в геном, с ограниченным репертуаром λ человека, экспрессированным с полностью человеческого случайным образом вставленного трансгена (смотрите, например, Taylor et al, 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res. 20(23):6287-6295; Wagner et al, 1994, Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8): 1389-1393). Тем не менее, трансгенные мыши, которые экспрессируют полностью человеческие антитела из случайным образом интегрированных в геном мыши трансгенов, и которые содержат поврежденные эндогенные локусы, как известно, проявляют существенные различия в иммунном ответе, по сравнению с мышами дикого типа, которые влияют на разнообразие вариабельных доменов антитела, получаемого из таких мышей.
Применимые не относящиеся к человеку животные, которые продуцируют разнообразную популяцию В-клеток, которые экспрессируют вариабельные домены антитела человека от ограниченного репертуара генов VH и одного или нескольких генов D и одного или нескольких генов J, будут способны продуцировать, предпочтительно согласно некоторым вариантам осуществления репертуары реаранжированных генов вариабельной области, которые будут достаточно разнообразны. Согласно различным вариантам осуществления разнообразие включает в себя разнообразие множественности сегментов J, соматическую гипермутацию и полиморфное разнообразие в последовательности гена VH (для вариантов осуществления, где гены VH присутствуют в полиморфных формах). Комбинаторное разнообразие происходит в спаривании гена VH с одним из множества родственных вариабельных доменов легкой цепи человека (которые, согласно различным вариантам осуществления, содержат разнообразие множественности J-сегментов и/или соматические гипермутации).
Не относящиеся к человеку животные, содержащие ограниченный репертуар генов VH человека и полный или по существу полный репертуар генов VL человека, будут согласно различным вариантам осуществления продуцировать популяции В-клеток, которые отражают различные источники разнообразия, такие как разнообразие множественности сегментов J (например, соединение VDJ, VJ, присоединения Р, присоединения N), комбинаторное разнообразие (например, родственный ограниченный VH тяжелой цепи человека, легкой цепи человека) и соматические гипермутации. Согласно вариантам осуществления, включающим ограничение репертуара VH до одного гена VH человека, один ген VH человека может присутствовать в двух или более вариантах. Согласно различным вариантам осуществления присутствие двух или более полиморфных форм гена VH будет обогащать разнообразие вариабельных доменов популяции В-клеток.
Изменчивости в последовательностях зародышевой линии генных сегментов (например, генов V) вносят вклад в разнообразие ответа антител у людей. Относительный вклад в разнообразие благодаря различиям последовательности гена V изменяется среди генов V. Степень полиморфизма варьирует в семействе генов и отражается во множестве гаплотипов (участки последовательности с унаследованными полиморфизмами), способных производить дополнительное разнообразие, как это наблюдается в различиях гаплотипов VH между связанными и несвязанными индивидуумами в человеческой популяции (смотрите, например, Souroujon et al, 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VHIII Gene Family, J. Immunol. 143(2): 706-711). Основываясь на данных от определенных полиморфных семейств генов VH человека, некоторые предположили, что разнообразие гаплотипов в зародышевой линии вносит основной вклад в неоднородность генов VH в человеческой популяции, что отражается в большом разнообразии различных генов VH зародышевой линии в человеческой популяции (смотрите, Sasso et al, 1990, Prevalence and Polymorphism of Human VH3 Genes, J. Immunol. 145(8): 2751-2757).
Хотя человеческая популяция отображает большое разнообразие гаплотипов по отношению к репертуару генов VH благодаря широко распространенному полиморфизму, определенные полиморфизмы отражаются в преобладающих (т.е. консервативных) аллелях, наблюдаемых в человеческой популяции (Sasso et al, 1990). Полиморфизм VH может быть описан в двух основных формах. Первая представляет собой вариацию, вытекающую из вариации аллелей, связанной с различиями в нуклеотидной последовательности между аллелями одного и того же генного сегмента. Вторая вытекает из многочисленных дубликатов, вставок и/или удалений, которые произошли в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина. Это привело к уникальной ситуации, в которой гены VH, полученные путем дублирования из идентичных генов, отличаются от их соответствующих аллелей одной или несколькими нуклеотидными заменами. Это также напрямую влияет на количество копий генов VH в локусе тяжелой цепи.
Полиморфные аллели вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека (гены VH) в значительной степени были результатом вставки/удаления генных сегментов и единственных нуклеотидньгх различий в кодирующих областях, оба из которых характеризуются потенциалом иметь функциональные последствия на молекулу иммуноглобулина. В таблице 1 представлены функциональные гены VH, перечисленные по семейству генов VH человека и количеству идентифицированных аллелей для каждого гена VH в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Есть некоторые данные для предположения, что полиморфные гены VH были вовлечены в чувствительность к таким определенным заболеваниям, как, например, ревматоидный артрит, в то время как в других случаях связь между VH и заболеванием была менее ясна. Эта неоднозначность была приписана числу копий и присутствию различных аллелей в различных популяциях человека. На самом деле, несколько генов VH человека демонстрируют вариации числа копий (например, VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23). Согласно различным вариантам осуществления описанные в настоящем документе гуманизированные мыши с ограниченными репертуарами VH содержат множественные полиморфные варианты отдельного представителя семейства VH (например, два или более полиморфных вариантов VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23, заместив все или по существу все функциональные сегменты VH мыши в эндогенном локусе мыши). Согласно конкретному варианту осуществления два или более полиморфных варианта описанных в настоящем документе мышей находятся в количестве вплоть до и включая в себя число, указанное для соответствующего представителя семейства VH в таблице 1 (например, для VH1-69, 13 вариантов; для VH1-2, пять вариантов; и т.д.).
Обычно наблюдаемые варианты определенных генов VH человека известны в настоящей области техники. Например, один из наиболее сложных полиморфизмов в локусе VH принадлежит гену VH1-69. Ген VH1-69 человека содержит 13 известных аллелей (Sasso et ah, 1993, A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alleles, Journal of Clinical Investigation 91: 2358-2367; Sasso et al, 1996, Expression of the immunoglobulin VH gene 51pl is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9): 2074-2080) и существует по меньшей мере в трех гаплотипах, которые несут дубликаты гена VH1-69, что приводит к множественным копиям гена VH в данном локусе. Эти полиморфные аллели включают в себя различия в определяющих комплементарность областях (CDR), которые могут существенно влиять на антигенную специфичность. В таблице 2 представлены известные аллели для VH1-69 человека и SEQ ID NO для последовательностей ДНК и белка зрелых вариабельных областей тяжелой цепи. В таблице 3 представлены известные аллели для VH1-2 человека и SEQ ID NO для последовательностей ДНК и белка зрелых вариабельных областей тяжелой цепи.
Репрезентативные последовательности геномной ДНК и полномерного белка гена VH1-69 представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно. На фиг. 13 и фиг. 14 представлены выравнивания тринадцати известных VH1-69 аллелей ДНК и белка, соответственно. Репрезентативные последовательности ДНК и белка гена VH1-2 представлены в SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:61, соответственно. На фиг. 16 и фиг. 17 представлены выравнивания пяти известных VH1-2 аллелей, соответственно. На фиг. 16 и фиг. 17 представлен процент идентичности/сходства матрицы для выравнивания белковых последовательностей, соответствующих тринадцати известным VH1-69 аллелям и пяти известным VH1-2 аллелям человека, соответственно. Согласно различным вариантам осуществления модифицированный локус настоящего изобретения содержит ген VH, выбранный из таблицы 1, присутствующий в двух или более числе копий, причем число копий включает в себя число аллелей, включительно, представленные в таблице 1. Согласно одному варианту осуществлений модифицированный локус настоящего изобретения содержит ген VH1-69, выбранный из таблицы 2, присутствующий в двух или более числе копий, причем число копий включает в себя число аллелей, включительно, представленные в таблице 1. Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус изобретения содержит ген VH1-2, выбранный из таблицы 3, присутствующий в двух или более числе копий, причем число копий включает в себя число аллелей, включительно, представленные в таблице 1.
Хотя широко обсуждается варианты осуществления, использующие ограниченный репертуар VH человека в мыши, также предусматриваются другие не относящиеся к человеку животные, которые экспрессируют ограниченный репертуар VH человека. Такие не относящиеся к человеку животные включают в себя любые из тех, которые могут быть генетически модифицированы, чтобы экспрессировать описанный в настоящем документе ограниченный репертуар VH человека, включая в себя, например, мышь, крысу, кролика, свинью, корову (например, корову, быка, буйволу), оленя, овцу, козу, курицу, кошку, собаку, хорька, примата (например, мармазетку, макака-резуса) и т.п. Например, для тех не относящихся к человеку животных, для которых подходящие генетически модифицируемые ES клетки не легкодоступны, используют и другие способы для получения не относящегося к человеку животного, содержащего генетическую модификацию. Такие способы включают в себя, например, модификацию генома не ES клетки (например, фибробластов или индуцированных плюрипотентных клеток) и использования ядерной передачи для передачи модифицированного генома подходящей клетке, например, яйцеклетке, и постепенное формирование модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) у не относящегося к человеку животного при подходящих условиях с образованием эмбриона. Способы модификации генома не относящегося к человеку животного (например, генома свиньи, коровы, грызуны, курицы, и т.п.) включают в себя, например, использование цинк-пальцевой нуклеазы (ZFN) или эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN) для изменения генома для включения ограниченного репертуара VH человека. Таким образом, согласно одному варианту осуществления предусматривается способ для редактирования генома не относящегося к человеку животного для включения в него ограниченного репертуара VH человека, содержащего стадию редактирования генома, используя ZFN или TALEN для включения в себя не более одного или не более двух генных сегментов VH человека (или их полиморфных вариантов), причем не более одного или не более двух генных сегментов VH человека функционально связаны с последовательностью константного гена иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления последовательность константного гена выбирают из константной последовательности тяжелой цепи человека и не относящейся к человеку константной последовательности тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления константная последовательность представляет собой не относящуюся к человеку, и не более одного или не более двух генных сегментов VH человека функционально связаны с не относящейся к человеку последовательностью константного гена в эндогенном локусе иммуноглобулина человека.
Согласно одному аспекту не относящееся к человеку животное представляет собой небольшое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из надсемейства мышиных. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой животное из семейства, выбранного из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомячок, крысы и мыши Нового Света, полевки), Muridae (истинные мыши и крысы, песчанки, колючие мыши, хохлатые крысы), Nesomyidae (рипидомисы, скальные крысы, белохвостые крысы, Малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, кроты, бамбуковые крысы и цокоры). Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированных грызунов выбирают из истинной мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, колючей мыши и косматого хомяка. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой представителя семейства Muridae.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна, который представляет собой мышь линии C57BL. Согласно одному варианту осуществления линию C57BL выбирают из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6N, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/01a. Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой мышь линии 129. Согласно одному варианту осуществления линию 129 выбирают из группы, состоящей из 129Р1, 129Р2, 129РЗ, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S6, 129S9/SvEvH (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (смотрите, например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, смотрите также Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6- Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой сочетание вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL (например, линии C57BL/6). Согласно другому варианту осуществления, мышь представляет собой сочетание вышеуказанных линий 129 или сочетание вышеуказанных линий C57BL/6. Согласно одному варианту осуществления линия 129 сочетания представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой сочетание из линии, полученной от 129/SvEv и C57BL/6. Согласно конкретному варианту осуществления мышь представляет собой сочетание из линии, полученной от 129/SvEv hC57BL/6, как описано в Auerbach et al. 2000 BioTechniques 29:1024-1032. Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой сочетание линии BALB, например, линия BALB/C. Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой сочетание линии BALB (например, линия BALB/C) и вышеуказанной линии.
Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой крысу. Согласно одному варианту осуществления крысу выбирают из крысы линии Wistar, линии LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. Согласно одному варианту осуществления линия крысы представляет собой сочетание двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из Wistar, Lea, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.
Антиген-зависимое использование гена Vн
Антиген-зависимое преимущественное использование генов VH может быть использовано в разработке терапевтических средств для людей, направленных на клинически значимые антигены. Способность продуцировать репертуар вариабельных доменов антител с использованием конкретного гена VH может обеспечить значительное преимущество в поиске высокоаффинных вариабельных доменов антител для использования в терапевтических средствах для людей. Исследования, касающиеся частоты использования гена VH наивной мыши и человека в вариабельных доменах антител показывают, что большинство вариабельных доменов тяжелой цепи не происходят от любого определенного единственного или преимущественно используемого гена VH. С другой стороны, исследования ответа антител на определенные антигены показывают, что в некоторых случаях определенный ответ антитела отображает смещенное использование определенного гена VH в репертуаре В-клеток после иммунизации.
Хотя репертуар VH человека довольно разнообразен, по некоторым оценкам ожидаемая частота использования любого данного гена VH, предполагая случайный выбор генов VH, составляет приблизительно 2% (Brezinschek et al, 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral В Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunol. 155: 190-202). Но использование VH в периферических В-клетках у людей искажается. Согласно одному исследованию функциональное изобилие генов V соответствует схеме VH3>VH4>VH1>VH2>VH5>VH6 (Davidkova et al, 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J, Immunol. 45: 62-73). Одно из ранних исследований показало, что частота использования семейства VH3 была приблизительно 0,65, в то время как частота использования семейства VHI была приблизительно 0,15; эти и другие наблюдения показывают, что сложность зародышевой линии репертуара VH человека не точно отражена в компартменте периферической В- клетки у людей, имеющих нормальный репертуар VH зародышевой линии, ситуация, которая близка с наблюдаемой у мыши, т.е. экспрессия гена VH нестохастическая (Zouali and These, 1991, Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral В Cells by In Situ Hybridization, J. Immunol. 146(8):2855-2864). Согласно одному сообщению частота использования гена VH у людей, от наибольшей к наименьшей представляет собой VH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6; реаранжировки в периферических В-клетках, показывают, что частота использования семейства VH3 выше, чем можно ожидать, основываясь на относительном числе генов VH3 зародышевой линии (Brezinschek et al, 1995). Согласно другому сообщению частота использования VH у человека соответствует схеме VH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6, основанной на анализе периферийных небольших иммунокомпетентных В-клеток, активированных митогеном лаконоса (Davidkova et al, 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human В Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). В одном из докладов утверждается, что среди наиболее часто используемых представителей семейства VH3 находятся 3-23, 3-30 и 3-54 (Brezinschek et al, 1995). В семействе VH4 представитель 4-59 и 4-4b обнаруживались относительно более часто (там же), а также 4-39 и 4-34 (Brezinscheck et al, 1997, Analysis of the Human VH Gene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488-2501). Другие утверждают, что активированный репертуар тяжелой цепи искажен в пользу высокой экспрессии VH5 и более низкой экспрессии VH3 (Van Dijk-Hard and Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107:136-144). Другие исследования утверждают, что к наиболее часто используемым генам VH в репертуаре взрослого человека относится VH4-59, а затем VH3-23 и VH3-48 (Arnaout et al, 2001, High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE 6(8): 108). Хотя исследования частоты использования основаны на относительно небольшом количестве образцов, таким образом, проявляют высокую дисперсию, взятые вместе исследования показывают, что экспрессия V гена не представляет собой чисто стохастический процесс. В действительности, исследования с определенными антигенами установили, что в некоторых случаях результаты свидетельствуют четко против определенных частот использования и в пользу других.
Со временем стало очевидно, что наблюдаемый репертуар вариабельных доменов тяжелой цепи человека, созданных в ответ на определенные антигены, сильно ограничен. Некоторые антигены связаны почти исключительно с нейтрализующими антителами, содержащими только определенные конкретные гены VH, в том смысле, что эффективные нейтрализующие антитела получают, по сути, только из одного гена VH. Так обстоит дело в отношении ряда клинически важных патогенов человека.
Были обнаружены производные VH1-69 тяжелых цепей в различных репертуарах антигенспецифических антител терапевтического значения. Например, VH1-69 часто наблюдались в транскриптах тяжелых цепей репертуара IgE лимфоцитов периферической крови у детей раннего возраста с атопическим заболеванием (Bando et al, 2004, Characterization of VHs gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous VH1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99-106). Производные VH1-69 тяжелых цепей с высокой степенью соматической гипермутации также встречаются в В-клетках лимфомы (Perez et al, 2009, Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments, British Journal of Dermatology 162: 611-618), в то время как некоторые производные VH1-69 тяжелых цепей с существенными последовательностями зародышевой линии (т.е. практически без соматической гипермутации) были обнаружены среди аутоантител у пациентов с заболеваниями крови (Pos et al, 2008, VH1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7: 421-428).
Дополнительно, были найдены нейтрализующие антитела против таких вирусных антигенов, как ВИЧ, грипп и гепатит С (HCV), чтобы использовать последовательности, полученные из VH1-69 зародышевой линии и/или соматически мутированные (Miklos et al, 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of VL-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878-3884; Kunert et al, 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20(7): 755-762; Chan et al, 2001, VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis С virus-associated В cell lymphomas and by normal В cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4): 1023-1026; Carbonari et al, 2005, Hepatitis С virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory В cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174: 6532-6539; Wang and Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3): 233-234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3): 265-273; Marasca et al., 2001, Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis С Virus-Positive and Hepatitis С Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1):253-261).
Искажение частоты использования VH наблюдается также в гуморальном иммунном ответе на гемофильные инфекции типа В (Hib PS) у людей. Исследования показывают, что семейство VHIII (подсемейство VHIIIb, в частности, VH9.1) характеризует исключительно гуморальный ответ человека на Hib PS, с разнообразными генами D и J (Adderson et al., 1991, Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5): 1667-1674; Adderson et al, 1993, Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest. 91: 2734-2743). Гены JH человека также отображают искаженную частоту использования; JH4 и JH6 наблюдаются приблизительно в 38-41% в периферических В-клетках у людей (Brezinschek et al, 1995).
Как сообщалось, частота использование VH у ВИЧ-1-инфицированных людей искажена относительно использования VH3 и в пользу семейств генов VHI и VH4 (Wisnewski et al, 1996, Human Antibody Variable Region Gene Usage in HIV-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviology ll(l):31-38). Однако анализ кДНК костного мозга от инфицированных пациентов показал значительное использование VH3, не экспрессированных в функциональном репертуаре В-клеток, где Fab, отражающие использование VH3, проявляли эффективную нейтрализацию ВИЧ-1 in vitro (там же). Можно предположить, что гуморальный иммунный ответ на ВИЧ-1 инфекцию, возможно, ослабляется вследствие ограничения VH; описанные в настоящем документе не относящиеся к человеку модифицированные животные (не инфицированные ВИЧ-1), могут быть таким образом полезны для получения доменов нейтрализующих антител, полученных из определенных генов VH, присутствующих у описанных в настоящем документе генетически модифицированных животных, но полученных из разных генов VH, чем наблюдаемые в ограниченном репертуаре инфицированных людей.
Таким образом, способность продуцировать высокоаффинные вариабельные домены антител человека у ограниченных по VH мышей, например, (ограниченный, например, представителем семейства VH3 и его полиморфой (полиморфами)) иммунизированных ВИЧ-1, может предусматривать богатый источник для разработки эффективных терапевтических средств для людей, нейтрализующих ВИЧ-1, путем получения ограниченного (например, ограниченный представителем семейства VH3 и его полиморфы (полиморф)) репертуара такой иммунизированной мыши.
Ограничение ответа человеческого антитела на определенные патогены может снижать вероятность получения вариабельных областей антител от инфицированных людей, которые могут служить трамплинами для разработки высокоаффинных нейтрализующих антител против патогена. Например, иммунный ответ человека на инфекцию ВИЧ-1 клонально ограничен по всем инфекциям ВИЧ-1 и в развитии СПИДа (Muller et al, 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol 38: 327-334; Wisnewski et al, 1996). Дополнительно, гены VH вообще не присутствуют во всех полиморфных формах у любого определенного индивидуума; определенные индивидуумы в определенных популяциях обладают одним вариантом, в то время как индивидуумы в других популяциях обладают другим вариантом. Таким образом, наличие биологической системы, которая ограничена одним геном VH и его вариантами будет согласно различным вариантам осуществления предусматривать до сих пор неиспользованный источник разнообразия для продукции вариабельных областей антител (например, тяжелые и легкие родственные домены человека) на основе ограниченного гена VH. Таким образом, согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, которое содержит множество полиморфных вариантов не более одного, или не более двух представителей семейства генных сегментов VH человека. Согласно одному варианту осуществления не более одного, или не более двух генных сегментов VH человека функционально связаны с одним или несколькими генными сегментами DH человека, одним или несколькими генными сегментами JH человека и человеческим или не относящимся к человеку генным сегментом константной области. Согласно одному варианту осуществления константная область находится в эндогенном локусе константного гена не относящегося к человеку иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления, не относящееся к человеку животное дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, полученную из последовательности VL человека, например, реаранжированный или нереаранжированный генный сегмент VL человека или реаранжированная последовательность VL/JL человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, полученная из последовательности VL человека, находится в эндогенном локусе не относящегося к человеку гена VL; согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, полученная из последовательности VL человека, находится на трансгене. Согласно конкретному варианту осуществления не относящееся к человеку животное не в состоянии экспрессировать вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, который сам содержит эндогенный генный сегмент VL или JL и содержит не более одного или не более двух генов легкой цепи, которые кодируют реаранжированные домены VL человека (например, из не более одного или не более реаранжированных последовательностей VL/JL человека).
Генетически модифицированные мыши, которые экспрессируют вариабельные области тяжелой цепи человека с ограниченным использованием генного сегмента VH, применимы для получения относительно большого репертуара разнообразия множественности сегментов J, комбинаторного разнообразия и соматически мутированных высокоаффинных вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина человека от иначе ограниченного репертуара. Согласно одному варианту осуществления ограниченный репертуар относится к заранее определенному ограничению в количестве и/или идентичности генов зародышевой линии, что приводит к невозможности образовать у мыши реаранжированный ген тяжелой цепи, который происходит от любого гена V, кроме предварительно выбранного гена V. Согласно вариантам осуществления, которые используют предварительно выбранный ген V, но не предварительно выбранный ген D и/или ген J, репертуар ограничен по отношению к идентичности гена V, но не гена D и/или J (например, репертуар состоит в основном из не более одного или не более двух генных сегментов VH (и/или их полиморф), а также множества генных сегментов D и множества генных сегментов J)). Идентичность предварительно выбранного гена V (и любого предварительно выбранного гена D и/или J) не ограничивается каким-либо конкретным геном V.
Разработка такой мыши, которая реаранжировала бы единственный ген VH (присутствует в виде единственного сегмента или набора вариантов) с различными генными сегментами D и J человека (например, сегментами DH и JH) предусматривает перестановочную машину in vivo разнообразия множественности сегментов J/комбинаторного разнообразия/соматической гипермутации, которая может быть использована для повторения мутаций в результирующих реаранжированных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи (например, в зависимости от обстоятельств может быть V/D/J или V/J). У такой мыши процесс клональной селекции работает для выбора подходящих вариабельных областей, которые связывают представляющий интерес антиген, основанные на единственном заранее выбранном гене VH (или его вариантах). Поскольку компоненты клональной селекции мыши предназначены для селекции, основанной на единственном заранее выбранном генном сегменте VH, фоновый шум (например, большое разнообразие не являющихся антигенсвязывающими доменов VH, полученных из многих генных сегментов зародышевой линии) в значительной степени ликвидирован. С помощью правильного отбора генного сегмента VH относительно большее число клонально отобранных антигенспецифических антител может быть подвергнуто скринингу в течение более короткого периода времени, чем с помощью мыши с большим разнообразием сегментов V.
Предварительный отбор ограниченного репертуара и ограничение мыши по единственному сегменту V предусматривает систему для перестановки множественности сегментов V/D/J со скоростью, которая согласно различным вариантам осуществления выше, чем наблюдаемая у мышей, которые иначе должны рекомбинировать до 40 или более сегментов V с областей D и J. Удаление других сегментов V освобождает локус для образования большего количества комбинаций V/D/J для предварительно выбранного сегмента V, чем иначе наблюдается. Увеличенное число транскриптов, к которым приводит рекомбинация предварительно выбранного V с одним из множества сегментов D и одним из множества сегментов J, будет поддерживать эти транскрипты в системе клональной селекции в виде пре-В клеток, и система клональной селекции, таким образом, предназначена для циклирования В-клеток, которые экспрессируют предварительно выбранную область V. Таким образом, более уникальные реаранжировки области V, полученные от предварительно выбранного сегмента V, могут быть подвергнуты скринингу организмом, чем это было бы возможно в ином случае в заданный промежуток времени.
Согласно различным аспектах описываются мыши, которые повышают разнообразие множественности сегментов рекомбинаций V/D/J для предварительно выбранной области V, потому что все или по существу все рекомбинации в вариабельном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина будут в предварительно выбранном сегменте V и сегментах D и J, которые помещены в таких мышах. Таким образом, мыши предусматривают способ получения разнообразия сегментов CDR3 с использованием основания или ограниченного репертуара генов VH.
Согласно одному аспекту предусматривается не относящееся к человеку животное, причем популяция В-клеток не относящегося к человеку животного экспрессирует тяжелые цепи иммуноглобулина, которые получают из не более одного или не более двух генных сегментов VH человека. Согласно одному варианту осуществления каждый из не более одного или не более двух генных сегментов VH человека присутствует в двух или более полиморфных формах. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека присутствует в трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 полиморфных формах. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное экспрессирует вариабельный домен легкой цепи человека, полученный из генного сегмента VL человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения популяции В-клеток у не относящегося к человеку животного, причем популяция В-клеток экспрессирует тяжелые цепи человека, полученные из единственного генного сегмента VH зародышевой линии человека и двух или более генных сегментов D человека и двух или более генных сегментов J человека; способ, содержащий стадию иммунизации описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном, и позволение не относящемуся к человеку животному развивать иммунный ответ на представляющий интерес антиген, причем иммунный ответ включает в себя экспрессию тяжелых цепей человека на поверхности В-клеток в популяции В-клеток. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна (например, мышь или крысу). Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека, сегмент DH человека и сегмент JH человека функционально связаны с не относящимся к человеку геном константной области. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую домен VL человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая домен VL человека, связана с генной последовательностью константной области не относящейся к человеку легкой цепи.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения не относящегося к человеку животного, которое экспрессирует популяцию иммуноглобулинов, характеризующихся наличием тяжелых цепей, которые происходят из множества реаранжировок единственного генного сегмента VH человека (или единственного представителя семейство генов VH человека) и одного из множества генных сегментов DH и одного из множества генных сегментов JH. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-69 человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека представляет собой генный сегмент VH1-2 человека.
Согласно одному аспекту предусматривается способ получения популяции вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека, чьи CDR1 и CDR2 происходят от того же генного сегмента VH зародышевой линии, и чьи CDR3 происходят от генного сегмента зародышевой линии и двух или более сегментов D человека, и двух или более сегментов J человека; способ, предусматривающий иммунизацию описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного представляющим интерес антигеном и предоставление не относящемуся к человеку животному развивать иммунный ответ на представляющий интерес антиген, причем иммунный ответ включает в себя экспрессирование вариабельных доменов тяжелой цепи человека в тесной связи с вариабельным доменом легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна (например, мышь или крысу). Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека, сегмент D человека и сегмент J человека функционально связаны с не относящимся к человеку геном константной области. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую домен VL человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая домен VL человека, связана с генной последовательностью константной области не относящейся к человеку легкой цепи.
Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное не способно экспрессировать не относящийся к человеку домен VH, и причем каждая тяжелая цепь иммуноглобулина популяции тяжелых цепей, экспрессированных у животных, содержит домен VH человека, содержащий CDR1 и CDR2, которые идентичны, но для одного или нескольких соматических гипермутаций, и причем популяция тяжелых цепей содержит множество последовательностей CDR3, полученных из множества реаранжировок с множеством генных сегментов D и J.
Согласно одному аспекту предусматривается биологическая система для получения изменения в идентичности и длине CDR3, содержащая генетически модифицированное описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное, причем не относящееся к человеку животное содержит не более одного или не более двух генных сегментов VH человека и два или более генных сегмента D, и один или несколько генных сегментов J, причем не относящееся к человеку животное дополнительно содержит гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина. Согласно различным вариантам осуществления не относящееся к человеку животное в ответ на иммунизацию представляющим интерес антигеном производит иммунный ответ, который включает экспрессию популяции тяжелых цепей иммуноглобулина, характеризующихся наличием у каждой CDR1 и CDR2, которые отличаются только соматической гипермутацией, и CDR3, которые отличаются реаранжировкой и соматической гипермутацией. Согласно одному варианту осуществления биологическая система представляет собой мышь, которая генетически модифицирована, как описано в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент VH человека и генный сегмент VL человека находятся в эндогенных локусах мышиного тяжелого и легкого иммуноглобулина, соответственно. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов VH человека и генный сегмент VL человека находятся на трансгенах (т.е. в локусе, отличном от эндогенного локуса иммуноглобулина).
Примеры
Предусматриваются следующие примеры, чтобы описать специалистам в настоящей области техники, как производить и применять способы и композиции согласно настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают своим изобретением. Если не указано иное, температура указана в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному. В вышеизложенных примерах, когда указывается использование наборов и реагентов от различных поставщиков, все процедуры были проведены в соответствии с требованиями производителя.
Пример 1. Конструкция ограниченных локусов тяжелой цепи
Уникально сконструированный локус тяжелой цепи человека, содержащий единственный генный сегмент VH человека, расположенный перед всеми генными сегментами DH и JH человека создали с помощью серии реакций гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках (BHR) с использованием ДНК бактериальной искусственной хромосомы (ВАС). Несколько нацеливающих конструкций для создания единственного VH, содержащего локус тяжелой цепи, сконструировали с использованием технологии генетической инженерии VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США №6586251 и Valenzuela, D.M., et al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659).
Конструкция ограниченного локуса тяжелой цепи VH1-69 человека. Вкратце, четыре модификации выполнили с использованием ДНК ВАС человека для создания нацеливающей конструкции, содержащей генный сегмент VH1-69 человека со всеми сегментами DH и JH человека (фиг.1). Согласно первой модификации модифицированная ВАС человека, содержащая множественные дистальные (5') генные сегменты VH человека, включая VH1-69, расположенные выше гигромициновой кассеты выбора, и 5' гомологичное плечо мыши было нацелено со второй спектиномициновой кассетой, которое также содержало модифицированную последовательность сигнала рекомбинации (RSS; BHR 1, фиг 1, вверху слева). Эта модифицированная последовательность сигнала рекомбинации (RSS) вводила две точечные мутации (Т в А и G в А) в 3' области RSS гена VH1-69 человека, изменяя нонамер RSS на оптимальную консенсусную последовательность. Таким образом, первая модификация (BHR 1) создала геномный фрагмент человека, содержащий генный сегмент VH1-69 человеческий с модифицированной 3' RSS, уникальный сайт рестрикции AsiSI, расположенный приблизительно в 180 п.о. ниже по ходу транскрипции от RSS и спектиномициновую кассету (фиг. 1, посередине слева).
Вторая модификация (BHR 2) включала в себя использование неомициновой (Нео) кассеты, окруженной сайтами FRT, для удаления гигромициновой кассеты и 5' генных сегментов VH человека выше по ходу транскрипции от генного сегмента VH1-69. Эту модификацию нацеливали 5' на генный сегмент VH1-69 человека, чтобы оставить интактными около 8,2 т.п.о. промоторной области VH1-69 человека и 5' гомологичного плеча мыши (фиг.1, внизу слева).
Третья модификация (БГР 3) включала в себя другую спектиномициновую кассету, окруженную уникально сконструированными сайтами 5' PI-Seel и 3' AsiSI, нацеленными на геномной фрагмент человека, содержащий первые три функциональных генных сегментов VH человека и все генные сегменты DH и JH человека (фиг. 1, посередине справа). Геномный фрагмент человека ранее нацеливали на неомициновую кассету, и он содержал гомологичные плечи 5 'и 3', содержащие мышиную геномную последовательность 5' и 3' эндогенного локуса тяжелой цепи, включая в себя интронный энхансер 3' и ген IgM. Эта модификация удаляла геномную последовательность 5' мыши и генные сегменты VH человека, оставляя приблизительно 3,3 т.п.о. межгенной области VH-DH выше по ходу транскрипции от генного сегмента DH1-1 человека, все сегменты DH и JH человека и геномный фрагмент 3' мыши, содержащий интронный энхансер 3' и ген IgM (фиг. 1, внизу справа).
Четвертую модификацию получали с помощью использования уникальных сайтов PI-Seel и AsiSI (описанные выше) для лигирования двух модифицированных ВАС от BHR 2 и BHR 3 (фиг.1, внизу в центре), которые производили окончательную нацеливающую конструкцию. Окончательная нацеливающая конструкция для создания модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащей единственный генный сегмент VH человека и все генные сегменты DH и JH человека в ES клетках, содержала от 5' до 3', 5' гомологичное плечо, содержащее приблизительно 20 т.п.о. мышиной геномной последовательности выше по ходу транскрипции от эндогенного локуса тяжелой цепи, 5' сайт Frt, неомициновую кассету, 3' сайт Fit, приблизительно 8,2 т.п.о. промотера VH1-69 человека, VH1-69 человека с модифицированной 3' RSS, 27 генных сегментов DH человека, шесть сегментов JH человека, а также 3' гомологичное плечо, содержащее приблизительно 8 т.п.о. мышиной геномной последовательности ниже по ходу транскрипции от генного сегмента JH мыши, включая 3'интронной энхансер и ген IgM (фиг. 1, внизу). Нацеливающий вектор VH1-69 человека (SEQ ID NO:3) линеаризовали и электропорировали в гетерозиготные ES клетки мыши для удаления эндогенного локуса тяжелой цепи.
Конструкция ограниченного локуса тяжелой цепи VH1-2 человека. С использованием описанных выше стадий, другие полиморфные генные сегменты VH, связанные с константными областями тяжелой цепи мыши, используют для конструкции серии мышей, содержащих ограниченное число сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина (например, 1, 2, 3, 4 или 5), причем сегменты V представляют собой полиморфные варианты представителя семейства генов V. Иллюстративные полиморфные генные сегменты VH происходят от генных сегментов VH человека включая в себя, например, VH1-2, VH2-26, VH2-70 и VH3-23. Такие генные сегменты VH человека получают, например, путем синтез de novo (например, технология Blue Heron, Bothell, WA) с использованием последовательности, доступные из опубликованных баз данных. Таким образом, фрагменты ДНК, кодирующие каждый ген VH, согласно некоторым вариантам осуществления, получают независимо для включения в описанный в настоящем документе нацеливающий вектор. Таким образом, множественные модифицированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащие ограниченное число генных сегментов VH, конструируют связанными с константными областями тяжелой цепи мыши. Иллюстративная стратегия нацеливания для создания ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи, содержащего генный сегмент VH1-2 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека, показана на фиг. 2.
Вкратце, модифицированный клон ВАС человека, содержащий три генных сегмента VH человека (VH6-1, VH1-2, VH1-3), 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека (смотрите USSN 13/404075; поданный 24 февраля 2012, который включен в настоящий документ посредством ссылки), используют для создания ограниченного гуманизированного локуса тяжелой цепи, содержащего генный сегмент VH1-2 человека. Этот модифицированный клон ВАС функционально связывает вышеупомянутые генные сегменты тяжелой цепи человека с интронным энхансером мыши и константной областью IgM. Ограниченный локус тяжелой цепи на основе VH1-2 человека получают с помощью двух гомологичных рекомбинаций с использованием описанного выше модифицированного клона ВАС человека.
При первой гомологичной рекомбинации, 205 п.о. генного сегмента VH6-1 человека (от приблизительно 10 п.о. выше по ходу транскрипции (5') от стартового кодона VH6-1 в экзоне 1 до приблизительно 63 п.о. ниже по ходу транскрипции (3') от начала экзона 2) в модифицированном клоне ВАС человека удаляют с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации с использованием спектиномициновой (aadA) кассеты, окруженной уникальными сайтами рестрикции PI-SceI (фиг. 2, BHR 1). Это позволяет впоследствии удалять кассету aadA, не нарушая другие генные сегменты человека в ограниченном локусе тяжелой цепи.
Для второй гомологичной рекомбинации, 5' конец модифицированного клона ВАС человека, включая в себя весь генный сегмент VH1-3 человека и около 60 п.о. ниже по ходу транскрипции (3') от генного сегмента, удаляют с помощью гомологичной рекомбинации с использованием гигромициновой кассеты, содержащей окруженные 5' AsiSI и 3' AscI сайты рестрикции (фиг. 2, BHR 2). Как описано выше, спектиномициновую кассету необязательно удаляют после подтверждения финального нацеливающего вектора, включая удаление двух генных сегментов VH человека, окружающих генный сегмент VH1-2 человека (фиг. 2, внизу). Иллюстративный нацеливающий вектор VH1-2 человека представлен в SEQ ID NO:70.
Использование полиморфных генных сегментов VH в ограниченном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой новый подход к получению антител, популяции антител и популяции В-клеток, которые экспрессируют антитела, содержащие тяжелые цепи с различными CDR, полученными из единственного генного сегмента VH человека. Использование комплекса соматической гипермутации животного-хозяина вместе с комбинаторной ассоциацией с реаранжированными вариабельными доменами легкой цепи иммуноглобулина человека приводит к конструированию уникальных тяжелых цепей и уникальных пар VH/VL, которые расширяют иммунный репертуар генетически модифицированных животных и повышают их применимость в качестве платформы для создания нейтрализующих антител, специфичных к человеческим патогенам.
Таким образом, использование описанной выше стратегии для включения дополнительных и/или других полиморфных генных сегментов VH в локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши позволяет продуцировать новые репертуары антител для использования в нейтрализации человеческих патогенов, которые могли бы эффективно ускользать от иммунной системы хозяина.
Описанные выше нацеленные ES клетки использовали в качестве доноров ES клеток и вводили в 8-клеточный эмбрион мыши с помощью способа VELOCIMOUSE ® (смотрите выше). Мышей, несущих гуманизированный локус тяжелой цепи, содержащий единственный генный сегмент VH человека, все генных сегментов DH и JH человеческий, функционально связанные с генами константной области иммуноглобулина мыши, определяли путем генотипирования с использованием модификации анализа аллелей (Valenzuela et al, смотрите выше), который обнаружил присутствие неомициновой кассеты, генного сегмента VH человека и области в генных сегментах DH и JH человека, а также эндогенные последовательности тяжелой цепи. В таблице 4 представлены праймеры и зонды, используемые в этом анализе для подтверждения мышей, несущих ограниченный локус тяжелой цепи, содержащий единственный генный сегмент VH1-69 человека, 27 генных сегментов DH человека и шесть генных сегментов JH человека.
Мыши, несущие сконструированный локус тяжелой цепи, который содержит единственный генный сегмент VH человека, могут быть отнесены к линии FLPe делеторных мышей (смотрите, например, Rodriguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-ZoxP. Nature Genetics 25: 139-140) для того, чтобы удалить любую неомициновую кассету Frt'ed, введенную нацеливающим вектором, который не удаляют, например, на стадии ES клеток или в зародыше. Необязательно, неомициновая кассета остается в мышах.
Потомство является генотипированным, и выбирают детеныша, гетерозиготного по гуманизированному локусу тяжелой цепи, содержащей единственный генный сегмент VH человека, все сегменты DH и JH человека, функционально связанные с эндогенными константными генами иммуноглобулина мыши, для характеристики репертуара тяжелой цепи иммуноглобулина.
Пример 2 Характеристика мышей, экспрессирующих тяжелые цепи, полученные из единственного генного сегмента VH человека
Описанных в примере 1 мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи оценивали на экспрессию и развитие В-клеток с помощью проточной цитометрии.
Вкратце, селезенки и костный мозг собирали у мышей дикого типа (n=3 в группе; шесть недель, самки или самцы) и у мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, всем генным сегментам DH и JH человека, функционально связанным с константными областями тяжелой цепи мыши. Эритроциты из селезенок лизировали с помощью лизирующего буфера АСК (Lonza Walkersville) с последующим отмыванием полной средой RPMI.
Проточная цитометрия. Клетки (1×106) инкубировали с мышиными антителами CD16/CD32 (2,4G2, BD PHARMINGEN™) на льду в течение 10 минут, после чего метили следующими панелями антител в течение 30 минут на льду. Панель костного мозга: мышиные антитела FITC-CD43 (1 В11, BioLegend), PE-ckit (2 В8, BIOLEGEND®), РеСу7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Панель костного мозга и селезенки: мышиные антитела FITC-Igκ (187.1, BD Biosciences), PE-Igλ, (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (11/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD Biosciences). Костный мозг: незрелые В-клетки (B220intIgM+), зрелые В-клетки (B220hiIgM+), про-В-клетки (CD19+ckit+CD43+), пре-В-клетки (CD19+ckit-CD43-), незрелые Igκ+ В-клетки (B220intIgM+Igκ+Igλ+), незрелые Igλ+ В-клетки (B220intIgM+Igκ-Igλ+), зрелые IgK+ В-клетки (B220hiIgM+Igκ+Igλ-), зрелые Igλ+ В-клетки (B220hiIgM+Igκ-Igλ+). Селезенка: В-клетки (CD19+), зрелые В-клетки (CD19+IgDhiIgMint), переходные/незрелые В-клетки (CD19+IgDintIgMhi). Костный мозг и селезенка: Igκ+ В-клетки (CD19+Igκ+Igλ-), Igλ+ В-клетки (CD19+Igκ-Igλ+).
После окрашивания клетки отмывали и фиксировали в 2% формальдегиде. Сбор данных проводили на проточном цитометре LSRII и анализировали с помощью программного обеспечения FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Результаты для компартмента селезенки показаны на фиг. 3, 4А и 5-7. Результаты для компартмента костного мозга показаны на фиг. 4В и 8-11В.
Экспрессия VH человека. Экспрессию генного сегмента VH1-69 человека определяли у мышей, гетерозиготных и гомозиготных по генному сегменту VH1-69 человека, всем генных сегментов DH и JH человека, функционально связанными с константными областями тяжелой цепи мыши, с помощью анализа количественной ПЦР с использованием зондов TAQMAN®.
Вкратце, CD19+-клетки очищали из селезенки групп мышей (n=3 в группе), используя мышиные микрогранулы CD 19 (Miltenyi Biotec) в соответствии с требованиями завода-изготовителя. Общую РНК очищали с использованием мининабора RNEASY™ (Qiagen) и геномную РНК удаляли с использованием обработки, не содержащей РНазу ДНКазой на колонке (Qiagen). Приблизительно 200 нг мРНК обратно транскрибировали в кДНК с использованием набора First Stand cDNA Synthesis (Invitrogen) и затем амплифицировали с использованием универсального мастер-микса для ПЦР TAQMAN™ (Applied Biosystems) с использованием системы обнаружения последовательности ABI 7900 (Applied Biosystems). Использовали уникальные комбинации праймер/зонд для специального определения экспрессии производных VH1-69 тяжелых цепей человека (табл. 5). Относительную экспрессию нормализовалиь к константной области к мыши (тСк). Результаты показаны на фиг. 12.
Пример 3 Гуморальный иммунный ответ у мышей, экспрессирующих тяжелые цепи, полученные из единственного генного сегмента VH человека
Гуморальный иммунный ответ определяли у мышей, гомозиготных по локусам вариабельного гена тяжелой и легкой к цепи человека (Нκ), и у мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, всем генным сегментам DH и JH человека, функционально связанным с константными областями тяжелой цепи мыши (1 г VH НО), с помощью сравнительной иммунизации с использованием человеческого рецептора клеточной поверхности (Антигена А).
Иммунизация. Сыворотку собирали у группы мышей до иммунизации описанным выше антигеном. Антиген (2,35 мкг каждого) вводили в начале первичной иммунизации, смешанного с 10 мкг олигонуклеотида CpG (Invivogen) и 25 мкг Adju-phos (Brenntag) в качестве адъювантов. Иммуноген вводили через подушечку лапы (п.л.) в объеме 25 мкл на мышь. Впоследствии мышей повторно иммунизировали через п.л. в количестве 2,3 мкг антигена вместе с 10 мкг CpG и 25 мкг Adju-phos в качестве адъювантов на 3, 6, 11, 13, 17 и 20 день для достижения в общей сложности шести повторных иммунизации. У мышей брали кровь на 15 и 22 дни после четвертой и шестой повторной иммунизации, соответственно, и антисыворотку оценивали на титры антител с антигеном А.
Титры антител определяли в сыворотке иммунизированных мышей с использованием анализа ELISA. Девяносто шести луночные планшеты для микротитрования (Thermo Scientific) покрывали антигеном А (1 мкг/мл) в фосфатном буфере (PBS, Irvine Scientific) в течение ночи при 4°C. На следующий день планшеты отмывали фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich) четыре раза, используя машину для мойки планшетов (Molecular Devices). Затем планшеты блокировали с помощью 250 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich) в PBS и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Затем планшеты отмывали четыре раза в PBS-T. Сыворотки от иммунизированных мышей и предварительно иммунные сыворотки серийно разводили в десять раз в 0,1% BSA PBS- Т, начиная с 1:100, и добавляли к блокированным планшетам в двух экземплярах, и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Последние две лунки оставляли пустыми для использования в качестве вторичного антитела контроля. Планшеты снова отмывали четыре раза PBS-T в машине для мойки планшетов. Разведение 1:5000 козьего антитела к мышиному конъюгированному вторичному антителу IgG-Fc-пероксидаза хрена (HRP, Jackson Immunoresearch) добавляли в планшеты и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты снова отмывали восемь раз PBS-T и развивали с использованием в качестве субстрата ТМВ/Н202. Субстрат инкубировали в течение двадцати минут, и реакцию останавливали с помощью 1 н H2SO4 (VWR). Планшеты считывали на спектрофотометре (Victor, Perkin Elmer) при 450 нм. Титры антител рассчитывали с использованием GRAPHPAD PRISM™ (GraphPad Software, Inc)..
Титр сыворотки рассчитывали как разведение сыворотки в экспериментальном диапазоне титрования при сигнале связывания с антигеном, эквивалентном двухкратному превышению фона. Титр антител для гуморального иммунного ответа против рецептора клеточной поверхности человека (антиген А) приведены на фиг. 19.
В аналогичном эксперименте гуморальный иммунный ответ определяли у мышей, гомозиготных по локусам вариабельного гена тяжелой и легкой к цепи человека (Нк), и у мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека, всем генным сегментам DH и JH человека, функционально связанным с константными областями тяжелой цепи мыши (1 г VH НО)) по сравнительной иммунизации с использованием вакцин против вируса гриппа FLUVIRIN® (Novartis Vaccines) и FLUMIST® (Medlmmune LLC).
Вкратце, сыворотку собирали у группы мышей до иммунизации описанным выше антигеном (как описано выше). Мыши (п=5), гомозиготные по единственному генному сегменту VH (VH1-69) человека, всем генным сегментам DH и JH человека, функционально связанным с константными областями тяжелой цепи мыши (1 г VH НО) иммунизировали интраназально (и.н.) FLUMIST® (живой ослабленной вакциной против гриппа) в 1/3 обычной дозы на мышь. Одна нормальная доза FLUMIST® содержит 106,5-7,5 ОЕФ (относительная единица флуоресценции) живой ослабленной вакцины против гриппа. Таким образом, каждую мышь примировали с помощью 70 мкл FLUMIST® в день 1, после чего повторно иммунизировали на 3, 6, 11, 13, 17, 20 день для достижения в общей сложности шести повторных иммунизации. В этой иммунизации вспомогательные вещества не использовали. У мышей брали кровь на 15 и 22 день после 4 и 6 повторной иммунизации, соответственно, и антисыворотки оценивали на титры антител к FLUMIST® (как описано выше).
Подобным образом, в иммунизациях с FLUVIRIN®, предварительно иммуннизированную сыворотку собирали у мышей до начала иммунизации. Мыши (n=5), гомозиготные по единственному генному сегменту VH (VH1-69) человека, всем генным сегментам DH и JH человека, функционально связанным с константными областями тяжелой цепи мыши (1 г VH НО) иммунизировали FLUVIRIN® (трехвалентной инактивированной вакциной против гриппа) через подушечку лапы (п.л.) в объеме 75 мкг каждого из гемагглютинина/мыши/повторной вацинации. Мышей примировали на 1 день с последующей повторной вакцинацией через f.p. на 3, 6, 11, 13, 17, 20 день для достижения в общей сложности шести повторных иммунизации. В этой иммунизации вспомогательные вещества не использовали. У мышей брали кровь на 15 и 22 день после 4 и 6 повторной иммунизации, соответственно, и антисыворотки оценивали на титры антител к FLUVIRIN® (как описано выше).
Титр сыворотки рассчитывали как разведение сыворотки в экспериментальном диапазоне титрования при сигнале связывания антигена, эквивалентном двухкратному превышению фона. Титр антител для гуморального иммунного ответа против FLUMIST® и FLUVIRIN® приведены на фиг. 20.
Как показано в этом примере, титры антител, полученные у мышей 1 г VH НО, были сопоставимы с полученными у мышей, имеющих множество генных сегментов VH человека (Нκ), как для рецептора клеточной поверхности человека, так и вирусного антигена (например, гриппа). Таким образом, мыши, содержащие локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, ограниченные до одного генного сегмента VH, способны развивать устойчивый иммунный ответ на антиген способом, сравнимым с мышами, имеющими локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащие множество генных сегментов VH человека (например, 80 VH).
Пример 4. Анализ частоты использования генов антител и длины CDR3 у мышей с ограниченным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина
Спленоциты собирают из мышей, гомозиготных по единственному генному сегменту VH человека в эндогенном локусе тяжелой цепи и гомозиготных по замещению эндогенных вариабельных локусов легкой цепи κ вариабельными локусами легкой цепи κ человека, иммунизированными рецептором клеточной поверхности человека (антигена А) анализировали на частоту использования генного сегмента тяжелой и легкой цепей с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на мРНК из В-клеток селезенки.
Вкратце, селезенки собирают и гомогенизируют в 1×PBS (Gibco) с использованием предметных стекол. Клетки осаждали в центрифуге (с ускорением 500g в течение 5 минут), а эритроциты лизировали в лизирующем буфере АСК (Gibco) в течение 3 минут. Клетки отмывали с помощью 1×PBS и фильтровали с использованием фильтра с ячейкой 0,7 мкм. В-клетки выделяли из клеток селезенки с использованием магнитного позитивной селекции MACS для CD 19 (Miltenyi Biotec). Общую РНК выделяли из осажденных В-клеток с помощью набора RNeasy Plus (Qiagen). ПолиА+ мРНК выделяли из общей РНК с использованием мини-набора прямой мРНК Oligotex® (Qiagen).
Двухцепочечную кДНК получали из мРНК В-клеток селезенки с помощью 5'-RACE с использованием набора синтеза кДНК SmarTer™ Pico (Clontech) с заменой подаваемой обратной транскриптазы и dNTP с Superscript® II и dNTPs (Invitrogen). Репертуары антител VH и Vκ амплифицировали из кДНК с использованием праймеров, специфичных для константных областей IgM, IgG или IgK и 5' RACE праймеров SmarTer™ (табл. 6). Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick® (Qiagen). Второй раунд ПЦР выполняли с использованием того же праймера 5' RACE и двухраундового праймера 3', специфичного для константных областей IgM, IgG или IGk (табл. 7). Продукты второго раунда ПЦР очищали с использованием системы SizeSelect™ E-Gel® (Invitrogen). Третью ПЦР проводили с праймерами, которые добавляли 454 адаптеров и штрих-кодов. Продукты третьего раунда ПЦР очищали с использованием гранул ХР Agencourt® AMPure® (Beckman Coulter). Очищенные продукты ПЦР количественно определяли с помощью кПЦР SYBR® с помощью набора количественной библиотеки КАРА (КАРА Biosystems). Суммарные библиотеки подвергали ПЦР в эмульсии (emPCR) с использованием набора 454 GS Junior Titanium Series Lib-A emPCR (Roche Diagnostics) и двунаправленному секвенированию с использованием инструмента Roche 454 GS Junior в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
Биоинформационный анализ. 454 последовательности сортировали на основе идеального совпадения со штрих-кодом образца и обрезали для соответствия определенному качеству. Последовательности аннотировали на основе выравнивания реаранжированных последовательностей иммуноглобулина в базу данных сегментов V(D)J зародышевой линии человека с использованием локальную установки Igblast (NCBI, v2.2.25+). Последовательность помечали как неоднозначную и удаляли из анализа, если были обнаружены множественные лучшие попадания с идентичными сцепленными генами. Набор скриптов Perl разработали для анализа результатов и сохранения данных в базе данных mysql. Область CDR3 определяли между консервативным кодоном С и мотивом FGXG для легких цепей и мотивом WGXG для тяжелых цепей. Длину CDR3 определяли с использованием только продуктивных антител. Из последовательностей нуклеиновых кислот и предсказанной аминокислотной последовательности антител, частоту использование гена идентифицировали для последовательностей примированных IgM (15650), примированных IgG (18967) и примированных Ig (26804). Результаты показаны в таблице 8, в таблице 9, на фиг.21 и фиг.22.
В таблице 8 представлен процент наблюдаемых генных сегментов DH и JH человека, используемых в последовательностях вариабельных областей производных VH1-69 тяжелой цепи, примированных IgM (15650 последовательностей) и примированных IgG (18967 последовательностей). Генные сегменты DH4-4/DH4-11 и DH5-5/DH5-18 человека представлены в таблице 8 вместе из-за одинаковой идентичности последовательностей между соответствующими парами генных сегментов DH. В таблице 9 представлен процент генных сегментов Vκ и Jκ человека, наблюдаемых среди легких цепей (26804 последовательности), родственных вариабельных областей производных VH1-69 тяжелой цепи. Процентные показатели в таблицах 8 и 9 представляют округленные значения и в некоторых случаях могут не составлять 100%, когда суммируются.
Длина аминокислотной области CDR3 примированных IgM производными VH1-69 тяжелых цепей показана на фиг.21. Длина аминокислотной области CDR3 примированных IgG производных VH1-69 тяжелых цепей показано на фиг. 22.
Как показано в таблицах 8 и 9, мыши, согласно настоящему изобретению продуцируют антигенспецифические антитела, содержащие производные VH1-69 тяжелых цепей, которые демонстрируют различные реаранжировки генного сегмента VH1-69 человека с различными сегментами DH человека и сегментами JH человека. Дополнительно, антигенспецифические антитела содержат родственные легкие цепи человека, содержащие домены Vκ человека, получаемые в результате различных реаранжировок генных сегментов Vκ и Jκ человека.
Настоящее изобретение может относиться, в частности, к следующим перечисленным ниже вариантам осуществления изобретения:
1. Мышь, содержащая ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся наличием единственного генного сегмента VH человека, одного или нескольких генных сегментов DH человека и одного или нескольких генных сегментов JH человека, причем единственный генный сегмент VH человека представляет собой полиморфный генный сегмент JH.
2. Мышь по варианту 1, содержащая делецию всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH, DH и JH.
3. Мышь по варианту 1, у которой единственный генный сегмент VH человека выбирают из VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 и VH3-23.
4. Мышь по варианту 3, у которой единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH 1-69.
5. Мышь по варианту 3, у которой единственный генный сегмент VH человека представляет собой VH 1-2.
6. Мышь по варианту 1, у которой единственный генный сегмент VH человека функционально связан с человеческим или не относящимся к человеку геном константной области иммуноглобулина.
7. Мышь по варианту 6, у которой ген константной области иммуноглобулина представляет собой ген константной области мыши, крысы или человека.
8. Мышь по варианту 1, дополнительно содержащая один или несколько генных сегментов VL иммуноглобулина человека, функционально связанных с одним или несколькими генными сегментами JL человека.
9. Мышь по варианту 8, у которой один или несколько генных сегментов VL человека и/или один или несколько генных сегментов JL человека выбирают из генных сегментов κ и λ человека.
10. Мышь по варианту 8, у которой один или несколько генных сегментов VL иммуноглобулина человека и один или несколько генных сегментов JL человека функционально связаны с не относящимся к человеку геном константной области легкой цепи.
11. Мышь по варианту 10, у которой не относящийся к человеку ген константной области легкой цепи выбирают из гена константной области κ или λ мыши или крысы.
12. Мышь, содержащая в своей зародышевой линии замену в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH, DH и JH единственным генным сегментом VH человека и/или его полиморфными вариантами, одним или несколькими генными сегментами человека и одним или несколькими генными сегментами JH человека.
13. Мышь по варианту 12, дополнительно содержащая замену в эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VL и JL одним или несколькими генными сегментами VL и одним или несколькими генными сегментами JL человека.
14. Мышь по варианту 12, у которой единственный генный сегмент VH человека выбран из генного сегмента VH 1-69 и VH 1-2 человека.
15. Клетка или ткань, происходящая из мыши по варианту 1 или 12.
16. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH человека, предусматривающий:
(а) иммунизацию мыши по варианту 1 или 12 представляющим интерес антигеном;
(б) предоставление указанной мыши возможности развивать иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и,
(в) получение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH человека из указанной мыши.
17. Способ по варианту 16, в котором последовательность области VH иммуноглобулина по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 или SEQ ID NO: 58.
18. Способ по варианту 16, в котором последовательность области VH иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 или их полиморфные варианты.
19. Способ по варианту 16, в котором последовательность области VH иммуноглобулина кодирует белок, который по меньшей мере на 75% идентичен SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 59.
20. Способ по варианту 16, в котором последовательность области VH иммуноглобулина по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68.
21. Способ по варианту 16, в котором последовательность области VH иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 или их полиморфный вариант.
22. Способ по варианту 16, в котором последовательность области VH иммуноглобулина кодирует белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 69.
23. Применение мыши по варианту 1 или 12 для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи человека.
24. Применение по варианту 23, при котором вариабельный домен тяжелой цепи человека характеризуется наличием последовательностей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 человека, происходящих из полиморфного генного сегмента VH человека.
25. Применение по варианту 24, при котором генный сегмент VH человека выбирают из генного сегмента VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 или VH3-23 человека.
26. Применение по варианту 25, при котором генный сегмент VH человека представляет собой VH1-2.
27. Применение по варианту 25, при котором генный сегмент VH человека представляет собой VH1-69.
28. Применение мыши по варианту 1 или 12 для получения антитела человека, при котором антитело человека содержит вариабельный домен тяжелой цепи, происходящий из реаранжированного генного сегмента VH1-2 человека, генного сегмента VH1-69 человека или их полиморфного варианта.
29. Применение по варианту 28, при котором реаранжированный генный сегмент VH1-69 человека по меньшей мере 75% идентичен SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 или SEQ ID NO: 58.
30. Применение по варианту 28, при котором реаранжированный генный сегмент VH1-2 человека по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Macdonald, Lynn
McWhhirter, John
Gurer, Cagan
Hosiawa, Karolina A.
Murphy, Andrew J.
<120> Restricted Immunoglobulin Heavy Chain
Mice
<130> 1370A-WO
<150> 61/658,459
<151> 2012-06-12
<150> 61/597,969
<151> 2012-02-13
<150> 61/547,974
<151> 2011-10-17
<160> 81
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 872
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 1
gcaggattta gggcttggtc tctcagcatc ccacacttgt acagctgatg tggcatctgt 60
gttttctttc tcatcgtaga tcaggctttg agctgtgaaa taccctgcct catgcatatg 120
caaataacct gaggtcttct gagataaata tagatatatt ggtgccctga gagcatcaca 180
taacaaccac attcctcctc taaagaagcc cctgggagca cagctcatca ccatggactg 240
gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt aaggggcttc ctagtcctaa 300
ggctgaggaa gggatcctgg tttagttaaa gaggatttta ttcacccctg tgtcctctcc 360
acaggtgtcc agtcccaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 420
tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct ggaggcacct tcagcagcta tgctatcagc 480
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagggatcat ccctatcttt 540
ggtacagcaa actacgcaca gaagttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacgaatcc 600
acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 660
tgtgcgagag acacagtgtg aaaacccaca tcctgagagt gtcagaaacc ctgagggaga 720
aggcagctgt gccgggctga ggagatgaca gggtttatta ggtttaaggc tgtttacaaa 780
atgggttata tatttgagaa aaaaagaaca gtagaaacaa gtacatactc ctctaatttt 840
aagataatta ttccattcaa gagtcgtaat at 872
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gly Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
115
<210> 3
<211> 99294
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 3
aagcttatct ctctgttgct cagactcatc taggaatttc agaaatttct gttctagcat 60
ctcttccagc ttttgtctcc aaccctcatt ctcttctttc tttttttttt taaattatat 120
gttctctgtc tttttaaaaa actttttaaa attaggtatt tatgtcattt acatttccaa 180
tgctatccca aaagtcccac ccacgctccc caacccacta tcccacccac ccactcccac 240
ttcttggccc tggcattcac agtgtactga gacatataaa gtttgcacaa ccaatgggcc 300
tctctttcca ctgatggccg actaggccat cttctgatac atatgcagct agagacacga 360
gattctgggg gtactggtta gttcatattg ttgttccacc tatagggttg cagatccttt 420
tagctccttg ggtactttct ctagctcctc cattgggggc cctgtgatcc atccaatagc 480
tgactgtgag catccacttc tgtgtttgct aggccccaga tagtctcaca agagacagct 540
atatctgggt cctttcagca aaatcttgct agtgtatgca acggtgtcag agtttggaag 600
ctgattatgg gatggatccc cggatatggc attctctagt tggttcatcc ttttgtctca 660
gctccaaact ttgtctctgt aactccttcc atgggtgttt tgttcccagt tctaaggagg 720
ggcaaagtat ccacactttg gtcttcattc ttcttgagtt tcatgtgttt tgcaaattgt 780
atcttatatc ttgggtattc taagtttctg ggctaatatc cacttatcag tgagtacaca 840
ttgtgtgagt tcttttgtga ttgggttacc tcactcagta tgatgccctc caggtccatc 900
catttgccta ggaatttcat aaattcattc tttttaatag ctcagtagta ctccattgtg 960
tagatgtacc acattttctg tattcattcc tctgttgagg ggcatctggg ttctttccag 1020
cttctggcta ttataaataa ggctgctatg aacatagtgg agcatgtgac cttcttaccg 1080
gttgggacat cttctggata tatgcccagg agaggtattg ctggatcttc cggtagtact 1140
atgtccaatt ttctgaggaa ctgacaaact gatttccaga gtggttagta ccagcttgca 1200
atcccaccaa caatgagagg agtgttcgtc tttctccaca tcctcaccag catgctgctg 1260
tcacctgaat ttttgatgct tagccattct gactggtgtg aggtggaatc tcagggttgt 1320
tttgatttgt atttccctga tgattaagga tgctgaacat tttctcaggt gcttctcagc 1380
cattcagtat tctttaggtg agaattcttt gtttagctct aagccccatt tttttaatgg 1440
ggttatttga ttttctggag tccaccttct tgagtttttt tttccatttt ttattacata 1500
atttcctcaa ttacatttcc aatgctatcc caaaagtccc ccataccctc ccccccccaa 1560
ttccctaccc accccttccc atttttttgg ccctggcgtt cccctgtact ggggcatata 1620
aagtttgtgt gtccaatggg cttctctttc cagtgatggc tgactaggcc atcttttgat 1680
acatatgcag ctagagtcaa gagctcccgg gtactggtta gttcataatg ttgttccacc 1740
tatagggttg cagatccctt tagcttcttg ggtactttct ctagctcctc cattgggagc 1800
cctgtgatcc atccaatagc tgactgtgag catccacttc tgtgtttgct aggccccggc 1860
atagtctcac aagagacagc tacatctggg tccttttgat aaaatcttgc tagtgtatgc 1920
aagggtgtca gcatttggaa gctgattatg gggtggatcc ctggatatgg cagtctctac 1980
atggtccatc cttttgtctc agctccaaac tttgtctctg taacttcttc catgagtgtt 2040
ttgttcccaa ttctaaggag gggcatagtg tccacacttc attcttcatt cttcttgagt 2100
ttcatgtgtt tagcaaattg tatcttatat cttgggtatc ctaggttttg ggctaatatc 2160
cacttatcag tgagtacata ttgtgtgagt tcctttgtaa atgtgttacc tcactcagga 2220
tgacgccctc caggtccatc catttggcta ggaatttcat aaattcattc tttttaatag 2280
ctgagtagta ctccattgtg taaatgtacc acattttctg tactcattcc tctgttgagg 2340
ggcatctggg ttctttatag gttctggcta ttataaataa ggttgctatg aacatagtgg 2400
agcatgtgtc cttcttaccg gttgagacat cttctggata tatgcccagg cgaggtattg 2460
ctggatcctc cggtagtact atgtccaatt ttctgaggaa ctgccagact gatttccaga 2520
gtggttgtac aagcctgcac tctcaccaac aatggaggag tgttcctctt tctccacatc 2580
cacgccagca tctgctgtca cctgaatttt tgatcttagc cattctgact ggtgtgaggt 2640
ggaatctcag ggttgttttg atttgcattt ccctgatgat taaggatgtt gaacattttt 2700
ttcaggtgct tctctgccat tcggtattcc tcaggtgaga attctttgtt cagttctgag 2760
ccccattttt taatggggtt atttgatttt ctgaagtcca ccttcttgag ttctttatat 2820
atgttggata ttagtcccct atctgattta cgataggtaa agatcctttc ccaatctgtt 2880
ggtggtcttt ttctcttatt gacggtgtct tttgccttgc agaaactttg gagtgagttc 2940
tttatatata ttggatatta gtcccctatc tgatttagga taggtaaaga tcctttccca 3000
atctgttggt gacctttttg tcttattgac ggtgtctttt gccttgcaga atctttgcaa 3060
ttttatgagg tcgcatttgt caattctcga tcttacagca caagtcattg ctgttctgtt 3120
caggaatttt tcctctgtgc ccatatcttc gaggctttta cctgctttct cctctatatg 3180
tttgagtgtc tctggtttaa tgtggagttc cttaatccac ttagatttga ccttagtaca 3240
aggagatagg aatggatcaa ttcgcattct tctacatgat aaccgctagt tgtgccagca 3300
ccatttgttg ataatgctgt cttttttcca ctggatggtt tttgctccct tgtctaagat 3360
caagtgacca taggtgtgtg ggttcatttc tgggtcttca attctatttc attggtctac 3420
ttgtctgttg ttataccagt accatgcaga ttttatcaca attgctctgt agtagagttt 3480
taggtcaggc atggtgatta caccagaggt tttttttatc cttgagcaga gtttttgcta 3540
tcctaggttt tgtgttattt cagatgaatt tgcagattgc cctttccagt tcgttgaaga 3600
attgagttgg aattttgatg gggattgcat tgaatctgta gattgctttg gcaatatagc 3660
catttttact atattgatcc tgccaatcca tgagcatggg agatctttcc atcttctcaa 3720
atcttcttta atttctttct tcagagactt gaagttcttg tcatacagat ctttcacttc 3780
cttagttaga gtcacgctaa ggtattttat attatttgtg actattgaga agggtgttgt 3840
ttccctaatt tctttctcag cctgtttatc ctttgtgtac agaaaagcca ttgacttgtg 3900
ttagttaatc tcatatccag ctacttcact gaagcggttt atcaggttta ggagttctct 3960
ggtgtaattt ttagggtcac tcatatatac tatcatatca tctgcaaaaa gtgacatttt 4020
gacttcttcc tttccaattt gtatcccctt gatctccttt tgttgtcgaa ttgctctggc 4080
aaggacatca agtactatat tgaataggta gggagaaaat cggcaccctt gtctagtccc 4140
tgattttagt aggattgctt caagtttctc accatttact ttgatgttgg ctactggttt 4200
gctgttgaat gctttttatc atgtttaggt atgggccttg aattcctgat ctttccaaga 4260
cttttatcat gaaagggtgt tggattttgt caaatgcttt ctccagcctt tcattctgag 4320
gttgtgtctg tctttttccc tgagatgggt ttcctgtaag cagcaaaatg ttgggtcctg 4380
tttgtgtagc ccgtctgtta ttctatgtct ttttattggg gagttgagtc cattgatatt 4440
aagatatatt aaggaaaagt aattgttgct tcctattatt tttgttttta aagttggcat 4500
tctgttcttg tggctgtctt cttttaggtt tgttgaagga ttcctttctt gctttttcta 4560
ggtcgtggtt tccatccttg tattcatttt ttttctgtta ttatcctttg aaggactgga 4620
ttcatggata gataatgtgt gaatttggtt ttgtcttgga atacttttgt ttctccatct 4680
acggtaattg agagtttggc tgggtatagt agcctgggct ggcaattgtg ttgtcttagt 4740
gtctatataa tgtctgtcca ggatcttctg gctttcatag tctgtggtga aaaatctggt 4800
gtaattctga taggcttgcc tttatatgtt acttgaattt ttcacttact gcttttaata 4860
ttctttcttt atttagtgca tttgttgttc tgattattat gtgtcgggag gaatttcttt 4920
tctggtccag tctatttgga gttctgtagg cttcttgtat gttcacgggc atctctttct 4980
ttaggtttgg gaagttttct tctataattt tgttgaagat atttgctggc ccttcaagtt 5040
gaaaatgttc attctcatct actcctatta ttcgtatggt tggtcttctc attgtgtcct 5100
ggatttcctg gatgttttga gttaggatct ttttgcattt tccattttct ttgattgttg 5160
tgcagatgtt ctctatggaa tcttctgcac ctgatattct ctcttccatc tcttgtagtc 5220
tgttgctgat gctcgcatct atggttccag atttctttcc tagggtttct atctccagtg 5280
ttgccccact ttgggttttc tgtatagtgt ctacttccct ttttagatct agtatggttt 5340
tgttcatttc catcacctgt ttgggtgtgt tttcctgttt ttctttaaag acttgcaact 5400
ctttagcaga gttctcctgt atttaagtga gttattaaag tccttcttga tgtccagtac 5460
cataattgtg agatatgcct ttaaatccaa gtctaggttt ttgggtgtgt tggggtgccc 5520
tggactggct gagttgggag tgctgcattc tgatgatggt gagtggtctt ggtttctgct 5580
agtaagattc ttacatctgc ctttcgccat ctggtaatct ctggagtcag ttgttaaagt 5640
tgtctctggt taaagcttgt tcctctcgtg attctgttat tctcttccag cagacctggg 5700
agactagctc tttcctgagt ttcagtggtc agagcactct ctgcaggcag gatttcctct 5760
ttcagggaag gtgcacagat atctggtgtt cagatttgcc tcctggcaga agatgatggc 5820
ctgaaacagg acctgtccca gaagctgtta gcttctgtag tcaacactgt cacctgtgca 5880
gactagtctc ggtggagtcc gggaaccaag atgtctcctg cagatgctct ggcattccct 5940
tctgggccgg gtgatcacct ctcctctggc agggaaggtg ccctggtgtc tggaacccga 6000
aaagggggct gcctcagaag ctctgtggct actgcctgtc ccagaagctg ttagcttctg 6060
tagtccacac tctcacctgt gcagactagt cttggtggag tctgggaacc aagatgtctc 6120
ccgcagatgc tccagccatt ctcctctttc tgttgcttat tttgacctat gaaatcctgg 6180
acatatagtt ctagtgttgc ttgtaatctc ttttctaagc caaggaattt tttttatcta 6240
gggcacaatc ttttgagaag acatattaaa tcaagagaat aaatattgca agaccaataa 6300
atgataaggt atctattttc tttaaatcca tcgctgtcaa accattcaaa atatcctcac 6360
ataaagccaa aaagatattt attgtgtttc ccatcttagt tgagttcaag tcaatatttt 6420
ggtgccattt tgttgcagta aatctctaac acaaatatgc ctgggcaatg aaaacacaac 6480
tcagttaata tgaatacaga ttgttcagat ctaccactac actaccatct tcttcatcta 6540
agagacccct tagaacttgc agtttctcca ggccttgtgc ttctgcgctg cttttcttct 6600
tcttcctctt ctacattgct tctctcataa acctacttct ttttttccct ccttctgttc 6660
catcttccct tttatctgcc caatcattag ctctccttta ttttacaaat taaggtgtga 6720
agccggtttc taggaaatca cctgagtgct gacttgttcc ttgttcagag ccacgcacag 6780
gagaacagaa ttaacatcaa atataattat ccccagggct atccacaaca cgtgcatcct 6840
ataagatcac cacggactaa tgctggtctt caattacaac ataaacaaca aaaaccccac 6900
atatatgtgg aaacaaatcg aactatacaa agaatcaatg aaaccaggag cttgttcttt 6960
gagaaaaatc aacaagatag ataaaccctt agccagacta accagagggc acagagacag 7020
tatccaaatt aataaagtca gaaatgaaag gaagacataa caatgaaata tatcttaaaa 7080
taattaatct gtttgtagac tattagcagt tgaaaatatt aaaatcatgt tctacaaacg 7140
tggaattatt attgataatt ttctcactgt gcttgaaatt agcattttct taatgtttaa 7200
cttcaaagag tttttgctat tttgaaatat taaacatata cttactgata aaataatttc 7260
cctcctaaca acactgataa tcttttttta agtaaactga ttattagaca atgtacacag 7320
atatataatg tgttttaaat actctcccac tgtcaggtgg tatcatatag ggcctttgaa 7380
tatattttta aatgtattat ttgtaatatt ttatggtctc tcctatgctt atttctgaaa 7440
gaatattttg tatgttttga aacaatttag tatttaacat tagatatagg atcctcagtt 7500
atggatagta ttaaatattc attaatgata tttttaaggt ataaaaggat atgaatataa 7560
aagtttaaca aattttatgt attatttgat tctaaaaata ctcaatatta ttaatatgtt 7620
tgatgtttaa aatgcattta aataataaaa acatttaaaa aaataaaatc aagaaatgag 7680
gttctaagca gaggtcaagg aaaatgagga atagaaaaat agtaaaaatc aatatgtcca 7740
tttattcaag gaaagctcct acatagacat tgcaccagat tagcaaatat tatggtcctc 7800
atattagttt aagttaggag actatgctta tgttatctat ttacattcta aggagcctag 7860
acatttgtga atggattaca ttataagagg aggatgtcta cttaagtagg catgaacgcc 7920
tgtgcattgc accctatgag ttccatcagc attccatgat tggagtatga agaacagcat 7980
tatagacatt acccagaacc ttagtggttc tagaatgcca agataaaaca atctaacctt 8040
ctggatagta gggataaatg ttcctatatc atcagaattc actggtgccc tgaggatgtt 8100
accctgctaa ctgacaattc acaggacatc acatggattc tgataagttg cagaaaagag 8160
gagatgcatt caattggtcc tcctccttct aagctgcaat attaggtgca tccaatttgt 8220
gaacttcaat ttagattaca atagacatga ataatctgaa ttcatgtagt acatattttt 8280
gttttaatat gagttaccat tgttcagaaa attaaataca catgatcaca tattcctaca 8340
tagtgctgtt agtttttcac atctctggga caatattcca aatatctcct tcattagtga 8400
aaatatcaac tactgtaaag cttagctaac atgcctttgc aggaataaga acatcctgga 8460
ttgaaagcta cacagggaga tgtaaaactt tctaagcaca cacattctcc atccattagg 8520
atcatggtcc atgagatttt tctctctctc ttcttcccat taaatgcatg tacatgcagg 8580
ttgggaaaca gattgtgttg cagaatacat ttgcttgatt tccacttcct tctcaatgca 8640
aatatttttg aagtgttaat tttgctgtga gtaccacagt ggttcttgct ctttctgttg 8700
actcctgtct gtgaatgttc caggaattca cacatggaca cacgtggggc tgcatctgag 8760
ctccagactc actgttgtcc ttctgtcctc agctgctctg gcccaggcac agcctcgtga 8820
attcaacaaa gaccctgatc tctcttgttt acacctcatt acaaatggga actgttagag 8880
gtggacccaa ctgcatttcc atgaggaaag cacatgagtt tgagagggtc gttgatgata 8940
aggtagaaac aactttaatt cataggctga gatatcagtc atcacctcca gataaacaag 9000
agccatttct tcctgcatct gagccctgta agcacactag ctttaggaat atgttactgc 9060
tgaagtcaga ttgggcaact tcatagtata caatagaaaa tctacctgca gatgagttca 9120
gaaccagcag ggggcacaat ggggccaaga atccctagca gagagatgtg gtgtgtgtgc 9180
aggggactct gcatcctctg tggtttcctt tcttaactta catgtacctg tagtgattga 9240
catgtaacgt ttccacgctc aaacactgtg aagatacttt gctaaacact tcaaagattt 9300
atgttttctt gatgtgtgca tgtgtgtatt cttttttgtt tttagacaca gggtttctct 9360
gtgtagtcct ggctgccctg gaactcactc tgtagaccag gctggcctcg aactcagaaa 9420
tctgcctgct tctgcctccc aagtgctgaa gttaaagaca tgtgccacca ttgcctggcc 9480
atgtgtgtat tcttgatgca ctcttctgtt gacagataca cagtttattt ccataattta 9540
tttattgtga tggtgctgca ataatcactt atgtacaaat gtttctgaag tatatttagt 9600
tttggtcatt tgggtgatta tttttttctt tctagtatat agcattttgg aaaggtagat 9660
attaattgta tgtatgggaa ggaggctgta aattctaata acttagctgc ttttgaaatt 9720
tgtcctcaat tctatcatcc ttgtaaccac cttaaatcca tctattagcc ttgtcacaag 9780
tgagccactg tctcaggctg caaatctttt tatagattag gtcgtgatgt tacatccaca 9840
gcctctgcac aatgctcagg ggtgggatat gggatgaatt ccctcagaca gcattaggac 9900
ttggatctca gcagactgat tcttgaccca aatgtctctt cttctctagc aggagtaagt 9960
ccttatctaa gatgtactct gctcatgaat atgcaaatca attgagtcta tggtggtaaa 10020
tatagggatg tctacacccc tcaaaaactt aagatcactg tcgtcttcac agtcacagga 10080
gtacacagga catcaccatg tgttggagct gtatcatcct cttcctgtta gcaacagctg 10140
cacgtaaggg gcttacagta gcaggcttga ggtctggcca tacactcatg tgacaatgac 10200
atccactctg tccttccctt cacaggtgtg cactcccagg tccagctgca gcagtctggg 10260
gctgagctgg tgaggcctgg ggcctcagtg aagatttcct gcaaggcttt tggctacacc 10320
ttcacaaacc atcatataaa ctgggtgaag cagaggcctg gacagggcct ggactggatt 10380
ggatatatta atccttataa tgattatact agctacagaa ccagaagttc aagggcaagg 10440
ccacattgac tgtagacaaa tcctccagca cagcctatat ggagcttagc agcctgacat 10500
ctgaggactc tgcagtctat tactgtgcaa gacacagtgc tacaaacaca tcctgagtgt 10560
gtcagaaacc ctggaggaga agcaagcaga gctggaatgg agatgacaga aagattatca 10620
tttagacttg ctcagaaaga gaaattttga atgcccattt attgcctctt ccttacagta 10680
ctatagtgcc tgtttttgtt gacattttca aactaatttc caaagtcact accacaattt 10740
acaatcacat aaaaagcaag caaggataac attattttct gtgcttactt gccatttata 10800
ttcttgctta ttctcatctc actgaggtca tattgggaca ttaaatttct ggggttactt 10860
tttattaaaa atttttcatt attcattcac tttacatcct tctagtcttc ctctcacaca 10920
tgccctatcc ctttctcctc tgagaggatg gagccctccc taccctcgta tccccttacc 10980
caggcacatc aagtgtctgc agtactagga atattctctg tcaatgctgc cagacaaggc 11040
agacaagtta ggggatcagg attcacagga aggcaacagc ttgagggaca gcccccactg 11100
aagttattgg tggattcaca tgaagactga gttgcacatc tgctacatat attcaggggt 11160
cctatttaca gctcaagtag actcttgttg gtggtttagt ctcttagaac cccaagtgtc 11220
caggttagtt gactctgtgg gtcttccttt ggagttccta tcccctccag atccctcagt 11280
tcttctccca actcttccat aagacacccg taggtccatc caatgtttgg ttttgggttt 11340
ttctgcatct gcttcagtca gctgctgggt ggagcatctc tgaggataat tatgagaagc 11400
tcttatgtgc aagcataaca ggatatcatt attagtgtca gggactggtg cttggccatg 11460
ggatgggtct caagtttggt cagttatttg gccattccca cagtctctga taatctttgt 11520
ccctgcattt cttgtagaca ggaaaaatat tgggttgaaa gttttgtggg tgggttggcg 11580
tctctattgc tccactgggc ttctttctgg atataggagt ttgcctcttc aggttccata 11640
ttcccaaagt agtgtgtcac actaaggtca ctcccataca gagggacact cattctcttg 11700
ccacgtctct gtccaccttc attggacctg aggttcctga atcatacaga actgcatgtg 11760
tgcaaccaca cagaacaagg ctatctatca gaggcctacc ataccaggac catcaaggtt 11820
caccttactc ccaatactga ctacaaaaag aacatcaagg accaatgcag tctatatgga 11880
taaacacact tgaaagaaca caaacaagat tgagggcaac atgacacctc caaagcatac 11940
ctaaccgagt acagcatgcc ctggatatcc taacacaatc aaaacacaag aaagttacct 12000
taaatccagt cttataaagg tgatgaaggc ctttaaatag gaaatgaatt aatccttagg 12060
ataatacagg acaatacatt cgaacagata gaggtcttta ggaggaaaga aataaatccc 12120
tcaaagacat acatgaaaat acaattaaac aggtgaaagt aataactaca atggtgtaag 12180
acctaaaaat ggaaatagaa gcaataaagt aacacaaact tagaatcttg aaggtggaaa 12240
acctagagaa caggaatact agatgcaagg atgatatctt ctaggtccat ccatttgctt 12300
gcacaattta tcatgtcctt gcttttaata gttgaacagt atttcattgt ttaaatgaac 12360
cacatgttct gtctccattc tctggatgag ggggtgagca agtttttcca cattctggct 12420
attacaaata gagctgctat gaacctagta gaaaacatat cctgtgtatg gtggagagtt 12480
ttggagtata tcaccaagag tgttatagct gggtcttcat gtagaactat tcctaatttt 12540
ctgagaaatc ccaagtcaga tttctagaat ggttgttcaa gtgttcactc caaccatcaa 12600
tggaggactg ttttccttgc cagcatgtgc tgtattttga gtttttgatc ctagccagtt 12660
ttatcctgca tttcacactt agatatggac tatggtacag gacagagaga aaccaacctt 12720
ctactcacca ggatattcta cctgctacca atttatttat ttatttattt atttatttat 12780
ttatttattt atttatttat attagagaac aacaccatgc agtttagaag aagtactaag 12840
acgtcagtga tgttatactg tgcctaacct tgcattgtac aatctcagct ttcaggtaag 12900
acagtgcatg actcttatgc agtgccaact gttttctgat tgtatttatg gtctattgcc 12960
taggaatgac ctcctctcaa ataaacatgg tcaaaagccc atggcctgag atgacagagc 13020
ccctagtaga ccctagttgt atttctgaag tttagatatc ataatgactt ataaatactt 13080
atgtttatac aatagattag agctgctctc agccatgacc aaggagcttc tgtgttcaat 13140
gaataatgat tgatgcagac attcgtgagt ggtcaaagtg gtgagaatga ttagagagtc 13200
ctcagccaca caagcgttaa tgatatgaac tttccaatat attaactgta ttaatgaata 13260
aatgcagaca tcatatgaga tctcattagt agttcttagg tattgcattt ttatatacaa 13320
ttatgcatat cagtacatta tagtgtataa aggaaattgt ctagcataat agagaaaaat 13380
aggacagtca agaaacaaaa gagtagaaat tatgggtgaa atatgcagtg tgaaatattt 13440
acatgaaaat tttaaccata tgtaaaattg ttatttttgt ttttcagaat gagtttgctc 13500
attctttgac atttttattc ctgtgtgaaa tatatcagga tcatatgtat cccattctga 13560
tggtctgact tccactggga atttccaata tatctcttcc aactaactga ccagtttctt 13620
tttttcttat tttctctctt tctcgttttg ttttgctttg ttttgttttt caagacaggg 13680
tttctctgtg tagctctggc tgtcctggaa ctcactttgt agatcaggct ggcttcgagc 13740
tcataaatcc acttgcctct gcctcctgag tgctgggatt aaaggagtgg ctaccacgcc 13800
cggctagttt ttttttttct tataagaaca acatttactg gatggtcact tacatattca 13860
gaggttcagt caattattat caaggcagaa gcatggcagt ggtccagtag tcatggcact 13920
ggggaaggag ctgagagatc tacatcttgc tccaaaggga aagaggaata gtctgacttc 13980
catgtgtttc agaggagggt ttcatttccc acccccacag tgacacactt cctccaacac 14040
ggccacacct cctaatattg ccactcttgg atcaagcata ttcacaccac aaaggaaagt 14100
ttagagataa acattaagaa aattaatgaa gtcattttat cttatatgct caacatgact 14160
agtacttaaa accataattt tacatgtaca atatttcatg gcataacata ttttttatat 14220
ttttattaga tattttcttt atttatattt caaatgtgat accctttccc aattcccctc 14280
caaaaatccc ctatgccttc ccctcatagc cagctcccaa acccacccac tcctgctttc 14340
tggtcctggc attcccctat actggggcat aaaaccttca caggaccaag tgcctcttct 14400
ccattgatgg ccaattaggc catcctctgc tacatatgca gctagagcca tgagttccac 14460
catgtgtttt ctttgattgg tggtttagtt ccagggagct ctgggggtat tggttagttc 14520
atattgttcc tcctatgggg ctgcaaaccc tttcagcccc ttgggtattt tttctagctc 14580
cttcattggg gaccctgtgc tccatccaat ggatgagtga gcctccactt ttgtatttgt 14640
caggaactgg cagagtctct caggagacaa ttatatcagg ctcctgtcag caaaatctcg 14700
ttggcatctg caatagtgtc tgggtttggt ggttgtttat gggatggatt tctgggtggg 14760
gcagtctctg gattgtcatt cctttagtct ctgcttccac ctttgtcttt gtaactccat 14820
ccatgggtat tttgttcccc cttcaaagaa ggatcaaaat atccacactt tagtcttcct 14880
tcttcttgag tctcatgtgt ttttcaaatt gtatcttggg tattctgagc ttctaggcta 14940
atatccactt atcagtgagt gattatcatg tctgttcttt tgtgattgag ttacctcact 15000
tagcatgata tcctccaggt ctatccattt gtctaagaat ttcataaagt cattgtcttt 15060
aatagctgca tcgtactcaa ttgtgtaaat gcaccacatt ttctttatcc attcctctgt 15120
tgagggacac ttggtttttc ccagcttctg gttattataa ataaggctgc tatgaacata 15180
gtggaacatg tgtccttagt acatgttgga acatcttctg ggtatatgcc caggagtggt 15240
attgctggat cttctggtgg tactatgtcc aaatttttgg ggaaccatca aactgatttc 15300
ctgagtggtt gtacaagctt gcaatcccac accagcaata gtggaatgtt catctttgtc 15360
caagtccttg ccagcatctg ctgtcacctg agtttttgat cttagccatt cttactggtg 15420
tgaggtggaa tcttggggtt gttttgattt gcatttccct gatgtttaag ggttttgaac 15480
atttttaggt gcttattaga catttggtat tcctcagttt agaaatcttt gtttagctct 15540
gtaccacatt tttgaatagg gttatttggt tttctggagt ctaacttctt gagttctttg 15600
tacatattgg atattagccc tctatcagat ttagaattag taaggatctt tccccaaact 15660
gttggtggtt cttttgtctt attgacagtg tactttgcct tagagaagct ttgcaatttt 15720
atgaggtccc atttgtcaat tcttgatctt atagtacaag ccattggtct tttgttcagg 15780
aatttttccc atgtgtccat atgttcaagg catttcccca ctttctccac tacaagtttt 15840
agtgtctctg gttttatgtg gaggtccttg atccacttag atttgagctt tgtacaagga 15900
gataagaatg gatagattca cattcttcta catgctctct gccagttgag ctagcaccat 15960
ttgttgaaaa tgctgtcttt tttttccccc actggatggt ttttagctct tttggccaag 16020
atcaagtgac cattggtgtg tgggttcatt tcttggtctt caattctagt tcactgactt 16080
acctgtttgt cactgtacaa ggaccatgca gcttttttca caattgctct gtagtacagc 16140
ttgaggtctg ggatggtgat tctaccagag agattctttt actgttgtga ataatttttg 16200
ctatcatagg atattttttt atttcagatg aatttacaaa ttgctctttc taactctgtg 16260
aacaattgag ttggaatttt gattgtgatt gctttgaata ctcaagatat aatttacaaa 16320
acacatgaaa cttaacaagg actactaaag tgcagatact tcgatccttc ttagaagggg 16380
gaacaaaata cccatagatg gagttacaga gacaaagttc ggagcagaga ctataggaac 16440
gaccatccag aggtccacct ggggatccat catgtaaaca accacccaaa acagacacta 16500
ttgtggatgc caagaagaac ttgctgacag gagtctgata tagctgtctc ttgagaggct 16560
ctgccagggc ctcagaaagt ggaggctcac agccatccat tggatggagc acagggtccc 16620
caatgaagga gctagagaaa gtactcaagg agctgaaggg gtttgcagcc ccataggagg 16680
aacaacaata tgaactaacc agtaccccca gagctccctg ggactaaacc accaatcaaa 16740
gaaaacacat ggagggactt gaagctcttg ctgcatttat agcagaggat ggcctagatg 16800
gtcatcaatg ggaggagagg tcaatggtcc tgggaaggtt ccatgcccca gtatagggga 16860
atgccagggc caggaagcag gagtgggtgg gctggggatc agggaggggg agatgatagg 16920
gcattttcag tggggaaact aggaaagagg ataacattta aaatataaat aaagaaaata 16980
tctaattaaa aaggattacc tatgtgcatg ggagctcatg agcagcaggg gtcactctaa 17040
ggccaataat ccacatagag cgatgagctg tgtgtgaaca ggactctgta tcctctgtgg 17100
tttcctttct taagtgtatt aactgatctg tccagctgtg attgacatgt gatgtctcca 17160
tgctcaagcc cagtaaagat tctctgttaa ataccttaca gacttatgtt tacttgtttt 17220
tatttgcttt tcatattttt ttaaaaagtc atacaatgta ttctaataac tcattctccc 17280
atctccaatt tattctaagt ttttcttaac tcatccaacc acacactttt taattctgat 17340
aaagcacccc cccccccaaa aaaaaaccca accaaccaaa aaaaaaaaaa gccaaggaat 17400
ttaaaagggg attgaaagca aataaaaact aaacaaaaaa gtaaaaacta cacacacaca 17460
cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacactca cacacacaca cacacaccac 17520
acacacacac acccatgcac gaacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 17580
acacacacac acacatggaa tccagtaaaa ccacaactct ttacccatga tacacaggaa 17640
aatataagtc aaacaaacag aatggaagaa ggtggtatta taaaaatgtc tgcacaaata 17700
ccattaagtt cattttcttg ttggctacca actgctaagc ctgtctccct tgattaattg 17760
tgcttatcat cccctatgaa ctccattgga ggacactaat ttttccttct gtctccagga 17820
attgaagtgt tgcagaactc tcagtagctt tatttacctg cacaatacag cctctaatcc 17880
aaccagtgaa aattaccaca tgagagactt ccaaatgaaa gaacaggtaa agttgtctac 17940
tggcaagctt agtaatatca tgtaaatgcc ttagaattta atgacatatg tcatcctctg 18000
aggttaataa atccattttg gtgcatatat accctgaact caccactaac ataatacaac 18060
aattaaaaaa ttccaacatg gatgcagagg aatccctgag ggacatttgt tgatttgtga 18120
gcacaatata attatttttt gggggggaaa tgtctgaatg ttaactcttt accagtgata 18180
atctattcta ttaatgtgta cataggtagc actaattaaa atcactgtgt tatcaggtaa 18240
tgaaacagag gaagtaggat gctgggaaac agacttttgg aaggtcccaa gggaaaccac 18300
agggacctag tggtgataga ttatggtgag agtcctgaga gtggtcatag attatagcat 18360
atttcatatg caattgaaaa tttcaaagaa tgaaaatcct tatgaaatat agaaataaca 18420
actttactta tgtacatata cttcatagta caatttttac actgtgcata tttctcctgt 18480
aacatctggt tcctcctatt ttcctttatt ctcctagaca atttcactga tacaatctca 18540
tgtttttgta taaatagttg tatataacta ttaaatacat aagctgttaa tgagtcttca 18600
ttaatgtctg tgattttttt attgtcttaa ttaatactat tatctctaat tgcatccaca 18660
ttttcaaaag caatgtaaat ttcttactca tttctgttca aaaacttctg ttgttgtatc 18720
attaccatgc cttagtgata aaatcctttc ttgacacatc tatagctatt gctataattt 18780
agttattgat gatcctcctg caataatcat tgataggtaa atattttaag cacttttact 18840
tttagtcatt ttagtgagat ttgaagtagt atataacctg ttggaaaggc aaatattaat 18900
tccatatatg tgaaagaaga cgctaaaact aaaaacatta gccactttta gatatcttct 18960
ccttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 19020
tcttcttctt cttcttttct tcttcttctt ctccttctcc ttctccttct ccttctcctt 19080
ctcctcttcc tcctccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc 19140
ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc 19200
ttcctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc 19260
tttctttctt tctttctttc tttctttctt ctcctcctcc ttctttttcc ttctccttcc 19320
ccttcacctt ccccttcctt cctctttccc ttccccttct ccttctcctc aatctacaat 19380
ctgttaacat attaacatgt cccagagtag agcaacagac tcaggtcaaa catctactga 19440
gaaatttgcc catgtagtta acatctacag catctgtcta ggggttacaa aaagtctatg 19500
ggatacaatt cctcagaaag gaataggatt tggacctgag catactgctg cctaacacat 19560
gaaatggcag ttcttctcca gctggactag gtccttaact aagaaatgca ctgctcatga 19620
atatgcaaat tacccaagtc tatggcagta aatacagaga tgtccacacc ctgaagacaa 19680
cctatgaaca atgttctctc cacagtccct gaagacactg attctaggac cgaagttcct 19740
attccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttct cgcgcgtctg gcctccgagg 19800
cctccgcgcc gggttttggc gcctcccgcg ggcgcccccc tcctcacggc gagcgctgcc 19860
acgtcagacg aagggcgcag cgagcgtcct gatccttccg cccggacgct caggacagcg 19920
gcccgctgct cataagactc ggccttagaa ccccagtatc agcagaagga cattttagga 19980
cgggacttgg gtgactctag ggcactggtt ttctttccag agagcggaac aggcgaggaa 20040
aagtagtccc ttctcggcga ttctgcggag ggatctccgt ggggcggtga acgccgatga 20100
ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag ctagttccgt cgcagccggg atttgggtcg 20160
cggttcttgt ttgtggatcg ctgtgatcgt cacttggtga gtagcgggct gctgggctgg 20220
ccggggcttt cgtggccgcc gggccgctcg gtgggacgga agcgtgtgga gagaccgcca 20280
agggctgtag tctgggtccg cgagcaaggt tgccctgaac tgggggttgg ggggagcgca 20340
gcaaaatggc ggctgttccc gagtcttgaa tggaagacgc ttgtgaggcg ggctgtgagg 20400
tcgttgaaac aaggtggggg gcatggtggg cggcaagaac ccaaggtctt gaggccttcg 20460
ctaatgcggg aaagctctta ttcgggtgag atgggctggg gcaccatctg gggaccctga 20520
cgtgaagttt gtcactgact ggagaactcg gtttgtcgtc tgttgcgggg gcggcagtta 20580
tggcggtgcc gttgggcagt gcacccgtac ctttgggagc gcgcgccctc gtcgtgtcgt 20640
gacgtcaccc gttctgttgg cttataatgc agggtggggc cacctgccgg taggtgtgcg 20700
gtaggctttt ctccgtcgca ggacgcaggg ttcgggccta gggtaggctc tcctgaatcg 20760
acaggcgccg gacctctggt gaggggaggg ataagtgagg cgtcagtttc tttggtcggt 20820
tttatgtacc tatcttctta agtagctgaa gctccggttt tgaactatgc gctcggggtt 20880
ggcgagtgtg ttttgtgaag ttttttaggc accttttgaa atgtaatcat ttgggtcaat 20940
atgtaatttt cagtgttaga ctagtaaatt gtccgctaaa ttctggccgt ttttggcttt 21000
tttgttagac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac 21060
aaggtgagga actaaaccat gggatcggcc attgaacaag atggattgca cgcaggttct 21120
ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 21180
tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 21240
gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 21300
acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 21360
ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 21420
aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 21480
ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 21540
cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 21600
gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 21660
tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 21720
ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 21780
cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 21840
cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaggggatcc gctgtaagtc 21900
tgcagaaatt gatgatctat taaacaataa agatgtccac taaaatggaa gtttttcctg 21960
tcatactttg ttaagaaggg tgagaacaga gtacctacat tttgaatgga aggattggag 22020
ctacgggggt gggggtgggg tgggattaga taaatgcctg ctctttactg aaggctcttt 22080
actattgctt tatgataatg tttcatagtt ggatatcata atttaaacaa gcaaaaccaa 22140
attaagggcc agctcattcc tcccactcat gatctataga tctatagatc tctcgtggga 22200
tcattgtttt tctcttgatt cccactttgt ggttctaagt actgtggttt ccaaatgtgt 22260
cagtttcata gcctgaagaa cgagatcagc agcctctgtt ccacatacac ttcattctca 22320
gtattgtttt gccaagttct aattccatca gacctcgacc tgcagcccct agagaagttc 22380
ctattccgaa gttcctattc tctagaaagt ataggaactt cctagggttt caccggttaa 22440
atggcatgtc ccctgttagt ggttcatgca agcagaagct gtatcctgtt tgacaaagat 22500
tcagcatgaa aggtcctgct acctaaaaaa aaatagacag atgagattta attaacctaa 22560
ataatttttt tcacaacaac agagtgaata cgcaatttac agaatgacag aaaacttttg 22620
cacactttgc ctgtgacagg gaactaatat gaagaatttg caaggaactc aaacaactct 22680
acaacaacaa cagcaacaag aaccaaataa ctccgttaaa atgagcaaag gacatgagta 22740
gacattttca aaagaacaca tagaaatgga taataaatat ataaacaata ctcaacatca 22800
ctaaccatca gggaaatgca aattaaaacc acaataagat atcatcttcc accagtcaca 22860
atgactatta ctaaaaactc aaataatatc agatgttgct gaggatggga aatgaaggca 22920
actcttagac attgttgatg aggatgtaga tgagtacaac ctctgtggaa aatggtatgg 22980
agatttccca gaaaactaga aatagaactg tcatttggtc cagcaatccc actactgggt 23040
aactacccaa aggaaaataa actattattt caaaaagata cccaccttct atgcttacca 23100
taaaactact ctcaatagca catatgtcaa actgagtgtc tgccaaccga tgattttata 23160
aaagaatata gcatgtatgc acaattcaat actagtcagc cacaataagg aatgaaactg 23220
tgtcttttgc agcaagatgc atagaagtgg gggacaatat aattagtgaa ctaactcaca 23280
aacagaatgt cacatgtcac acattattac ttgtaagtgg gaggtaaaca gcgtgtacac 23340
aaggatttgt agagagaaat tacacacatt ggagacttac aaggatgggc gggcagaagg 23400
tgggagcatg atgagtcatt acataacagg cacaatataa aataattaag aattgaccaa 23460
tgatcttaaa attaaaatgt agaatatgat caataaatga acttgatatt agttgacctc 23520
attaaattta aaaacttttt ctactcaaat gactgtaaga aaatgaatgc ccggttacag 23580
atgagaaact gtttgcgagt caaataacca ccaatgtaac tataataaga aacttcagaa 23640
ctcaactgtg aataaaaaag aaacaactga tggataaatt aggcaagggt ttctacagac 23700
atttcgtcaa agaagatgtg cagatgacac tgaagcatat aaacaggatc tcaacaggat 23760
tttccgttag agaaattcaa atcaagcccg caaagagaca ccactgtaca ctttttaaaa 23820
tggctgaaat taagaagaaa tacagataac atcaatgctg gtgagcatac caggttgcta 23880
gaggctaaaa cattgctaac aggaatgcaa aatgaaacag atactcagga aaataatttt 23940
tagttttctc taaaatcaaa cataccctta acacctgaat atttgcatca gagaaaaaca 24000
atcttacatt cacgcataac ttctattcaa atattcaaga tatcgtgtgt atgtgtgtta 24060
gaaagtaaaa ataacataaa tgtctcaaaa tttgaatagg tgaagaacta ggaagcatct 24120
ataaattgaa taccaccagc aataaaaaaa taacaagtga ccgatacata aactattaca 24180
ggtgaactcc agacattgtg ctaagtgaga gaagccagtc tcaaagatca aagggacaca 24240
gctgtaagca ccacggtcat cctcaggtgt cagtggtttg ggctggactt tctgtgtctc 24300
tttcctgacc agacccagat attgagctcc accacttgca gatggaaaat cctattttca 24360
accatgcagt gaggtttgaa ctgcttcaca gactgaacga aacaaacacg ggctcctttg 24420
aacagcgtcc ggcatttgtt ccaaccacaa gagaacgtcc ctcagctctc ccacctcctc 24480
ggttctctcc tgcaagccag cagccctgca gtttagcctg catctcccgt gcatccaccc 24540
atctccctcc aagcaccttc ccccacaccc tccactgttt ctgagagcac aggcaggctt 24600
tgaacttttc cgcattctgt tgttattgaa gttaggatgt ttaggaccaa cttaaggatc 24660
atattttatg actgaattcc agtgcccctt ctctcctggg acagagtgca taaccaagtt 24720
tctgcaggtg gagacgaagt tgagcttttt tcttcctcag cctaggagat gagcgctaat 24780
tggagggttg gcagaagctt cccaccatcc cagcactttg gttctggtgg ggcggaatcg 24840
gtgccatagg gcagagctag aaaccgcgga ctgaatgttc ccagtggcac tggacccagg 24900
gcagagcctc catccacgag tggggctcta tggaagaagt gagtctctgg ctctcagtag 24960
ctctcgtcca gcactgaacc tcagcatcat gtgctgtgtg cagggtcaga gggccaacgt 25020
actggcccct gggaaagcgt ttcctctggt gggagttggt agaaggtgtc ctgtcttctt 25080
ggctgcatct gtccgcagtg gagtttacat catgctgagc tgggatgtgg aaggaaggaa 25140
gagcatctta gatcaaatat gatgactggc cttactgagt tttctagatt ttcctgaata 25200
aatgtttctt cactcactgt gtgctgttag agtctttcca aacctgtaat ttcccaaaat 25260
aattttcact ggtctcatga gggcatggat tcattgagcc cctcatgctg tcaaagagaa 25320
atagaactgt tttttttttt cacttcatag cgaacatcca tgggttatca aataatgggc 25380
tggcttttct tccaacactt tacagacacc atcaattttc ttcttgctta taaggtttta 25440
accagaagaa tgctgtcatg gtcttttctg ttcttttgga aggaatgccc cctctactca 25500
cctccacttg tctgcctgta tttctatttg tctttggttt tcaacaattt taataagatt 25560
tacctaaatg tgtgtggggg gagcatgggg tgttattctg ctgttctgtg ttctctgaga 25620
tgcatggatt caccatttac tctgtctcca tttttgtgaa aacaattaga aaaaaagtca 25680
gtatgagccc agaaacaagc ctccctgaag tgggcacagg accacctggg ggcgctcagg 25740
acccactgaa cacaagagcc agccccaggg caggtgcaga tgcgggttaa gttctggttt 25800
cctgtcaacc ctgtggcttc ctctccataa aacagtttcc tttgtggcat atctctggat 25860
tccttatcct gttcttcctg tgaagtctct gaagaagaaa catttgtcgt aacaagagaa 25920
aaactttctc acatgcacca aaggcagagt cacctacagt cacttactcc tgtttctcaa 25980
tgtcaataag ttaccaatgc ttctgaagtt aatcagctaa atctataaaa ggtgcggtgt 26040
ttaactcagc attacagccc agctcaacag aactccaaag gtcagccagc agcagccagg 26100
aaaaagtgca tgctgggcat tggggcagag ggagttacca tccagtgcaa gagaagaaag 26160
cccccgtggt ggtcattgtc aggactccaa tcccacagtt ccaattgtag gtgatgccag 26220
gcaaaggaag agagacccca ccaatggtta gtgtggatgt cgagtttgat gtttccacac 26280
tcacactcca ggtgaatatg aaaagattta ttagctctat ttctgaggtg tctgctgaga 26340
gcagcacagt cctctcaaga aattacagat tggaatttcc tcagtagagc aggaaaggag 26400
gctggctcag ggctttataa tgatttggtg gtggggtcgg cggggggggg ggggcgtttc 26460
tactcaggag aaggagcttg tgtgatttaa acctcacact gacatcacat gagggagctt 26520
ccatgatttc ttactagatt tcccatgtgt gggggacaag gatgagggag aataaacctt 26580
aattcatcag catcaaggca ccaaaaatag gacctgacac tttattctcc ctagcagctt 26640
aagaaaatga gtgaaaaaga gagataagag tccacccatg tgctgaaaag catagctctt 26700
ggtaaagacg agaaaaaggc actcctacga agaaggggtt gggcagaagc tttatgctga 26760
agggtttggc taaagagaca taatcaacag gttacaggag gggctactga tgttcatgga 26820
ggtggtcctc acacatgcat actgaacaaa catgtctgta acgtatgacc cctgttcact 26880
taccagtgga gacttagcat ttaaattcat tccagtcagg ccctatgtgc aaacagcaga 26940
agcagagaca caaaggtact cagggtgcag cctctgtgaa cggccagagc caggccatgg 27000
tcagcggtct cggattagga gaaagttcct gatatcactg tagtgttcaa tcaaagctgg 27060
ggttatggtt tgtggaacag gggtcagttc atcagggggt gggctgcaat tgtcttcata 27120
gtgcttgtct cagtgccggt gcttactgag ccactagaga aaaaggttta attgagcttc 27180
tttaaaatca acattttgaa ttatttatca gacgtttcaa atatgtcatg ttgtttagat 27240
tctattgctg gagagttaag gtgatatttg gggttttgta actctgtttt ttcatacttc 27300
ctgaattgct tatctgtttg cttttcatta gctaaactat cgcttcttct tattttttaa 27360
ttcattctga ttttgatgaa tatttaattc cctttagaat gtgaatataa tgtacattgt 27420
gtgggtattt tgattttggt tcttggttta cttagtggca aagactctgt aagagttcct 27480
tgtctataga tagccattat ttagtggctt tctgaaatgg tggttttagt accaaagtac 27540
tggacttgtg agtaggctca ctgccccctg caggtcctag atagtggagg cctcaggaac 27600
tgtttctcat ttggaatgcc tttgtttcag cagattttgt gttgggttgt taagttcacc 27660
ctccacatta gtagatgtcc ttacagatta gagctgactc tggtagaagc agttgagtgc 27720
atgcttgata tctgtgcaca gggagaagct ctctgttgcc tcaggcgatg gactggtcta 27780
tgaaatgcac agtgacctga gttccctgct cagcccctga gaggtggacc aagctggaca 27840
cacatgagcc accgagcctg gcaagcaaaa gcgccagcct tgatggaaat ggcgagctga 27900
gcggcatcta ctcagtgtgg tttcttttgt tattaagagc tttagtgtgg tggctgtttc 27960
aaattcccgt tgtagtagta atatactggg tatgtgagca ggcccgtggt cttttgcggg 28020
gttggaatca ccgaagtaat gagaagctaa tctcattttc aactgctgta cactggtggt 28080
attgagtttg tatgaggtca tgcagtttga acgtcaggcc agtaggtggt gctcgcaggt 28140
aagagccggc tatggtggca gcagaagggt ttatgcttta ctggtgatta aagtgggaaa 28200
cttggcgtgt tccagatctt agagaaaaga tttttagtta tttctcattc aacctgatac 28260
tacctgaaag tctctcgaat gtaactttta ttttgtcgag atgggttctt tctataccca 28320
ttttttatgt tttttttgtg aaaggatgtt gtttcatcaa atgcgttttc agcatcaatt 28380
gaaaaaagtt atatgtggat taaagatcaa aatgtaaaac ctaacactat aaaacctctg 28440
gataataaca taggaaacag aatttaggag gtaagaactg acaaaggttt tataatgaaa 28500
atgctagaag tagttgcaac aaaattgaaa attgacaaat gggacctaag taaattaaag 28560
aacttctgta cagcaaaaga cactatcgac agagtaaaca ggcaacctac agaatgggaa 28620
ataaaatatt tgcagcctat acatctgaca aaggtccgac acttagtata tacatggaaa 28680
tttaacaaac atacaagaaa taaaaagtga ccaaaggaca tgaaaagaca cttcaaaaaa 28740
gacctacatg tggccaacaa gcataggaaa aaatgctgaa tatcactatc attagagaaa 28800
tacatatcaa aacctcaatg aggtaccgtc tcacatcagt caggatggct aatcttaaaa 28860
aaaaaataac agatttttaa ggttacagaa aaaaggggaa atttatacac ttttggcggg 28920
aatataaatg agttcaacca ttgtggaaag cagtgtggtg atccctccaa taacctaaaa 28980
cagaagtttc atttgaccca acaatcctac aactggacat atacctaaag gaatataaac 29040
atgtaggttc actgcagcac tatccacaat agcatagaca tggaatttac ctaaatcccc 29100
atcactggca gaatgataga gaaaaatgtg gtacatacaa ccatggaata ctatgcagct 29160
aaggaaagaa tgaaactatg tcctttgtag gaacatgatg gaactggcag tcaatactct 29220
tagaaaacta attcaggaac agaaaaccag atattatata ttctccctta tttgttggag 29280
ataaataaaa gcaaatattc ttccagggcc tgagtcttcc ttattcaaca agtcattcta 29340
aattaagtgt tcagcaagtt gctgatactc atctaaatat tctatttcat ctgggccact 29400
tacatcactc aaaaagcaat gagagctata tttctaaggg gggttctagg ataataaata 29460
cctgaatagt gagaatatga aggatatgga aactgggcca cttatatcac tcaaaaagga 29520
atgagagcta tatttataag gggggttcta ggataataaa tacctgaata gtgagaatat 29580
gaaggatatg gaaactgggc cacttatatc actcaaaaag caatgaaagc tatatttaca 29640
aggggggttc taggataata aatatctgaa tagtgagaat atgaaggata tggatggttt 29700
ttttttaact caatgggcac ataactgtgg gagatactat attcctatga agaaggtatt 29760
cagacttcag agataagtaa tgtttcctac attgtgcttg tgacttggaa gcagtggatt 29820
gaagagtgtg ataagtgccc agaccaagca gaacagaaat cagcatgtaa agatgatgat 29880
ctatggatat gatctaaaac catgtaaata cttcaaataa ttctatttaa tgcagtttga 29940
aataaaacac aaacttattc aaaatacaaa ttacttggta attattttgg gagctatgag 30000
ttcaccaaga aactcaaatt cctatttcta tttcaacccc tgattcctac tgtcaatggg 30060
agggaagtct cagaaccaat cacacatcag acggcaaatc tgtcaaccaa gagtctttcc 30120
actgaaggac ctgggaggtc aggaccctca ggaaagtgct ggggaccctg tcttgggagt 30180
gcccagcaga tctcagaact ctccatgggt cctgctggac actcatgtag ggtaacgagt 30240
ggccaccttt tcagtgttac cagtgagctc tgagtgttcc taatgggacc aggatgggtc 30300
taggtgcctg ctcaatgtca gagacagcaa tggtcccaca aaaaacccag gtaatcttta 30360
ggccaataaa atgtgggttc acagtgagga gtgcatcctg gggttggggt ttgttctgca 30420
gcgggaagag cgctgtgcac agaaagctta gaaatggggc aagagatgct tttcctcagg 30480
caggatttag ggcttggtct ctcagcatcc cacacttgta cagctgatgt ggcatctgtg 30540
ttttctttct catcctagat caggctttga gctgtgaaat accctgcctc atgcatatgc 30600
aaataacctg aggtcttctg agataaatat agatatattg gtgccctgag agcatcacat 30660
aacaaccaca ttcctcctct gaagaagccc ctgggagcac agctcatcac catggactgg 30720
acctggaggt tcctctttgt ggtggcagca gctacaggta aggggcttcc tagtcctaag 30780
gctgaggaag ggatcctggt ttagttaaag aggattttat tcacccctgt gtcctctcca 30840
caggtgtcca gtcccaggtg cagctggtgc agtctggggc tgaggtgaag aagcctgggt 30900
cctcggtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gaggcacctt cagcagctat gctatcagct 30960
gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agggatcatc cctatctttg 31020
gtacagcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagagtcac gattaccgcg gacaaatcca 31080
cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc gtgtattact 31140
gtgcgagaga cacagtgtga aaacccacat cctgagagtg acaaaaaccc tgagggagaa 31200
ggcagctgtg ccgggctgag gagatgacag gggttattag gtttaaggct gtttacaaaa 31260
tgggttatat atttgagaaa aaaagaacag tagaaacaag tacatactct aattttaaga 31320
taaatattcc attcaagagt cgtaatataa gccaaattca cagagtggaa aaggcgcgat 31380
cgcggagcag gggatcctta gatattggtt ggggttatct caccttaggt ctgaatatgg 31440
ggttgtctta gactgttttg tgctgttaga atagaatacc caagactggg aaatttatac 31500
tgaacggaaa tttatttctc acagttctag aggctgtgaa gtccaagagc acaggtgcca 31560
gagcaagtcc aagagcaagg gaaagtccaa agcaagtcca ggagcatctg gcgaggacct 31620
tcttgctgtg tcatcacatg gcggaaggca agaaagagag caagaggggg ccgaactcac 31680
ccttttataa cagcaccaat cccacccatg aggtggggac cttatgacct aatcactctt 31740
catactgtta caatggcaat gaaatttcaa catgagtttt ggaggagaga agcattcaaa 31800
ccacagcaag ggtgctccta cctcctctct cagggcatct gcagaaagag ctgcaactgc 31860
acgtccttcc tccgtccatc ctccatccct tcccaatgtc cgtgcatatc ctgtgaccca 31920
ggaggtctgg catagggggt gctcctgcct taggtctgag gccctgtctg aagaggggta 31980
ggtgaggagg ccatctgatg gtctgggcca agacagtcac aggacgcatc atttatcatc 32040
aaggaggctg agggttgagt ctccaggtcc agggaactcc ccacaaagtg ggaaccctgc 32100
ccagctccac acagcctctg ctgggggacc ctgctctggt gcagagcctg gggacaggtc 32160
ttgagctcag ccagagtctg cctccctgtc atttaggaac taaaccaagc ggcaggatgc 32220
tggagcccag cccccatctg accttacagg gccaaggctg gggccctggg ttcccctcaa 32280
ggcgcagcag gactggagcc ccaggcagtg caggagtggc caaagctggg gcttcctcca 32340
gagcccccaa gcatcacggc accaagaagg gtaggaccct ggcctgagga attggcacca 32400
aagccccaga aactaccctg gacaccatgg agagaggcct ggaggggaag caccaggcac 32460
tgcctcccct tctgatccca cctgaggtgg ctgccaagcc cagagagccg ctctgatgtc 32520
ccccagccct gcagcccagg gatacctgta ctgtgcccct gggggacccc tggccagtct 32580
gtgcaaagaa gtcaccaccc tacactcaga gacagtgggg gtcctcgtcc cacatcctca 32640
gagcatggcc cggctgctgc agggatggtc tcctggtcct cagagcatgg cccggctgct 32700
gcagggatgg tctcctggtc ctcagagcat ggcccagctg ctgcagggat ggtctcctgg 32760
aggcccccca gtgctctatt gtcagggctc cctccacccc cccgcaccaa gagagagcca 32820
gaccccagca aggcttccag tggcttcagg tcacacccct aggctgaccc cagccccatt 32880
aacacctgcc tgagaaagct ccacgcacca gaactgaccg tctgctccaa ctcttgacct 32940
cccgttctca gggcgtctgc tgaaaaggct gcaactgcac atccttcctc cgtccgttcc 33000
cgatgtccgt gtgtctcctg tggccaggaa ggtctttctc gggacctgag agccgctccc 33060
tgaagtgtcc ccattgggaa ggatggggcc tgtgtctcca ggctctggga ggacagaatc 33120
ctgacctcaa cagtggccgg cacggacaca actggcccca tcccggggac gctgaccagc 33180
gctgggcaac ttttcccttc cccgacgact gagccccgag caccctccct gctcccctac 33240
cacctccctt tacaaggctg tggcctctgc acagatgata atggagcttg gctcattccc 33300
ctagagtcgg tagggagtta aggacaaaac tcagtttcct ccacctgaac tcaagtctgc 33360
ctatgtttac ctaatcacac ctggtggaca gtttggacaa acttgcacac tcagagacac 33420
agacacttct agaaatcatt atctccctgc cccggggacc ccactccagc agaagtctgc 33480
taggcactgg cctgggccct cctgctgtcc taggaggctg ctgacctcct gcctggctcc 33540
tgtccccagg tccagagtca gagcagactc cagggacgct gcaggctagg aagccgcccc 33600
ctccaggcca gggtctagtg caggtgccca ggacaagaaa gattgtgaat gcaggaatga 33660
ctgggccaca cccctcccgt gcacgccccc tcttgccctg caccccacag cccagccccc 33720
cgtgctggat gcccccccac agcagaggtg ctgttctgtg atcccctggg aaagacgccc 33780
tcaacctcca ccctgtccca cggcccaagg aagacaagac acaggccctc tcctcacagt 33840
ctccccacct ggctcctgct gggaccctca aggtgtgaac agggaggatg gttgtctggg 33900
tggcccctag gagcccagat cttcactcta cagaccccaa cccaagcacc cccttctgca 33960
gggcccagct catccccctc ctcctccctc tgctctcctc tcgtcgcctc tacgggaaat 34020
ccgggactca gcagtaaccc tcaggaagca gggcccaggc gccgtttaat aggaggcttc 34080
ctcacaatga aacttttaga aagccttgac tacaatgatg accttggtgt ggctgtgaac 34140
actgtcagct cccacagctg ctgcagcaaa aaatgtccat agacagggtg ggggcccggg 34200
gtcgtctgct gtcctgctca gcccacagca cgcatggagg atctgaggtg ccacacctga 34260
cgcccaggcc agaacatgcc tccctccagg gtgacctgcc atgtcctgca ttgctggagg 34320
gacaggggca gcctatgagg atctggggcc aggagatgaa tcctattaac ccagaggaaa 34380
actaacagga cccaagcacc ctccccgttg aagctgacct gcccagaggg gcctgggccc 34440
accccacaca ccggggcgga atgtgtacag gccccggtct ctgtgggtgt tccgctaact 34500
ggggctccca gtgctcaccc cacaactaaa gcgagcccca gcctccagag cccccgaagg 34560
agatgccgcc cacaagccca gcccccatcc aggaggcccc agagctcagg gcgccggggc 34620
agattctgaa cagccccgag tcacggtggg tacaactgga acgaccaccg tgagaaaaac 34680
tgtgtccaaa actgtctcct ggcccctgct ggaggccgcg ccagagaggg gagcagccgc 34740
cccgaaccta ggtcctgctc agctcacacg acccccagca cccagagcac aacggagtcc 34800
ccattgaatg gtgaggacgg ggaccagggc tccagggggt catggaaggg gctggacccc 34860
atcctactgc tatggtccca gtgctcctgg ccagaactga ccctaccacc gacaagagtc 34920
cctcagggaa acgggggtca ctggcacctc ccagcatcaa ccccaggcag cacaggcata 34980
aaccccacat ccagagccga ctccaggagc agagacaccc cagtaccctg ggggacaccg 35040
accctgatga ctccccactg gaatccaccc cagagtccac caggaccaaa gaccccgccc 35100
ctgtctctgt ccctcactca ggacctgctg cggggcgggc catgagacca gactcgggct 35160
tagggaacac cactgtggcc ccaacctcga ccaggccaca ggcccttcct tcctgccctg 35220
cggcagcaca gactttgggg tctgtgcaga gaggaatcac agaggcccca ggctgaggtg 35280
gtgggggtgg aagaccccca ggaggtggcc cacttccctt cctcccagct ggaacccacc 35340
atgaccttct taagataggg gtgtcatccg aggcaggtcc tccatggagc tcccttcagg 35400
ctcctccccg gtcctcacta ggcctcagtc ccggctgcgg gaatgcagcc accacaggca 35460
caccaggcag cccagaccca gccagcctgc agtgcccaag cccacattct ggagcagagc 35520
aggctgtgtc tgggagagtc tgggctcccc accgcccccc cgcacacccc acccacccct 35580
gtccaggccc tatgcaggag ggtcagagcc ccccatgggg tatggactta gggtctcact 35640
cacgtggctc ccctcctggg tgaaggggtc tcatgcccag atccccacag cagagctggt 35700
caaaggtgga ggcagtggcc ccagggccac cctgacctgg accctcaggc tcctctagcc 35760
ctggctgccc tgctgtccct gggaggcctg gactccacca gaccacaggt ccagggcacc 35820
gcccataggt gctgcccaca ctcagttcac aggaagaaga taagctccag acccccaaga 35880
ctgggacctg ccttcctgcc accgcttgta gctccagacc tccgtgcctc ccccgaccac 35940
ttacacacgg gccagggagc tgttccacaa agatcaaccc caaaccggga ccgcctggca 36000
ctcgggccgc tgccacttcc ctctccattt gttcccagca cctctgtgct ccctccctcc 36060
tccctccttc aggggaacag cctgtgcagc ccctccctgc accccacacc ctggggaggc 36120
ccaaccctgc ctccagccct ttctcccccg ctgctcttcc tgcccatcca gacaaccctg 36180
gggtcccatc cctgcagcct acaccctggt ctccacccag acccctgtct ctccctccag 36240
acacccctcc caggccaacc ctgcacatgc aggccctccc cttttctgct gccagagcct 36300
cagtttctac cctctgtgcc taccccctgc ctcctcctgc ccacaactcg agctcttcct 36360
ctcctggggc ccctgagcca tggcactgac cgtgcactcc cacccccaca ctgcccatgc 36420
cctcaccttc ctcctggaca ctctgacccc gctcccctct tggacccagc cctggtattt 36480
ccaggacaaa ggctcaccca agtcttcccc atgcaggccc ttgccctcac tgcccggtta 36540
cacggcagcc tcctgtgcac agaagcaggg agctcagccc ttccacaggc agaaggcact 36600
gaaagaaatc ggcctccagc accctgatgc acgtccgcct gtgtctctca ctgcccgcac 36660
ctgcagggag gctcggcact ccctgtaaag acgagggatc caggcagcaa catcatggga 36720
gaatgcaggg ctcccagaca gcccagccct ctcgcaggcc tctcctggga agagacctgc 36780
agccaccact gaacagccac ggagcccgct ggatagtaac tgagtcagtg accgacctgg 36840
agggcagggg agcagtgaac cggagcccag accataggga cagagaccag ccgctgacat 36900
cccgagcccc tcactggcgg ccccagaaca ccgcgtggaa acagaacaga cccacattcc 36960
cacctggaac agggcagaca ctgctgagcc cccagcacca gccctgagaa acaccaggca 37020
acggcatcag agggggctcc tgagaaagaa aggaggggag gtctccttca ccagcaagta 37080
cttcccttga ccaaaaacag ggtccacgca actcccccag gacaaaggag gagccccctg 37140
tacagcactg ggctcagagt cctctcccac acaccctgag tttcagacaa aaaccccctg 37200
gaaatcatag tatcagcagg agaactagcc agagacagca agaggggact cagtgactcc 37260
cgcggggaca ggaggatttt gtgggggctc gtgtcactgt gaggatattg tagtagtacc 37320
agctgctata cccacagtga cacagcccca ttcccaaagc cctgctgtaa acgcttccac 37380
ttctggagct gaggggctgg ggggagcgtc tgggaagtag ggcctagggg tggccatcaa 37440
tgcccaaaac gcaccagact cccccccaga catcacccca ctggccagtg agcagagtaa 37500
acagaaaatg agaagcagct gggaagcttg cacaggcccc aaggaaagag ctttggcggg 37560
tgtgcaagag gggatgcggg cagagcctga gcagggcctt ttgctgtttc tgctttcctg 37620
tgcagatagt tccataaact ggtgttcaag atcgatggct gggagtgagc ccaggaggac 37680
agtgtgggaa gggcacaggg aaggagaagc agccgctatc ctacactgtc atctttcaag 37740
agtttgccct gtgcccacaa tgctgcatca tgggatgctt aacagctgat gtagacacag 37800
ctaaagagag aatcagtgaa atggatttgc agcacagatc tgaataaatt ctccagaatg 37860
tggagccaca cagaagcaag cacaaggaaa gtgcctgatg caagggcaaa gtacagtgtg 37920
taccttcagg ctgggcacag acactctgaa aagccttggc aggaactccc tgcaacaaag 37980
cagagccctg caggcaatgc cagctccaga gccctccctg agagcctcat gggcaaagat 38040
gtgcacaaca ggtgtttctc atagccccaa actgagaatg aagcaaacag ccatctgaag 38100
gaaaacaggc aaataaacga tggcaggttc atgaaatgca aacccagaca gccagaagga 38160
caacagtgag ggttacaggt gactctgtgg ttgagttcat gacaatgctg agtaattgga 38220
gtaacaaagg aaagtccaaa aaatactttc aatgtgattt cttctaaata aaatttacag 38280
ccggcaaaat gaactatctt cttaagggat aaactttcca ctaggaaaac tataaggaaa 38340
atcaagaaaa ggatgatcac ataaacacag tggtcgttac ttctactggg gaaggaagag 38400
ggtatgaact gagacacaca gggttggcaa gtctcctaac aagaacagaa caaatacatt 38460
acagtacctt gaaaacagca gttaaaattc taaattgcaa gaagaggaaa atgcacacag 38520
ctgtgtttag aaaattctca gtccagcact gttcataata gcaaagacat taacccaggt 38580
tggataaata aacgatgaca caggcaattg cacaatgata cagacataca ttcagtatat 38640
gagacattga tgatgtatcc ccaaagaaat gactttaaag agaaaaggcc tgatatgtgg 38700
tggcactcac ctccctgggc atccccggac aggctgcagg cacactgtgt ggcagggcag 38760
gctggtacct gctggcagct cctggggcct gatgtggagc aggcacagag ccgtatcccc 38820
ccgaggacat atacccccaa ggacggcaca gttggtacat tccggagaca agcaactcag 38880
ccacactccc aggccagagc ccgagaggga cgcccatgca cagggaggca gagcccagct 38940
cctccacagc cagcagcacc cgtgcagggg ccgccatctg gcaggcacag agcatgggct 39000
gggaggaggg gcagggacac caggcagggt tggcaccaac tgaaaattac agaagtctca 39060
tacatctacc tcagccttgc ctgacctggg cctcacctga cctggacctc acctggcctg 39120
gacctcacct ggcctagacc tcacctctgg gcttcacctg agctcggcct cacctgactt 39180
ggaccttgcc tgtcctgagc tcacatgatc tgggcctcac ctgacctggg tttcacctga 39240
cctgggcttc acctgacctg ggcctcatct gacctgggcc tcactggcct ggacctcacc 39300
tggcctgggc ttcacctggc ctcaggcctc atctgcacct gctccaggtc ttgctggaac 39360
ctcagtagca ctgaggctgc aggggctcat ccagggttgc agaatgactc tagaacctcc 39420
cacatctcag ctttctgggt ggaggcacct ggtggcccag ggaatataaa aagcctgaat 39480
gatgcctgcg tgatttgggg gcaatttata aacccaaaag gacatggcca tgcagcgggt 39540
agggacaata cagacagata tcagcctgaa atggagcctc agggcacagg tgggcacgga 39600
cactgtccac ctaagccagg ggcagacccg agtgtccccg cagtagacct gagagcgctg 39660
ggcccacagc ctcccctcgg tgccctgcta cctcctcagg tcagccctgg acatcccggg 39720
tttccccagg cctggcggta ggtttggggt gaggtctgtg tcactgtggt attacgattt 39780
ttggagtggt tattataccc acagtgtcac agagtccatc aaaaacccat ccctgggaac 39840
cttctgccac agccctccct gtggggcacc gccgcgtgcc atgttaggat tttgactgag 39900
gacacagcac catgggtatg gtggctaccg cagcagtgca gcccgtgacc caaacacaca 39960
gggcagcagg cacaacagac aagcccacaa gtgaccaccc tgagctcctg cctgccagcc 40020
ctggagacca tgaaacagat ggccaggatt atcccatagg tcagccagac ctcagtccaa 40080
caggtctgca tcgctgctgc cctccaatac cagtccggat ggggacaggg ctggcccaca 40140
ttaccatttg ctgccatccg gccaacagtc ccagaagccc ctccctcaag gctgggccac 40200
atgtgtggac cctgagagcc ccccatgtct gagtaggggc accaggaagg tggggctggc 40260
cctgtgcact gtccctgccc ctgtggtccc tggcctgcct ggccctgaca cctgggcctc 40320
tcctgggtca tttccaagac agaagacatt cccaggacag ctggagctgg gagtccatca 40380
tcctgcctgg ccgtcctgag tcctgcgcct ttccaaacct cacccgggaa gccaacagag 40440
gaatcacctc ccacaggcag agacaaagac cttccagaaa tctctgtctc tctccccagt 40500
gggcaccctc ttccagggca gtcctcagtg atatcacagt gggaacccac atctggatcg 40560
ggactgcccc cagaacacaa gatggcccac agggacagcc ccacagccca gcccttccca 40620
gacccctaaa aggcgtccca ccccctgcat ctgccccagg gctcaaactc caggaggact 40680
gactcctgca caccctcctg ccagacatca cctcagcccc tcctggaagg gacaggagcg 40740
cgcaagggtg agtcagaccc tcctgccctc gatggcaggc ggagaagatt cagaaaggtc 40800
tgagatcccc aggacgcagc accactgtca atgggggccc cagacgcctg gaccagggcc 40860
tgcgtgggaa aggcctctgg gcacactcag gggctttttg tgaagggtcc tcctactgtg 40920
tgactacagt aactaccaca gtgatgaacc cagcagcaaa aactgaccgg actcccaagg 40980
tttatgcaca cttctccgct cagagctctc caggatcaga agagccgggc ccaagggttt 41040
ctgcccagac cctcggcctc tagggacatc ttggccatga cagcccatgg gctggtgccc 41100
cacacatcgt ctgccttcaa acaagggctt cagagggctc tgaggtgacc tcactgatga 41160
ccacaggtgc cctggcccct tccccaccag ctgcaccaga ccccgtcatg acagatgccc 41220
cgattccaac agccaattcc tggggccagg aatcgctgta gacaccagcc tccttccaac 41280
acctcctgcc aattgcctgg attcccatcc cggttggaat caagaggaca gcatccccca 41340
ggctcccaac aggcaggact cccacaccct cctctgagag gccgctgtgt tccgtagggc 41400
caggctgcag acagtccccc tcacctgcca ctagacaaat gcctgctgta gatgtcccca 41460
cctggaaaat accactcatg gagcccccag ccccaggtac agctgtagag agagtctctg 41520
aggcccctaa gaagtagcca tgcccagttc tgccgggacc ctcggccagg ctgacaggag 41580
tggacgctgg agctgggccc atactgggcc acataggagc tcaccagtga gggcaggaga 41640
gcacatgccg gggagcaccc agcctcctgc tgaccagagg cccgtcccag agcccaggag 41700
gctgcagagg cctctccagg gggacactgt gcatgtctgg tccctgagca gccccccacg 41760
tccccagtcc tgggggcccc tggcacagct gtctggaccc tctctattcc ctgggaagct 41820
cctcctgaca gccccgcctc cagttccagg tgtggttatt gtcagggggt gtcagactgt 41880
ggtggataca gctatggtta ccacagtggt gctgcccata gcagcaacca ggccaagtag 41940
acaggcccct gctgtgcagc cccaggcctc cagctcacct gcttctcctg gggctctcaa 42000
ggctgctgtt ttctgcactc tcccctctgt ggggagggtt ccctcagtgg gagatctgtt 42060
ctcaacatcc cacggcctca ttcctgcaag gaaggccaat ggatgggcaa cctcacatgc 42120
cgcggctaag atagggtggg cagcctggcg gggacaggac atcctgctgg ggtatctgtc 42180
actgtgccta gtggggcact ggctcccaaa caacgcagtc cttgccaaaa tccccacggc 42240
ctcccccgct aggggctggc ctgatctcct gcagtcctag gaggctgctg acctccagaa 42300
tggctccgtc cccagttcca gggcgagagc agatcccagg ccggctgcag actgggaggc 42360
caccccctcc ttcccagggt tcactgcagg tgaccagggc aggaaatggc ctgaacacag 42420
ggataaccgg gccatccccc aacagagtcc accccctcct gctctgtacc ccgcaccccc 42480
caggccagcc catgacatcc gacaacccca caccagagtc actgcccggt gctgccctag 42540
ggaggacccc tcagccccca ccctgtctag aggactgggg aggacaggac acgccctctc 42600
cttatggttc ccccacctgg ctctggctgg gacccttggg gtgtggacag aaaggacgct 42660
tgcctgattg gcccccagga gcccagaact tctctccagg gaccccagcc cgagcacccc 42720
cttacccagg acccagccct gcccctcctc ccctctgctc tcctctcatc accccatggg 42780
aatccagaat ccccaggaag ccatcaggaa gggctgaggg aggaagtggg gccactgcac 42840
caccaggcag gaggctctgt ctttgtgaac ccagggaggt gccagcctcc tagagggtat 42900
ggtccaccct gcctatggct cccacagtgg caggctgcag ggaaggacca gggacggtgt 42960
gggggagggc tcagggcccc gcgggtgctc catcttggat gagcctatct ctctcaccca 43020
cggactcgcc cacctcctct tcaccctggc cacacgtcgt ccacaccatc ctaagtccca 43080
cctacaccag agccggcaca gccagtgcag acagaggctg gggtgcaggg gggccgactg 43140
ggcagcttcg gggagggagg aatggaggaa ggggagttca gtgaagaggc ccccctcccc 43200
tgggtccagg atcctcctct gggacccccg gatcccatcc cctccaggct ctgggaggag 43260
aagcaggatg ggagaatctg tgcgggaccc tctcacagtg gaatacctcc acagcggctc 43320
aggccagata caaaagcccc tcagtgagcc ctccactgca gtgctgggcc tgggggcagc 43380
cgctcccaca caggatgaac ccagcacccc gaggatgtcc tgccaggggg agctcagagc 43440
catgaaggag caggatatgg gacccccgat acaggcacag acctcagctc cattcaggac 43500
tgccacgtcc tgccctggga ggaacccctt tctctagtcc ctgcaggcca ggaggcagct 43560
gactcctgac ttggacgcct attccagaca ccagacagag gggcaggccc cccagaacca 43620
gggatgagga cgccccgtca aggccagaaa agaccaagtt gcgctgagcc cagcaaggga 43680
aggtccccaa acaaaccagg aagtttctga aggtgtctgt gtcacagtgg agtatagcag 43740
ctcgtcccac agtgacactc gccaggccag aaaccccatc ccaagtcagc ggaatgcaga 43800
gagagcaggg aggacatgtt taggatctga ggccgcacct gacacccagg ccagcagacg 43860
tctcctgtcc acggcaccct gccatgtcct gcatttctgg aagaacaagg gcaggctgaa 43920
gggggtccag gaccaggaga tgggtccgct ctacccagag aaggagccag gcaggacaca 43980
agccccctcc ccattgaggc tgacctgccc agagggtcct gggcccaccc aacacaccgg 44040
ggcggaatgt gtgcaggcct cggtctctgt gggtgttccg ctagctgggg ctcacagtgc 44100
tcaccccaca cctaaaacga gccacagcct ccggagcccc tgaaggagac cccgcccaca 44160
agcccagccc ccacccagga ggccccagag cacagggcgc cccgtcggat tctgaacagc 44220
cccgagtcac agtgggtata actggaacta ccactgtgag aaaagcttcg tccaaaacgg 44280
tctcctggcc acagtcggag gccccgccag agaggggagc agccacccca aacccatgtt 44340
ctgccggctc ccatgacccc gtgcacctgg agccccacgg tgtccccact ggatgggagg 44400
acaagggccg ggggctccgg cgggtcgggg caggggcttg atggcttcct tctgccgtgg 44460
ccccattgcc cctggctgga gttgaccctt ctgacaagtg tcctcagaga gtcagggatc 44520
agtggcacct cccaacatca accccacgca gcccaggcac aaaccccaca tccagggcca 44580
actccaggaa cagagacacc ccaataccct gggggacccc gaccctgatg actcccgtcc 44640
catctctgtc cctcacttgg ggcctgctgc ggggcgagca cttgggagca aactcaggct 44700
taggggacac cactgtgggc ctgacctcga gcaggccaca gacccttccc tcctgccctg 44760
gtgcagcaca gactttgggg tctgggcagg gaggaacttc tggcaggtca ccaagcacag 44820
agcccccagg ctgaggtggc cccaggggga accccagcag gtggcccact acccttcctc 44880
ccagctggac cccatgtctt ccccaagata ggggtgccat ccaaggcagg tcctccatgg 44940
agcccccttc aggctcctct ccagacccca ctgggcctca gtccccactc taggaatgca 45000
gccaccacgg gcacaccagg cagcccaggc ccagccaccc tgcagtgccc aagcccacac 45060
cctggaggag agcagggtgc gtctgggagg ggctgggctc cccaccccca cccccacctg 45120
cacaccccac ccacccttgc ccgggccccc tgcaggaggg tcagagcccc catgggatat 45180
ggacttaggg tctcactcac gcacctcccc tcctgggaga aggggtctca tgcccagatc 45240
cccccagcag cgctggtcac aggtagaggc agtggcccca gggccaccct gacctggccc 45300
ctcaggctcc tctagccctg gctgccctgc tgtccctggg aggcctgggc tccaccagac 45360
cacaggtcta gggcaccgcc cacactgggg ccgcccacac acagctcaca ggaagaagat 45420
aagctccaga cccccaggcc cgggacctgc cttgctgcta cgacttcctg ccccagacct 45480
cgttgccctc ccccgtccac ttacacacag gccaggaagc tgttcccaca cagaccaacc 45540
ccagacgggg accacctggc actcaggtca ctgccatttc cttctccatt cacttccaat 45600
gcctctgtgc ttcctccctc ctccttcctt cgggggagca ccctgtgcag ctcctccctg 45660
cagtccacac cctggggaga cccgaccctg cagcccacac cctggggaga cctgaccctc 45720
ctccagccct ttctcccccg ctgctcttgc cacccaccaa gacagccctg gggtcctgtc 45780
cctacagccc ccacccagtt ctctacctag acccgtcttc ctccctctaa acacctctcc 45840
caggccaacc ctacacctgc aggccctccc ctccactgcc aaagaccctc agtttctcct 45900
gcctgtgccc acccccgtgc tcctcctgcc cacagctcga gctcttcctc tcctagggcc 45960
cctgagggat ggcattgacc gtgccctcgc acccacacac tgcccatgcc ctcacattcc 46020
tcctggccac tccagcccca ctcccctctc aggcctggct ctggtatttc tgggacaaag 46080
ccttacccaa gtctttccca tgcaggcctg ggcccttacc ctcactgccc ggttacaggg 46140
cagcctcctg tgcacagaag cagggagctc agcccttcca caggcagaag gcactgaaag 46200
aaatcggcct ccagcgcctt gacacacgtc tgcctgtgtc tctcactgcc cgcacctgca 46260
gggaggctcg gcactccctc taaagacgag ggatccaggc agcagcatca caggagaatg 46320
cagggctacc agacatccca gtcctctcac aggcctctcc tgggaagaga cctgaagacg 46380
cccagtcaac ggagtctaac accaaacctc cctggaggcc gatgggtagt aacggagtca 46440
ttgccagacc tggaggcagg ggagcagtga gcccgagccc acaccatagg gccagaggac 46500
agccactgac atcccaagcc actcactggt ggtcccacaa caccccatgg aaagaggaca 46560
gacccacagt cccacctgga ccagggcaga gactgctgag acccagcacc agaaccaacc 46620
aagaaacacc aggcaacagc atcagagggg gctctggcag aacagaggag gggaggtctc 46680
cttcaccagc aggcgcttcc cttgaccgaa gacaggatcc atgcaactcc cccaggacaa 46740
aggaggagcc ccttgttcag cactgggctc agagtcctct ccaagacacc cagagtttca 46800
gacaaaaacc ccctggaatg cacagtctca gcaggagagc cagccagagc cagcaagatg 46860
gggctcagtg acacccgcag ggacaggagg attttgtggg ggctcgtgtc actgtgagga 46920
tattgtacta atggtgtatg ctatacccac agtgacacag ccccattccc aaagccctac 46980
tgcaaacgca ttccacttct ggggctgagg ggctggggga gcgtctggga aatagggctc 47040
aggggtgtcc atcaatgccc aaaacgcacc agactcccct ccatacatca cacccaccag 47100
ccagcgagca gagtaaacag aaaatgagaa gcaagctggg gaagcttgca caggccccaa 47160
ggaaagagct ttggcgggtg tgtaagaggg gatgcgggca gagcctgagc agggcctttt 47220
gctgtttctg ctttcctgtg cagagagttc cataaactgg tgttcgagat caatggctgg 47280
gagtgagccc aggaggacag cgtgggaaga gcacagggaa ggaggagcag ccgctatcct 47340
acactgtcat ctttcgaaag tttgccttgt gcccacactg ctgcatcatg ggatgcttaa 47400
cagctgatgt agacacagct aaagagagaa tcagtgagat ggatttgcag cacagatctg 47460
aataaattct ccagaatgtg gagcagcaca gaagcaagca cacagaaagt gcctgatgca 47520
aggacaaagt tcagtgggca ccttcaggca ttgctgctgg gcacagacac tctgaaaagc 47580
cctggcagga actccctgtg acaaagcaga accctcaggc aatgccagcc ccagagccct 47640
ccctgagagc ctcatgggca aagatgtgca caacaggtgt ttctcatagc cccaaactga 47700
gagcaaagca aacgtccatc tgaaggagaa caggcaaata aacgatggca ggttcatgaa 47760
atgcaaaccc agacagccac aagcacaaaa gtacagggtt ataagcgact ctggttgagt 47820
tcatgacaat gctgagtaat tggagtaaca aagtaaactc caaaaaatac tttcaatgtg 47880
atttcttcta aataaaattt acaccctgca aaatgaactg tcttcttaag ggatacattt 47940
cccagttaga aaaccataaa gaaaaccaag aaaaggatga tcacataaac acagtggtgg 48000
ttacttctgc tggggaagga agagggtatg aactgagata cacagggtgg gcaagtctcc 48060
taacaagaac agaacgaata cattacagta ccttgaaaac agcagttaaa cttctaaatt 48120
gcaagaagag gaaaatgcac acagttgtgt ttagaaaatt ctcagtccag cactgttcat 48180
aatagcaaag acattaaccc aggtcggata aataagcgat gacacaggca attgcacaat 48240
gatacagaca tatatttagt atatgagaca tcgatgatgt atccccaaat aaacgacttt 48300
aaagagataa agggctgatg tgtggtggca ttcacctccc tgggatcccc ggacaggttg 48360
caggctcact gtgcagcagg gcaggcgggt acctgctggc agttcctggg gcctgatgtg 48420
gagcaagcgc agggccatat atcccggagg acggcacagt cagtgaattc cagagagaag 48480
caactcagcc acactcccca ggcagagccc gagagggacg cccacgcaca gggaggcaga 48540
gcccagcacc tccgcagcca gcaccacctg cgcacgggcc accaccttgc aggcacagag 48600
tgggtgctga gaggaggggc agggacacca ggcagggtga gcacccagag aaaactgcag 48660
acgcctcaca catccacctc agcctcccct gacctggacc tcactggcct gggcctcact 48720
taacctgggc ttcacctgac cttggcctca cctgacttgg acctcgcctg tcccaagctt 48780
tacctgacct gggcctcaac tcacctgaac gtctcctgac ctgggtttaa cctgtcctgg 48840
aactcacctg gccttggctt cccctgacct ggacctcatc tggcctgggc ttcacctggc 48900
ctgggcctca cctgacctgg acctcatctg gcctggacct cacctggcct ggacttcacc 48960
tggcctgggc ttcacctgac ctggacctca cctggcctcg ggcctcacct gcacctgctc 49020
caggtcttgc tggagcctga gtagcactga gggtgcagaa gctcatccag ggttggggaa 49080
tgactctaga agtctcccac atctgacctt tctgggtgga ggcagctggt ggccctggga 49140
atataaaaat ctccagaatg atgactctgt gatttgtggg caacttatga acccgaaagg 49200
acatggccat ggggtgggta gggacatagg gacagatgcc agcctgaggt ggagcctcag 49260
gacacaggtg ggcacggaca ctatccacat aagcgaggga tagacccgag tgtccccaca 49320
gcagacctga gagcgctggg cccacagcct cccctcagag ccctgctgcc tcctccggtc 49380
agccctggac atcccaggtt tccccaggcc tggcggtagg tttagaatga ggtctgtgtc 49440
actgtggtat tacgatattt tgactggtta ttataaccac agtgtcacag agtccatcaa 49500
aaacccatgc ctggaagctt cccgccacag ccctccccat ggggccctgc tgcctcctca 49560
ggtcagcccc ggacatcccg ggtttcccca ggctgggcgg taggtttggg gtgaggtctg 49620
tgtcactgtg gtattactat ggttcgggga gttattataa ccacagtgtc acagagtcca 49680
tcaaaaaccc atccctggga gcctcccgcc acagccctcc ctgcagggga ccggtacgtg 49740
ccatgttagg attttgatcg aggagacagc accatgggta tggtggctac cacagcagtg 49800
cagcctgtga cccaaacccg cagggcagca ggcacgatgg acaggcccgt gactgaccac 49860
gctgggctcc agcctgccag ccctggagat catgaaacag atggccaagg tcaccctaca 49920
ggtcatccag atctggctcc gaggggtctg catcgctgct gccctcccaa cgccagtcca 49980
aatgggacag ggacggcctc acagcaccat ctgctgccat caggccagcg atcccagaag 50040
cccctccctc aaggctgggc acatgtgtgg acactgagag ccctcatatc tgagtagggg 50100
caccaggagg gaggggctgg ccctgtgcac tgtccctgcc cctgtggtcc ctggcctgcc 50160
tggccctgac acctgagcct ctcctgggtc atttccaaga cagaagacat tcctggggac 50220
agccggagct gggcgtcgct catcctgccc ggccgtcctg agtcctgctc atttccagac 50280
ctcaccgggg aagccaacag aggactcgcc tcccacattc agagacaaag aaccttccag 50340
aaatccctgc ctctctcccc agtggacacc ctcttccagg acagtcctca gtggcatcac 50400
agcggcctga gatccccagg acgcagcacc gctgtcaata ggggccccaa atgcctggac 50460
cagggcctgc gtgggaaagg cctctggcca cactcgggct ttttgtgaag ggccctcctg 50520
ctgtgtgact acagtaacta ccatagtgat gaacccagtg gcaaaaactg gctggaaacc 50580
caggggctgt gtgcacgcct cagcttggag ctctccagga gcacaagagc cgggcccaag 50640
gatttgtgcc cagaccctca gcctctaggg acacctgggt catctcagcc tgggctggtg 50700
ccctgcacac catcttcctc caaatagggg cttcagaggg ctctgaggtg acctcactca 50760
tgaccacagg tgacctggcc cttccctgcc agctatacca gaccctgtct tgacagatgc 50820
cccgattcca acagccaatt cctgggaccc tgaatagctg tagacaccag cctcattcca 50880
gtacctcctg ccaattgcct ggattcccat cctggctgga atcaagaagg cagcatccgc 50940
caggctccca acaggcagga ctcccgcaca ccctcctctg agaggccgct gtgttccgca 51000
gggccaggcc ctggacagtt cccctcacct gccactagag aaacacctgc cattgtcgtc 51060
cccacctgga aaagaccact cgtggagccc ccagccccag gtacagctgt agagacagtc 51120
ctcgaggccc ctaagaagga gccatgccca gttctgccgg gaccctcggc caggccgaca 51180
ggagtggacg ctggagctgg gcccacactg ggccacatag gagctcacca gtgagggcag 51240
gagagcacat gccggggagc acccagcctc ctgctgacca gaggcccgtc ccagagccca 51300
ggaggctgca gaggcctctc cagggagaca ctgtgcatgt ctggtaccta agcagccccc 51360
cacgtcccca gtcctggggg cccctggctc agctgtctgg gccctccctg ctccctggga 51420
agctcctcct gacagccccg cctccagttc caggtgtggt tattgtcagg cgatgtcaga 51480
ctgtggtgga tatagtggct acgattacca cagtggtgcc gcccatagca gcaaccaggc 51540
caagtagaca ggcccctgct gcgcagcccc aggcatccac ttcacctgct tctcctgggg 51600
ctctcaaggc tgctgtctgt cctctggccc tctgtgggga gggttccctc agtgggaggt 51660
ctgtgctcca gggcagggat gattgagata gaaatcaaag gctggcaggg aaaggcagct 51720
tcccgccctg agaggtgcag gcagcaccac ggagccacgg agtcacagag ccacggagcc 51780
cccattgtgg gcatttgaga gtgctgtgcc cccggcaggc ccagccctga tggggaagcc 51840
tgtcccatcc cacagcccgg gtcccacggg cagcgggcac agaagctgcc aggttgtcct 51900
ctatgatcct catccctcca gcagcatccc ctccacagtg gggaaactga ggcttggagc 51960
accacccggc cccctggaaa tgaggctgtg agcccagaca gtgggcccag agcactgtga 52020
gtaccccggc agtacctggc tgcagggatc agccagagat gccaaaccct gagtgaccag 52080
cctacaggag gatccggccc cacccaggcc actcgattaa tgctcaaccc cctgccctgg 52140
agacctcttc cagtaccacc agcagctcag cttctcaggg cctcatccct gcaaggaagg 52200
tcaagggctg ggcctgccag aaacacagca ccctccctag ccctggctaa gacagggtgg 52260
gcagacggct gtggacggga catattgctg gggcatttct cactgtcact tctgggtggt 52320
agctctgaca aaaacgcaga ccctgccaaa atccccactg cctcccgcta ggggctggcc 52380
tggaatcctg ctgtcctagg aggctgctga cctccaggat ggctccgtcc ccagttccag 52440
ggcgagagca gatcccaggc aggctgtagg ctgggaggcc acccctgccc ttgccggggt 52500
tgaatgcagg tgcccaaggc aggaaatggc atgagcacag ggatgaccgg gacatgcccc 52560
accagagtgc gccccttcct gctctgcacc ctgcaccccc caggccagcc cacgacgtcc 52620
aacaactggg cctgggtggc agccccaccc agacaggaca gacccagcac cctgaggagg 52680
tcctgccagg gggagctaag agccatgaag gagcaagata tggggccccc gatacaggca 52740
cagatgtcag ctccatccag gaccacccag cccacaccct gagaggaacg tctgtctcca 52800
gcctctgcag gtcgggaggc agctgacccc tgacttggac ccctattcca gacaccagac 52860
agaggcgcag gccccccaga accagggttg agggacgccc cgtcaaagcc agacaaaacc 52920
aaggggtgtt gagcccagca agggaaggcc cccaaacaga ccaggaggtt tctgaaggtg 52980
tctgtgtcac agtggggtat agcagcagct ggtaccacag tgacactcac ccagccagaa 53040
accccattcc aagtcagcgg aagcagagag agcagggagg acacgtttag gatctgagac 53100
tgcacctgac acccaggcca gcagacgtct cccctccagg gcaccccacc ctgtcctgca 53160
tttctgcaag atcaggggcg gcctgagggg gggtctaggg tgaggagatg ggtcccctgt 53220
acaccaagga ggagttaggc aggtcccgag cactctcccc attgaggctg acctgcccag 53280
agagtcctgg gcccacccca cacaccgggg cggaatgtgt gcaggcctcg gtctctgtgg 53340
gtgttccgct agctggggct cacagtgctc accccacacc taaaatgagc cacagcctcc 53400
ggagcccccg caggagaccc cgcccacaag cccagccccc acccaggagg ccccagagct 53460
cagggcgccc cgtcggattc cgaacagccc cgagtcacag cgggtataac cggaaccacc 53520
actgtcagaa tagctacgtc aaaaactgtc cagtggccac tgccggaggc cccgccagag 53580
agggcagcag ccactctgat cccatgtcct gccggctccc atgaccccca gcacgcggag 53640
ccccacagtg tccccactgg atgggaggac aagagctggg gattccggcg ggtcggggca 53700
ggggcttgat cgcatccttc tgccgtggct ccagtgcccc tggctggagt tgacccttct 53760
gacaagtgtc ctcagagaga caggcatcac cggcgcctcc caacatcaac cccaggcagc 53820
acaggcacaa accccacatc cagagccaac tccaggagca gagacacccc aataccctgg 53880
gggaccccga ccctgatgac ttcccactgg aattcgccgt agagtccacc aggaccaaag 53940
accctgcctc tgcctctgtc cctcactcag gacctgctgc cgggcgaggc cttgggagca 54000
gacttgggct taggggacac cagtgtgacc ccgaccttga ccaggacgca gacctttcct 54060
tcctttcctg gggcagcaca gactttgggg tctgggccag gaggaacttc tggcaggtcg 54120
ccaagcacag aggccacagg ctgaggtggc cctggaaaga cctccaggag gtggccactc 54180
cccttcctcc cagctggacc ccatgtcctc cccaagataa gggtgccatc caaggcaggt 54240
gctccttgga gccccattca gactcctccc tggaccccac tgggcctcag tcccagctct 54300
ggggatgaag ccaccacaag cacaccaggc agcccaggcc cagccaccct gcagtgccca 54360
agcacacact ctggagcaga gcagggtgcc tctgggaggg gctgagctcc ccaccccacc 54420
cccacctgca caccccaccc acccctgccc agcggctctg caggagggtc agagccccac 54480
atggggtatg gacttagggt ctcactcacg tggctcccat catgagtgaa ggggcctcaa 54540
gcccaggttc ccacagcagc gcctgtcgca agtggaggca gaggcccgag ggccaccctg 54600
acctggtccc tgaggttcct gcagcccagg ctgccctgct gtccctggga ggcctgggct 54660
ccaccagacc acaggtccag ggcaccgggt gcaggagcca cccacacaca gctcacagga 54720
agaagataag ctccagaccc ccagggccag aacctgcctt cctgctactg cttcctgccc 54780
cagacctggg cgccctcccc cgtccactta cacacaggcc aggaagctgt tcccacacag 54840
aacaacccca aaccaggacc gcctggcact caggtggctg ccatttcctt ctccatttgc 54900
tcccagcgcc tctgtcctcc ctggttcctc cttcggggga acagcctgtg cagccagtcc 54960
ctgcagccca caccctgggg agacccaacc ctgcctgggg cccttccaac cctgctgctc 55020
ttactgccca cccagaaaac tctggggtcc tgtccctgca gtccctaccc tggtctccac 55080
ccagacccct gtgtatcact ccagacaccc ctcccaggca aaccctgcac ctgcaggccc 55140
tgtcctcttc tgtcgctaga gcctcagttt ctcccccctg tgcccacacc ctacctcctc 55200
ctgcccacaa ctctaactct tcttctcctg gagcccctga gccatggcat tgaccctgcc 55260
ctcccaccac ccacagccca tgccctcacc ttcctcctgg ccactccgac cccgccccct 55320
ctcaggccaa gccctggtat ttccaggaca aaggctcacc caagtctttc ccaggcaggc 55380
ctgggctctt gccctcactt cccggttaca cgggagcctc ctgtgcacag aagcagggag 55440
ctcagccctt ccacaggcag aaggcactga aagaaatcgg cctccagcac cttgacacac 55500
gtccgcccgt gtctctcact gcccgcacct gcagggaggc tccgcactcc ctctaaagac 55560
aagggatcca ggcagcagca tcacgggaga atgcagggct cccagacatc ccagtcctct 55620
cacaggcctc tcctgggaag agacctgcag ccaccaccaa acagccacag aggctgctgg 55680
atagtaactg agtcaatgac cgacctggag ggcaggggag cagtgagccg gagcccatac 55740
catagggaca gagaccagcc gctgacatcc cgagctcctc aatggtggcc ccataacaca 55800
cctaggaaac ataacacacc cacagcccca cctggaacag ggcagagact gctgagcccc 55860
cagcaccagc cccaagaaac accaggcaac agtatcagag ggggctcccg agaaagagag 55920
gaggggagat ctccttcacc atcaaatgct tcccttgacc aaaaacaggg tccacgcaac 55980
tcccccagga caaaggagga gccccctata cagcactggg ctcagagtcc tctctgagac 56040
accctgagtt tcagacaaca acccgctgga atgcacagtc tcagcaggag aacagaccaa 56100
agccagcaaa agggacctcg gtgacaccag tagggacagg aggattttgt gggggctcgt 56160
gtcactgtga ggatattgta gtggtggtag ctgctactcc cacagtgaca cagacccatt 56220
cccaaagccc tactgcaaac acacccactc ctggggctga ggggctgggg gagcgtctgg 56280
gaagtagggt ccaggggtgt ctatcaatgt ccaaaatgca ccagactccc cgccaaacac 56340
caccccacca gccagcgagc agggtaaaca gaaaatgaga ggctctggga agcttgcaca 56400
ggccccaagg aaagagcttt ggcgggtgtg caagagggga tgcaggcaga gcctgagcag 56460
ggccttttgc tgtttctgct ttcctgtgca gagagttcca taaactggtg ttcaagatca 56520
gtggctggga atgagcccag gagggcagtc tgtgggaaga gcacagggaa ggaggagcag 56580
ccgctatcct acactgtcat ctttcaaaag tttgccttgt gaccacacta ttgcatcatg 56640
ggatgcttaa gagctgatgt agacacagct aaagagagaa tcagtgagat gaatttgcag 56700
catagatctg aataaactct ccagaatgtg gagcagtaca gaagcaaaca cacagaaagt 56760
gcctgatgca aggacaaagt tcagtgggca ccttcaggca ttgctgctgg gcacagacac 56820
tctgaaaagc cttggcagga tctccctgcg acaaagcaga accctcaggc aatgccagcc 56880
ccagagccct ccctgagagc gtcatgggga aagatgtgca gaacagctga ttatcataga 56940
ctcaaactga gaacagagca aacgtccatc tgaagaacag tcaaataagc aatggtaggt 57000
tcatgcaatg caaacccaga cagccagggg acaacagtag agggctacag gcggctttgc 57060
ggttgagttc atgacaatgc tgagtaattg gagtaacaga ggaaagccca aaaaatactt 57120
ttaatgtgat ttcttctaaa taaaatttac accaggcaaa atgaactgtc ttcttaaggg 57180
ataaactttc ccctggaaaa actacaagga aaattaagaa aacgatgatc acataaacac 57240
agttgtggtt acttctactg gggaaggaag agggtatgag ctgagacaca cagagtcggc 57300
aagtctccaa gcaagcacag aacgaataca ttacagtacc ttgaatacag cagttaaact 57360
tctaaatcgc aagaacagga aaatgcacac agctgtgttt agaaaattct cagtccagca 57420
ctattcataa tagcaaagac attaacccag gttggataaa taaatgatga cacaggcaat 57480
tgcacaatga tacagacata catttagtac atgagacatc gatgatgtat ccccaaagaa 57540
atgactttaa agagaaaagg cctgatgtgt ggtggcactc acctccctgg gatccccgga 57600
caggttgcag gcacactgtg tggcagggca ggctggtaca tgctggcagc tcctggggcc 57660
tgatgtggag caagcgcagg gctgtatacc cccaaggatg gcacagtcag tgaattccag 57720
agagaagcag ctcagccaca ctgcccaggc agagcccgag agggacgccc acgtacaggg 57780
aggcagagcc cagctcctcc acagccacca ccacctgtgc acgggccacc accttgcagg 57840
cacagagtgg gtgctgagag gaggggcagg gacaccaggc agggtgagca cccagagaaa 57900
actgcagaag cctcacacat ccacctcagc ctcccctgac ctggacctca cctggtctgg 57960
acctcacctg gcctgggcct cacctgacct ggacctcacc tggcctgggc ttcacctgac 58020
ctggacctca cctggcctcc ggcctcacct gcacctgctc caggtcttgc tggaacctga 58080
gtagcactga ggctgcagaa gctcatccag ggttggggaa tgactctgga actctcccac 58140
atctgacctt tctgggtgga ggcatctggt ggccctggga atataaaaag ccccagaatg 58200
gtgcctgcgt gatttggggg caatttatga acccgaaagg acatggccat ggggtgggta 58260
gggacatagg gacagatgcc agcctgaggt ggagcctcag gacacagttg gacgcggaca 58320
ctatccacat aagcgaggga cagacccgag tgttcctgca gtagacctga gagcgctggg 58380
cccacagcct cccctcggtg ccctgctgcc tcctcaggtc agccctggac atcccgggtt 58440
tccccaggcc agatggtagg tttgaagtga ggtctgtgtc actgtggtat tatgattacg 58500
tttgggggag ttatcgttat acccacagca tcacacggtc catcagaaac ccatgccaca 58560
gccctccccg caggggaccg ccgcgtgcca tgttacgatt ttgatcgagg acacagcgcc 58620
atgggtatgg tggctaccac agcagtgcag cccatgaccc aaacacacag ggcagcaggc 58680
acaatggaca ggcctgtgag tgaccatgct gggctccagc ccgccagccc cggagaccat 58740
gaaacagatg gccaaggtca ccccacagtt cagccagaca tggctccgtg gggtctgcat 58800
cgctgctgcc ctctaacacc agcccagatg gggacaaggc caaccccaca ttaccatctc 58860
ctgctgtcca cccagtggtc ccagaagccc ctccctcatg gctgagccac atgtgtgaac 58920
cctgagagca ccccatgtca gagtaggggc agcagaaggg cggggctggc cctgtgcact 58980
gtccctgcac ccatggtccc tcgcctgcct ggccctgaca cctgagcctc ttctgagtca 59040
tttctaagat agaagacatt cccggggaca gccggagctg ggcgtcgctc atcccgcccg 59100
gccgtcctga gtcctgcttg tttccagacc tcaccaggga agccaacaga ggactcacct 59160
cacacagtca gagacaaaga accttccaga aatccctgtc tcactcccca gtgggcacct 59220
tcttccagga cattcctcgg tcgcatcaca gcaggcaccc acatctggat caggacggcc 59280
cccagaacac aagatggccc atggggacag ccccacaacc caggccttcc cagaccccta 59340
aaaggcgtcc caccccctgc acctgcccca gggctaaaaa tccaggaggc ttgactcccg 59400
cataccctcc agccagacat cacctcagcc ccctcctgga ggggacagga gcccgggagg 59460
gtgagtcaga cccacctgcc ctcgatggca ggcggggaag attcagaaag gcctgagatc 59520
cccaggacgc agcaccactg tcaatggggg ccccagacgc ctggaccagg gcctgcgtgg 59580
gaaaggccgc tgggcacact caggggcttt ttgtgaaggc ccctcctact gtgtgactac 59640
ggtgactacc acagtgatga aactagcagc aaaaactggc cggacaccca gggaccatgc 59700
acacttctca gcttggagct ctccaggacc agaagagtca ggtctgaggg tttgtagcca 59760
gaccctcggc ctctagggac accctggcca tcacagcgga tgggctggtg ccccacatgc 59820
catctgctcc aaacaggggc ttcagagggc tctgaggtga cttcactcat gaccacaggt 59880
gccctggccc cttccccgcc agctacaccg aaccctgtcc caacagctgc cccagttcca 59940
acagccaatt cctggggccc agaattgctg tagacaccag cctcgttcca gcacctcctg 60000
ccaattgcct ggattcacat cctggctgga atcaagaggg cagcatccgc caggctccca 60060
acaggcagga ctcccgcaca ccctcctctg agaggccgct gtgttccgca gggccaggcc 60120
ctggacagtt cccctcacct gccactagag aaacacctgc cattgtcgtc cccacctgga 60180
aaagaccact cgtggagccc ccagccccag gtacagctgt agagagactc cccgagggat 60240
ctaagaagga gccatgcgca gttctgccgg gaccctcggc caggccgaca ggagtggaca 60300
ctggagctgg gcccacactg ggccacatag gagctcacca gtgagggcag gagagcacat 60360
gccggggagc acccagcctc ctgctgacca gaggcccgtc ccagagccca ggaggctgca 60420
gaggcctctc cagggggaca ctgtgcatgt ctggtccctg agcagccccc cacgtcccca 60480
gtcctggggg cccctggcac agctgtctgg accctccctg ttccctggga agctcctcct 60540
gacagccccg cctccagttc caggtgtggt tattgtcagg gggtgtcaga ctgtggtgga 60600
tacagctatg gttaccacag tggtgctgcc catagcagca accaggccaa gtagacaggc 60660
ccctgctgtg cagccccagg cctccacttc acctgcttct cctggggctc tcaaggtcac 60720
tgttgtctgt actctgccct ctgtggggag ggttccctca gtgggaggtc tgttctcaac 60780
atcccagggc ctcatgtctg cacggaaggc caatggatgg gcaacctcac atgccgcggc 60840
taagataggg tgggcagcct ggcgggggac agtacatact gctggggtgt ctgtcactgt 60900
gcctagtggg gcactggctc ccaaacaacg cagtcctcgc caaaatcccc acagcctccc 60960
ctgctagggg ctggcctgat ctcctgcagt cctaggaggc tgctgacctc cagaatgtct 61020
ccgtccccag ttccagggcg agagcagatc ccaggccggc tgcagactgg gaggccaccc 61080
cctccttccc agggttcact ggaggtgacc aaggtaggaa atggccttaa cacagggatg 61140
actgcgccat cccccaacag agtcagcccc ctcctgctct gtaccccgca ccccccaggc 61200
cagtccacga aaaccagggc cccacatcag agtcactgcc tggcccggcc ctggggcgga 61260
cccctcagcc cccaccctgt ctagaggact tggggggaca ggacacaggc cctctcctta 61320
tggttccccc acctgcctcc ggccgggacc cttggggtgt ggacagaaag gacacctgcc 61380
taattggccc ccaggaaccc agaacttctc tccagggacc ccagcccgag caccccctta 61440
cccaggaccc agccctgccc ctcctcccct ctgctctcct ctcatcaccc catgggaatc 61500
cggtatcccc aggaagccat caggaagggc tgaaggagga agcggggccg tgcaccaccg 61560
ggcaggaggc tccgtcttcg tgaacccagg gaagtgccag cctcctagag ggtatggtcc 61620
accctgcctg gggctcccac cgtggcaggc tgcggggaag gaccagggac ggtgtggggg 61680
agggctcagg gccctgcggg tgctcctcca tcttcggtga gcctccccct tcacccaccg 61740
tcccgcccac ctcctctcca ccctggctgc acgtcttcca caccatcctg agtcctacct 61800
acaccagagc cagcaaagcc agtgcagaca aaggctgggg tgcagggggg ctgccagggc 61860
agcttcgggg agggaaggat ggagggaggg gaggtcagtg aagaggcccc cttcccctgg 61920
gtccaggatc ctcctctggg acccccggat cccatcccct cctggctctg ggaggagaag 61980
caggatggga gaatctgtgc gggaccctct cacagtggaa tatccccaca gcggctcagg 62040
ccagacccaa aagcccctca gtgagccctc cactgcagtc ctgggcctgg gtagcagccc 62100
ctcccacaga ggacagaccc agcaccccga agaagtcctg ccagggggag ctcagagcca 62160
tgaaagagca ggatatgggg tccccgatac aggcacagac ctcagctcca tccaggccca 62220
ccgggaccca ccatgggagg aacacctgtc tccgggttgt gaggtagctg gcctctgtct 62280
cggaccccac tccagacacc agacagaggg gcaggccccc caaaaccagg gttgagggat 62340
gatccgtcaa ggcagacaag accaaggggc actgacccca gcaagggaag gctcccaaac 62400
agacgaggag gtttctgaag ctgtctgtat cacagtgggg tatagcagtg gctggtacca 62460
cagtgacact cgccaggcca gaaaccccgt cccaagtcag cggaagcaga gagagcaggg 62520
aggacacgtt taggatctga ggccgcacct gacacccagg gcagcagacg tctcccctcc 62580
agggcaccct ccaccgtcct gcgtttcttc aagaataggg gcggcctgag ggggtccagg 62640
gccaggcgat aggtcccctc taccccaagg aggagccagg caggacccga gcaccgtccc 62700
cattgaggct gacctgccca gacgggcctg ggcccacccc acacaccggg gcggaatgtg 62760
tgcaggcccc agtctctgtg ggtgttccgc tagctggggc ccccagtgct caccccacac 62820
ctaaagcgag ccccagcctc cagagccccc taagcattcc ccgcccagca gcccagcccc 62880
tgcccccacc caggaggccc cagagctcag ggcgcctggt cggattctga acagccccga 62940
gtcacagtgg gtataactgg aacgaccacc gtgagaaaaa ctgtgtccaa aactgactcc 63000
tggcagcagt cggaggcccc gccagagagg ggagcagccg gcctgaaccc atgtcctgcc 63060
ggttcccatg acccccagca cccagagccc cacggtgtcc ccgttggata atgaggacaa 63120
gggctggggg ctccggtggt ttgcggcagg gacttgatca catccttctg ctgtggcccc 63180
attgcctctg gctggagttg acccttctga caagtgtcct cagaaagaca gggatcaccg 63240
gcacctccca atatcaaccc caggcagcac agacacaaac cccacatcca gagccaactc 63300
caggagcaga gacaccccaa cactctgggg gaccccaacc gtgataactc cccactggaa 63360
tccgccccag agtctaccag gaccaaaggc cctgccctgt ctctgtccct cactcagggc 63420
ctcctgcagg gcgagcgctt gggagcagac tcggtcttag gggacaccac tgtgggcccc 63480
aactttgatg aggccactga cccttccttc ctttcctggg gcagcacaga ctttggggtc 63540
tgggcaggga agaactactg gctggtggcc aatcacagag cccccaggcc gaggtggccc 63600
caagaaggcc ctcaggaggt ggccactcca cttcctccca gctggacccc aggtcctccc 63660
caagataggg gtgccatcca aggcaggtcc tccatggagc ccccttcaga ctcctcccgg 63720
gaccccactg gacctcagtc cctgctctgg gaatgcagcc accacaagca caccaggaag 63780
cccaggccca gccaccctgc agtgggcaag cccacactct ggagcagagc agggtgcgtc 63840
tgggaggggc taacctcccc accccccacc ccccatctgc acacagccac ctaccactgc 63900
ccagaccctc tgcaggaggg ccaagccacc atggggtatg gacttagggt ctcactcacg 63960
tgcctcccct cctgggagaa ggggcctcat gcccagatcc ctgcagcact agacacagct 64020
ggaggcagtg gccccagggc caccctgacc tggcatctaa ggctgctcca gcccagacag 64080
cactgccgtt cctgggaagc ctgggctcca ccagaccaca ggtccagggc acagcccaca 64140
ggagccaccc acacacagct cacaggaaga agataagctc cagaccccag ggcgggacct 64200
gccttcctgc caccacttac acacaggcca gggagctgtt cccacacaga tcaaccccaa 64260
accgggactg cctggcacta gggtcactgc catttccctc tccattccct cccagtgcct 64320
ctgtgctccc tccttctggg gaacaccctg tgcagcccct ccctgcagcc cacacgctgg 64380
ggagacccca ccctgcctcg ggccttttct acctgctgca cttgccgccc acccaaacaa 64440
ccctgggtac gtgaccctgc agtcctcacc ctgatctgca accagacccc tgtccctccc 64500
tctaaacacc cctcccaggc caactctgca cctgcaggcc ctccgctctt ctgccacaag 64560
agcctcaggt tttcctacct gtgcccaccc cctaacccct cctgcccaca acttgagttc 64620
ttcctctcct ggagcccttg agccatggca ctgaccctac actcccaccc acacactgcc 64680
catgccatca ccttcctcct ggacactctg accccgctcc cctccctctc agacccggcc 64740
ctggtatttc caggacaaag gctcacccaa gtcttcccca tgcaggccct tgccctcact 64800
gcctggttac acgggagcct cctgtgcgca gaagcaggga gctcagctct tccacaggca 64860
gaaggcactg aaagaaatca gcctccagtg ccttgacaca cgtccgcctg tgtctctcac 64920
tgcctgcacc tgcagggagg ctccgcactc cctctaaaga tgagggatcc aggcagcaac 64980
atcacgggag aatgcagggc tcccagacag cccagccctc tcgcaggcct ctcctgggaa 65040
gagacctgca gccaccactg aacagccacg gaggtcgctg gatagtaacc gagtcagtga 65100
ccgacctgga gggcagggga gcagtgaacc ggagcccata ccatagggac agagaccagc 65160
cgctaacatc ccgagcccct cactggcggc cccagaacac cccgtggaaa gagaacagac 65220
ccacagtccc acctggaaca gggcagacac tgctgagccc ccagcaccag ccccaagaaa 65280
cactaggcaa cagcatcaga gggggctcct gagaaagaga ggaggggagg tctccttcac 65340
catcaaatgc ttcccttgac caaaaacagg gtccacgcaa ctcccccagg acaaaggagg 65400
agccccctgt acagcactgg gctcagagtc ctctctgaga caggctcagt ttcagacaac 65460
aacccgctgg aatgcacagt ctcagcagga gagccaggcc agagccagca agaggagact 65520
cggtgacacc agtctcctgt agggacagga ggattttgtg ggggttcgtg tcactgtgag 65580
catattgtgg tggtgactgc tattcccaca gtgacacaac cccattccta aagccctact 65640
gcaaacgcac ccactcctgg gactgagggg ctgggggagc gtctgggaag tatggcctag 65700
gggtgtccat caatgcccaa aatgcaccag actctcccca agacatcacc ccaccagcca 65760
gtgagcagag taaacagaaa atgagaagca gctgggaagc ttgcacaggc cccaaggaaa 65820
gagctttggc aggtgtgcaa gaggggatgt gggcagagcc tcagcagggc cttttgctgt 65880
ttctgctttc ctgtgcagag agttccataa actggtattc aagatcaatg gctgggagtg 65940
agcccaggag gacagtgtgg gaagagcaca gggaaggagg agcagccgct atcctacact 66000
gtcatctttt gaaagtttgc cctgtgccca caatgctgca tcatgggatg cttaacagct 66060
gatgtagaca cagctaaaga gagaatcagt gaaatgcatt tgcagcacag atctgaataa 66120
atcctccaga atgtggagca gcacagaagc aagcacacag aaagtgcctg atgccaaggc 66180
aaagttcagt gggcaccttc aggcattgct gctgggcaca gacactctga aaagcactgg 66240
caggaactgc ctgtgacaaa gcagaaccct caggcaatgc cagccctaga gcccttcctg 66300
agaacctcat gggcaaagat gtgcagaaca gctgtttgtc atagccccaa actatggggc 66360
tggacaaagc aaacgtccat ctgaaggaga acagacaaat aaacgatggc aggttcatga 66420
aatgcaaact aggacagcca gaggacaaca gtagagagct acaggcggct ttgcggttga 66480
gttcatgaca atgctgagta attggagtaa cagaggaaag cccaaaaaat acttttaatg 66540
tgatttcttc taaataaaat ttacacccgg caaaatgaac tatcttctta agggataaac 66600
tttcccctgg aaaaactata aggaaaatca agaaaacgat gatcacataa acacagtggt 66660
ggttacttct actggggaag gaagagggta tgagctgaga cacacagagt cggcaagtct 66720
cctaacaaga acagaacaaa tacattacag taccttgaaa acagcagtta aacttctaaa 66780
tcgcaagaag aggaaaatgc acacacctgt gtttagaaaa ttctcagtcc agcactgttc 66840
ataatagcaa agacattaac ccaggttgga taaataagcg atgacacagg caattgcaca 66900
atgatacaga catacattca gtatatgaga catcgatgat gtatccccaa agaaatgact 66960
ttaaagagaa aaggcctgat gtgtggtggc aatcacctcc ctgggcatcc ccggacaggc 67020
tgcaggctca ctgtgtggca gggcaggcag gcacctgctg gcagctcctg gggcctgatg 67080
tggagcaggc acagagctgt atatccccaa ggaaggtaca gtcagtgcat tccagagaga 67140
agcaactcag ccacactccc tggccagaac ccaagatgca cacccatgca cagggaggca 67200
gagcccagca cctccgcagc caccaccacc tgcgcacggg ccaccacctt gcaggcacag 67260
agtgggtgct gagaggaggg gcagggacac caggcagggt gagcacccag agaaaactgc 67320
agaagcctca cacatccacc tcagcctccc ctgacctgga cctcacctgg cctgggcctc 67380
acctgacctg gacctcacct ggcctgggct tcacctggcc tgggcttcac ctgacctgga 67440
cctcacctgg cctcgggcct cacctggcct gggcttcacc tggcctgggc ttcacctgac 67500
ctggacctca cctggcctgg gcctcacctg acctggacct cacctggcct gggcttcacc 67560
tggcctgggc ttcacctggc ctgggcttca cctgacctgg acctcacctg gcctgggctt 67620
cacctgacct ggacctcacc tggcctcggg cctcacctgc acctgctcca ggtcttgctg 67680
gagcctgagt agcactgagg ctgtagggac tcatccaggg ttggggaatg actctgcaac 67740
tctcccacat ctgacctttc tgggtggagg cacctggtgg cccagggaat ataaaaagcc 67800
ccagaatgat gcctgtgtga tttgggggca atttatgaac ccgaaaggac atggccatgg 67860
ggtgggtagg gacagtaggg acagatgtca gcctgaggtg aagcctcagg acacaggtgg 67920
gcatggacag tgtccaccta agcgagggac agacccgagt gtccctgcag tagacctgag 67980
agcgctgggc ccacagcctc ccctcggggc cctgctgcct cctcaggtca gccctggaca 68040
tcccgggttt ccccaggcct ggcggtaggt ttgaagtgag gtctgtgtca ctgtggtatt 68100
actatgatag tagtggttat tactaccaca gtgtcacaga gtccatcaaa aactcatgcc 68160
tgggagcctc ccaccacagc cctccctgcg ggggaccgct gcatgccgtg ttaggatttt 68220
gatcgaggac acggcgccat gggtatggtg gctaccacag cagtgcagcc catgacccaa 68280
acacacgggg cagcagaaac aatggacagg cccacaagtg accatgatgg gctccagccc 68340
accagcccca gagaccatga aacagatggc caaggtcacc ctacaggtca tccagatctg 68400
gctccaaggg gtctgcatcg ctgctgccct cccaacgcca aaccagatgg agacagggcc 68460
ggccccatag caccatctgc tgccgtccac ccagcagtcc cggaagcccc tccctgaacg 68520
ctgggccacg tgtgtgaacc ctgcgagccc cccatgtcag agtaggggca gcaggagggc 68580
ggggctggcc ctgtgcactg tcactgcccc tgtggtccct ggcctgcctg gccctgacac 68640
ctgagcctct cctgggtcat ttccaagaca ttcccaggga cagccggagc tgggagtcgc 68700
tcatcctgcc tggctgtcct gagtcctgct catttccaga cctcaccagg gaagccaaca 68760
gaggactcac ctcacacagt cagagacaac gaaccttcca gaaatccctg tttctctccc 68820
cagtgagaga aaccctcttc cagggtttct cttctctccc accctcttcc aggacagtcc 68880
tcagcagcat cacagcggga acgcacatct ggatcaggac ggcccccaga acacgcgatg 68940
gcccatgggg acagcccagc ccttcccaga cccctaaaag gtatccccac cttgcacctg 69000
ccccagggct caaactccag gaggcctgac tcctgcacac cctcctgcca gatatcacct 69060
cagccccctc ctggagggga caggagcccg ggagggtgag tcagacccac ctgccctcaa 69120
tggcaggcgg ggaagattca gaaaggcctg agatccccag gacgcagcac cactgtcaat 69180
gggggcccca gacgcctgga ccagggcctg tgtgggaaag gcctctggcc acactcaggg 69240
gctttttgtg aagggccctc ctgctgtgtg actacggtgg taactcccac agtgatgaaa 69300
ccagcagcaa aaactgaccg gactcgcagg gtttatgcac acttctcggc tcggagctct 69360
ccaggagcac aagagccagg cccgagggtt tgtgcccaga ccctcggcct ctagggacac 69420
ccgggccatc ttagccgatg ggctgatgcc ctgcacaccg tgtgctgcca aacaggggct 69480
tcagagggct ctgaggtgac ttcactcatg accacaggtg ccctggtccc ttcactgcca 69540
gctgcaccag accctgttcc gagagatgcc ccagttccaa aagccaattc ctggggccgg 69600
gaattactgt agacaccagc ctcattccag tacctcctgc caattgcctg gattcccatc 69660
ctggctggaa tcaagagggc agcatccgcc aggctcccaa caggcaggac tcccacacac 69720
cctcctctga gaggccgctg tgttccgcag ggccaggccg cagacagttc ccctcacctg 69780
cccatgtaga aacacctgcc attgtcgtcc ccacctggca aagaccactt gtggagcccc 69840
cagccccagg tacagctgta gagagagtcc tcgaggcccc taagaaggag ccatgcccag 69900
ttctgccggg accctcggcc aggccgacag gagtggacgc tggagctggg cccacactgg 69960
gccacatagg agctcaccag tgagggcagg agagcacatg ccggggagca cccagcctcc 70020
tgctgaccag agacccgtcc cagagcccag gaggctgcag aggcctctcc agggggacac 70080
agtgcatgtc tggtccctga gcagccccca ggctctctag cactgggggc ccctggcaca 70140
gctgtctgga ccctccctgt tccctgggaa gctcctcctg acagccccgc ctccagttcc 70200
aggtgtggtt attgtcaggg ggtgccaggc cgtggtagag atggctacaa ttaccacagt 70260
ggtgccgccc atagcagcaa ccaggccaag tagacagacc cctgccacgc agccccaggc 70320
ctccagctca cctgcttctc ctggggctct caaggctgct gtctgccctc tggccctctg 70380
tggggagggt tccctcagtg ggaggtctgt gctccagggc agggatgact gagatagaaa 70440
tcaaaggctg gcagggaaag gcagcttccc gccctgagag gtgcaggcag caccacagag 70500
ccatggagtc acagagccac ggagccccca gtgtgggcgt gtgagggtgc tgggctcccg 70560
gcaggcccag ccctgatggg gaagcctgcc ccgtcccaca gcccaggtcc ccaggggcag 70620
caggcacaga agctgccaag ctgtgctcta cgatcctcat ccctccagca gcatccactc 70680
cacagtgggg aaactgagcc ttggagaacc acccagcccc ctggaaacaa ggcggggagc 70740
ccagacagtg ggcccagagc actgtgtgta tcctggcact aggtgcaggg accacccgga 70800
gatccccatc actgagtggc cagcctgcag aaggacccaa ccccaaccag gccgcttgat 70860
taagctccat ccccctgtcc tgggaacctc ttcccagcgc caccaacagc tcggcttccc 70920
aggccctcat ccctccaagg aaggccaaag gctgggcctg ccaggggcac agtaccctcc 70980
cttgccctgg ctaagacagg gtgggcagac ggctgcagat aggacatatt gctggggcat 71040
cttgctctgt gactactggg tactggctct caacgcagac cctaccaaaa tccccactgc 71100
ctcccctgct aggggctggc ctggtctcct cctgctgtcc taggaggctg ctgacctcca 71160
ggatggcttc tgtccccagt tctagggcca gagcagatcc caggcaggct gtaggctggg 71220
aggccacccc tgtccttgcc gaggttcagt gcaggcaccc aggacaggaa atggcctgaa 71280
cacagggatg actgtgccat gccctaccta agtccgcccc tttctactct gcaaccccca 71340
ctccccaggt cagcccatga cgaccaacaa cccaacacca gagtcactgc ctggccctgc 71400
cctggggagg acccctcagc ccccaccctg tctagaggag ttggggggac aggacacagg 71460
ctctctcctt atggttcccc cacctggctc ctgccgggac ccttggggtg tggacagaaa 71520
ggacgcctgc ctaattggcc cccaggaacc cagaacttct ctccagggac cccagcccga 71580
gcaccccctt acccaggacc cagccctgcc cctcctcccc tctgctctcc tctcatcact 71640
ccatgggaat ccagaatccc caggaagcca tcaggaaggg ctgaaggagg aagcggggcc 71700
gctgcaccac cgggcaggag gctccgtctt cgtgaaccca gggaagtgcc agcctcctag 71760
agggtatggt ccaccctgcc tggggctccc accgtggcag gctgcgggga aggaccaggg 71820
acggtgtggg ggagggctca gggccctgca ggtgctccat cttggatgag cccatccctc 71880
tcacccaccg acccgcccac ctcctctcca ccctggccac acgtcgtcca caccatcctg 71940
agtcccacct acaccagagc cagcagagcc agtgcagaca gaggctgggg tgcagggggg 72000
ccgccagggc agctttgggg agggaggaat ggaggaaggg gaggtcagtg aagaggcccc 72060
cctcccctgg gtctaggatc cacctttggg acccccggat cccatcccct ccaggctctg 72120
ggaggagaag caggatggga gattctgtgc aggaccctct cacagtggaa tacctccaca 72180
gcggctcagg ccagatacaa aagcccctca gtgagccctc cactgcagtg cagggcctgg 72240
gggcagcccc tcccacagag gacagaccca gcaccccgaa gaagtcctgc cagggggagc 72300
tcagagccat gaaggagcaa gatatgggga ccccaatact ggcacagacc tcagctccat 72360
ccaggcccac caggacccac catgggtgga acacctgtct ccggcccctg ctggctgtga 72420
ggcagctggc ctctgtctcg gacccccatt ccagacacca gacagaggga caggcccccc 72480
agaaccagtg ttgagggaca cccctgtcca gggcagccaa gtccaagagg cgcgctgagc 72540
ccagcaaggg aaggccccca aacaaaccag gaggtttctg aagctgtctg tgtcacagtc 72600
gggtatagca gcggctacca caatgacact gggcaggaca gaaaccccat cccaagtcag 72660
ccgaaggcag agagagcagg caggacacat ttaggatctg aggccacacc tgacactcaa 72720
gccaacagat gtctcccctc cagggcgccc tgccctgttc agtgttcctg agaaaacagg 72780
ggcagcctga ggggatccag ggccaggaga tgggtcccct ctaccccgag gaggagccag 72840
gcgggaatcc cagccccctc cccattgagg ccatcctgcc cagaggggcc cggacccacc 72900
ccacacaccc aggcagaatg tgtgcaggcc tcaggctctg tgggtgccgc tagctggggc 72960
tgccagtcct caccccacac ctaaggtgag ccacagccgc cagagcctcc acaggagacc 73020
ccacccagca gcccagcccc tacccaggag gccccagagc tcagggcgcc tgggtggatt 73080
ctgaacagcc ccgagtcacg gtgggtatag tgggagctac taccactgtg agaaaagcta 73140
tgtccaaaac tgtctcccgg ccactgctgg aggcccagcc agagaaggga ccagccgccc 73200
gaacatacga ccttcccaga cctcatgacc cccagcactt ggagctccac agtgtcccca 73260
ttggatggtg aggatggggg ccggggccat ctgcacctcc caacatcacc cccaggcagc 73320
acaggcacaa accccaaatc cagagccgac accaggaaca cagacacccc aataccctgg 73380
gggaccctgg ccctggtgac ttcccactgg gatccacccc cgtgtccacc tggatcaaag 73440
accccaccgc tgtctctgtc cctcactcag ggcctgctga ggggcgggtg ctttggagca 73500
gactcaggtt taggggccac cattgtgggg cccaacctcg accaggacac agatttttct 73560
ttcctgccct ggggcaacac agactttggg gtctgtgcag ggaggacctt ctggaaagtc 73620
accaagcaca gagccctgac tgaggtggtc tcaggaagac ccccaggagg gggcttgtgc 73680
cccttcctct catgtggacc ccatgccccc caagataggg gcatcatgca gggcaggtcc 73740
tccatgcagc caccactagg caactccctg gcgccggtcc ccactgcgcc tccatcccgg 73800
ctctggggat gcagccacca tggccacacc aggcagcccg ggtccagcaa ccctgcagtg 73860
cccaagccct tggcaggatt cccagaggct ggagcccacc cctcctcatc cccccacacc 73920
tgcacacaca cacctacccc ctgcccagtc cccctccagg agggttggag ccgcccatag 73980
ggtgggggct ccaggtctca ctcactcgct tcccttcctg ggcaaaggag cctcgtgccc 74040
cggtcccccc tgacggcgct gggcacaggt gtgggtactg ggccccaggg ctcctccagc 74100
cccagctgcc ctgctctccc tgggaggcct gggcaccacc agaccaccag tccagggcac 74160
agccccaggg agccgcccac tgccagctca caggaagaag ataagcttca gaccctcagg 74220
gccgggagct gccttcctgc caccccttcc tgccccagac ctccatgccc tcccccaacc 74280
acttacacac aagccaggga gctgtttcca cacagttcaa ccccaaacca ggacggcctg 74340
gcactcgggt cactgccatt tctgtctgca ttcgctccca gcgcccctgt gttccctccc 74400
tcctccctcc ttcctttctt cctgcattgg gttcatgccg cagagtgcca ggtgcaggtc 74460
agccctgagc ttggggtcac ctcctcactg aaggcagcct cagggtgccc aggggcaggc 74520
agggtggggg tgaggcttcc agctccaacc gctccactag ccgagactaa ggaagtgaga 74580
ggcagccaga aatccagacc attccatagc aaatggattt cattaaagtt accagacttc 74640
agtgtaagta acatgagccc catgcacaac aatcccttat gaaggggaag tcagtgtcgc 74700
ctcggatttc ttgaaaaaca caaaaactta tcaatgcctg taaaagtctg ttggaaagaa 74760
aatatgattc aagaatgtta tgcccaacaa agctggcata ttttctaccc ggacacactc 74820
agggaatgtg gtcccttgag tgcttctctc actgcgtaaa tcctacgtgg tgtttaagca 74880
tattcataaa tgtgtatgtc tatttttatg tgtaagatgg ttcattttta ttttatttat 74940
tcaatatgta caataaagaa tattgacaaa taggctggac atggtggctc ccacctgtaa 75000
tcccagccct ttgggaggcc gaggcgggca gatcacctga ggtctggagt tcgagaccag 75060
cctggccaac atgatgaaaa cccatctcta ctaaaaatac aaagattagc caggcatggt 75120
ggtgcatgcc tgtaatccca gccactcagg aggctgagac aggagaaatg cgtgaacccg 75180
gaaggcggag gttgcagtga gccgagatca caccactgca ctccagcctg gcgacagagc 75240
aagattccat ctcaaaaaaa aaaaaagaca aagaaatttg tttttttgaa taaagacaaa 75300
tttcatcaca cgaagataaa gatgcaaagc tccagacagg aaggcacgga cagcacagtg 75360
aagcccggag cgggcgctgg ggggccaggg gcatggcggg ggtgccagcg tctctcggtt 75420
cctaccatgg ccactccagc ctgtgttctc acgaggatgg ctgtgcaatg ctaggagcgt 75480
gttcgaagct ctagggcaac cactggaagt gaggctgagg agcagagccc agaggcccgt 75540
ggagctgatg aaaagaaagc tggagaaagt gtttgctgcc tcccaacatg gtaagaaaag 75600
atagaaagag agagcacacg gcaaagggag cttgctgagg gactctttac aatggcttgc 75660
acagagctca gggggtctgg gaggctaggg ccctgcgcag ggcagtcacc ccagcctgct 75720
gaccaaggtt tgctgcaggc agctctgggg gtggttgagg cgcggtccct ggagccaccc 75780
ctcaagggaa cgaggcagca gagtgggcca aggcccaggt cggctgcaag gctgcccagg 75840
acttggggtc cttacatcag cagccactga tgcagctggc ccagagagag gcgccgagca 75900
ggttgcctcc aggggacaaa ccaggtcgga gagggtgagg cagtggatgg agccacaaca 75960
accccgggca cgggtgacac gcacgttcat gcacatctga cccttcctcc ctcaccaaac 76020
aggtccccct gccttcccca tggttgcgaa aaagcaaaat gtagacgttt tttctttttt 76080
aattcatgtt ttaattgaca aatgaagccg tatatattta ttgtgtacaa catgatgctt 76140
taaaatatgt atacatcgtg gaacagcaac gttgagctaa tttaacacgc attacttcac 76200
atacttgtca tcttttgtgg cgagaatgct taaaatccac tctcttagta ttttttaaga 76260
atgcaataca ttgttgtcaa ctgtggtcac cgtcatgcat agccaagctc ccgacctcac 76320
cctcctgcca gctcaggctg tgcatccttt caccagcatc ccccaccccg gcccctggcc 76380
ctggtaacta ccactctata ctctacgtat gagttcagct ttttaagatt ccacagatga 76440
atgagatcat acagtatttg ctttctatgc ctggcttatt ttagttaaca cactgtcctc 76500
cagatccatc cgttgttgca aatgacaggg tttcattctt tttaaagtct aaagagtatt 76560
ccattgtgtc aatggacctc atttgcttta tccatgcatc aactatggac atttaggttg 76620
attccatttc ttagctgttg tggatggtgc tgcagtaaac atggggctgc agatgtctct 76680
tcaacatact gacatcatgt cctttggata aatacccagt agtgggatcg ctggatcaca 76740
atgtacagtt ttttttttaa tggaaacttt cattttttgg tgaaattagg aaaacagata 76800
aaacccacag aatccaaaat atatgtgaag atgccaaaaa cagttgacat tgggcagagg 76860
tcacatggaa ggaagtgaat acatgacggg gtgtgagggc ccagaggcag ctgaaatacg 76920
ctttctaaac acaaggacct cttctgagag ggcagaagtt ttatcctgca catgcaatga 76980
ccagcacagc taaaatacac tttctaaaca tgaggacctc ttctgagagg gcagctttat 77040
cctgcaaatg caatgaccag cacaggaccc agaataaaga gagttgccag cggacgcctg 77100
gtgtccatgt gtccaggtga gttcgagatg cggacggcgc tggccagcca gtcacaccct 77160
aagtcaatct gctgcatgca tttgtccttg ccacagcaga aaacgagaaa gcctttgggc 77220
tgcaaagctt cacaggctcc tcttctcccg actccatgga aacagctaca aagagcaggc 77280
ccagtagagc ttaattcatg aaaatgagta ataaacttga actggaacag tatcgacttt 77340
ttagaaacgg cagcaaagtg tataaaaaat attcaccaga acaatatttc caaacgatga 77400
gatgagaatt tcagccaagt aatcctccat ggatagaaaa taatgaaggg attggattta 77460
tgaaggaaaa tcatggagct caaatacaag aaaagagaat caaaaatgaa caggaggaga 77520
taaaatatgg tttggccaaa gttacaaaat aaatttttta aaaacccttc atcatggcaa 77580
gtagaaagag cgagaggaaa aacagatccc gtggaagaca caaataggac atggggagaa 77640
aaatgaatga gatgaaacag agcagaaata aaattttacg gaactaaaga caagtgatct 77700
gaacctgcct ggggcctggg ggacctcgcc accctgaagg gaaagaacat gcctggctgg 77760
ctttgccacc tgctcattgc agagccccac agcttgcaac aaacataggc ggtagccagg 77820
gagtggttac agcaggcctt gagcaagacc cagtgttgtg ctgacttcag gtctgaccca 77880
gcactgtcat agtggtggtg tccatagtgg tagtgggggt gcttgtgtca ctccaccccc 77940
atctccagga ggctcagaac agacagagag agactccatt tgtttgggag aaagtaaggg 78000
atgagaacaa gagtctctgc ctggtaatcc agagaattat tctagatctt ggccaagatt 78060
atcaaagcag tacctctatg agtcttttgg gcttggagtc cccctaaagc agatatagct 78120
aagatcacaa cacccaagtc cttttgaata tgtgggaaga cttcccaagg acaggagcaa 78180
acaaacaagc ccagactgca aaaaaacaag ccgagactgc aataaacacc tcactcttca 78240
atgcccaggc actgaagaac atctcctagc agcaacacca tccaggaaaa catggcctca 78300
accagtgaac taaataaggc accagggacc agtctcggag aaatagaggt atgttatctt 78360
tcagagaatt caaagtagct ttgttgagga aactcaaaga aattcaagat aacacagtga 78420
aggaattcag aatcctatcc gataaattta acagagattg aagcaattaa aaagaattaa 78480
gcagaaatta tggagctgaa aaatgcaatt ggcatactga aaaatgcatc agagtatttt 78540
catagcctca tatatcaagt agaagaaaga attagtgagc ttgaaaacag gctatttgga 78600
aaagcacgat aaaaggagac aaaagagaaa agaataaata acaatgaagc atatctacag 78660
gatctagaaa atagcctcaa aaggccaaat ctaagaatta ttagccttaa agaggaggta 78720
gagaaagagg gatggagagt ttattcaaag ggataataac agaaaacttc ccaaacctag 78780
agaaagatat caatatccaa atgcaagaag gatgtagtac accaaggaga tttaatgcaa 78840
agaagactac ctcaaggcat tcaatactca aactcccata tgacaaggac tttaaaaaga 78900
tcctaaaagc agcaaaagaa aagaaatgaa taaaatacta tggagctcca atatgtctgg 78960
cagcagactt ttcagtgaag actttatatg ccaggagaga gtgtcataat ggatttaaag 79020
tgctgaagga aaaaactttt accctcgaac agtatagctg gtgaaattat ccttcaaaca 79080
tgaaggagaa ataatttgtt tccagacaaa tgttgaggga tttcatgaac accagacctg 79140
tcttttaaga aatgctaaag ggagtacttc aatcagaaag aaacacgtta gtgaacaata 79200
agaaatcatc tgaaggcaca aaactcaccg gtaatagtaa gtacacagaa aaacacagaa 79260
tattataaca ctgtaactgt ggtgtgtaaa ctccttttgt ttgtttgttt gtttgtttgt 79320
ttgtttttgt ttttagacgg agttttgctc cagcccaggc tggagtgcaa tggcacaatc 79380
tcagctcact gcaacttcca cctcccgggt tcaagcaatt ctcctgcctc agcctcccaa 79440
gtagctggga ttacaggcat gtgctaccat gtccagctaa ttttgtattt tagtagagac 79500
ggtgtttcac catgttggtc aggctagcct tatcttgagt agaaaaacta aatgatgaag 79560
caatgaaaaa taataactac aacttttcaa gacatagtac aataagatat aaatcataac 79620
aaaaagttaa aaggtggagg gatgaagtta aggcatagag tctttattag ttttcttttt 79680
acttgtctgt ttatgcaaac agtgttaagt tgtcatcagt ttaaaataat gggtcataag 79740
atactatttg caagcctcat ggtaacgtca aaccaaaagc aatacaacag atacacaaaa 79800
aacaaaaagc aagaagctaa attacgtcat cagagaaaat caccttcact aaaaggaaga 79860
cggagaaaag aatgaagaga gagaagacca aaagcaaata gcaatatggc aggagtaagt 79920
ccttacttat caataatacc attgaatgta aatggactaa actctccaat caaaagacat 79980
agagtggctg aatcaattaa agaaaaaaca agacccattg atctgttgtc cacaagaaac 80040
acactttatc tataaagaca cacatagact gaaaacaaag ggatggaaaa agatactcca 80100
cgccaatgga aaccaaagaa agagcaggag tagctacact tatatcaggc aaaatagatt 80160
tcaagacaaa aactataaga agagacaagg tcactaatga taaacaggtc aattcagcaa 80220
gaggatataa caattgtaaa tatatatgca cccaatgctg gagcacccag atatataaag 80280
caagtattta ctagagctaa agagagaaat agactccaat gcaataatag ctggagattt 80340
caacatccca ctttcaacat tgaacagatc ctccagatag aaaatcaaca aagaaatatt 80400
ggacttaatc tgcactatcg accaaatgga tctaacagat atttacagaa catttcatcc 80460
aacagctgca gaacacacat tcttttcctc agcacataga tcattctcaa ggatagacca 80520
tatgttgggt cacaaaacaa gttttaaaat attcaaatac attgaaataa tatcaagcat 80580
cttctgtgac cacaatggac taaaactaga aatcaataac aagaggaatt ttggaaacta 80640
tataaatata tggaaattaa tgaatgctga gtgggtcaat gaagcaatta agaaggaaac 80700
tgaaattttt cttggaacga atgatcatgg aaacagaaaa taccaaaacc tatgggatac 80760
agcaaaagca gtactaagag ggaagtttac agctacaaat gcttacatta aaaaagaaga 80820
aaaacttcaa taaaaaaacc taacaatgca tcttaaagaa ctagaaaagc aagaggaaat 80880
caaatccaaa attagtagaa gaaaacagta aaggtcagag cagaaataag taaaattgaa 80940
atgaagaaaa caatacaaaa gatcaataaa acaacaggtt gttttcttga aaagttaaac 81000
aaaattgaca aacctttagc cagactaaga aaaaaagaca gaagatccaa ataaataaaa 81060
tcagagatga aaaaggtgac attacaactt acaccacaga aattcaaagg atcattagtg 81120
gctactataa gcaactatat gccaataaat tggaaaatct agaagaaatg cagaaattcc 81180
tagacacata caacctccca agattaaacc aagaagaaat tcaaaacctg aacagactga 81240
taacaagtaa tgagatcaaa gccgtaataa aaagcctccc agtaaagaga agcccaggac 81300
ccgacggctt cactgctgaa ttctaccaaa catttaaagt agaactaata ccaatcctac 81360
tcaaactatt ccaaaaaata gaggtggaag gaatacttca aaactcatta tacgaggcca 81420
gtattaacct gacaccaaaa ctagacaaag acacatgaaa aaaagaaaac tacaggccaa 81480
tatgtctgat gaatattgac acaaaaatcc tcaacaaaat actagcaaac caaattcaac 81540
tacacattag aaagttcact catcatgacc aagtggaatt tatctaactt gggatgcaaa 81600
gatggttcaa catatgcaaa tcaatcaatg tgatacatca tatcaacaga atgaacaaca 81660
aaaaccattt gatcatttaa ttgatactga aaaagcattt gataaaattc aacattcctt 81720
cataataaaa attctcttct atactaggta caaaagaaac ttacctcaac ataataaagc 81780
catatatgac agtcccacag tatgatacta aatgaggaaa aactgagagc ctttcctcta 81840
cgatctggaa catgacaaag atgcccactt tcatcactgt tattcaacat agtactggaa 81900
gtcctagctg gagcgatcag acaagagaaa gatataaaag acatccaaat tggaaaggaa 81960
taagtcaaat tatcctcatt tgcatatggt atgatcttct atttagagct aactaaagac 82020
tccaccaaaa aaagttatta gaactgacga acaaattcag taaagctgca ggatacaaaa 82080
tcaacataca aaaatcagta gcatttctat atgccaacaa tgaccaatgt gaaaaagaaa 82140
ttaaaaagta accctattta caataaccac aaataaacac ctaggaatta accaaagagg 82200
taaaagattt ctgtaatgaa aactataaaa cactgatgaa agaaattgaa gagtacacca 82260
aaaaatggaa agcaattgca tgttcatgga ttagaagaat cagtgttgtt ataatgtcca 82320
tactatccaa agcaatctac agattcaatg caatccttat caaaatacca atgacatcat 82380
tcacagaaat agaaaaaaaa aatcctaaaa tttacgtgga accacaaaga cccagaatag 82440
ccaaagctct cctaagcaaa aagaacgaaa ctgtaggaat gacattgcct gtcttcaaat 82500
tctactacag agctatagat agtaaccaaa acagcgtggt actggcataa aaacagacac 82560
agagacaaac agaacaaaat ttaaaaaccc agaaataaat ccacacacct acagcaaatt 82620
catttttgac aaagttgcca agaacatact ctggggaata gataatgata tctcttcaat 82680
aaatagtgtg gggaaaactg gatatccata tacataacag tgaaactaga cccctctctc 82740
tctcactata tacaaaaatc aaatcaaaat tgtttaagga cttaaatcta agacctcata 82800
ctatgaaacc actgcaagac aaccttggcg gaaactctcc aagacatcag tccaggcaaa 82860
gatttcttga gtaatatccc acaagcacag acaaccaaag caaaaatgga caaatgggat 82920
cacatcaagt taaaaagctt ctgcacagta agggaaacaa ccaacaaaat gaagagacaa 82980
cccacagaat gggagaaaat atttgaaaaa tacccatctg gcaagggatt aaaaaccaga 83040
atatatgcag aatatataag gagctcaaac agtgctatag aaaaaaaaat ctaataatct 83100
gatttaaaaa tgggaaaaat gttagaatag acatttctta aaataagaca tacagatggc 83160
aaaccgacat ggaacggtgc tcaacatcat ggattatcac agaaacacaa tcaatcaaaa 83220
ctaaaactaa aatgtgctat catctcaccc cagttaaaat ggctgatatc cagaagacag 83280
gcaataacaa atgctggcaa ggatgtgggg aaaagggagc ccccatacac tgttgctggg 83340
attgtaaatt agtacaacca ctgtggagag cagcatgaaa gttcctcaaa aaactgaaag 83400
aaagctacca taggatccag caatcccact gctgtgtata tactacaaaa gaaaggaagt 83460
cagtatatga agaggtatct gcactcccat gtttgttgca gccctgttca caacagccaa 83520
gatttggaag caacctaagt gtccatcagc agttgaatgt ataaagaaaa tgtggtgcat 83580
atacacaatg gagtattatt caataataaa aaggaatgag attgagtcat ttgcaacaac 83640
atggatggaa ctggagatca ttatgtgaag tgaaataagc caggcacaga aagacaaaca 83700
ttacaatgtt cttacttatt aatgagatct aaaaatcaaa acaattgcac ccatgttcat 83760
aaagagtaaa aggatggtta ccagatgctg agaacggtgg tggggggata gggaaaggtg 83820
gcagtggtta acgggtacaa aaaaatagaa agaatgaata agacttgcta cttgatagca 83880
cagcaaggtg gctatagtca gtaatttagt tgtatatttt taataatgaa aggtgtataa 83940
ttggattgtt tctaacacaa aggataatgc ttaagaggat ggatacccca ttttccatga 84000
tgtgattatt tcacattgca cgcctagatc aaaacatcca atgtacccca taaatatata 84060
catcttctat gtacccataa aaattctgta aaataaaata tataaaaaga ggtgacagat 84120
atggaagaca ggcaaagaag agacgacatc cacataatcc gagtacctaa gaaagaatgg 84180
agtccagtgc atctcaggag ccaccattct aagccaattt tctctggttc tctcagtcac 84240
cctaccaata cgtgggcaat cttgttttat ttcaggatag agtttttgaa attatagatt 84300
taagtatgct ttctgttcta ttacttttgg taattaattt tagaaagaac taatttgggc 84360
acaaatttga aaaaattcta aatccaaaaa aaaaaagaaa aaaacacaca cacaatcatc 84420
tataaggggg atgatgacca gtcctagatt tctcaccagc cacattcaag atcagtaaat 84480
ggtaggacaa aacctgtagg gtccttaagg gggaaagaag tagtggatag tccagagtct 84540
atatacagcc aactgttctt gaagaaaaaa ggctgctgaa aaggagttcc aaacattcta 84600
taatccataa tctcatgatg aaactactag aggaagacca ccagccatca aaaggtgctt 84660
ggagaaccca gggccaagaa ccaaaagtaa atattaagtg tccttaactg cgagactaag 84720
atagaaatga ctgtggggga ccatgtggcc tcaacagagg tgaaatggtg tctgcctgac 84780
aaagtggaca ttttacaatg atcaaaacac agaatatgag atagagagca cttctgaatt 84840
actgcctcac tccaaataac tctcagccaa aggacttcag taaaaccaaa ttgggcatat 84900
tagacagtac aaacaaattc taagaaaata atattactga ttacaatcac atgatgctag 84960
agatggaggg gaaaaggaag aggaaaccag gtaatttcat actcgtatat agtaaagaac 85020
taaagtacat tgtccaaaga agaacaaaga atattttgga aagttataaa ggtagccact 85080
acacatagaa gatagcaaag aacaagaaaa cttaagatgg aaaacttttt ggaagcataa 85140
gaatagaaaa tataaactac taagataaga ttgaagccaa acagatctat gaaaacaaca 85200
aacatcaatg gccttaactt gcctattaaa aggaagagac tttcaaattg gaccacaaga 85260
taaaacccaa ctctatatag catatgagta ttacacacaa aatgggaaaa gctgaaaaaa 85320
cttgggcaaa attcacccca agcaaattcc actgtttcct ttgggacaaa atgccaagct 85380
ccatgccagg gaagatgatt ctcctcagac cttctcctca ctctcccagt cctcttaggg 85440
aaggaattgg gtgttagagg agggagactc tgtcgattat cagctgaagc agtggtgtgc 85500
tcctgcgttg cttctgacct gggaaatgaa gcagcaagac tctttctgct gtgtctttgc 85560
ccagaagggc catcccccca gagcagagta cccaggccgg caggagcagt ggtggaagcg 85620
tggaaaccac gtctcctaca gcagagacca tcagaagcgg agcctcgggt ataagggaaa 85680
caacgcgttc tccctaacct gggagtgaca gacagcgtca ttcctcacag tgataccctg 85740
tgttctagcc atctggccca tgacagagcc agcccagagc cagcccagag ccagcccctc 85800
accatcctgg agcctggcca gctcgccaag ctgcaccata ggcctggaag gcgtggagac 85860
ctgcggcagt gccctgtcct cccgtgaggc ctgccatccc tgccaggggt cgcctctggc 85920
ttctccttct ccaggaccgc acggtccaga ggctcagtgc ctggagtagg tgttgcctcc 85980
ctgcttctag gcccagaccc tcccttgttc ctgaccccgg gcctttccct ctggcttgga 86040
catccagggc cctgtctcag ctggggagct gctcctgctc aaggactgtc ttccgcggga 86100
tcgaaaggcc gcgtcctgaa caatgcgtgg gccacgtaag cggagcaggc tctaaaggcc 86160
gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa 86220
cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg 86280
gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag 86340
cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc 86400
tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc 86460
gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa 86520
cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg 86580
gccacgggag cggagcagac tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgtgtgg gccacgtgag 86640
cggagcgccc tctccactgc cctcggggcc gcagctccca gctcagctcc cagccctgct 86700
cagggcagcc aggccaggag gtaccatcca ggctaagtga ccctcagggg ggacaggtgc 86760
cccaggagat gccagctgtt gggagaggct gggggaccaa ctcgacctgg cctgtgggcc 86820
ctgccctggc cacccattgt aggatccagc cgccacgcct gtgacactcg tgtgctttcc 86880
ctggtgtgtg cttgtggcag gtgggggcag agggtcctca ggccagagag ccactccccc 86940
agcgccagac caccctcttc ctcactcccc cacctcaccc cctcacaggt gcctcccagg 87000
ccatcagggc ccaaccaccc ctaaacaaat gggttctcgg cccctcgtgg ctggaggtgg 87060
gttctctcac cattcccagc ctaagactcc atccccatgc tggcagctgt tcaaccatgt 87120
ctagagagat ccactgtccc agacagcacc tcagggtccc ccgtcctgcc tggaaccctg 87180
taggaaactc cacaaaccgc cgccattctg tccacacccc tacaggagcc ccaaccctct 87240
ccccacatcc aggcttccct cccagacccc tcatccctgc ccgcacggtg cctgaggggg 87300
ccttcttggg cagcgcctaa gcaagccccc agcacccttc ggccccttca aggcacacag 87360
gccccctttc cacccagcct caggaaacca cctgtgtcct ccaacgacag gtcccagcct 87420
cccagccttt gccttgcctg ttcctctccc tggaactctg ccccgacaca gaccctcccc 87480
agcaagcccg caggggcacc tcccctgccc ccagacaccc tgtgcccgtc agttcatccc 87540
cagcagaggc cctcaccagg cacaccccca tgctcacacc tggccccagg cctcagcctc 87600
cctgagggcc ccacccagcc cgcgtctggc cagtggtgcg tgcaaagccc ctcacccaga 87660
ctcggcggaa ggcagccagt gcaggcctgg ggaggggctc tccttagacc accttgcacc 87720
ttccctggca cccaccatgg gaagagctga gactcactga ggaccagctg aggctcagag 87780
aagggaccca gcactggtgg acacgcaggg agcccacgcc agggcgccgt ggtgagtgag 87840
gcccagtgcc acccactgag gcctcccgtt cagtgggacg acggtgaaca ggtggaacca 87900
accaggcaac ccccgccggg ccccacagac gggatcagag caggaaaggc ttcctgcccc 87960
tgcaggccag cgaggagccc tggcgggggc cgtggccctc caggcgagga ggctcccctg 88020
gccaccgcca cccgggcctc tctgctgctg ggaaaacaag tcagaaagca agtggatgag 88080
aggtggcgtg acagacccag cttcagatct gctctaattt acaaaagaaa aggaaaaaca 88140
cacttggcag ccttcagcac tctaatgatt cttaacagca gcaaattatt ggcacaagac 88200
tccagagtga ctggcagggt tgagggctgg ggtctcccac gtgttttggg gctaacagcg 88260
gaagggagag cactggcaaa ggtgctgggg gcccctggac ccgacccgcc ctggagaccg 88320
cagccacatc agcccccagc cccacaggcc ccctaccagc cgcagggttt tggctgagct 88380
gagaaccact gtgctaactg gggacacagt gattggcagc tctacaaaaa ccatgctccc 88440
ccgggacccc gggctgtggg tttctgtagc ccctggctca gggctgactc accgtggctg 88500
aatacttcca gcactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt gagtctgctg 88560
tctggggata gcggggagcc aggtgtactg ggccaggcaa gggctttggc ttcagacttg 88620
gggacaggtg ctcagcaaag gaggtcggca ggagggcgga gggtgtgttt ttgtatggga 88680
gaagcaggag ggcagaggct gtgctactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg 88740
gtcactgtct cctcaggtga gtcccactgc agccccctcc cagtcttctc tgtccaggca 88800
ccaggccagg tatctggggt ctgcagccgg cctgggtctg gcctgaggcc acaccagctg 88860
ccatccctgg ggtctccgcc atgggctgca tgccagagcc ctgctgtcac ttagccctgg 88920
ggccagctgg agcccccaag gacaggcagg gaccccgctg ggcttcagcc ccgtcaggga 88980
ccctccacag gtagcaagca ggccgagggc agggacggga aggagaagtt gtgggcagag 89040
cctgggctgg ggctgggcgc tggctgttca tgtgccgggg accaggcctg cgctttagtg 89100
tggctacaag tgcttggagc actggggcca gggcagcccg gccaccgtct ccctgggaac 89160
gtcacccctc cctgcctggg tctcagcccg ggggtctgtg tggctgggga cagggacgcc 89220
ggctgcctct gctctgtgct tgggccatgt gacccattcg agtgtcctgc acgggcacag 89280
gtttgtgtct gggcaggaac agggactgtg tccctgtgtg atgcttttga tatctggggc 89340
caagggacaa tggtcaccgt ctcttcaggt aagatggctt tccttctgcc tcctttctct 89400
gggcccagcg tcctctgtcc tggagctggg agataatgtc cgggggctcc ttggtctgcg 89460
ctgggccatg tggggccctc cggggctcct tctccggctg tttgggacca cgttcagcag 89520
aaggcctttc tttgggaact gggactctgc tgctggggca aagggtgggc agagtcatgc 89580
ttgtgctggg gacaaaatga ccttgggaca cggggctggc tgccacggcc ggcccgggac 89640
agtcggagag tcaggttttt gtgcacccct taatggggcc tcccacaatg tgactacttt 89700
gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag gtgagtcctc acaacctctc 89760
tcctgcttta actctgaagg gttttgctgc atttttgggg ggaaataagg gtgctgggtc 89820
tcctgccaag agagccccgg agcagcctgg ggggctcagg aggatgccct gaggcaacag 89880
cggccacaca gacgaggggc aagggctcca gatgctcctt cctcctgagc ccagcagcac 89940
gggtctctct gtggccaggg ccaccctagg cctctggggt ccaatgccca acaacccccg 90000
ggccctcccc gggctcagtc tgagagggtc ccagggacgt agcggggcgc cagttcttgc 90060
ctggggtcct ggcattgttg tcacaatgtg acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa 90120
ccctggtcac cgtctcctca ggtgagtcct caccaccccc tctctgagtc cacttaggga 90180
gactcagctt gccagggtct cagggtcaga gtcttggagg cattttggag gtcaggaaag 90240
aaagccgggg agagggaccc ttcgaatggg aacccagcct gtcctcccca agtccggcca 90300
cagatgtcgg cagctggggg gctccttcgg ctggtctggg gtgacctctc tccgcttcac 90360
ctggagcatt ctcaggggct gtcgtgatga ttgcgtggtg ggactctgtc ccgctccaag 90420
gcacccgctc tctgggacgg gtgccccccg gggtttttgg actcctgggg gtgacttagc 90480
agccgtctgc ttgcagttgg acttcccagg ccgacagtgg tctggcttct gaggggtcag 90540
gccagaatgt ggggtacgtg ggaggccagc agagggttcc atgagaaggg caggacaggg 90600
ccacggacag tcagcttcca tgtgacgccc ggagacagaa ggtctctggg tggctgggtt 90660
tttgtggggt gaggatggac attctgccat tgtgattact actactacta cggtatggac 90720
gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggta agaatggcca ctctagggcc 90780
tttgttttct gctactgcct gtggggtttc ctgagcattg caggttggtc ctcggggcat 90840
gttccgaggg gacctgggcg gactggccag gaggggacgg gcactggggt gccttgagga 90900
tctgggagcc tctgtggatt ttccgatgcc tttggaaaat gggactcagg ttgggtgcgt 90960
ctgatggagt aactgagcct ctagactgag cattgcagac taatcttgga tatttgtccc 91020
tgagggagcc ggctgagaga agttgggaaa taaactgtct agggatctca gagcctttag 91080
gacagattat ctccacatct ttgaaaaact aagaatctgt gtgatggtgt tggtggagtc 91140
cctggatgat gggataggga ctttggaggc tcatttgagg gagatgctaa aacaatccta 91200
tggctggagg gatagttggg gctgtagttg gagattttca gtttttagaa taaaagtatt 91260
agctgcggaa tatacttcag gaccacctct gtgacagcat ttatacagta tccgatgcat 91320
agggacaaag agtggagtgg ggcactttct ttagatttgt gaggaatgtt ccacactaga 91380
ttgtttaaaa cttcatttgt tggaaggaga gctgtcttag tgattgagtc aagggagaaa 91440
ggcatctagc ctcggtctca aaagggtagt tgctgtctag agaggtctgg tggagcctgc 91500
aaaagtccag ctttcaaagg aacacagaag tatgtgtatg gaatattaga agatgttgct 91560
tttactctta agttggttcc taggaaaaat agttaaatac tgtgacttta aaatgtgaga 91620
gggttttcaa gtactcattt ttttaaatgt ccaaaattct tgtcaatcag tttgaggtct 91680
tgtttgtgta gaactgatat tacttaaagt ttaaccgagg aatgggagtg aggctctctc 91740
ataacctatt cagaactgac ttttaacaat aataaattaa gtttcaaata tttttaaatg 91800
aattgagcaa tgttgagttg gagtcaagat ggccgatcag aaccagaaca cctgcagcag 91860
ctggcaggaa gcaggtcatg tggcaaggct atttggggaa gggaaaataa aaccactagg 91920
taaacttgta gctgtggttt gaagaagtgg ttttgaaaca ctctgtccag ccccaccaaa 91980
ccgaaagtcc aggctgagca aaacaccacc tgggtaattt gcatttctaa aataagttga 92040
ggattcagcc gaaactggag aggtcctctt ttaacttatt gagttcaacc ttttaatttt 92100
agcttgagta gttctagttt ccccaaactt aagtttatcg acttctaaaa tgtatttaga 92160
attcattttc aaaattaggt tatgtaagaa attgaaggac tttagtgtct ttaatttcta 92220
atatatttag aaaacttctt aaaattactc tattattctt ccctctgatt attggtctcc 92280
attcaattct tttccaatac ccgaagcatt tacagtgact ttgttcatga tcttttttag 92340
ttgtttgttt tgccttacta ttaagacttt gacattctgg tcaaaacggc ttcacaaatc 92400
tttttcaaga ccactttctg agtattcatt ttaggagaaa gacttttttt ttaaatgaat 92460
gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg tggttgagag gacactcagt 92520
cagtcagtga cgtgaagggc ttctaagcca gtccacatgc tctgtgtgaa ctccctctgg 92580
ccctgcttat tgttgaatgg gccaaaggtc tgagaccagg ctgctgctgg gtaggcctgg 92640
actttgggtc tcccacccag acctgggaat gtatggttgt ggcttctgcc acccatccac 92700
ctggctgctc atggaccagc cagcctcggt ggctttgaag gaacaattcc acacaaagac 92760
tctggacctc tccgaaacca ggcaccgcaa atggtaagcc agaggcagcc acagctgtgg 92820
ctgctgctct taaagcttgt aaactgtttc tgcttaagag ggactgagtc ttcagtcatt 92880
gctttagggg gagaaagaga catttgtgtg tcttttgagt accgttgtct gggtcactca 92940
catttaactt tccttgaaaa actagtaaaa gaaaaatgtt gcctgttaac caataatcat 93000
agagctcatg gtactttgag gaaatcttag aaagcgtgta tacaattgtc tggaattatt 93060
tcagttaagt gtattagttg aggtactgat gctgtctcta cttcagttat acatgtgggt 93120
ttgaattttg aatctattct ggctcttctt aagcagaaaa tttagataaa atggatacct 93180
cagtggtttt taatggtggg tttaatatag aaggaattta aattggaagc taatttagaa 93240
tcagtaagga gggacccagg ctaagaaggc aatcctggga ttctggaaga aaagatgttt 93300
ttagttttta tagaaaacac tactacattc ttgatctaca actcaatgtg gtttaatgaa 93360
tttgaagttg ccagtaaatg tacttcctgg ttgttaaaga atggtatcaa aggacagtgc 93420
ttagatccga ggtgagtgtg agaggacagg ggctggggta tggatacgca gaaggaaggc 93480
cacagctgta cagaattgag aaagaataga gacctgcagt tgaggccagc aggtcggctg 93540
gactaactct ccagccacag taatgaccca gacagagaaa gccagactca taaagcttgc 93600
tgagcaaaat taagggaaca aggttgagag ccctagtaag cgaggctcta aaaagcacag 93660
ctgagctgag atgggtgggc ttctctgagt gcttctaaaa tgcgctaaac tgaggtgatt 93720
actctgaggt aagcaaagct gggcttgagc caaaatgaag tagactgtaa tgaactggaa 93780
tgagctgggc cgctaagcta aactaggctg gcttaaccga gatgagccaa actggaatga 93840
acttcattaa tctaggttga atagagctaa actctactgc ctacactgga ctgttctgag 93900
ctgagatgag ctggggtgag ctcagctatg ctacgctgtg ttggggtgag ctgatctgaa 93960
atgagatact ctggagtagc tgagatgggg tgagatgggg tgagctgagc tgggctgagc 94020
tagactgagc tgagctaggg tgagctgagc tgggtgagct gagctaagct ggggtgagct 94080
gagctgagct tggctgagct agggtgagct gggctgagct ggggtgagct gagctgagct 94140
ggggtaagct gggatgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct 94200
gagctggggt gagctgggct gagctgggct gagctgggct gagctggggt gagctgagct 94260
ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct ggggtgagct 94320
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gagctgagct 94380
ggggtgagct gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct 94440
ggggtgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct gagctggggt 94500
gagctgggct gagctggggt gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct 94560
gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gggctgagct gagctgagct gagctgagct 94620
gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct 94680
ggggtgagct gagctgagct gggctgagct ggggtgagct gggctgagct gggctgagct 94740
gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctgggct gagctgagct 94800
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct ggggtgagct 94860
gagctgagct gggctgagca gggctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct 94920
gggctgagct gggctgagct gagctgagct gggctgagct gggctgagct gggctgagct 94980
gggctgagct gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctggggt gagctgagct 95040
ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct 95100
gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctagggt gaactgggct 95160
gggtgagctg gagtgagctg agctgaggtg aactggggtg agccgggatg ttttgagttg 95220
agctggggta agatgagctg aactggggta aactgggatg agctgtggtg agcggagctg 95280
gattgaactg agctgtgtga gctgagctgg ggtcagctga gcaagagtga gtagagctgg 95340
ctggccagaa ccagaatcaa ttaggctaag tgagccagat tgtgctggga tcagctgtac 95400
tcagatgagc tgggatgagg taggctggga tgagctgggc tagctgacat ggattatgtg 95460
aggctgagct agcatgggct ggcctagctg atgagctaag cttgaatgag cggggctgag 95520
ctggactcag atgtgctaga ctgagctgta ctggatgatc tggtgtaggg tgatctggac 95580
tcaactgggc tggctgatgg gatgcgccag gttgaactag gctcagataa gttaggctga 95640
gtagggcctg gttgagatgg ttcgggatga gctgggaaaa gatggactcg gaccatgaac 95700
tgggctgagc tgggttggga gaccatgaat tgagctgaac tgagtgcagc tgggataaac 95760
tgggttgagc taagaataga ctacctgaat tgtgccaaac tcggctggga tcaattggaa 95820
attatcagga tttagatgag ccggactaaa ctatgctgag ctggactggt tggatgtgtt 95880
gaactggcct gctgctgggc tggcatagct gagttgaact taaatgagga aggctgagca 95940
aggctagcct gcttgcatag agctgaactt tagcctagcc tgagctggac cagcctgagc 96000
tgagtaggtc taaactgagt taaaaatcaa cagggataat ttaacagcta atttaacaag 96060
cctgaggtct gagattgaat gagcagagct gggatgaact gaatgagttt caccaggcct 96120
ggaccagtta ggctaggacc tcgttctata gaggcagact gtgtgctaca gtggagtttc 96180
aagatgattc catgagtcct ccccgccccc aacataaccc accttcctcc taccctacac 96240
gcctgtctgg tgtgtaaatc ccagctttgt gtgctgatac agaagcctga gcccctcccc 96300
cacctccacc tacctattac tttgggatga gaatagttct cccagccagt gtctcagagg 96360
gaagccaagc aggacaggcc caaggctact tgagaagcca ggatctaggc ctctccctga 96420
gaacgggtgt tcatgcccct agagttggct gaagggccag atccacctac tctagaggca 96480
tctctccctg tctgtgaagg cttccaaagt cacgttcctg tggctagaag gcagctccat 96540
agccctgctg cagtttcgtc ctgtatacca ggttcaccta ctaccatatc tagccctgcc 96600
tgccttaaga gtagcaacaa ggaaatagca gggtgtagag ggatctcctg tctgacagga 96660
ggcaagaaga cagattctta cccctccatt tctcttttat ccctctctgg tcctcagaga 96720
gtcagtcctt cccaaatgtc ttccccctcg tctcctgcga gagccccctg tctgataaga 96780
atctggtggc catgggctgc ctggcccggg acttcctgcc cagcaccatt tccttcacct 96840
ggaactacca gaacaacact gaagtcatcc agggtatcag aaccttccca acactgagga 96900
cagggggcaa gtacctagcc acctcgcagg tgttgctgtc tcccaagagc atccttgaag 96960
gttcagatga atacctggta tgcaaaatcc actacggagg caaaaacaaa gatctgcatg 97020
tgcccattcc aggtaagaac caaaccctcc cagcaggggt gcccaggccc aggcatggcc 97080
cagagggagc agcggggtgg ggcttaggcc aagctgagct cacaccttga cctttcattc 97140
cagctgtcgc agagatgaac cccaatgtaa atgtgttcgt cccaccacgg gatggcttct 97200
ctggccctgc accacgcaag tctaaactca tctgcgaggc cacgaacttc actccaaaac 97260
cgatcacagt atcctggcta aaggatggga agctcgtgga atctggcttc accacagatc 97320
cggtgaccat cgagaacaaa ggatccacac cccaaaccta caaggtcata agcacactta 97380
ccatctctga aatcgactgg ctgaacctga atgtgtacac ctgccgtgtg gatcacaggg 97440
gtctcacctt cttgaagaac gtgtcctcca catgtgctgc cagtgagtgg cctgggctaa 97500
gcccaatgcc tagccctccc agattaggga agtcctccta caattatggc caatgccacc 97560
cagacatggt catttgctcc ttgaactttg gctccccaga gtggccaagg acaagaatga 97620
gcaataggca gtagaggggt gagaatcagc tggaaggacc agcatcttcc cttaagtagg 97680
tttgggggat ggagactaag cttttttcca acttcacaac tagatatgtc ataacctgac 97740
acagtgttct cttgactgca ggtccctcca cagacatcct aaccttcacc atccccccct 97800
cctttgccga catcttcctc agcaagtccg ctaacctgac ctgtctggtc tcaaacctgg 97860
caacctatga aaccctgaat atctcctggg cttctcaaag tggtgaacca ctggaaacca 97920
aaattaaaat catggaaagc cctcccaatg gcaccttcag tgctaagggt gtggctagtg 97980
tttgtgtgga agactggaat aacaggaagg aatttgtgcg tactgtgact cacagggatc 98040
tgccttcacc acagaagaaa ttcatctcaa aacccaatgg taggtatccc cccttccctt 98100
cccctccaat tgcaggaccc ttcctgtacc tcatagggag ggcaggtcct cttccaccct 98160
atcctcacta ctgtcttcat ttacagaggt gcacaaacat ccacctgctg tgtacctgct 98220
gccaccagct cgtgagcaac tgaacctgag ggagtcagcc acagtcacct gcctggtgaa 98280
gggcttctct cctgcagaca tcagtgtgca gtggcttcag agagggcaac tcttgcccca 98340
agagaagtat gtgaccagtg ccccgatgcc agagcctggg gccccaggct tctactttac 98400
ccacagcatc ctgactgtga cagaggagga atggaactcc ggagagacct atacctgtgt 98460
tgtaggccac gaggccctgc cacacctggt gaccgagagg accgtggaca agtccactgg 98520
taaacccaca ctgtacaatg tctccctgat catgtctgac acaggcggca cctgctattg 98580
accatgctag cgctcaacca ggcaggccct gggtgtccag ttgctctgtg tatgcaaact 98640
aaccatgtca gagtgagatg ttgcatttta taaaaattag aaataaaaaa aatccattca 98700
aacgtcactg gttttgatta tacaatgctc atgcctgctg agacagttgt gttttgcttg 98760
ctctgcacac accctgcata cttgcctcca ccctggccct tcctctacct tgccagtttc 98820
ctccttgtgt gtgaactcag tcaggcttac aacagacaga gtatgaacat gcgattcctc 98880
cagctacttc tagatatatg gctgaaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc 98940
cccgggtacc gagctcgaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg 99000
ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 99060
atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 99120
agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 99180
gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 99240
taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgaa ccccttgcgg ccgc 99294
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 4
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 5
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 6
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 7
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 8
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 9
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 10
tcctccaacg acaggtccc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 11
gatgaactga cgggcacagg 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 12
tccctggaac tctgccccga caca 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 13
ctctgtggaa aatggtatgg agatt 25
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 14
ggtaagcata gaaggtgggt atcttt 26
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 15
atagaactgt catttggtcc agcaatccca 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 16
tggtcacctc caggagcctc 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 17
gctgcagggt gtatcaggtg c 21
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 18
agtctctgct tcccccttgt ggctatgagc 30
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 19
gatgggaaga gactggtaac atttgtac 28
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 20
ttcctctatt tcactctttg aggctc 26
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
cctccactgt gttaatggct gccacaa 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
ggtgtgcgat gtaccctctg aac 23
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
tgtggcagtt taatccagct ttatc 25
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
ctaaaaatgc tacacctggg gcaaaacacc tg 32
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 25
gccatgcaag gccaagc 17
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 26
agttcttgag ccttagggtg ctag 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 27
ccaggaaaat gctgccagag cctg 24
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 28
aactacgcac agaagttcca gg 22
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
gctcgtggat ttgtccgc 18
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 30
cagagtcacg attacc 16
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 31
tgagcagcac cctcacgtt 19
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
gtggcctcac aggtatagct gtt 23
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
accaaggacg agtatgaa 18
<210> 34
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 34
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 35
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 36
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 36
caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 37
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 38
<211> 275
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 38
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggc 275
<210> 39
<211> 91
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr
85 90
<210> 40
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 40
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 41
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 42
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 42
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 43
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 44
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 44
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 45
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 46
<211> 233
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 46
agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct 60
atgctatcag ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggaaggatca 120
tccctatctt tggtacagca aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg 180
cggacgaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gag 233
<210> 47
<211> 77
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 47
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
20 25 30
Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr
35 40 45
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
50 55 60
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
65 70 75
<210> 48
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 48
caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 49
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 50
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 50
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 51
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 52
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 52
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 53
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 54
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 54
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 56
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 56
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 57
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 58
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 58
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 59
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 60
<211> 305
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 60
gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct 60
cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120
tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggacg gatcaaccct aacagtggtg 180
gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccag taccagggac acgtccatca 240
gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggtcgtg tattactgtg 300
cgaga 305
<210> 61
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 62
<211> 307
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 62
gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct 60
cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120
tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggatg gatcaaccct aacagtggtg 180
gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccat gaccagggac acgtccatca 240
gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggccgtg tattactgtg 300
cgagaga 307
<210> 63
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 64
<211> 307
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variation
<222> (124)...(124)
<223> n=a, g, t, or c
<400> 64
gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cttggggcct 60
cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120
tgcnacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggatg gatcaaccct aacagtggtg 180
gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccat gaccagggac acgtccatca 240
gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggccgtg tattactgtg 300
cgagaga 307
<210> 65
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (38)...(38)
<223> Xaa=any amino acid
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 66
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 66
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggctg ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 67
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 68
<211> 346
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 68
aggatgtggg ttttcacact gtgtctctcg cacagtaata cacgaccgtg tcgtcagatc 60
tcagcctgct cagctccatg taggctgtgc tgatggacgt gtccctggtc atggtgaccc 120
tgccctgaaa cttctgtgca tagtttgtgc caccactgtt agggttgatc cgtcccatcc 180
actcaagccc ttgtccaggg gcctgtcgca cccagtgcat atagtagccg gtgaaggtgt 240
atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccagg cttcttcacc tcagccccag 300
actgcaccag ctgcacctgg gagtggacac ctgtggagac tcgcga 346
<210> 69
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> synthetic
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 70
<211> 150288
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 70
gcgcgccctg gcatggagga aatgacaaag attattagat tgaagacttt ctcagaaaat 60
gatattaagt cattaaggaa aaggaacaat ataaacgtgt atttgagaaa ttttaattat 120
ttgagagatt tttcatacaa tatttattct gcaagcaaat ttcagggatt gaattaataa 180
aactgataca gaacttcctc tgtaggtatc tgtgtaaaca tcaatttctg aatcagtgtt 240
gtaaatattt tggaacacac acacaaatca cattttatct ctacttttat ctctattttt 300
aaaaatgcca aaaaaactca ttttgtgcat gtagcatttt gaattcccac catcaatgca 360
tgatagttct tggttttcca cattcatatt gccatttatc attatgagaa ttgtgtgttt 420
taaccattct aataggtgag taatggtatc taatttttag ttaaatgcac atttccctaa 480
taaaaattca catttaacaa ttttcatata atttttgcca agatgcctct tctcatattt 540
ggttcatttt taactgcatt gttttctttt gattagttgt aagtttactt gcatattgat 600
tataaaatca tttaacaaat taaaagaatt catttaacaa atatgtgact tggaagtatt 660
ttctccaagt ctgcggctgt cttttactcc cttatcagta tgtattgcag aaaagtgtgt 720
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttatacaaat ttagatttaa aaaatgtaaa atgttattca 780
tccacagatc atgtctttgg tattatatct gaaatctcat tataaaatac agtaatagca 840
attacttttt ccacgtctct aatctcaggc tacaatcaac tcatgagtgt ttaagcttca 900
cctacttgat tagaggacta tcaacctaac atatttggaa tacttctgta aaaagatgtg 960
ttcctcttcc tattatttct ttatttgatc acttattaat atgtgtattg gtttatggat 1020
gtctatttca tactctgaag aagatccatg ctacattatt cattttattt ttcaaaccac 1080
cacggcttta ttatgtgctg ggagctcatt gagtttggat cctgcatcct tacagctcac 1140
ctcatgcttt tgtttttgaa cacttccctg tttcctgcta ttataataaa ttctaaactc 1200
attttctata ttatcttttt catacataga atcagccatt tttctaaaga ttgcttgctt 1260
ctgatgttaa agaatagtat ttaaaaaatt gtaatactgg gtatgtgcat tgttaatgtg 1320
gtataagtac ttgcaggacc tctcaaccaa ctggcctagt aaactatgta tctaaccttc 1380
tgtaatgtga ttacattaaa aatgagaaca cactggtctc tctacccaat tatgctacca 1440
catggatctt tctagccttc cttccttgac tgtctataac ctctcactgc aaaatgagga 1500
accccatcca accatatgcc attttattac ttagctgcac aatttcagga cacatgcata 1560
gcagtatcag aaatgtaaag ctgtaccctt gtaggaaaca tgtttatcta ctagaataga 1620
gtgcttatgt tcagtttctt tacactttaa acttacagag tttcctcatt ttcaaagttc 1680
cttaggtcag caacttcatt ttccactttc ttcagtgagg tcatttcaat gacactgtat 1740
aatttgattt atttgaaatt ctataaaagc caaaactgta gtcaagtgaa caacaacata 1800
tagaggatat tcgaggagtt tagagactgg tataaaataa gttaaaaaga cactgtttaa 1860
gaagattaaa attattttta gtgatatgca atggttcaga tatgacacaa ttaatttgtc 1920
taagcacata gttttgtgat ggaaaatata aacctaaata tatacaatta aaaaaaaatt 1980
tagcagttca ttaacccaag gatcaaatgc agattgtata aaattatctc attacttatt 2040
ttgtgagggt ggagatttca tgagatgtat gcaacaaaga atgaggtaat tttcctgatt 2100
tgcatataag atgttgccat tcactaaaga cctttaattt tttaaattgt ttttttttta 2160
aatcaatttt ctatgtgacc caggtttttt tctcttgaca agcaaataac ccacaggatt 2220
attttctttc cttggttgag aaatatttcc ccaaacttca gctcagttca ggcatacact 2280
gtccctgaat gggcatttac cctcagatgg gtacacacac ctgtcaacat gtggactctt 2340
ctgtcagaca aacgcacctt tactcacgtg gattcttctc tcagacaaac acacatgtcc 2400
ccacgtggac tctttcctca gactaccaca tatgttctta catttactct ttcctcagaa 2460
aacagacatt tcctcatgtg gactcttgtc tcagacaagc aaacatgtct ccatgtgaac 2520
tcttcactca cataagtaca catatgtcca cattgactgt ttccttacac aagtacatat 2580
atccaatgtc gaattgttct gtggcaaaat gatctcaaga taatgataat cataaacccc 2640
ctccctgaca aggcatagat ctgtattttt ttcattgcaa cctaactttg ccttattgtc 2700
aagaacagta gtttgcagct ctaaatatac caattagaga caggtgtcca ttttctctgg 2760
aaacgtattt ttatgttctt actggacata tttgttgata atgtttgcta ttatgaagat 2820
accccaacag tgtccacatt agagaataaa aaatagtaat gggcagatta actctgtgca 2880
tccagaccca gaaatccttt gaccttgact tccctgaaat gtagacacag aggatggatg 2940
agcaatgctg agcagtgcac ccatgaccac aaaaagaaag acgtggaaat gtgtcccctc 3000
cacttctcat gaaaggcagc tcatcccctg ttccctcagg ccctggcgag gagccacccc 3060
atgtctgtgc ccttcctcag tgtccacacc gtggggtctg cattgatctg gattctcttc 3120
tcatccccgt caatattagt gtccttcgta aatcaggtcc agctgtggct tctcctcacg 3180
gggctgttct cagtctgttt gctgtgttca cggaagtcct gtgtgaagtt tactgatgga 3240
gtcagagggg gaaaaaattt acagcccagt ggtgagactc tcctgcaaag cctctggttt 3300
cacctttact ggttacagca tgagcttggt ccagcacgct tcacaacagg gataggtgtg 3360
ggtgccaaca gtgagtgatc aagtatgaat tctcagggtt actttccatg agtacaaata 3420
aattaacaat ctcaagcaac acccttttaa gtgcagtctg ccttacaatg accaatctga 3480
aagccaagga caaggtcatg tattactgtg agtgacacag tgagggaaac cctgtgtgag 3540
cccagacaca aagctcaccg cagggagaca ggaggggact atgtggtaga tgctgctcag 3600
aaccaccagg gggcatcagg accatcaggg agggtgcaca gaaccaccag gaggggctca 3660
ggacaccagg gggcgctcag aaccaccagg gggccctcag gacaccagag ggtgctcaga 3720
accaccagga ggcgctcagg acaccagggg gcgctcagaa cactaggagg tgctatgaat 3780
cactaggggg cgctcaggac acaagggagc actcagaacc accagggata gctcaggata 3840
ccagggggca ctcggaaccg ccagggggcg ctcaggacac tagggggcgc tcagaaccac 3900
cagggggcac tcaggaccat cagggagggt gcacagaacc accaggaggg gctcaggaca 3960
ccagggggcg ctcaggacca caagggggcc ctcaggacac cagggggcac tcggaaccac 4020
cagggggcac tcagaaccat cagggagggt gcacagaacc accaggaggg gctcaggacc 4080
accaggaggt gctcaggaca ccagggggcg ctcagaacac taggaggtgc tatgaatcac 4140
tagggggcgc tcaggacaca agggagcact cagaaccacc agggatagct caggacacca 4200
gggggcactc ggaaccgcca gggggcgctc aggacactag ggggcgctca gaaccaccag 4260
gaggcactca ggaccatcag ggagggtgca cagaaccacc aggaggtgct caggacacca 4320
gggggcgctc agaacactag gaggtgctat gaatcactag ggggcgctca ggacacaagg 4380
gagcactcag aaccaccagg gatagctcag gataccaggg ggcactcgga accgccaggg 4440
ggcgctcagg acactagggg gcgctcagaa ccaccagggg gcactcagga ccatcaggga 4500
gggtgcacag aaccaccagg aggggctcag gacaccaggg ggcgctcagg accacaaggg 4560
ggccctcagg acaccagggg gcactcggaa ccaccagggg gcactcagaa ccatcaggga 4620
gggtgcacag aaccaccagg aggggctcag gaccaccagg aggtgctcag gacaccaggg 4680
ggcgctcaga acactaggag gtgctatgaa tcactagggg gcgctcagga cacaagggag 4740
cactcagaac caccagggat agctcaggac accagggggc actcggaacc gccagggggc 4800
actcaggaca ctagggggca ctcagaaccg ccaaggggcg ctcagaagaa gcagggggtg 4860
ctcagaacac cagagggtgc tcagaagcac cagggggcgc tcaggacacc aaagggcact 4920
catgagactg tggcaagggg gtgctgagaa ccacaggatg tgaccaagac accaaggggc 4980
actcagaact gccagggggt gctcaggaca ccagaggatt ctcagaacca ccaggggatg 5040
ctcaggaaac tagcgggtgc tcagaaccac cggaggacac tcagaaaacc aggggatgct 5100
caggaaccac cagggggcgc ccacgacacc agagggcagt cagaaccacc ggggcatgct 5160
cagaaccacc agggggcgct caggacacca ggggatgctc aggacactag gggcgctcag 5220
gaaccaccag gggacgctca ggacactagt agggtctcag aaccaccagg ggatgctcag 5280
gacactaggg ggcgctcagg aaccaccagg ggtcacccag gacaccaggg gtcgctcagg 5340
aaaccagagg gtgcccagga aaccagggga ggttcaggaa ccaccagggg gcactgagga 5400
caccaagggg tgctcagaac caccaggggg cgctcaggaa ccaccagggg gcgctcagga 5460
cactagtagg cactgaggaa ccaccagggg gcgctcagga cactagtagg cactgaggaa 5520
ccaccagggg gggctcagga cactagtagg cactgaggaa ccaccagggg gcgctcagga 5580
cactagtagg cactgaggaa ccaccagggg gggctcagga caccagaggt cgctcagaaa 5640
accagggggt gctcagaacc accagggggc actcaggaac caccagtggg tgttcaggac 5700
agcaagaatg gctcaggaca ccagggagca ctcaggacct ccaaggggct ctttggaggc 5760
agctccatat caggtacctg gggaggatga ggtttccttt tccaccttgg tgattcctga 5820
cctggtcaag caaaagtctt ccccaggatc tcttacgatg tcttccttgt aactcatggt 5880
ttctttcacc tataaaacat taacttagaa caggggttca attcaacttt taactctgcc 5940
tattttcaga gttatactag caatgatata tctcagtata ttttttttaa ttgtgtatat 6000
tcaatccaaa gtctggctct atgcacaatt tttttgtttt ctgtgctgtc agacacacta 6060
ttgtaaatgc ttttctaaca actcagcata tgcatggggt ccagtttctt ttcctttcat 6120
cggctgtttg tgcagatgaa acaccacttt aagggctcct gtcctccact ttggcccctg 6180
gtgttctgct tctcaaactt tctccatctt ctctttttct gtcaaaatat tttatcttcc 6240
tcagtctcca tgcaggaaac aggaagtcct tttacttcct gtcctccatg tctggtaaat 6300
cagttcactt cttttcatga tcactgaagc caaccaagtt taggagagta acagttctcc 6360
ttagaataca ctctacctgc agaccctctg ccctcatcac acttttctag ggtcctgcag 6420
acataacccc cacccattcc tctttttccc taagtaccac agactaggct ctgcaactta 6480
tgctaccctc tgtgtgctca gcccaggggc tcagtagtgc tttcatgaag tccaaatccc 6540
taatgtgttt gcccactctc agaccaccct ccagcaagct gccattgtga ttgaatcctg 6600
caaagcatgg gctgctttca gtttcctatt gctggatgtt ctttattata aaggcatatt 6660
ggcaaataac gactagagtt tgtattgaaa attaacgcca aaaagttttt taaaaagttt 6720
ttcaaataga aaagttctat cctgcctagt ttaaaaaaat acaatgttac tttaatcaat 6780
gatttaataa aaatttaagt gatgtttgtc ttattagtta ttcaatttat taataactga 6840
ctgatattta aaaagtaaat actggctggg cgcagtggct cacgcctgta atctcagcac 6900
tttgggaggg tgaggtgggt ggatcacctg aggtcgggaa ttcgagacca gcctgaccaa 6960
catggagaaa ccccctctct actaaaaata caaaattagc tgggcgtggc ggggaagctg 7020
aggcaggaga atcgcttgaa cctgggaggc ggaggttgcg gtgagccgag aacacgccat 7080
tgcactccag cctgggcgac aagaccaaaa ctctgtctca aaaaaaaaaa aaagtaaata 7140
ccattgtaca cttaagtaat atatttggca agaatggcat ttacattcat tcaaaaatga 7200
aactgcaaat acgagttaca ttcaattaaa taattaaaat aatatagaaa aaaatgggtg 7260
tgttgttttg gtgtttaata tacattcatt tttgcatgga cgggtatatg tgtcattgct 7320
gggctgttgt gtatgtgtgc gtgtgtgtgt gtgtctgtgt gtacaactat gaagtttaaa 7380
atatattatt aaattacgta gttatattaa tccaaattta tcatgttaaa atattaggaa 7440
aaaaacacca gtagagaaat tacagagaac atcagcaatg cctacagcat ttacaagagt 7500
cacattaata acaaacaaac tagttcaaat gtttagatat gacacatgca gtagaaaacg 7560
ttcacatggt attaacacaa aaatggtgca caactgagga aattataata cgttcatgat 7620
attggctaca taaatgctta tgatagtaat gcttttcatc catcaaatgc ttatgataat 7680
gcttttcatc catcatatta tagatgataa aacaactcta taaacacttc catcactagc 7740
gtttaatatg agatgcctca catctttttc tgaaataaat aaacatctgt ccaccacttc 7800
gatgatcatt tcaggattat cctctgaaat aattatccat aataatttta gtaacaatat 7860
tattttcaga agcctatttt ataaggtctt tgaactatta tttttatgat tgttacttta 7920
tattttacac actttttatt tggaataatt ataggttatc agaacaattg taaggaaaat 7980
acagtgtgtt cacatccatc tccaagtttt cactaaagtt aatatgtcaa aaaaaacatg 8040
ggacatggga ctaatatatt tacattgata agtttctgtt tattcagctc tgggatttat 8100
ttgaattttg ccaattttta acagtttcct tttttccttt ttcttttctt tttgagataa 8160
ggtgtcactt tcctattgct ttttgtttgt ttctttgttc aacccacgta accacatcaa 8220
attcagtcac catgttcctc tcatatcttc tggttaatca cagtttgggt tcctgctgtc 8280
ttcccattga atattctata aatgaaacta gtcaaataag ttgattctgg tcacttatat 8340
atttacctat tttatcacgt ttgttttgtc aatcacagta agtgtcgaat tcgctatctg 8400
ttatagatgt tagcctattt tctatcccag atccattggt taaatctttg gtgatgcctt 8460
ttagaaaact gatcccttta ccctatgtaa tatgcccctt gattcctgaa agtcttatgt 8520
ctaccttgtc tgaatttaac atagctaagc acgctttctt ttcgttcata ttttcatggt 8580
ccatgttttc ctgtatttaa cttttctatg tagagcaaat ttctgtacag agctagtagt 8640
tgggtcttgc tttttaaatc aactataata attctatttt aaaactggta ttactatttt 8700
tctgttaatt tctgttttaa tttggcattt tatgatcatg tttatttctc tattaactta 8760
ttgtttagtt catcttttat gaatattgta ttggccctaa gatatacaat aagaattgtg 8820
tataatcaga ttctaattca aataacgtaa aacctcttca taggttgtag agctattata 8880
acttattctt ctaaacactc tttctcatcc gttgtcttag tttattctca gtttgcactt 8940
atatgtgcta taaaatataa tatgtgcatt tttatcatta catagacata tattagaaca 9000
attaaaaata taaaaactac atttcaactt cattttttca ttcttgacca catgttttat 9060
ttggatagat tcatgtttcg gatgtatatc atatggctac tcaccctggc agaaaatttg 9120
ccaaagcacc tactgaagga tgaatgcact agcaataaat tttctcagaa tcgatttgtc 9180
ttacagggta ttcatttgac tttcgcttta aatgaaattt ttaatatata tagaattcca 9240
gtttgacttt aatttgtaat ttattttctt gtactcatgt attcattatt ttcttcctga 9300
agatggtcac acattccatt ctgctgggcc ttcattatag atatttgtgt gtatctattc 9360
agggctatat ttgcaattta tggatgccac aattatcaga gttgaagtca gcttctgctg 9420
tccacagaga tttcaagttc ctcccatgat acttgctttt gtgtccctgt ttgatcctgg 9480
gtctttatat ttagttttcc ccagggaggc tgtctgtttc agctgtggaa agtgcaccct 9540
actgacagtt taaattgatg actgtgtggt gaaggaggtt ggacaaagcg ggacttcctc 9600
caaccttctg actgagtctc cttcttatgc aggagtagta agcatagttc tggggagtgg 9660
ccttccacat tgtcctgtcc ttaactcttt ccccagggct ggaacgtctt ttcccagaca 9720
caactgtttt tcaccagtgt ccccagcttt ttacccacta tccttaccct aaagagtaag 9780
gatttctttc ctgaggaagg agatgggagg tgtttctgga tcaagtttcc ttggtgtcgt 9840
ctgtttcctt ttgtttctgt tgacttcacc acagctcata tgacacatgc tttggtggat 9900
ttcccctgga ggtagtggag gtgcattcag gcattccaca ggagctgctg ttcttttccc 9960
cagtcaacac cacaagacac cagatgagga agttgtccgt ggatttttca agttctctag 10020
gaaaagcttg caagcactag gccaatctaa caccattagt acatgcatac taaaaaaaaa 10080
aaagtcatta agtatttcta ggttagtctg tttctatctc aaatgccatc cagtggcacc 10140
tgccctacgt acactagcag gtaggtcctg gttctctctg caggctccta tcttctcaga 10200
tttcagtttt cttgtttgct tggtgaaatc aactcagata tgttgaatgt tttttctctc 10260
ttttatttgt agctgttcag cttcgttgtt aatgaggtca gaataaaatc acagttttct 10320
catttttttc acattcccac actgaatagc tgctttccgt ataaaagcca gaaactgaga 10380
gaacacattg aatatccatt acaggtgaat gttaaacaat ttgagatatg tttgtgtact 10440
ggaataaaat gctgcattac aatcaagtca tcactcattc acataaaaca tggccacatt 10500
ctcaaataat gtagggacct gagtgcccct ccatctactg gcctctcctg gggccctagc 10560
ctggccacac cttcttgcag ggcagtcttg gacgccctgg gatcccgcac caaaatttct 10620
gccctggcag aacatgcctg actggtggag agctccaatc gggcagccct catgtgcaca 10680
caccagctta cacacttcct ccgaatactg taggttcacc caggcccacg taacttccca 10740
catcactttg cagtcacatg tctgtatagg tgggttttgc ttttcttgtc ccaccattgc 10800
gtggagtgca gtcccctccc cccaccccaa ccaccatggc agaggaagct ttggtgggga 10860
aaaagccagg gccgctcctg tcagcgtccc gcacttgcgc taattctgca cagagaatag 10920
cagatcatct cacacattca gaaatcactc ctgcttgtgg ggcatgaata cggcacccgg 10980
gcctgtgccc acaagtgtcc catccctgag ccaacacctc ctccagtgtg accttgaaca 11040
cagtcaccaa cagggcccca cagacgcaat gcctctgcca ctgtggcgaa cacctgcagg 11100
gaggcaggca cccagacacc cactagcact ctgccacagc tgccacacct ccaacagccc 11160
aggacagtgg attcctaacc ttaaggagcc ggagaaccaa gtcagggact agtataactt 11220
cccccagagt cagagcacac agtctaggtg ttgggagctg agcactggcc acctaaattt 11280
ttccagaaat gaagccagtt ggctgaatcc accttatacc acaatcaaac cctcaaggtc 11340
atccaatagg gtaaaagaaa ataaaaatgt atccaaaggt cagcaacttc aaagattgaa 11400
ggtggataag cccacaaaga tgagaaagaa ccagtgcaaa agtcctgaaa acaaaaaggg 11460
cgccctcttt cctccaaaca accacagcac ctcttcaaca gcagttctga atggggctga 11520
gatggctgaa atgacagaaa cagaactcag aatatggaga gtgaaaatgt agatgaatac 11580
agctatttat ggagaatact ataaatgttc ctcaaaaaat aaagaaacaa aatctactgt 11640
agaatccagc agtctcactg ctggctatgt atccaaagga aatgaaatca acatgtcaaa 11700
gagatatctg cactccatgt tcacgttcat tgcagcatta tttaaaatag taaagatatg 11760
gaaacatcct aaattcccat gaatggatga atgaataaag aaaatgcata cagacacaac 11820
agagtaatgt tcatccttaa ataagaagga aaccctgcct ctgtgacagc atgcatgaat 11880
ctagaggacc ttatgccaag tgaaacaagc caggaacaga ggaagagtca ttcatgattt 11940
cactgtatat attaaagcag tagacttgca gaggtagagt agaatgttgg ttaccagggc 12000
ctagaggggt ggactgggaa agggagatgt gggttaaagt gcacaacgtt ccagttagac 12060
cggaggtata agttatgcct ttctaatgca cagcatgtca actatagctg ataaggtagt 12120
atatatttca aaattactaa aaaaataaac attagaattt ccccactaag aaatgataaa 12180
tttgtgaggt gatgaatata agcggcttga gttacccagt tcataatgta tacatgtatc 12240
ataactaaac aacatatgtc ataaatatat gcaaaaatta tttgtaattt ataataaaat 12300
aagtttcata tttaaataat tacattaaga aaatgaacag aaactttcag atttcaagaa 12360
tattttatat atatatatat atatcttaaa acaaacttgc aacagaatat agaaataagt 12420
tttacgactc aatggaaaag aacagaattc aataaaaact ggctaaaaga aacaacagct 12480
gcatcattat agaaaattct ggaataatca gccatataaa gattctcact ctcttagaac 12540
tagaattccg taggacttgt aattcctcct gacctgggtg ggaggcaaaa ggaagaacag 12600
ctaatggtga ttcagtgagt tttatacctg tgtgtacttc tgtgctcact cagcagaaag 12660
aaaagaagaa aagaaagaaa gagagaaaga aagaaacaga aagaaagaaa gaaagaagaa 12720
agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagagaa agaaagaaga 12780
aggaagaagg aaggaaagaa aagaaagaaa gaaagagaga gagggagaga gggaaggaag 12840
ggacagcaga agtcattgtg gtgtgtgtga aagcacaatc cttgggctcc cccacatcca 12900
tctctactcc agtcccatca atgtccagca aatacatttt ctaagatgaa gtattttaaa 12960
ctttctaaat cctgctagaa aacccctcag ctctttcagt tttgctctat cacttgaatt 13020
attgaattaa atctagtttt tgtgggccta tcaataccat aagccaaaat aacacatgaa 13080
gaaattgcac tgagacacat gaaaaccttc tgaaagctcc ataatttcag atctgcattc 13140
ttatttcccc gaacctaaat cactgaatag agactcagaa cgagttgatc ttgttcctga 13200
acgtgcacag agccaaggac atcctgtctg tctggaacag ctcaggtttg ttcctgtttc 13260
tcctagagga tataaaatct tgagttaggg aaaaacagcc agggacaccc tgggctttgt 13320
tcttctctcc cctggaggca ggatgtcctt cagagctttg tcccagtggg taacacagct 13380
gctgaggtgt acaacccacg tggcctcgtt ttggtcactt ttgcatggtg agcctgcttt 13440
gcaccatggc ctacaatatg cgtgtgtaac taatctgtct ccatcttcaa aatgacatta 13500
ttccacatca aatctagtgc aggtgcctca cacagaacat tctcaattac ctccatcatt 13560
cataaaattg atgccattaa tttcaagtat acatacatca gactcattta acgtattgtt 13620
attctcattg tttgaaacat aacttttaga tcaaataatt aacaataata aaaatataaa 13680
ttttgaagtc aggtaatgtg atttctctag ttgtgttctc tttgctcaga atggcttggg 13740
ctgttctgca tcttttgttt ttccacatat attttaggat tttttaaaaa tttctgtgaa 13800
gaatatcatt gttgttttca tagggattgt actgagtctg tagattgctt taagtattat 13860
ggacatttta acaatattga atctttgaat tcataaacat ggaatattgt tccatcttgt 13920
gtcctcttta tttcctcaat gttttataga tttattgtag ttttttttta ctttgttcat 13980
tacacattgt atgcctgtac caaaacatca catataccca acaaatagaa atatatatac 14040
tattatgtgc ttataacaat taaaaattat gtatgtatat tgaatctatt caaaatcaga 14100
aactatttct ttttactgtt tgtaaggtct tgtctctagg ctataaaaag aatttgtaaa 14160
actcaacaga aagcataata taaacagaat tctaaaatga gtgaaaatct gaacaaacac 14220
ctcaccaaga aaaaatgtta tctgaaaata agaatatata aaattgttca gtatcaattg 14280
tcataaactg atactcatat ttaccaaata caaaagtaaa catgatgtat ttcaacagaa 14340
ttgattctca aatatttgta tactcataca gtggaatact atcagtcata aaaactatgg 14400
gttattaatt cagaagacaa cattttaaca ttttttctaa gtgaaggaag atggacaaaa 14460
gagactaagt attgtacaat tccattcatg agacctgcta aatacagtaa aattaaaagg 14520
attttaaaaa caggtttgtg ataggcaggg cttttgggga aagacaagag actgacttgg 14580
caaagctcag gggatatttt tagggtaaaa caaactgtgt gccattgtga tatgcctaat 14640
ttcttattat atttgttcag agttaatagt gtacgtttca accaactcgg tgattttata 14700
ttttctattt gctgatagag acatgttcat ttttgtcaat cactttgcta aatgtggctg 14760
agaggctgtt gaaatgaacg ctgagcaaat gtattcacca aatctacaag agcaaattat 14820
ttgccaattg ctgattgagt ggggtctata atgtatttga gattgggtgt ggggatgtta 14880
ttgtgtgaga tcatgatgtt tagaccatga cactctctgg tgagggatca ctcattcatt 14940
gcacatttaa tgaaaggcag gtaggaggag cagaagggga tgagtcacac tcctgaccac 15000
agccacaggt tattgaaggc agaactgatg taatccccta aggtagacca ctgcccctcc 15060
aaggtgacct tatcctagag ttgacacaca tcctgggaca ccagagacaa ctccttctct 15120
cccctttctc tgcacttcag ctggaagcaa ctgtctcacc gagcaccttg tgttaaggaa 15180
tgagagttcc tgttccaggt gtgagggccc aggtgcatcc acttgatcca gcacaagagc 15240
aagaacagcc ttccagaaaa tgacatcgcc tgaggtataa ccagctctca cctgctgcag 15300
cttcctctga ataaaaagga aactgttgaa acttcctcat aagtgtcctg ctgtgccatt 15360
ccctttgtcc ccacatgttc agttgtgtct gtccagatgt cacttttgtg tagggagatt 15420
agggttctgc ttccagtacc agaacacaca tgacctctta ggggacttca gggttttgct 15480
gacatatgtg atgatcttaa aagtcattag ctccatttct acatcaaaaa acatctgaac 15540
caaaggagca cataggctca ggcctgtaat cccagcactt tgggaagcca aggcagagga 15600
atcacttgag gtcaggaatt tgagaccagc ctggtgaaca tggtgaaacc ccgtctctac 15660
taaaaaatat atacaaaaat tagccaggcg tggtggcact agcctgtaat cccagctact 15720
tgaaaggctg aggcaggaga attgcttgaa cccaggaggt ggagattgaa gtgagctgag 15780
atcgcaccac ttcactccag cctgggcgac agagtgagcc tccatctaaa aaaaaaaaaa 15840
atttatatat atatatatat atatatatat ataataaata tatattatat atcatatata 15900
tattttatat aatatatatg tatattttta tatattatac atacatatca atatatgata 15960
tataatatgt atatataata tataatatgt atattcatat attatataat atgtatattg 16020
atatatatta cacatatata ttttgatata tatatatctc caaaccatct aaatatcaag 16080
tattttttaa tccatctaag agctgaaatt gctgaaaaaa ctactccctc caaaagctgt 16140
agagacaggc acatccacag tcacagcaga gacttgctga cttggaagag aagctcctgg 16200
agacacattg gtgagaacat ttacctggtg attatgctga atgtctggag gacaaatgtg 16260
gactaggggg agggtgagca ctcctagagg ctgtacaccc cacacttgtg tggacttgcc 16320
ctccagggcc ttcaggttct cgtggaagca attaaaatag attccctata gccatgaact 16380
ggggaggagt aatcacggag aaaagatgca caaaaagact tttctagaaa gctcatccaa 16440
gggaaggtat tctccaaaat cttagtttat gtgggggaag gaaatacttc caaattacag 16500
acccctcctc ctcagccttc ctctatcacg caaatgataa aattagccaa gaggagtcag 16560
attcaaggcg gtagccctgg gtgcagcatc tgcagaaggg aggaaagaga gaaaatcagc 16620
tgtatcactg gagattcctt gtgaaggtca ctgctcagga gaagagggca accaaaccag 16680
ggagagtcaa ctgtaagaac ataccatgct cccctgcccc acacattacc tcctcaacag 16740
catcattaat atggattaaa gagggcagtg tgattgcttt agatctgttt gagaaagaaa 16800
gtcacatact gaggcctagg gtcagggtcg gcggcacttc ccgtgagtaa gatactacga 16860
agaaggaaaa attaggggtc cataactgtg aaaatcagcc acagtgtgtg tgagaatgtt 16920
tgtgtttgtg tttctgtgtg tttgagtagg agttattgga acagcggacg tggagtgagc 16980
tttaatccac atccatctgc agcttcaggt attctcagat gcagtattca tctgcaagag 17040
ccgaaatgag aaaagagcca cctccaaccc ccccagagtt ttagcctccc tttgtttcca 17100
gtgatccagt gcatctagac ctccaggaag tggactccct ggtgatttta gcgattcttc 17160
tcttggagcc accctgaaga ggacattggg tttccaaagg cccattcact atttcaagaa 17220
gtggtgccat cagctcatgt tgtcactgaa ggagcattct gagccagggc acagtcactt 17280
cctagtgagc tacagaggct gagagaaaaa tgctctgtga gacccaatgg gaagctccct 17340
gcagtgcaag gtctgggtgg cagggagcgc tagggcctcg cccagcacag gctgcagccc 17400
tggagcaggt gcaagggagg ctggggaggg gttcctccca gggtctgatg tcttcctttt 17460
ctcggacaaa catgctttaa taagttaaac aagactttag taaagactat tgatgtgtct 17520
ttgtgtcttt cagtatacag ttctatttgt aggatttatc taacctaaca agtcaatgag 17580
aatcacatgt aaaaggagaa atttctagga ttttcagata tcttaatagg taggagatgg 17640
agaaaaggga tggttttatt aattcagtgc ttgccaatct taacagagac agtagtaaga 17700
catgcagaaa gcaaagccca gaaaagtatg aaggtgtcaa agtgccattt aagtatgggt 17760
tcacttggag gaccatgttc tgcgggaact tgttttcagc agacaatcta ttttagcaga 17820
gttctgggca tacaagggga cacacatcat taaacaagga ttgggacagg gacttcagcg 17880
tcccactgtt gcatggccca taaattatgt gtgttctctt tctcatcttg gatcaagtct 17940
agagctatga aatagtatcc ctcatgaata tgcaaataac ctgagattta ctgaagtaaa 18000
tacagatctg tcctgtgccc tgagagcatc acccagcaac cacatctgtc ctctagagaa 18060
tcccctgaga gctccgttcc tcaccatgga ctggacctgg aggatcctct tcttggtggc 18120
agcagccaca ggtaagaggc tccctagtcc cagtgatgag aaagagattg agtccagtcc 18180
agggagatct catccacttc tgtgttctct ccacaggagc ccactcccag gtgcagctgg 18240
tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 18300
ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 18360
ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca cagaagtttc 18420
agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg gagctgagca 18480
ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agacacagtg tgaaaaccca 18540
catcctgagg gtgtcagaaa cccaagggag gaggcagctg tgctggggct gagaaatgaa 18600
agggattatt atttttaatg ttgtttacag tatgtcatta ataaattgaa aaaaagtaac 18660
aatagaagta tatactctaa ttatatggga actttgtttt ttcagttttt tcattttttt 18720
tttttttttt ggtttgtttg tgacagagtc tcactctgcc acccaggctg gagtgtaacg 18780
gcacaatctc agctcactac aacctccacc tcccaggttc aagcaattct cctgcctcgg 18840
cctccagagt agttgggatt acaggcaccc gccaccatgc ccggtgaatt tttgtatttt 18900
tagtagagac ggggtttcac catgttagct aggctggtct caaactgctg atctcaggtg 18960
atctaccctc ctcagcctcc caaagtcctg ggattacagg cgtgagccac tgcgcctggc 19020
ccaattatat gggaattgtt tatataatta tcaccctata agcaaaattc atggaggagg 19080
aaaagctcta ctgaagaaag ctgataccgg cattcccatg aaagtatctg tgtagaagta 19140
agtattaaaa tcagttgaat aggcaaggca tggtggctca cgcctataat cccagcactt 19200
tgggagaccg aggcaggtgg atcacaaggt aaggagttca agatcagcct gcccaagatg 19260
gtgaaacccc ttctctacta aaaatacaaa gaattagctg ggcgtggtgg tgggtgcctg 19320
taatcgcagc tattcgggag gctgaggcag agaattgctt gaacctggga ggtgaaggtt 19380
gcagtgagcc gagatcacgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga aactccatct 19440
caaaacaaaa caaaacaaaa caaaacaaaa aaacagttga ataaagtacc ttagagtcat 19500
ctgttcaatt aacatgttta actccaaaga aatactgaaa atattttcca aaaaggaagt 19560
gccattttac gttcctacca acagtgaata agattttctt ttctggagcc ttgtcagtat 19620
tcactaatgc tttgctgtgc agccgttgta atattatagt aaatgagtag cagtatttaa 19680
tggttgtttt aaatatacat attcttaata caaagtcttg atgaacactt ttttatacat 19740
tgttttatga ggtgtgtgtt cagatctatg tatgccagaa atgcctggca gcgttaattt 19800
aagcacactg tgagaatgac cctatagttt atgaagaatg tatgttcaga gctctgagct 19860
aagaaatcca ggagctgtca acccagaagt ttattccttg tctgtgaagg acatctgaat 19920
ccctggccta tcccttggaa cacaggatgt ccaggtgatt gatgctcttt gttaaatctg 19980
gaggttgcta ggtagagggt gctaagtgaa aatcataata taaactacac gtgttttaca 20040
aatggtagtg gttttcctgt ccaacacact tttcctgggc cacattgtat gcaagtcctc 20100
aatacaccct aggtcttgtt catgggctcc aggtctcctc ttcagccttt tggacatggt 20160
gccatgccta ttacagtcaa taggggtcta gcatgacaac tggtaggccc agaacaaggt 20220
caaagaaaat cctgcaagct cttagacaac agtgtcaagg aaggggagac ctgtggggaa 20280
atcccaggca ggccatgcac atctctgtgg gcccaacagc tgcaatcctt gatggatggg 20340
gcccgctgca tgtgtacggg gatgcctcca aaatgccaaa agttctggag gacctgttgc 20400
ctgaggtgga tgtgacaatg tgacaaagtg acagtcagat tcctgagctg tggcagctgt 20460
tggccactcc tgactgcact ctgagcaacc actgaggcag agctcattgc acaggctagg 20520
gtgtgtcagc cacgagaaca gttgtaacta taatgagatg ccgcctgtag ggataggata 20580
gcaaattgga gaccattgtt tatttggtag gccatttaaa gtgttgctga ctgccacacc 20640
aatgcattag gactactatg actacgtcat cctgggagcc taagtcctgg cgtccgatgt 20700
agagctccag tgggaaggag atgaaggtta ggatgagtcc ataaaggttc ttgctctgca 20760
gcccctgctt tgctgtctca cttggtgaac agagaatggg aggtcaatgc ggacaaagtc 20820
cagggtccag gcttatcagt caaatacttg gtgtcatctg gttacataag actatagtta 20880
ttccatattt catcatagat aagataagat gcaggtctac tcatgtccca ccacaccaaa 20940
gcagttggaa acctcccaag gcctcctggg acattggcga tcctttattc cccatttcgg 21000
caaacccctt gggcccccat ggcacttaga caagaaggtg ccccactgcg actgttccaa 21060
aagggaggat gagggctctg aagaagctga agtcacagtg aaatgaatac aaaccttggg 21120
agttctagtg cagggacagc cctgtgaatt ggatgtagtc agttaccctg aggggtttag 21180
gtggggactg tgttaaaggc aaggacataa gtgtgtgtcc ctaagaccct ggtctcaaag 21240
acagaaggaa gctgaagtga gatatactgt ttaggagtag caactgcact acatgtcatg 21300
ccttacgagt gtaggatgtg acaaagaggg ccactccaca tccggaacaa cctttagcag 21360
gctggctaaa ggatgccttc cagacacaaa agccttggaa tgccaggaca cagtctgtag 21420
ccaaatggta cttgtggtgg tcaccaccaa cataaaagtg ggccaactgt gccagcagaa 21480
gttagcccca cagaactttc ccccacctaa gagaaggcag tgcaccacaa tgcggaattc 21540
caccactgtg gaattggggg agcttagaat tggattcaga cacaagggga gagagtggat 21600
cacagggtgg cttctctatg ggataggggg tggagagtat tatactctct ggactcaaga 21660
tgagtaaaat gacacccatc acaaaccatc cagccctatg atggcacctt tatggtaagt 21720
ggttgcaggc tccaaggggg ccgggtccaa tgaggaagat gcccccacag ctcgttctca 21780
atggcagact atagaagagt tgcaggatat cttctgggag tcgagatgag gcatgctaat 21840
tatgctgaga attattgaag tcccaacaat gaattgttta ctgcaaaata aaagctacag 21900
ttatgtattc agtgcctacc caatggcatg gtgcactgat ttccacgtta agccccctgg 21960
gagggcagcc aacatttcat gtgccccagg tagttgctga cttaggagaa aagaagaaac 22020
tgagtaagca agggatgcac cctactgtga tgaagaacaa tggcaccaaa ggaagagaga 22080
cagccaagga gccagtcagg gtggccagac aacgaatgtg ctctaactgg caacacctac 22140
cagttctctg ggcccatagc ggcaataggt ggttatggaa gggccacgga agtcagaccg 22200
gttgaactag tgatacgacc tgggggactg ccacccagac cctgtgtagt atacacagct 22260
tccatcctag aacacatgag aatggatatc ttcttaggcg tgaccctcca aacaacggcc 22320
agggaattcc aacggagagt tagagtggtg atatgtgtga ccaagcagaa ggcaaactgg 22380
atgccagtag agctgccaac ccatggggag tcccacagct ggagcaacac cacccgccct 22440
gggaggggaa gatgatccaa tcatgaagat tgttaaggag ctagcccagg taggcattag 22500
gaggccactg catggttcct acaacagacc tgcatggccc atgcagaggc cagttgagac 22560
atggagaatg acagtagatt actgggagtt aaataaggtg gtctcccgag tgaatgcagc 22620
tgttcctaat atctcctcca gtctgacgag aataggagag gtgttagcca cgtagcattt 22680
ccttatcagt ttagtcaata ccttcttcag catttctgtt gccccagagt caagatcaat 22740
ttgcattaac ctaaaaagaa caatggactt ttactgtctt gttccaggga tatttacaca 22800
gcccaaatct cacagcctag tgacctccaa cctcagtcga tgggctgacc caaaggggat 22860
acatgttttc cactacattg gtgttatcat gataacctct gagtcttttt tcagcttata 22920
aattacagcc cctgtcttgc tgtctcactt gctgaataga ggatgggagg ttaatacaga 22980
caaaatccag ggtccaggct tatcagtcaa atagttggtg tcatctggtt gggtaaaact 23040
aaagtcattc catctgccat catagataag gtgcaggcct acccacgtcc caccacaaca 23100
aagcagctgc aaactctcaa ggccttctgg agcatcagtg tccttttatt ccttttattt 23160
gacatccctg aaggaggctg ctaggggaga ctgtgtccct cctaaattca tgtgctgaag 23220
tcccaaccct tggtccttca gaatgaaatc atacttggat tagtgtcctt taaagaggtg 23280
aataagttaa agtgagattc ctggagtggg gccctaatgc aatctgactg ttgttataag 23340
aagaggaagc aggagggagg gtgcacaggc cccgagggac ggccatgtta ccacagaaca 23400
gtgagaaggc gccatctgca tgccagggag cgagacctca gaggaaaccc acccagctgg 23460
cagcttgatc ttaggctttc atcctccata agtgtgagga aattggtttt gtattgtaag 23520
ccatccgatc tgtggtattt cgttataaaa gccctataaa atgaatacag taggtaatag 23580
gagagcttct atacattgaa aaagtcggat ggccagaaaa acctagacac tcctgttcag 23640
acctgagcag ggtgatggac ctgctttggg acaggagagg ggaagagatg aacccagcac 23700
ccagacccag ctgagcccat tcctcagcag gccgtccctg ggccggagct tgcacaggtg 23760
tgaaagagcc tgtcttggtc ttcaggggct catggagttg gacggagaat ggtgtagact 23820
caagaacacg tcatcggtgt gcccgtgttt atctgaatgg gatgtgtttc tagggtgtgc 23880
tcatccccaa agaagaatta atcaggtctc ttgggctaaa aagaggttgt ggcatttgtg 23940
tgtattaata actgtggtcg gacagtaaat tatgttaaac tgcttatggg aaggcacaat 24000
ggaaagaaac actttgttac agaaggaaaa aaaaggtgat tatttaaatg aggtgccttt 24060
gaaggtcacc atgccaagag gagcccatca catgatagtg ctggctttca tgttcaggag 24120
atcaggaggg tccgtccgct ggcttttatg acaccctaga cagagctgag agtgtaatgt 24180
atgaatggag gggaagtgga gagaggggag gccaaatgtt tggtgggaat ggagggtcac 24240
tattggagcc attaggaaat acacaagcat gaattatgct ggaggacaga acagtgttcc 24300
tggggaatat tgtgttgctt tgggagctgc tgaacataca ggagtttcac tgttcctagt 24360
tctcaaattc tctagactct ctggacaacc cagttttaaa tattgggaat ataggtaaga 24420
cacattcgtt attaaaaatt attaagagaa gatgtaggaa gaaatttaaa gtaatccatt 24480
tggttatgaa aatttagtta cagcgaactg tgatgtccgt ttcttacttg gaataatgga 24540
atgtaagtca ttagtcatct caacggttca tttttccata accatcaatt acaaaactgc 24600
tgagtaattt cctgaattgc ccaccataga aactgacctc acatttcctc aatgagaaac 24660
tgccagtccc gttgatccag cctcgttctt cccatcaggg attttgtatc tctgtggacg 24720
tgtggcacag tgctgcatat ccatcggcat atggcctcag gaaaggcgcc agcctatcca 24780
tgcatgatga agcttactta ggggatgaag cccgcatgct gggtgagcca gtgccaacag 24840
ctgaaagaat caactgcctg gtgtatgatg cttttatgaa aacaagccca gggcctcttg 24900
cattcttctg tattagattc tctggtgaag atttttattc atttctgcct gaaattgcca 24960
catataatta cctggaagca ttacaataaa ctgatttgga agttaactga cttcctggtg 25020
aggttaaaat gagtgtcagg tgcatagtga gacagaccgg agacatggat gcatagcaaa 25080
cttgtgctca ccatggtttc tatcttagtt agggaaactt ctgtaccttc cttagatgtt 25140
caggcactcc attgaggacc ctggcataac attatttatt gacagaccat agctcaaagt 25200
atagaactgg atactaccaa ggaggatata ctattactat tttatcttta tcttaaaata 25260
tactcttcca tctgaggtga aaattaatcc agatggtaga acttattgca gttactacag 25320
cattttagca aatcaaaagc cgcagaacaa acatatggac agatggcagg tatgttttcg 25380
gaatcgtaaa caagttcgtg atgactgtaa aaccaagggg tgtctcacga gggctggaaa 25440
cctctcacaa tgaaacaaca caatgaggat ctttgaaaag tactctgacc tcctggtgag 25500
ctggctgata tggaggctga gctccatgta gaaagccaaa ggaatttctg caggacgtca 25560
tcatgccaag cacagccgta acctgggtcc cagccctttt cacacgctca atggttagat 25620
cttgggaggg aatcaaagaa gccatagtaa aatatcaaaa tttaaacccc gattttgaat 25680
ttaaaaagtg ttaaaatatg gttgtggcct acactcagaa aatctgtgtc cttcagatgg 25740
tttctcagtg gcaccagatg gtttcaagtg gctattcatt aagtttctca gtgaaattac 25800
cagacataga ataaataaat tgtcactgtc ttaaatcaac ccatgggaaa ggaaaactgt 25860
gtaaatacag cagagaggaa acattgctca agggaaaaac aatctccaga aagtattgtt 25920
aaagaaacag aggccctctt tccagccagc gccgagcgat gggcacctct cgggacaact 25980
ggcacaaggg ccgcaaagct gggggcaaga gaaggccctg ccacaagaag cggaagtatg 26040
agttggggcg cccagctgcc aacagcaaga ctgacccgtg ccgcatccac acagtccgtg 26100
tgcgaggagg taacaagaaa tactgtgccc cgaggctgga cgtggggaat ttctcctggg 26160
gctcagaatg ctgcgctggt gaaacaaggg tcatcgatgt tgtctacaat gcatccaata 26220
acgagctggt tcgtaccaag accgtggtga agaattgcat cgtgcccatc gacagcacgc 26280
cctaccgaca gtggtacgag tcccactgtg cactgcccct gggccgcaag aagggagcca 26340
agctgactcc tgaggaagaa gagattttaa acaaaaaacg atctaaaaaa attcagaaga 26400
aatatgatga aaggaagaag aatgccaaaa tgagcagtct cctgggggag cagttccagc 26460
agggcaagct tcttgcgtgc atggcttcaa ggccgggaca gtgtggccga gcagatggct 26520
atgtgctaga gggcaaagag ttggagttct atcttaggaa aatcaaggcc cagaaaggca 26580
aataaatcct tgttttgtct tcacccatgt aataaaggtg tttattgttt tgttcccaaa 26640
aaaaaaaaag aaagaaaaag aaacagaggc atcacactta ctagaaaaac atattctatt 26700
tcatatatta tggggatatg acgtgatgtt ttgacatatg cgggcattgt gaaattatta 26760
aatcaagtaa ataaacatgt ccatcacctc acatacttat tttttatggt gtaaacgtgt 26820
aaaatctact ctcttatcag ttttcaagta tatagtacat tagtatcatg gaagtcacca 26880
tgctgtgcaa tagatcttca aacgaattcc ttctatctaa ccaaaactct gtaccctttc 26940
accaacgtct cagctttcac atgcccctga cgccagcccc tggtaggcac cattctactc 27000
tctactctga gttcaacatt tttagattgc atgtgtaagt gagatcatgg agtaattttt 27060
tatacctggc ttatttcact caacataaag agtcaaatgc tcaacatcac taatcatcag 27120
ggaaatgcaa attaaaacca cgataagata tcacctcaca catgttacaa tggcttagtc 27180
tcagtctgtc tttttgttac tataaccgaa taccagagac tgggcaattt ctaaagaaaa 27240
ggaatttatg ctttatggtg cttgagtcag agaagtctaa tatcaaggca ctggcatctc 27300
acaagggcct tctcactgcc tcatctcaca gcagaggtgg gtgagcaaga gaccatttgt 27360
ccacgagaga aaagagacca tcttttatta gaaattcact cctataataa ctaacccact 27420
ccattgatag tgacagtaat ccattcatga ggacagagcc ttcatgactt gatcacataa 27480
taaaggtccc acctctcaac actgttgcat taaagattat ttccagatcc taaactttgg 27540
gagacacatt taaaccatag cattccattc ctaatatcaa aatttatgtc cttatcacaa 27600
tgcaaattac attcattcca tcccaattgt ctccaaagtc ttatccagca tcagtgcaaa 27660
agtctgaagt ccaaagtctc atctaaatca gatatgagtg tgactcgagg cacaatttag 27720
cctgatataa attgtttcca tctgcgagcc tataaagtca aaacaagtta tctactttca 27780
aatacagtga acaatggggc aggtatggga tagaaattcc cattccaaag ctcagagaga 27840
ggcaaggaga aagcggtgcc tagttcaaaa cccaacaggg aaaaaaacat taagtcttat 27900
agctggaaaa tcatcctctt taacggcatc ttgtgcacac tggggagggg gatgggcccc 27960
caaggcctcc ggcagtcttg cctctatata ttttctgggt tcagtccact cagccgctct 28020
cacaggtggg actctcaggc ctctagctct cctaggctga ctggaaactc tttgtggtac 28080
ctccaaaccc acatttctgc ttggcattgt gctaagggcc cagtgtggtg actctgtctc 28140
tgcaacaagt cactgcccga gaccttaggc tgtccttagg ctgcccgaga ccttaggccg 28200
tccacagcat tctttgaaat ctaggtggag aaagccatgc cctcgtggtt cttgtattct 28260
gcacacctgc agaattaaca acacatggat gccatggaag ttgatgactt gtaccattaa 28320
agtgatggct tgagccacac ctaggtcctc ctgagccaca gcatgggcag ccaaggagtg 28380
ctgtgcctgg acaccgggaa cagagtccta aagtgcctgc tagaagtcag gccatagatt 28440
tccttcaaat ttctcccacc atataacctc gttcatggct ctgaacttcc accttacaga 28500
aggacctagg gatgaacaca attcagccac gttctttgcc actttatggc aaggatggcc 28560
tttgctccat tttccgatga gctattcttc tttttctcct gagacctcat cagaacggcc 28620
tttattgtcc acggttctac tgacattcta atggtcatca cctaaataat ctctaagaag 28680
tttcagaatt tcctcacagc tctcttcttc tgagtcctca aaagaatcac ctctagtgtt 28740
ctattcaggg caatccagac tttttatagt ctgatcctcc aaattattcc agtctttgtg 28800
cattactaca tccacttcta cattttgggg tatttgttat cgcaacagcc ccacctcttg 28860
atactgattt ttcgtcttag tccactttgt ggtgcaatga gtgaatacca cacactggct 28920
aaagtataag gaaaagaaat ttattttctc gcagctctag aggctgggaa gtcaatatca 28980
aggtgttagc atctggcaag agccttcttg ctgtgatgtc catgtggaag gcaggagagc 29040
aggtgcgaag gatggaaagg ggtttaaact cattttttaa tgaggaaccc aggcctgtag 29100
taactaatct gctaccacaa tgagtaacct actctgacga taatggcatt cattgcttca 29160
tgagggcaga gccctcatga cctaatcatt tcttaacatt cccacctctg gacactatgg 29220
aatttgggat taagtttcca atacacatcc tttctaaaca gcaggggctt tttaataggt 29280
tgaccaccca aggctgcagg aggctctgaa gcagtggcct gaggttggct gtcctttgtg 29340
agaatggaga gaagtgaact gactcatgga gacacaagta gatgaggtaa aggcattcat 29400
tgcttcatta catggatggt gaggtcgatt gaaggcatta acggattaaa gatggtggca 29460
aaaccgtctg aggtggagac cacggggagt ccatcagaaa tggaggacac gtcccaataa 29520
atggtgcttc atttccctgc aaagcagaag aaagcaaaga acaaaacaca acatcatagt 29580
gtacactgag cagtggattg agagaagagt ttcctaaggc ataactgaca gagtggagaa 29640
gacacacaaa tctttgcatg atgctaacat ttggactgtg gcttcattat ttcttattaa 29700
tattttactg aaatatcgct agaaggagac tgaaaatgaa gtgtgaaaag ttaaatggga 29760
tttctgctct atgtcctttt cagatgagag gaactaggga attccaggga agaaacaata 29820
atagctgctg agcaaggctt ttgcagggca ggacaaggaa tccccaaaga gaaaacggaa 29880
acctcagctt cactttgcat ctgctcctga gccaggtcct gagcgacccc tgtaggtcct 29940
gagtgcccct ccgtaggttc tgagcatccc ttggttgctg ggcgccctct ggtggtgtct 30000
gagcccctct ggtggtttct gagccccccg ccttatgtct gatcctccct ggtggtgtcc 30060
gagtgcccct gctagtgtct gagccccctg gtggtgtctg agtccccttc ttagtgtctg 30120
agccacccta ttagtgtctg aggacccctg atggtgtctg agcccccagt tagtgtctga 30180
gccaccctat tagtgtctga gcccccctgg tggtgtctga gcacaggaga gctcctctga 30240
aggaagggtc tacatgggga caggcgtgct tgtctcaggg aagggtccat gtggggacag 30300
gtgtgcttgt ctgaaggaag gttccacatg gagacaggtg tgcttgtctc agggaagggt 30360
ccacatgggg acaggtgagc ctgtctgagg ggacagaagt gcttgtctca aggaagggtc 30420
ctcatgtgga caggtgagct cttttgaggg aagggttgac ctggggacag gcatgcttgt 30480
ctgaggtaag ggtcctcctg gggacaggtg tgcttctctc agggaagggt ccacgtgggg 30540
acagaggtgc ttgtctaagg caagaatcca agtagggaca ggtgagctcg tctcagggaa 30600
gggtccaggt ggggacagtt gtgctcatct gagagaagcg ttgaagtggg gacaggtgtg 30660
cttgtctcaa ggaagggtcc atgtggggac aggtgtgcta gtatcaagaa agggtccaca 30720
tagggacagg tgtgcttctc tcagggaagg gtgcatgtgg ggacaggtgt gcacatcgga 30780
gagaatggtc cacctgggga caggtgttct tgcctcaggg aagagtccac cttctcaggg 30840
aagaagtgtg ctcctctgag ggaagggtgc acatggggac aggtgtgctt gtctcaggga 30900
agggtccatg tgggaacagg tgagctcatc tgagggaaga gtccacgtgg ggacaggtga 30960
gctcatctga gggaagggtc cacatgggga caagtgacct cgtctgaggg aagggtccac 31020
gtggggacag gtgagctcgt ctgaaggaag ggtccacttg gggaccggtg tgctcctctg 31080
agggaagggt ccacgtgggg acaggtgtgc tcctctggag ggaagggtcc acgtggggac 31140
aggtgagttc atctgaagga agggtccaca tggggacagt tatgctcctc tgagggaagg 31200
gtccatgtgg ggacaggtgt gcttgtctca gggaaaggtc cacgtgggga caggtgtgct 31260
caccttgggg aagaggacag atgagctcat ctcagggaag gggccatgtg gggacaggac 31320
caagggttgg gacttcagca caagaattta ggaggaacac agtcttccct agcagcctcc 31380
ttcagggatg tcaaatattt tccttctgtt ccctgtgaaa gccttaaagg ggtagggaaa 31440
gggcgttcaa cctgcacact cgtagagggg aaaccagctt cattagtaat cgttcatctg 31500
tggtaaaaag gcaggatttg aagcgatgga agatgggagt acggggcgtt ggaagacaaa 31560
gtgccacaca gcgcagcctt cgaaacacac cacggtcacg ttaagtttaa atggagtgac 31620
cacattcgcc aggaaaggga aatatttaca cttttgaaga aacagtaatt tgtgtttctg 31680
attatgatct ggccttggat tttccctccc ctcataagca atgacagaat tggcagaaat 31740
atgtgaaacg ttagttctca gacatgagac acccacagag ggccccctgt gcccttccct 31800
gagagctgat cagctcctgc atctgaagaa atgaccaaag accaggagag aaccacacag 31860
aagcatcgga gggacagcac ctggggctct gatggggtca ggaatagcat ctgttcccaa 31920
tagatggact aagtaaaaag tatcataatt cacaagagtt ttacatagca cagaagaaaa 31980
agttacccta tatcaactgt tgatcttgtg aatccaggaa ctctggattc aaggtggtcg 32040
ggcacatctt gatttacgca tttcagggac acatgagaca tcagtcaata taagtaagaa 32100
ggacattagt tccatccaga aaggctgaga caactcaaag caagtcctcc ccacttaggg 32160
cttccaggtc acaggtaggt gagagacaga tggttgcatt cttttgagtt tctgataagt 32220
gtttgcaaag gaggccatga ggatatgcac ctgtctctgt gagcagaggg acaactttaa 32280
atagactggg aggcagattt gtcctgagtg gtttccagct tgacggggcc caagatattt 32340
tcctttcaca atctggtaac ttcaaacaaa acttcaaagc cacaacaaaa caacacaaca 32400
acaaaaagaa taagacatgg gtacttatta agagtagaaa aacattcagt ccccaaggaa 32460
aatattggca gtgtctacct ccacatgaca aaggagtaag cagtgtgagc cacagaaagg 32520
agcactatta acccacagag caaccgagaa taacacgggt gatgcgaggg cattggacgc 32580
acatcattgc attttgtaga ttcagaaaga aacggaaaag attgacggtg gtaaaagaga 32640
cagccctgct tccctctccc ttttccctcc ccgatgaggc ctcacagcca tgaccctcag 32700
cctcatcccg cagtgcagca gctgccgtcc tgtccaggcc caccccctgc cccgccctgg 32760
gactgttacc tcattccctc ccggagtcca ggtgcccccc ggggtgtggt gcgggagcct 32820
ggggaggccc tttgttctct gtcagggtct ccctgggagg gacgcagcca ccgcagctgg 32880
ttggggcctg gcttcgccca ggacagtcct ttcctttccc attgtctttg gatgactatc 32940
gctgggctgg gacatgaggc gggcagaggc gcgggtcacc cttaggaccc ccctcttgct 33000
gctggggctc tgggcgctcc tggctccggt ccggtgttct caaggccgtc ccttgtggca 33060
ctatgcctcc tccgaggtgg tgattcccag gaaggagaca caccatagca aaggccttca 33120
gtttcccggc tggctgtcct acagcctgtg ttttggggtc aaagacacgt cattcacatg 33180
cggaggaaac accttctttg gcctagacat ctgctggtga caactcagga tgaccaagga 33240
gtcttgcaga tgggtgaccc ctacatccct ccagactgct agtacctcgg ctacctggag 33300
gaggtgcctc tgtccatggt caccgtcgac acgtgctatg gggacctcag aggcatcatg 33360
aggctggacg accttgcgta cgaaatcaaa cccctccagg attcccgcag gtttgaacat 33420
gttgtttttc agatagtggc cgagcccaac gcaacagggc ccacatttag agatgatgac 33480
aatgagacag accccctgtt ctctgaagca aatgacagca tgaatcccag gatatctaat 33540
tcgctgtata gttctcatag aggcaatata aaaggccacg ttcaatgttc caattcatat 33600
tatcgcatat atggcaatat tacaacttgt tccaaagagg tggtccagat gttcagtctc 33660
attgacagca ttgctcaaaa tattgatctg cggtactata tttatctttt gaccatatat 33720
aataatcgtg acccagcccc tgtgaatgaa tatcgaattc agagtgcaat gtttacctat 33780
tttaaaacaa ctttttttga tacttttcat gttcattcat ccacactact tattaaatac 33840
gtgccacatg aatctaacta tgaacctgaa aggtataact tctgttcccg tatagccctg 33900
ttacacattg gtactccagg cagacattat ttattggtag ccgtcataat aacccagaca 33960
cagatgagaa gtattggtct ggagtatgat gataactact gcacatgtca gagaagggcc 34020
tcctgcatta tgcagcgatt tcctgggatg acagatgcgt tcagtaactg ttcttatgga 34080
catgcacaaa attgttttat acattcaggc cggtgtgttt ttgaaacact tgctcctgtg 34140
tataacgaaa ccatgacaac ggttcgctgt ggaaacctca tagtggaggg gagggaggaa 34200
tgtgactgtg gctccttcaa gcagtgttat gccagttatt gctgccaaag tgactgtcac 34260
ttaacaccgg ggagcatctg ccatatagga gagtgctgta caaactgcag cttctcccca 34320
ccagggactc tctgcagacc tatccaaaat atatgtgacc ttccagagta ctgtcacggg 34380
accaccgtga catgtcccgc aaacgtttat atgcaagatg gaaccccgtg cactgaagaa 34440
ggctactgct atcgtgggaa ctgcactgat cgcaatgtgc tctgcaaggc gatctttggt 34500
gtcagtgctg aggatgctcc cgaggtctgc tatgacataa atcttgaaag ctaccgattt 34560
ggacattgta ttagacaaca aacatatctc agctaccagg cttgtgcagg aatagataag 34620
ttttgtggaa gactgcagtg taccaatgtg acccatcttc cccggctgca ggaacgtgtt 34680
tcattccatc actcagtgag aggagggttt cagtgttttg gactggatga acaccatgca 34740
acagacacga ctgatgttgg gcgtgtgata gatggcactc cttgtgttca tggaaacttc 34800
tgtaataaca cccagtgcaa tgtgactatc acttcactgg gctacaactg ccaccctcag 34860
aagtgcggtc atagaggagt ctgcaacaac agaaggaact gccattgcca tataggctgg 34920
gatcctccac tgtgcctaag aagaggtgct ggtgggagtg tcaacagcgg gccacctcca 34980
aaaagaacac gttccgtcaa acaaagccag caatcagtga tgtatctgag agtggtcttt 35040
ggtcgtattt acgccttcat aattgcactg ctctttggga cagccaaaaa tgtgcgaact 35100
atcaggacca ccaccgttaa ggaagggaca gttactaacc ctgaataaca ctaattcagc 35160
ctcccgatcc ctgtaaagat acagagaata taacagcaaa atctatgaaa caggatcagg 35220
ggaagggatg gcaaagctca agtccacatt tcttgaagtc cacaggaagc acagggtcct 35280
gtttcacatc acagggaaac gggaggcatt ggcttctgtc ccaggttctt gtaggtcgct 35340
gatgctcact ctgaaataaa tcttcaaaaa cacacattgg tgccttccac attttcttag 35400
actcctctgg gagcccaaac ttggccagaa cctcttgcct ggagagacat gaatgagcat 35460
ctggctcttg tcctgaggtc tctggtccca gaattaacgg aagttgccac cagctcctta 35520
cagggaacat tcatgacatt tctccagaag agagctccag agcaatgagc ttcctcattc 35580
cccaggtaat ctgtccttct ctaaacccga agtcagttta gggtgatcca gggctactcc 35640
ctgttccctg tctgttcctc acgggggtgc tgtgggcttt gcagtgagag ggacttgggt 35700
tcaaatcccc caccaagcaa atccccctac ctggggccga gcttcccgta tgtgggaaaa 35760
tgaatccctg aggtcgattg ctgcatgcaa tgaaattcaa ctagaaaaat aggtagacgt 35820
gaggggcaag ctgtctgtca tttagtgtga gctctgtgag tggcagctgc cccctttctt 35880
cctgccccca catttccttg aactgaaaca ggaagggaag ctgagtaagt cgtgatgagg 35940
aagagaaacc aggcttgtag cagcacaggc tggtccgggt ggaaaacagg gctaggtgta 36000
tcactgagtt attgtaaagg aaaatggaag ttaaatgtat aaataactga atgagataac 36060
attttatttt aacttaaaat tcacactaat attgactttt aaaatgcagt gtagatatgt 36120
cagagagaat ttcaaaggca aagcccaccg acggaagaaa tcacccttcc cataccatcc 36180
acagaaaact gttggtattc tagggtagta ctgagatcta gcatttttct gaatacatct 36240
gtggttctag atgtcctgct tccatagata ttgtttagaa ttcccacccc tttctccaaa 36300
cacagcttga tatcctttct ctgaacctgt tagaaatttc ctccattcag ctgtcataaa 36360
gatgcgagca atccattcct gtgcctctgt cagtgtgttc tattattttg tggctgaacg 36420
ctaatggaca gttaagtgtg aggtcagtga atacagtgcc ctccctctat gtgtccttcg 36480
ggtgtgaggg gttttgctga tagagcagca ggccccatcc caccctttat gcatctccgc 36540
cccccacctc acgctccagc tgacctctcc cctgtggcct ggggcgttcc ccagggggaa 36600
tgacctctcc tctctccagg gcccacccac tcagtgcccg tgcaagacca ccacgcttgg 36660
cacggcccca cctcgtgtca gggcctgtgt cccctgcccc accccctaaa cagatgggaa 36720
ccactgggac tctgctcagg gcagggggcg gaggtatgtg tgaaaggaag gcaaatgtgc 36780
actctgttgg agaaatatta taggtagttt gagcaaaaaa tctaatgcca tgggaacttt 36840
tagaatgata cgtattttaa caaagaacat gaccaataga gtttgtattg aagccaggaa 36900
aacactattt agagcaacag caatatcaaa aacacaagcc aacagttcac caagaaaaac 36960
caccattaac cccatggaaa tggtcttcca agagcatcgg cacttaaatc ctggaaatct 37020
gcctgcctca gcacctgttg tcctgacctg ccctcctgtg tgtcctaatc actcccaaac 37080
acggggcctg cactgtggga gattcacact gtgccaggtg gagggagcag gacaactgct 37140
aacaggttgt tggtgtggat gccgaggcca cccaagcagg tgtaaactcc cacctgtggg 37200
gcagggaaga gtgcacggga gacatgtccc gggcataggg tgagggagag ctgtgggggc 37260
tctgggttct gaagtgggtt ctgaagaggg ttctggcctg gcagggataa gaccaaccag 37320
catgtgaggc caggctggag tctggacctc tgaagctgca agggtcatgg gctgcttggc 37380
cccaggggct gtcctggttc tctatggagt actttcaaac attctttctt cttccaatcc 37440
ccctccttct ctcccaaagc ctgcatctcc caaatcctct ttgtcggatc ctcggcttca 37500
ctctgcatcc gtcctgagca tcgatcttcc aattccatcc tcttctcttc tgctatgtct 37560
aagctgctgt gaagccacct gctgtaattt actgctttat atttaatatt gtaccgtaca 37620
tctgttctgt ttccctcatc ataaatgctt catttcatgc tcagcatctg agaacacaag 37680
gccttgtcag ctgtcacctc cttccgttct ctgtttcctt cctcctatcc ccatattgct 37740
catcatgtcc agtctcctgc catcctgaat gcttctgatg gaaggtctga gatgtctcat 37800
gagcactgtg aagattcttt gtaatgtgag cttgttccag gcaggaattc tccttcaccc 37860
agccctggaa gccaagtata ggcagatggc catgctcaat caaagactga gctaacttaa 37920
cagtggcttt ggttttaagg tttctccaat ccccagggca caggatttca gggaattcag 37980
gtgagagtct gggtgttacc cttcaggagg ctgtaaactc catttcacct agtctacacc 38040
acagactatg gaaactatat atatatatag ttctgtccct ctagagaaac ctaatatgta 38100
tatatacaat atataatacg tattatatat tatatataat acgtattata tattatatat 38160
attatatata tattagagtt tattgaggag tattaaactc acaatcacaa ggtcccacag 38220
taggccatct gcaagctgag gagcaaggaa gccagtccga gtcccaaagc tgaagaattt 38280
gaagtctgat gttcgacggc aggaagcatc cagcacagga gaaagatgta ggctgggagg 38340
ctaagccagt ctagtctttt cacgtttttc tgcctgcttt atatcctggc cacactggca 38400
gctgattaga tggtgcccac ctagattaag ggtgggtctg cctttcccag tttactggct 38460
caaatgttaa tctcctttgg caacaccctc acagacacac ccaggatcaa tactttgcat 38520
gcttcaatcc aatcaagttg acactcagta tcaaccatca caagtccacc ccttgtcaac 38580
ttgaacccat acaaatctcc tgagatcata cataatcttc aaataaagac aataataagg 38640
tcataattac acctaatgta atacaactat cttttgtaca accagaaatg caccaatccc 38700
caacccaaat gctattatgt aaagttaaga acacttaaat gctgatatga agtcaataaa 38760
ttttatgtca catgataaag gaaaaaagaa atgaaggaat tttcttagta caagtgtgta 38820
catgcacaaa catgttttta acaaaagaag aaggaaatac tgatgacaat tacagtcctc 38880
atttctgcaa ctgatcacgt ggttgtagct ggtattgatg actaccttct tctactaccc 38940
attctgtatt ccctttgcct tcagcaagca tcacagcagg tagagttttt tctcctagtg 39000
gagtgatgca aaccttcatt cctgaagggt ctgggccatt tgtagtcctg cctggattgg 39060
gctgttgtag tttcccgttg accttaatga cagggcatgg taatgttaag agacgcccta 39120
atggatctcc tgtattccat acatattctt ccttacctcc attgtggagt aatagactga 39180
ttgcatcttg atagtccagg tcaatcagcc cagccaacac tgtaactccc ctcttagcct 39240
gtggacttaa aggtaggagg ggcccaaagt ggccaggtgg aaatctttac ttccagttta 39300
atggaattgt tgttgtttct cctgatggca gcattattcc cactggaact aagacctcta 39360
ggccaacaga atgtaatgtc atgggaccag gaagcaaaaa ttttgctagt ggatcactag 39420
gggtgatggt gaatggtgcc atttccactt ccaccccttg attcctggat ccatgaatta 39480
tggctatggg agaaagagta ccatatattg gatgctgatt tggagcatac atggcctttt 39540
ggagagcttt gccccagccc tgcaaagtat tggagcctag ttgacattgt aattgtgact 39600
ttgaaaggcc attccattct tctatcaatc cagctgcttc aggatgatgg ggaaaatggt 39660
aagacaagtg aatcccatga gcatgagccc actgccacac ttctttagcc gtaaagggag 39720
tgccttggtc agaggcaatg ctatgtggaa tactgtgaca gtggataagg cattccatga 39780
ctccacagat ggtagtcttg gcagaagcat tgcatgcata tctgcagtaa gtgtctattt 39840
cagtgaggac aaacctctgc cctttccagg atggaagagg tccaatataa tccaacctgc 39900
catcaggtag ctcactgatc accctgagga atggtgtcat ttgggtagag acccagagcc 39960
aaaccagatc acgccaccca acccctccca aatctcatgt cctctttgca tttcaaaacc 40020
aatcatgcct tcccaacagt cccccaacat cttaactcat ttcagtatta actcaaaagt 40080
ccaaatccaa agtcacattg gagacaaggc aagtcccttt catctatgaa cctgtaaaat 40140
gaaaaacaag tcagttactt ccaagacaaa atgggggtac aggcattaga tacatgctcc 40200
catttcagtt gggagaaatg agccagaata aaggggcttc aggtcacatg caagcccaaa 40260
ctccagtggg gcagtcatta aatcttaaag cttcaaaata atctcctttg actccattcc 40320
tcacattcag ggcatgctta tgcaaagtgg gggctcctac aaccttggga agctctcacc 40380
ctgtggcttt gcagctctga ccccatggct gctctcatgg gctttgcaga gttcagccct 40440
cctggctgct ctcattgagt gcatgcagct tttccaggtg cacagtgcaa gccgttaatg 40500
gatctaccat tctggggtct gaaagatggt ggccctcttc tcacagcccc attagtcact 40560
gtctccagtg gggactctgt gtgggggctc caaccccaca tttcccttct gcactgccct 40620
agcagaggct ctccatgaag gctttgcccc tggcgcagac ttctggctgg acatccagtc 40680
atttctataa atcctctgag atctgggtgg aggatcacaa agctgaactc ttctcttccg 40740
cacatcccta ggcccaacat catgtagaag ccaccaatga ttggggcttt ctgaagcaat 40800
ggcctgagct gtacattgga cttttttagc cacagctaga cctggagcag ctgggacaca 40860
gggcaccaag tcccaaggct ccaaagagaa gctgggccct ggacccagcc catgaaaaca 40920
tttttccctg ataggcctcc aggcctgtga ttggaagggc tgctgcaaag atctccgaca 40980
tgccctggaa acattttccc cattgtcttg attattaata ttcatctctt cattacttat 41040
gcaaatttct gcagccaact tgaatttctc cctagcaaat gtgtttttct ttactaccac 41100
atggccaggc tgcaaatttt ccaaactttt atgctctgtt tcccttttaa aaataagttc 41160
ctatttcaga tcatctctct caagggcaaa gttccacaga tttctagggc agggacaaaa 41220
ttccatcaag cttggtttta tacattttag agaggcatga gacatcaatc aaatacattt 41280
aagagacaca ttggtttggt ccagaaaggt ggaacaactc aaagctaggg cttccaggct 41340
ataggtgaat ttaaatattt tctggttgac aattggttga gtttgtctaa agacctggga 41400
tagatagaaa ggtaatgttc aggttaagat aaagattgta gagtccaaag ttcttttgaa 41460
gtcttatagt ggctgccctt agagataata ggtgacaaat gtttcctatt caaatcttag 41520
ttgaactctt taggattggg aggttctaga agaaaaagat ctagctatgt taatagagat 41580
tctttacaga tgcaaatttt cccccacaaa gaacagcttt gcagggccct ttctttcttt 41640
ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct tttttagatg 41700
gagttttgct cttgttgccc aggctagagt ataatggcac gatcttgtct caccacaacc 41760
tccacctcct gggttcaagt aattctcctg cctcagtctc ccgagtagct atgattacag 41820
gcatgcacca ccacacccgg ctaattctgt atttttagta gacacagggt ttctccatgt 41880
tggtgaggct ggtctcgaac tcccaacctc aggtgatccg cccacctcag cctcccaaag 41940
tgctgggatt acaggcatga gccaccatgc ccggcctgca gggccatctc agagtatggc 42000
aaagaaacat gttttggggt aaaatatttt gattttctta tttgtctcat aatgttatgc 42060
cagagtcagt ttggaaagta aatcatgata tataggttta aataaaaccc atctgatgag 42120
aatttatgat ttgtagagca tgcctcccca gactctttag ataggaattt gggcaagatg 42180
aaaaaaaaat cagagtttag tcctcactac ctaagaccag ctcagcttgg acttcactgt 42240
tcatgtcact atcagcattt tagtcaaaac cactcaataa gtctctagga agttccaaac 42300
tttcccacat cttcccttct cctttcaagt tctccaaact gttccaaccg ctgccaggag 42360
gtacccagtt ccaaagttgc ttccagattt tgagttatct ttatagcagt tccccactcc 42420
tggtaccaat ttactatatt agtctgtttc cacagtgcta taaagaactg cccgaaagtg 42480
gttaatttgt aaagaaaaga ggtttaattg actcacagtg ctgtgtggtt agggtcggag 42540
gctcaggaaa cttgcaatca tggtggaagt ggaagcaggc atgtgacaca tggcagcagg 42600
tgagagagag aaagagagag agagggaatg aaggaggaac caccatacat ggataaaacc 42660
atcagatctc atgagaactc actcactatc aggagaacat gaggacagca tgggggaaac 42720
cacccctatg acccagtcac ctcccaccag gtccacccct tgacacataa ggattactat 42780
ttgagatgag atttgtttaa tgacacagag ccaaaccaca tcagcatgtg acaaaggtct 42840
aatatcaaga atctatgagg gggcagttcc aaaatggctg aataggaaca gctccagtct 42900
acagctccca gcatgagcta cacagaagac aggtgatttc tgcatttcca actgaggtac 42960
tgggttcatc tcacgggggc ttgttggaca gtgggggcag gacagtgggt gcagcccacc 43020
aagagtgagc tgaagcaggg cgaggcattg cctaacccag gaagtgcaag gggtcaggga 43080
attcccgttc ctagccaagg gaagcggtga tggacggcac ctggaaaatc cggtcactcc 43140
caccctaata ctgcactttt ccaacggtct tagcaaatgg cacaccagga gattatatcc 43200
tatgcctggc ttggaggttc ccatgcccac ggaacctcgc ttattgctag cacagcagtc 43260
tgagatcaaa ctgcaaggtg gcagtgaggc tgggggaggg gtgcccacaa ttgctgaggc 43320
ttgagtaagt aaacaaagtg gctgggaagc tcaaactggg tggagtccac tgcagctcaa 43380
ggagacctgt ctgcctctgt agactccacc tctgggggca gggcatagct gaacaaaagg 43440
cagcagaaac ctctgcagac ttaaatgtcc ctgtctgaca gctttgaaga gagtagtgtt 43500
tctcccacat ggactttgag atctgagaat ggacagactg cctcctcaag tgggtccctg 43560
acccccgagt agcctaactg ggaggcaccc tccagtaggg gcagactgac accttacacg 43620
gctgggtgcc cctctgagat gaagcttcca gaggaattat caggcagcaa catttgctgt 43680
tcagcaatat tcgctgttct gcagcctctg ctgctgatac ccaggaaaat agggtctgca 43740
gtagacctcc agcaaactcc aacagacctg cagctgaggg tcctgactgt cagaaggaaa 43800
actaacaaac agaaaggaca tccacatgaa aaccccatct gtacatcacc attatcaaag 43860
acaaaaggta gataaaacca caaagatggg gaaaaaacag ggcagaaaag ctgaaaattc 43920
taaaaatcaa agtgcctctc cccctccaaa ggaatgcagc tcctcgccag caatggaaca 43980
aagctggatg gagaatgact ttgatgagtt gagagaaggt ttcagatgat caaacttctc 44040
cgagctaaag gaggaagttg gaacccattg caaagaagct aaaaaccttg aaaaaagatc 44100
agatgagtag ctaactagaa taatcagtgt agagaagtcc ttaaatgacc tgatggagct 44160
gaaaaccatg gtatgagaac tacgtgatga atgcacaagc ttcagtagcc gattcgatca 44220
actggaagaa agggtatcag tgattgaaga tcaaatgaaa gaaatgaagg gagaagagaa 44280
gtttagagga aaaaaaagta aaaagaaaga aacaaaccct ccaagaaata tcagactatg 44340
tgaaaagacc aaatctatgt ctgattggtg cacctgaaag tgacagggag aatggaacca 44400
agttggaaaa caccctgcag tatattatcc agcagaactt ccccaaccta gcaagacagg 44460
ccaacattca aattcaggaa atacagagaa ccccacaaag atactcctcg agaagagcaa 44520
ctccaagaca cataattgtt agattcacca aagttgaaat gaaggaaaaa atattaaggg 44580
cagccagaga gaaaggtcgg gttaccctca aagggaagcc catcagacta acagctgatc 44640
tctcagcaga aactctacaa gccagaagag agtgggggcc aatattcaac attcttaaag 44700
aaaagaaatt tcaacccaga atttcatatc catccaaact aagcttcata agtgaaggag 44760
aaataaaatc ctttacagac aaacaaatgc tgatagattt tgtcatcacc aggcctgccc 44820
tacaggagct cctgaaggaa gcactaaaca tggaaaggaa caactggtac cagccactgc 44880
aaaaacatgc caaatcataa agaccaccaa agcgaggaag aaactgcatc aactaacgag 44940
ccaaataacc agctaacatc ataatgacag gatcaaattc acacataaca atattaacct 45000
ttaatgtaaa tgggctaaat gctccaatta aaagacacag actggcaaat tggataaaga 45060
gtcaagaccc atcagtgtgc tgtattcagg agacccatct cacatgcaga gacacacata 45120
ggctcaaaat aaaggcatgg aggaagatct accaagcaac tggaaaacaa aaaaaggcag 45180
gagttgcaat cctagtctct gataaaagag actttaaacc aacaaagatc aaaagagacg 45240
aagaagacca ttacataatg gtaaagggat caattcaaca agaagagcta actatcctaa 45300
atatatatgc atccaataca ggagcaccca gattcataaa gcaagtcctt ggagacctac 45360
aaagagactt agattcccac acaataataa tgggagactt taacacccca ctgtcaacat 45420
tagacagatc aacgagacag aaagttaata aggatatcca gcaactgaac tcggctctgc 45480
accaagcaga cctaatagac atctacagaa ctctccaccc caaatcaaca gaatatacat 45540
tcttttcagc accacaccac acctattcca aaattgacca catagatgga agtaaagcac 45600
tcctcagcaa atgtaaaaga acagaaatta taacaaactg tctctcagag cacagtgcaa 45660
tcaaactaga actcaggatt aagaaactca ctcaaaacca ctcaactaca tggaaactga 45720
acaacctgct cctgaatgac tactgggtac ataatgaaac gaaggcagaa ataaagatgt 45780
tctttgaaac cagtgagaac aaagacacaa cataccagaa tctctgggac acattcaaag 45840
cagagtgtag agggaaattt atagcactaa atgcccacaa gagaaagcag gaaaaatcta 45900
aaattgacac cctaacatca caattaaaag agctagagaa gcaagtgcaa acacattcaa 45960
aagccagcag aaggcaagac ataactaaga tcagagcaga actgaaggaa acagagacac 46020
aaaaaaaccc ttcaaaaaat caatgaatcc aggagctggt tttttgaaaa gatcaacaaa 46080
attgatagac cactagcaag actaataaag aagaaaagag agaagaatca aatagatgca 46140
ataaaaaatg ataaagggga tatcaccacc gatcccacag aaatacaaac taccatcaga 46200
gaatactata aacacctcta cggaaataaa ctagaaaatc tagaagaaat ggataaattt 46260
ctcgacacat acaccatccc aagactaaac caggaagaag ttgaatctct gaatagacca 46320
ataacaggct ctgaaattga ggcaataatt aatagcttaa caaccaaaaa aagtccagga 46380
acagatggat tcacagccga attctaccag agctacaagg aggagctggt accattcctt 46440
ctgaaactat tccaatctat agaaaaagag ggaatcctcc ctaactcatt ttatgaggcc 46500
agcatcatcc taataccaaa gcctggcaga gacacaacaa aaaaaaagag aattttaggc 46560
caataaccct gatgaacatc aatgcaaaaa tcctcaataa aatactggca aaccgaatcc 46620
agcagcacat caaaaagctt atccaccatg atcaagtggg cttcatccct gggatgcaag 46680
tctggttcaa catacgcaaa tcaataaacg taatccagca tataaacaga accaacgaca 46740
aaaaacacat gattatctca atagatgcag aaaaggcctt tgacaaaatt caacaacact 46800
tcatgctaaa aactctcaat aaattagata ttgatgggac gtatctcaaa ataataagag 46860
ctatctatga caaacccaca gccaatatca tactgaatgg gcaaaaacta caagcattcc 46920
ctttgaaagc tggcacaaga cagagacacc ctctctcacc actcctattc aacatagtgt 46980
tggaagttct ggccagggca atcaggcagg agaaggaaat aaagggtatt caattaggaa 47040
aagaggaagt caaattgtcg ctgtttgcag atgacatgat tgtatatcta gaaaacccca 47100
tcgtctcagc ccaaaatctc cttaagctga taagcaactt cagcaaagtc tcaagataca 47160
aaatcaatgt gcaaaaatca cacgcatttc tataacccaa taacagacaa acagagagcc 47220
aaatcatgag tgaactccca ttcacaattg cttcaaagag aataaaatac cttggaatcc 47280
aacttacaag ggacgtgaag gacctcttca aggagaacta caaaccactg ctcaatgaaa 47340
taaaagagga tacaaacaaa tggaaaaaca ttccatgctc atgggtagga aggatcaata 47400
tcctgaaaat ggccatactg cccaaggtaa tttatagatt caatgacatc cccatcaagc 47460
taccaatgac tttcttcaca gaattgggaa aaactgcttt aaagttcata tggaaccaaa 47520
aaagagcctg caatgtcaag tcaatcctaa gccaaaagaa caaagctgga ggcatcacgc 47580
tacctgactt caaactatac tacgaggtta cagtaaccaa aacagcatgg tactggtacc 47640
aaaacagaga tacagaccaa tggaacagaa cagagccctc agaaataatg ccgcatatct 47700
acaactatct gatttttggc aaacctgaca aaaacaagaa atgggaaaac gattccctat 47760
ttaataaatg gtgctgggaa aactggctag ccatatgtag aaagctgaaa ctggatccct 47820
tccttacaca ttatacaaaa attaattcaa gaggattaaa gacttaaatg ttagacctaa 47880
aaccataaaa accctagaag aaaacctagg caataccatt caggacatag gcatgggcaa 47940
ggacttcatg tctaaaacac caaaagcaat gacaacaaaa gccaaaattg acaaatggga 48000
tctaattaaa ctaaagagct tctgcacagc aaaagaaact accatcagag taaacaggca 48060
acctacagaa tgggagaaaa tttttgcaat ctacttatct gacaaagggc taatatccag 48120
aatctacaat gaactcaaac aaatttacaa gaaaaacaaa caaccccatc aaaaagtggg 48180
caaaggatat gaatagacac ttctcaaaag aagacattta tggagccaaa agacacatga 48240
aaaaatgctc atcatcacta gccatcagag aaatgcaaat caaaaccaca atgagatacc 48300
atctcacacc agttagaacg gcgatcatta aaaagtcagg aaacaacagg tgctggagag 48360
gatgtggaga aataggaaca cttttacact gttggtggga ctgtaaacta gttcaaccat 48420
tgtggaagtc agtgtggcga ttcctcaggg atctagaact agaaatacca tttgacccag 48480
ccatcccatt actgggtata tacccaaagg attataaaac atgctgctat aaagacacat 48540
gcacacgtat gtttattgcg gcactattca caatagcaaa gacttggaac caacccatat 48600
gtccaacaat gatagactgg attaagaaaa tgtggcacat atacaccatg gaatactctg 48660
cagccataaa aaaggatgag ttcatgtcct ttgtagggac atggatgaag ctggaaacca 48720
tcattctcag caaactatca caaggacaaa aagacaaaca ctgcatgttc tcattcatag 48780
gtgggaattg aacaatgaga acacttggac acaggaaggg gaacatcaca caccagggcc 48840
tgttgtgggg tggggggagt ggggagggat agcattagga gatataccta atgttaattg 48900
atgagtttat gggtgcagca caccaacatg gcacatatat acatatgtaa caaacctgca 48960
cgttgtgcac atgtacccta aaacttaaag tataataaaa aaatttttaa aaaaagaaac 49020
acctgctttt ttctgttttc catttgctta gtagattttt ctccatcctt ttactttgag 49080
cctggggatg tcattgcatg tgagatgggt ctcttgaaga cagcatacat ttgggtcttg 49140
cttctttctc caacttggca attctctgcc ctttaattgg ggcatttagc ccatttacat 49200
tcaaggttaa tattgatatg tgcatatttc atcctgttat catgttgtta gctgctcaat 49260
atgcagattt gattgtatag ttgatttata gtggcaatcg ttatgtactt aagtgtgttt 49320
ttgtggtggc cagtaacgtt cttccattat catatttagc aatcccttaa gggcctcttg 49380
taaggcaatc tagtggtgat gaataccctt agcatttgct tgtctgaaaa ggatcttatt 49440
tctccttcac ttgtgaagct tcatttggct agatatgaaa ttcttgcttg gaatttcttt 49500
tctttaagaa tgctgaatat aggcccccaa tctcttctgg attgtacagt ttctgctgaa 49560
acctccattg ttagcctcat tgggttccct ttgtatgtga cctgaacctt ctttctagct 49620
gcctctaata ttttttttcc tttcaacctt taagagtctg atgtctgatg gctatatgtc 49680
ttagggatgg ttgtcatgta taatatcatg cagaggttat ttgcatttct tgaatttgaa 49740
tgttggcctc tctggtgagg ttggagaaat tttcatggag gatagcctga aatgtttttc 49800
aagtttcttt ttttctcttt ctcttcttaa gggataccaa tgtgtcatag atctggtctt 49860
tttacataat tgcacatttc tctgaggttt tatgccttct tttttattct ttgttcttta 49920
tttttgtctg actgagttaa ttcagagaat cagtttttaa gctctgtgat tctttcctca 49980
gcttggtcta ttctgctgtt aatacttgta attgtattct gaaattcttg aagtgagttt 50040
tttagctcta tcaaatcagt ttggttcttt cttaaaatgg ccatttcatc tttcagcttc 50100
tgtatcattt tactttattt cttagctccc ttggattggg tttcaacatt ctcctgaatc 50160
tcagtgatct tctttcctgt gcatattctg aattctatgt ctgtcatttc agccatttca 50220
gtcaggttaa gaaccattgc tgggaaacca gtgtgattat ttggaggtaa gaagacactc 50280
tggattttag agttgcagag tttcttgcat taattctttc tcatctttgt gggctgtttc 50340
tttaatcttt gaagtggctg tcctttggat gtttttgtct tttttgttgt tttttggtgt 50400
gtgtttttgt ttgtttgttc atttgtttgt tttttgctct tatcttcttt gatactcttg 50460
caggtttgat tgtggtataa agtggattca gttagctgtg tttcttgaaa atcttagagg 50520
gtccaggctc acctcagcac tcttgtggtg tgttctctgc tctgggactg ggcccctggc 50580
tttattctct ggccccttga gtttagaaac ttgctgcatt ggaggggctg aggtgttccc 50640
agtccattgg ccacaacact atagtagggg gtgccggcca aagcacttca ttagagtggt 50700
ggcagtggga tccattctta ctcatgggtg ccagcagttg tggagtcatg gcagggtgca 50760
catgcatctg ctggggtggg ggtactggca ggagcagagt ggcagcatcc ctacataggt 50820
tcctgctggc agtcacagcg cagtgaggtg cccgtgtgtt ggcagggaca gggtggtggg 50880
gcacacatgc acatgcttgc tggtggtaga gggagttgtg atctgctgtg cactcatgcc 50940
agcaaagcag ttgggaggta ctatgggtgg actggtgcac atcagcagag gctggcctgc 51000
tggaggtctc caatggttag gcatggtctg ctggcaaagg agctatgatg agggccccca 51060
ggaaacaccc tggttgggct tccaaggctg tactgcaagc aggcacagcc agcctggggc 51120
cccaggagag gccagaaggc aaggaaattc tcatttcaga tgggccctgt cccatggaca 51180
agaccaccct gctttattca ggtcccatag tcactctaag gttaaaatct cctagaggag 51240
gttggtgagc cttgggggat gggtgtcccc tggctgtgct ccactacagc cattctcatg 51300
tcaaacactc tgggctttac acagactgga gtcctgcccc tggcatctct ctaagcagct 51360
gtcccttcca gcacaagtgt ccatgggggt catggggtct cctgctgcta ggattctgga 51420
ggcccatggc aacagcaggc cactcctcac ctgttcaact caacctttcc ccaggagttg 51480
ctgggagcca ggaatgagtc ctggtgcttg gcatccccat gcagggttcc catcttcctc 51540
caccttcagc tcagcatctg tgtcctcccc cgtctactct caatccactc tcaatgcctc 51600
cccttcaaag atctgcttgg aaagcacccg tcttcctgat gtctcactcc ctccatggca 51660
gatattcctc ctggctgcat ctagtcagcc atcttgactc gcctccaaag tctttttaat 51720
taccacttcg gttaaattag taactatcat tttacaatgg cctgtgattc tgttttgatc 51780
aaatattttg agccttttag catctataac aaatgttctc aaaaatcaaa atcctaaatc 51840
aagtctctgc cttagtctta tttctggggc ttattaaggc tataaaaatt aatcaccata 51900
aggttgtaca agctttttac agcttccagt caggctatga actccagtat caccacctcc 51960
agcctgataa ttacatatat tggaagaaaa tcagttaaag gactccctct agacccttga 52020
aagggtgtga gagacaacat ggtttcgcct gccttcatgt gtcccagtcc atccctgtgg 52080
ctgcctctgt ccacctcagc ttgcccactg tctttccttc ccaactgtct gccctgctga 52140
cttctggcct cagtgacaga tgcaaagaca aggcgacagc cccacataga ccgtttaacc 52200
agtcccacat ttgcataagc taaatggtca tgtcacagtc tgttgcccag gctggtctca 52260
aactcctggg ctcaagtgat ccacccacct tgacccccaa ggtgctggga ttacaggctt 52320
gagccacagt gcccagccaa gaacccgttt ttgagtgggc accttggcac acacctgtaa 52380
acgcaacact ttgggaggcc aaggtgggag tgtggcttga ggccaggagg ttgaggttgc 52440
agtgagctat gatggcacca cctcactcca gcgtgggtgg cagagtgaga tcctttagaa 52500
aaaaaaaaaa aaaaaacttg ttttctctgc agccgggctc cgtgaccaaa cacaaacaca 52560
aacttcccct ccagagggtc caggaggggc tgggctgcag gaggtgctta gggcctctta 52620
gggaatggta agtgaccacc caacgcaggc actcagcccc aggggcatat gcagagagag 52680
ggtccaggag gagctgggct gcaggaggtg cttagggcct cttagggaat ggtaagtgac 52740
cacccaacgc aggcactcag ccccaggggc atatgcagag agagggtcca ggaggagctg 52800
ggctgcagga ggtgattagg gcctcttagg gaatggtaag tgaccatcca acgcaggcac 52860
tcagccccag gggcatatgc agagagaggc tgggaggaca ctttcagtga ctggggttac 52920
aaaccccaac cataagacat tgctggctct gtgagccgcc acctccagaa atctcccact 52980
tagttcttag cacttatcca ctcttccctt ttcctactct caattcctgg aggatgccct 53040
cctttctcag gctcagacca acctaccagc tccactctag acctgaacac atgactcctc 53100
cctctgtctc cacctggaaa tctcatcagt gcctcacatt tacactcctg aaaatcaggt 53160
cctgcctacc caccctcttg ctccacctga ttcctgccct gtttcagcca gagaccttgc 53220
agtctccttt aactctcaaa cccacccatg tcgtgtgagc atactgactg tgttctatgc 53280
aagaaagagc agtttcttgg tggtcctgcg gttttattag tccagaggca aagcgttggc 53340
agagctggtt tcttctgaac cctgggaggg agattctgtt ttcatgcctt ttccagattc 53400
tagaacccat attccttgct ctgtgtcccc ttcttccatc ttcaaaggcc atcctctcat 53460
ctctgtgtcc atcatcacat cacccttccc ctgactctgg ttctcctgct tccacttata 53520
agcacccttg tgattacatc atacccaccc agacaatgca gggccatatt ctcccctctc 53580
gagattaatt taatcacatc tacaaagttc ctcgtgccat atgaggtcac taaaccacat 53640
gttctggggg tttgaatgta aacatttggg ggatgcatta ttcagccacc cacaagcact 53700
gctccccact ggccacacac tatgcacagc cgagatcatg caagtgaggc acgttcatca 53760
acagcagctt cagcaggaaa ctatatgctc cactttcctg ccatttgtat ctggattttt 53820
ttttcgctat cattgtagaa agagtggtat tgtaaaatta aagatggatt attttctttc 53880
tagaacactt tggcaatcta tccaacatta tttatcccct tctgagtgtc aagtgtgagg 53940
tcattctttc attgagagct caatgcctac aattatgata atgcatattg ggtactttca 54000
cacatcagaa agttcttctt tcttaaaatc tgttcttgaa ttattcattc ttctctagct 54060
ttttgttgat ctattttata attttagaaa aatcagaaag taacttgaag tatctgtcat 54120
ctctacaggt ttacctccct ctttgtggcc ttcagaatgt catgacacgc ttttcccttg 54180
ctcatcacat ggtttctatg tatgagacct catcacagga gctgtggtcc cccgggagca 54240
ggcatctgtg gatggtgcct tgctcctggc tgctgggacc tgtgtgctgc cagtggcact 54300
ccacgacagt gatttcccag ctcagttttg cagctccaga tggtgggtga gacactagga 54360
ccactttgtg aacagcgagg gcttggggtt tgcttttcta ccatgtccag ggctgctgtt 54420
catgagggaa tgtttctaac ctgacatcat ggctgaagcc aacttagaac ctctctagcc 54480
gtatggggag taggtgagtg atacagatgt taattagctc agtggagcca ctcccctatg 54540
tagacatgtt acaaaacatt atgctgtaca gaataaatat aggtcatttt tatgtgtcaa 54600
tcaaaagaga aactaattat ttaaaaaaaa aaaaaaaacc tctctactca agccgaaacc 54660
tcagctccag tcccacaagt cacacaaggc tgctcccgtc ctgtgtatgt taaacctacc 54720
tcagaaatgc aagggggcat tcaggtttca ttctcaattc aaatgccctt tttaattttg 54780
tctattccta gcacctggca acttccagct ctttttttcg gggctcattc attatttaaa 54840
gcacgtataa tttttcaccc acattctaac acatgtagta ctgtagagaa tccttcccta 54900
ggaggatcta cagcattaga aaagaattaa gaactccaat atttacaaga aggaaaaagc 54960
aaaaagagat caaaaaatgg gcaacttcta gaaatagaaa accctcatga gtatgatgat 55020
aaatcgctgg cacacatgtg aatagttact tgatgcttat agtgatgtct gggaaaataa 55080
catgaaatac ttataatctg tttctcacac atgtaattca aaagaataga gagaagatga 55140
tttgaaatat tcttaagttt gtaggaaaaa agctacttcc atatgcataa ttgcatgtat 55200
tttgatactg ccattattaa gaactatcta agagggtcca ttaaaaataa aatttcttgg 55260
ctgggcacag tggctcatgc ctgtatccca gcactttgga aggccgaggc aggtggctca 55320
cctgaggtca gaagttcaaa accagcctgg ccaacatggt gaaacgctgt atctaccaaa 55380
aatacaaaaa ttagctgggc atggtggcat gcacctgtag tctgagctac ttggggggct 55440
gaggcaggat aatcgtttga acccaagagg tgtaggttgc agtgagctaa gatcatacca 55500
ccgcactcca gcctgacaga caaagcaaga ctctgtctca aaaatattaa aataaaattt 55560
ctcattccta ttacagagta atttaattca ttaatgccct gccctgttac aaaactcatt 55620
tgtaaaatac taattgtaat tgtgaaaaaa tggcaattga tactaatttt aaattctaaa 55680
aacagggcac ccatattaaa gattattctg cagtaagaga attagctata acattttgta 55740
ataaggtgga gaaaacattc tccaacttac aatggttggt gagaagaaag tttccagcac 55800
ggtagatgga ccctaagagc ccttgttgaa ataataagac aaaaagatat acagagagat 55860
gagccagatg aagggagaca gagagagaga gagagagaga gagagaggca cagaaatgag 55920
agatacaaag tgaaagaggg caacctgtgg ggtcatcaga tatttgtttt ctgttttgtt 55980
tattctaaca taaaggcagt ggtgggtcat cgatgtattt agagtttgca caatcactgt 56040
ggaacacaga cagacacagg ggaagaggag aaacacaggg cggtggcttg cccttggact 56100
gttcttagtt cctcaaaacg taacagcttt gcccaaccta agggaacttt cagcagctgc 56160
tcttctgcca taggcctctt tcctgccttg ttttcatgtg gctgactgtt tctgttcctg 56220
caggtcttag ctcatcagac aggcatttat tacctctgtg tcaacagtgg gagcttccat 56280
tactctctag catgacactc cccttcctct tttaggaaat ttaacatgga agtgagtttg 56340
ccatcggcct tctccccaca gtgttaacag tggtgaggaa gccagcctgt tccaccttgc 56400
ccctcccatg attccaacac tgagttcaga cttgtcacat ggaacttatc tttgcatgtt 56460
tgtggcacag acagatggac ccaaccatgg attagtggat ggatggatgg atggatggat 56520
ggatggatgg atggatggat ggatagatgg atggatggat ggctgagtag gtgtgtggat 56580
ggaagagtga aaagatagat ggatgcatgt atgggtggat gggtaggttg atggatgcat 56640
ggatgggtgg atggatgggt gagtggatga atgggtgggt aggtgggtgg ctacatgcat 56700
ggatgagtac ttggatagat aagtgagtgg atggatggat ggatggatga atgggtatgt 56760
gaagggatgg atgtattaga gtgggtagtt aggcaggcat gagctgatag tcaagtgatt 56820
gttaaactgc ctctctaaaa taataattgg tctcggctgg acgcggtggc tcatgtctgt 56880
aatcccaaca ctttgggagg ctgaggtggg cggatcacaa ggtcaagaga ttgagaccat 56940
cctgaccaac atggtgaaac cctgtcttta ctaaaaatac aaaaattagc tgggcgtggt 57000
ggcgtgcatc tatagttcca gctactcggg aggctgaggc aggagaattg cttgaacctg 57060
ggaggaagag gctgcagtga gctgagattg tgccactgca ctccagcctg gtgacagagc 57120
aaagctctgt ctcaaataat aataataata ataaataata attgatctca gccagcgcca 57180
agaaaaggca gtctcccaat agatagaaaa cacccgaaac tggtcatcag cagcttcctg 57240
ataagatctc aggcattggg tgagtgggct caagcatatg cactaagagg caaagtggca 57300
gagtttaact ggcacataat cttcctctag gaacactcta atagtaagag aaggacacct 57360
caaatgagca tgtgcacatt tcattaaacc cactgtgtat gcagcccctc ccaagtgctg 57420
gcaggccact gtacatgtgg gcagcccact ccaagggaag aatcaaggga gaagaaatac 57480
aaatcccaga accatgtcaa tgtataaaac cccaagtcaa gggccggaca gagcacttag 57540
atctctcaag tcgcccactt agccctcttc caagtgtact ttacttcctt tagttcccac 57600
tttaaaactt taataaacat ttactcctgc tctaaaactt gcttgggtct ctcactcttc 57660
tgtatgcccc ttggccaaat tctttcctcc aaggaggcga gaatcaagtt gctgcagacc 57720
tgtatggatt cgctcctgct aacagatagc tggatgggtg gacagatgca tgaattagtg 57780
gatggacgtt tggatgtgtg ggtgggtggg tggattgtgg gatggctgga tgaatgcatg 57840
gctggatggg tggacagatg catgaattag tggatggatg tttggatgtg tgagtgggtg 57900
ggtggattgt gggatggctg gatgaatgca tggctggatg ggtggacaga tgcatgaatt 57960
cgtggatgga cgtttggatg tgtgggtggg tgggtggatt gtgggatggc tggatgaatg 58020
catggctgga tgggtggaca gatgcatgaa ttcgtggatg gacgtttgga tgtgtgggtg 58080
ggtgggtgga ttgtgggatg gctggatgaa tgcatggctg gatgggtgga cagatgcatg 58140
aattcgtgga tggacgtttg gatgtgtggg tgggtgggtg gattgtggga tggctggatg 58200
aatgcatggc tgggtgggtg gatggatgca tggataagtg gtggacggat ggacgggtga 58260
gtggatgggt ggatgtgtgt gtggatgggt ggataggaaa gccctctaat tgattacagg 58320
gctcagtgtg tgcttcaaca tcatgatggc atcatcacat tggtccctgt atgaagcagt 58380
gggggaggag agtgtaccag gggagcagga atgacttttc tccagaatcg acctctccca 58440
ccctgcagcc tgggctgtgc aggccacatt ggagaaggtg cggtcgacta ctcctaaatg 58500
ttgttgtgtc caatggcttg ttgacgttga tgtaggaatg agcctacatc tccaccatag 58560
atggaactgt ttgggtcccc aaagcagaaa gcctcttctg ttgcaggtgc tgaagtttcc 58620
atcttcttct gcttatacgg aagctcacgc atcccttgga tggcaggcgt caggttcctg 58680
tgcgcactga gttcccccct tacatgcttt ggacagaagt gtgagacaca caagattgct 58740
gcaggaagtc cacctgtggg gatgctgcga cttctccagc aagaacacga gtctgctcat 58800
tgaccatcac cacacataac aaattaagtg tccctttttt gataacacgt cattgtttca 58860
cagagtattc ttttaaagtg tataagttga ctgcagttat tattttttac ttctgttact 58920
aatttactca taattaggca caatttacac ttaagaaatt tcttaatagt tttttcctcc 58980
ttaaggtgaa ctacagtcag ataacatact tatcaattgt ctctagctct tgtcagaaaa 59040
acatatagat gtgtgtgtgc gtgtgtcttg gcctttccaa tgatgaatta agatgtgcat 59100
tgagaaggca ttcactttat ttgacgttaa ggaagtacca agaagacgct ctccacagac 59160
cctgggaaag ccagcagctg caccccgagg ctgtgccagg cagggaacaa ggaggcagca 59220
ccacctgctg ggcagggaaa atgtcctccc agtccctgcc gcttctctgc agaggcacaa 59280
agagctgccc cttctcctgg gccttctcct gggctgatga gattgctccc cgatatgcca 59340
aatcagggtt gtgcatctga ggctctgtct agactctcag ctccttccta ctcctgcaaa 59400
gtgaagaaaa caatgccaag gggtcctgga ggcgtctcta cccctggaga gttttgactc 59460
tcttcaatag tctccactac cctgccctca ctccatgtcc tccgtttctc cctaaagcgg 59520
tgcccagtct gattgcactg tggcagggat aacgaggggc caggacatca ggggagagaa 59580
gtttctacct gagtcacagc agcggctgcc ctgcagactc ctgaagacac aagacacatt 59640
tccatcccag agacccagcg aaatgcaacc tcaggctaga gacagccagt tattttttct 59700
tgttctgtcc tggagaggcc actgagaaag tcgagcccct tgttgaggaa aacatgagat 59760
ctctgtgtgt cgtcctctgc ctgatggctg tacctccatg tgagtgtctc agagatttca 59820
gaacgggggc tgtgggctgt ggtgtccgct tgtgactcat ctctttgctt cttgtccctg 59880
agtgtcctgc atcagatgca gctactggag tcatgcccag ggctggtgag gtcctcacag 59940
acctctgggc ctggacccag cagccctctg ggaaggcgct ggggcacctc agctccaggg 60000
gcagcacaca cttcagccca gcctttctgg gccaactctc catctgtaga gacacatcca 60060
aggcccagtt atccctgcag ctgagctccg tgatggccaa gggcagggcc gcacattccc 60120
gtgggagaca gaatggggac ctcagcgtga gcccagacac aaacctccct gcagggaagc 60180
acaagaccac caggcggcgc tccagaccac acagcggccc cagaagcagg ttttaggggg 60240
cggggcagac gtgtccgcgt tgagtcaggt cattggtttt actttccctg agcaaacggc 60300
ctctgccaag gactcactgc acctctcacc ttcacagttg tttttttttt ttttttaatc 60360
accctgtaga gttttgctag ctaatttaga tattgaggag tgcttcatac ttccttgggc 60420
ctctgcttgc agaaacatag caattgtaag gaggcacgtg ggaaagcccc ggctcggtga 60480
cccgggggat gctgctgtgg ccctggcaag agggcgtcgg gccgcagtaa caaaggtgca 60540
gacggctctc agcctgcgcc cgcggagtac aacacataag ggctgtaacc taacgaaaaa 60600
agaatcgcag tgcaactgtc ctgcatttga gtttgtgatc agttttgccc tttgtcttta 60660
acaggttcta acataaaatt ttgaatgttg gttcaagccc tgtgggtaaa atgcacttac 60720
ccacattcct taaacaaata gaacactgag gtggaaatgt tttgaaaaag tagttttcag 60780
acatttggaa acaagcatca caggatcata acccctgaga aaagaaaaac aaatgaacga 60840
atcctgctat tgcctgaaag cagctgccag gacacacgga aaggcttagt gagctgagcg 60900
gacagagagc agagttcaag gcagcagcag cccgagggga ggagcaccgg ggagcaggct 60960
gctgtgcagc caggatgggc cggggtgggg cggggggaga acagctggag acttgccgca 61020
gggaggggga tccctcaggt ttggggctga gaactgactt atgcctgact tatgcctgca 61080
tgaaaagaaa ctactcgata tcagggggaa atcaccagaa acctgtggac ccaaaactac 61140
acagagccta cacaaggaaa gcattgtttg tgttctccca gccagggtgg aaagaccttg 61200
agatatgtaa agcttcaagc aatcttccga agtaatctcg tgagtagtgg tgccacatta 61260
attcaggact aaaggctgct ctgaactgaa cctaagaaat gcttcaagtg tagcctggag 61320
cccgggtgca gtggctcaca cctgtaatcc cagcactgtg ggaggccgag gcaggcggat 61380
cacttgaggt caggactttg agaccagcct ggccaacatg gcaaaacctg tctctactaa 61440
aaacacaaaa attagctggg cgtggtggca gatgcctgta atcacctccc acctggaccc 61500
ttccttgata catcagaatt acaactagag atgagattgg ggtggggaca cagagccaaa 61560
ccgtatcaca taggaaccta aaaggataat aaagtaggaa aacttcccac atcagtaacc 61620
ctttatccga tagtaatccc aatctgcaaa gtaaaactgt gtgattttac taagataacg 61680
gaatcttctc tacagaagga ctttccagtg caaaagctcc ccaccctcac catgaaatgc 61740
acgtgaccat ttccaatttg tgtaaagtcc tcagttagta ctgagacttc ggaaggttag 61800
aaatcccttt gctcatgctg catggtccgg atgagatgta agaatcatta gctaatagac 61860
atgcaacagc ttttgtgtga aagatgttat gagacattta aggtatttgc ttgtgattac 61920
taagcattca ttgtatcatt ggagcacatg tgcttttata ccctggagaa attccagtaa 61980
ttgaattgct gggttgaatg ggattttgat ttggattaaa tttaaactat agattttatt 62040
tagggaaaac tggcatctta attatgttat tggggggccc ttgctcccag agctcccaag 62100
atggtggcag gccgcttcca aaatgaccgc aggccacttc caagatggtg gcaagcctca 62160
tgttctctga cctggggttc ttggcctcac ggattccaag gaatggaagc ttgggccatg 62220
cagtgagtgt tatagctcta ttagaagccg tgggtcacgg aagagaaccg tggaacccag 62280
tgactagtgt tcagctcgat taggacgaac ccaggcactt agccgtgcag gaacaatggc 62340
gagcatttgg cccgatcgag agtggcaatg ggcgcctcgc tggatcagga gcacagcgga 62400
taccctgatg gatccggagg gatggaagcc agcggtgggt ctcccacggg ggcaaacagc 62460
agtggtggac ggtgagcgaa agcgaagctc gagccgtaac aaacatggac cagaagagtg 62520
cagttgcaag atttagtaga gtgaagacag agctcccata caaagggagg ggacccaaag 62580
agggtagctg ttaccggctc gaatgcctgg gtttatatcc cgatcattgt ccctcccgct 62640
gtgctctcag gtgatagatg attggctatt tctttacctc ctgcttttgc ctaattagca 62700
ttttagtgag ctctctttac tatctgattg gtcgggtgtg agctgagttg caagccccgt 62760
gtttaaaggt ggaagtggtc accttcccag ctgggcttag ggattcttag tcggcctagg 62820
aaatccagct agtcctgtct ctcaattaca ctgagttttc caatccatgc atccaatatg 62880
tggtgtatct cttcatatgt tcatagcctc tgagcaatgt tttacaattt tctgtgtaaa 62940
gaactccaca tcgttttatg tttcttctaa ggtatatcct gattgctttt tatgtcttca 63000
caagtttttt cctttcaaaa ttaattttcc aattgtttgg tgctaatatg ctcaaatgtc 63060
cttgattttc ttagtttgaa cagtccgttt ttgttttggg gatttatttt tttttcagat 63120
tctttaagat tttctatgtc tataaccata taatctctga acagagacag ttttgctttt 63180
tcctttcaac ttgaggtagg ttttctgggt agttcaggac gcgcaggcac tgggtgggtg 63240
gtgttagcag ctgcacgatg ccttggagag gacactctcg ggggactgtg gccgctgctc 63300
agctgtgacc gttcttatag caccagcagc tgcggccacc attcttatcc aatttccaaa 63360
gccacaccac aggccctctc aagaacgagg cgtggaggct atgccctctc ctggacacat 63420
catcattccc aagccccacg atgtgggccc catgggacgc acacctttgt ctgtccagac 63480
ctcagcccca cctcctcatc ctgcaccaga actcttcaga gcccagtgca tgaaatgggc 63540
taccaaggaa atgagggtag gttcctgaga ggaaactggc cctgcatttg ggagctagga 63600
gtctgctaat tcgcctggca gccctgtgca gccctccgtg gctacagtcc accccgtgcc 63660
catcagtgcc tccttcctgt gcaagcctgg acctcgccct gggctcagga tgggctgtag 63720
accgagaatg caggcgggaa agtctttgtc tatcggggcc atagtcaggt tctacagtga 63780
gtcagggaaa gacctgtgga ggtgtggatg aggacaatgg gtccaccatc aacaggagga 63840
cacgggttcg accccttgca gaggcacagt cccacatcac tgggaggcag ccacactcac 63900
tgcctcgccc tctcctcaca cagtgcagtt tccacgttca cagccccagc cagtcaccag 63960
gaatgccctg ggggcggcct ttccccagtg cactccgagc cctcccttgg ctgtgcggtg 64020
agctccatgc ccaggagata tccacccata gtcctccgga aagcagctga cctgccatgc 64080
cctggaacca caaatcccca cagatcagcc agcctgcagt gggccttgga tgtggtgagg 64140
agtggtggca cccccgttcc caccccacag atgcaacgcc tgtgggtgac gcatgtgagt 64200
actgaggagt agagggtaga actgtaggcc ccgagaacca cagaaactcg ggtgttacac 64260
tctggggcca tgtaaggaga aagtgtcact ggacagaaac aggcccctcc tagacactgt 64320
gtgcgccata gtcacctgtc attagctctc actcttgcag attcatgatt gaggtggtta 64380
aaaaaaaaaa agctcctact cacccatcca accccatcct ggggtgtttc caccaccctt 64440
ggggtttggg atgagctgcc cttgcccact gtgctctgtg gacctccctt tagaagctca 64500
cagctccctg cactcggctc catcctgccc caccacacag aagcaaaacc cctctccttt 64560
ccactgcagg cttttcctgg accagaatgc tgacctgctg cccttcactc ccgaagtggt 64620
gggactgcct ggggtggtgt gggtgttgag ccttcttact ctagggacct ggcacctggc 64680
cccaggggca cagggatggt gcatctgcct agggatgcct cctcatgcca gggggtgggg 64740
gttagtacca tcggccctca ggatttgttg catgaatgag tgaatgggtg aataaatgaa 64800
ggggatctga tctatgaata agggtatata gactttggtt gatgtaggac gccaaatgct 64860
ggaatttcag agtcatcaca cccaggggcc ctgcctctga gctcctcttt gcatccaatc 64920
tgctgaagaa catggctcta gggaaaccca gttgtagacc tgagggcccc ggctcttcaa 64980
tgagccatct ccgtcccggg gccttatatc agcaagtgac gcacacaggc aaatgccagg 65040
gtgtggtttc ctgtttaaat gtagcctccc ccgctgcaga actgcagagc ctgctgaatt 65100
ctggctgacc agggcagtca ccagactcga gtgccatttc attacctctt tctccgcacc 65160
cgacatagat tctcactcac ctgtgccatc tccggggaca gtgtctctag caacagtgct 65220
gcttggaact ggatcaggca gtccccatcg agaggccttg agtggctggg aaggacatac 65280
tacaggtcca agtggtataa tgattatgca gtatctgtga aaagtcgaat aaccatcaac 65340
ccagacacat ccaagaacca gttctccctg cagctgaact ctgtgactcc cgaggacacg 65400
gctgtgtatt actgtgcaag agacacagtg aggggaagtc agtgtgagcc cagacacaaa 65460
cctccctgca gggatgctca ggaccccaga aggcacccag cactaccagc gcagggccca 65520
gaccaggagc aggtgtggag ttaagcaaaa atggaacttc ttgctgtgtc ttaaactgtt 65580
gttgtttttt tttttttttt ggctcagcaa cagagatcat agaaaaccct ttttcatatt 65640
tttgaaatct gttcttagtc taatggagat tctctaatat gtgacaatgt ttttctcttg 65700
ctgtttttgg aattctttgt ctttgacttt tgacaacttg acttttgaca gtgtgcctca 65760
aagaagttct attttgggtt ctgtgaacct cctggatctg ggaagttttc agctatgatt 65820
tcattaaacg tgttttctac accatttccc tactcttttg gaatacccat aatgcaaata 65880
tttgttcact taattgtgtc ccataaatgc tggggatttt cttcattcct ttttactctt 65940
tttttctttt tattcatctg cctgaattat ttcaaaagat ctgtcttcaa cttcagaaac 66000
tcttttgctt ggcctagtct aatcttgaag gtctcaattg tacttttaat ttcattcatt 66060
gaattcttca actctggaat ttctgttggt tcttttttat gatacttatc tctttgttga 66120
attcctcatt caaatgataa attgttttcc tgatttcact gaattttcta tctgtacact 66180
attgtatctc cctgagtttc ttagagatta tccttttgaa ttatttttct gacattctgt 66240
atatttcctt atgattgggg tctgctactg gagaatgact gttgtctttt tcaggtgtcg 66300
tgtttcctgg ccttttcatg ttttatgtgt tcctacgttg atttctacac atctggcgga 66360
ccagtcatcc cttgcaattt aatggagtag gttttgcagg aaaagacttc ctagtacaga 66420
cgggtctcag ggtgtcagtg tggcggggcg tgctggcttt agttctaggt tgacgcagta 66480
gcgtagtctc catgtcgttt cttcagctgc cgtccacatt ggtgacgttt gcgagtgtct 66540
cagtggcctg ggctgagagg tttgtggcag tggaagtgca acgttgctag aggtggactc 66600
accaggctgt ttctgaggtc gaggcacatg catgcacatg gtggattgac caacttggtg 66660
ccaggctcac tagggttggg gacatggggc tgtttctcag gcccaggatg caaacacaag 66720
tctctttggc tggcctgggg gtgtggcttc tgagggcaat ccacagggct gtttctcagg 66780
ttcaggacac aagtgcatgg ccgctcaact ggcctgggca tgtgtctccc agggccaccc 66840
catgggctct ttctcagacc caggacatgg ccacatggct tcctcagctg gcctgggtgt 66900
gtgtctgctg gggggctgca ggggcacagg gttatttctc aggccggggt catgggcgca 66960
cagctgcttg ctggcttata ggagtgcctg ccaggggtgg cccatgatgc tgtttctcag 67020
gcctaatttc aggtgcagag cctttgggca ggtcaacggc atacctgtgg aaattggagt 67080
ggatgccaca gggctatttc tcaggtgcct gagtgtgggc acatatccac tctgccagcc 67140
tggagttagt atcaggtgct cggtggctca ggggcctctc ctgctcaggg gagggccctc 67200
agcagcttgg ccaaatcaat ggtggattca ccctgggcag gcctggcagg ctcttcctcc 67260
agctggatgt gcagcagcag gggttgggtt ttttgctgtg cagggccaga gtcacggcca 67320
atcctcagcc taggctctgc acagccaggg ttgtggcatt cagccaccca gatatgggca 67380
tcctgaagat ggagccccaa tgctagaaag gggcagtggc taccagcctc agggcaggat 67440
gcactccaga ggcggctccg gtctcaaggt ggcgctgggc tgcagcagct aggctcacag 67500
tggatgaatg ggggcaggga gtacacacct tgtgctccta atctgggatc attcctggca 67560
gctcccaaac ttggctgagg gcttgcaaaa cctgtggaat tctcctgttg caagggctgt 67620
agatgtttgc agtggcagtg ggtgctggcg ggaaatctgc ttaccttttc cctacatggg 67680
aagtccctcc tgtgtccaga ccaatccgat ctgggtgggg aagacaaggc tgcaaaggcc 67740
aggtgcctcc atgctgccct ccgatcacca cgggtgcgtt tccacacctc cactgcactc 67800
cgtcagtctc ccttcaacac tccagtcaaa ccttagctgt ttcttctttg ccttattcct 67860
tcctcatggg gagggtgtgg gtgaacacca ggcttctcta agttcttcat ccatcttgct 67920
gatgtcattc tccatccagg catgggtttt taagaagtag tgaatactga aatttcagca 67980
gaggacacct ctataaaaat tctgcaactg gaaaacctcc ttaaattggc tgattgtcat 68040
tacaattgga ggaaaactgc caataatttc aaatttagaa ggctgagact ctataaacaa 68100
agactaacaa tatgttttct gatatttttc cccaaaataa tacttttcca agacgaaaat 68160
ttttccaggg tatataagca catgtgctcc aatgatacaa caaatactta ctaatcataa 68220
gcaaatacct taaatgtctt ataacatctt tcacacaaaa gctgttgcat gtctattagc 68280
taaaaattct tatgtctcgt ccagatcatg cagcatgagc aaagggattt ttgaccttca 68340
aaagtctcag tactaactga ggactttaca caaattggaa atggtcacct gcatttcatg 68400
gtggtggtgg ggagcttttg cactggaaaa tccttctgta gagaagattc cattatcttg 68460
gtaaaattac atagttttat tttgcagatt gggattacca actgataaag ggttactgat 68520
gtggaagttt tcctacttta ttctcctatt aggttcctat gtgatatggt ttggctctgt 68580
gtccccaccc caatctcatc tccaattgta attcccatgt gtccagggag ggtccaggtg 68640
ggagtgatta gatcaagggt ggtttttccc aggctgtttt catgataggg tgttatcatg 68700
agatatgatg gtttaaaagt ggcaggttcc cctgctctct ctctcgcctg ctgccacata 68760
agacgtgcct tgctttccct tcaccttctg ccatgattgt aagtttcctg aggcctcccc 68820
agccatgcgg aactatgagt caattaaacc tcctctcttt ataaattacc cagtctcagg 68880
tagtatcttt atagcggtgt gaaaatggac taatacacta tggctttgaa ttaataattt 68940
aaaatttgtc agcttggcaa taaaacatcc tgttgacatt tattttttag gtaatatttt 69000
aaattggcag tttcattcat gtttttacaa attcttattt tcagggtgtt taaggccttt 69060
gctttgaact tggtggttcc ttacactcca tgctgttagt gaagagggac caggttggga 69120
ggcattggtt tgggtggtgg tcaggaaggg cagagtgatt tgagtagggt ctgagtggat 69180
aatagctcat cagtttggaa tttataaatg accagggatg atttaaggag attcctgcca 69240
gacacctatg ccatggccat gccctatctg gatctccagc cgtgagatga gaacccagcc 69300
atgcggggga gtctgttcgt tctgctcaat gttgtaagtg gcacatgcta ttggataatg 69360
tagaattgaa tggatatcat tttattatta taatttacaa acttcctaca ataaacttat 69420
cacctttata catagaaaca aatataagta cattttccct cccctatgtc attttgagcc 69480
ctctctccaa accatcctcc cactctgcga ctcactgtcc tgcatttggc tatgctctgg 69540
caagtcctgc ttagacaagc actcaccaga ccacctactc agcctccctt cagcgcccac 69600
ctggcccacc tgctcaaata catgttgagt ggtcacacac atggactgaa caccatctat 69660
tccatgcact gccccagtga ccgcactgag cagcaagaga gaaatgatcg cattagctat 69720
caattatgcc aattcaaatg ctggagtctt tctcagatac ttttcaatgt tcaagaattg 69780
ttgattgtga attctatacc caatgaaact atccttcaga aatgagcaga aaatggatac 69840
cttctcaaat aaacaaaaac taaaagaatt cttgctacaa gatgtactct taaagactgg 69900
ctaaaggaag ttcttcaaac agcaaggaaa ttgaattgat cttatgtcct gcacacttgc 69960
taaatttcct ctcaatttta gcagcactgt ttagattcca taggattttc catacaaaca 70020
gtcatgtggt ctatatatag agacagattt tcctcttttc cagtggggat aaatttatgt 70080
ctttttcttt ctgtgttaca gcaggtagga cctccagtac aatgttaaac agaagtggtg 70140
aaaacagaca ttcttgcctg tttcctaacg ttggagtttg gtcttttact atggtgtcag 70200
atgttagctg tagggttttt ataaatgccc ttcatcacat tgaggaagtt tgctcctatg 70260
cctaattttc tgagagtctt ttaatgtgac actcatgcta gaatttatta aatgctttct 70320
gtctactaag atgattatgc agttcttata ttaacatgaa taattacatt tatttattct 70380
ttaatatcaa ggcaattttg cattcctgag acaaacccca tttagtcatc atgtgttgtt 70440
attgttacat attgttggat tcaatttcct caaaatttgt taagaattgt tacatctatg 70500
tttacaagga agattagtct gtagggtatt ttttcttata ataactttgc ctagttttgc 70560
aatcagggta atgctggact cacagaatga gttgggaagc tatttcctcc tcttcatttt 70620
tctgaaagaa tttgtataaa attggaatta tatcttcctt aaaggtttgc aagatttcat 70680
aatgaagtca ttggcctaga gttttctttg tgggaaagtc tttgtttgtt tgttttgtgg 70740
tttgggtttt tttttaagag acacagtctc actctgttgc ccaggctgga atgcagtggt 70800
gtaatcatag ctcacagcag cctcaacctc ctgggctcaa gcaatcctcc tacctcagcc 70860
ttcagagtag ctgggactac gggcatgtac caccacaccc agctgtttgt ttgtttgttt 70920
atcgctttgt cttgtttttg aggtcttatt atgttgccca ggctggtctt gaactcctgg 70980
cctcaagtaa tcctcatgcc tcagcctccc acagtgctgg aattacaggc atgagccact 71040
gcacacagac tgtgggaaag tttttaacta aaaattcaat tttctcttcc ttttccagtg 71100
agctttccag tgtctttcaa ttaatgtatc tattttatct aagttgttga atttattgtc 71160
aaaatttttt taaacaatat tcctctctta gaggttgaac atctgtagaa tctgtagtga 71220
tggcacctct taaatccctg atcttgctca tctgtgtcgt ctctctttct ctaatcagta 71280
tgcctaaagt ttaatttcat tgattttctt aaaaaactgg ttttggtttt attgattttt 71340
ttccctagtt ttttgtgtta catttcattg acttctgctc tgatatttac tatttccttt 71400
ctactgccta cagtaagttt aatttgctat tttcttagtt tcctaaagtg gaagctaagt 71460
ttattgactt gaggcctttc ctctgtctgg atgcggatat ttgctgctaa acatttccct 71520
ccaacaccat gctgtgagtt ttagttacag cgggcttgga gttggcctga gaaattctac 71580
ttaaacagct gcacctatca tgtaagtgat aaatgatgta cctgcctggc cctcacccct 71640
ggtcaaagaa tgggatgtac taatgagcaa tgttgctgcg tagctgtgga tttcaaggta 71700
ttttctgtgt ggttttatca tcagcattgt ttgttgatga ctgcaagact gatgatttgc 71760
acctggcctc ggtgagatcc ccgaaagacc ctgcagatgg gctggttact tagcagaaaa 71820
tatgacaacg tggccagcag gaaacaggaa ggtacaatcg gctgcaggtg agctgttgga 71880
agtaagttcc aattttccta ttttgtattt gcattttaat agtgagactg cgcttatgtt 71940
atttgtgtga aacagcttta ttcatagcac tgtaatttaa agagaaaacc cattcatggg 72000
aacaacaaac gacctagaca ccaaggtagc tcatgccatc caaggctata ctgtgcagtg 72060
attgggaaaa tgggcactgg tcccagaagt ctgatcgaca ctctgccact ggctagtccc 72120
gtgctggggg gcgaggatcc acactctgcc actggttagt cccatgctgg ggacaagtat 72180
ccacactctg ccactggcta gtcccgtgct ggggggcgag gatccacact ctgccactgg 72240
ttagtcccat gctggggaca agtatccaca ctctgccact ggctagtccc gtgctggggg 72300
gcaaggatcc acactctgcc actgattagt gttgtgaaga tttaaataaa gaacccacac 72360
catattcttt gacttgtgct ttccgtatac tgagagatag taagagtaca ttattattat 72420
ttataaagta aactagaaag cacatgggaa gacaagaaga aaacctgaat aaacatgaat 72480
taccccattt tcctcaggag aaaactttca cactctgaag gtacacaaat tagcctacaa 72540
atttaatgta aagcaaatag actgttgtag gtaccaattc tcaatgtcac agtgttacat 72600
ggaaagtaaa atacacaaga acagcccaaa agatggaaac aatggacgtg gtcaaatgac 72660
atcagtacaa catccatatg gtcctaagta gccatcttta aaatgggtta gaaatgcctt 72720
caatcattca cacagacaca tgcattgaac aaactctaag aagtgttctt acacgggaaa 72780
agcaagttac agatgcatgg gcatgatatg gatgtagatg tgtgtatgtg catcccactc 72840
atacacaaaa tacccagcat cgcccacatg cctgctgtgt gcgtaagtgt gagcgagtgc 72900
acagacaaca gcgtgcagaa attcaaacca agctgtgggt acttgttacc actgggaagg 72960
gagtcggtca cagagggaaa gagaaacagg acatcagcct ttgacttcag aactgttcct 73020
gccttttcac atcctgtgct gttttcagca tcatcggagc ccttaacaca catcacggga 73080
gtaagagtgt gttagaggga gcattcggtg ggacagatat tgccatggct tgtggataga 73140
gttcacagtc cttaataatc cccgagatgg cagccaagag ctacgttctc aatcacgcag 73200
cttcacccca gaaactgaca gaaacccaac aaccaaaagg tgtccattct gacagcctca 73260
gcctgtgctg gctcagatga gcaaaaatgt acagatatta ataatgatgt tgatttgaag 73320
agcacagagg ggggtatgca tgataagggt ccaaattttt accttaaaaa agaatacatt 73380
tacttctcaa tcacctacat aacgatcatt ttttaaaaaa ctgatcaaat ttggtgttac 73440
aagggcacgt tgcaaattct tctggctact tttctctgac tattctaatt acgttaccgt 73500
gttttctcct gtatgtgccc gttcatgtga atgtcatttc tggctacttt tctctgacta 73560
ttctaattac gttaccgtgt tttctcctgt atgtgcccgt tcatgtgaat gtcatttctg 73620
gctacttttc tctgactatt ctaattacat taccgtgttt tcctgtatgt gcccgttcat 73680
gtgaatgtca tttctggcta cttttctctg actattctaa ttacgttacc atggtttctc 73740
ctatatgtgc ccgttcatgt gaatgtcatt tctggctact tttctctgac tattctaatt 73800
acgttaccgt gttttctcct gtatgtgccc gttcatgtga atgtcatttc tggctacttt 73860
tctctgacta ttctaattac attaccgtgt tttcctgtat gtgcccgttc atgtgaatgt 73920
catccaggca gatttcccaa atccggcttc ctgtaaccaa gggctgaaag agggaacggt 73980
ttcctgggaa tcctttttgc agtttatttt acccggaggc agaagcccac ggttccgtga 74040
agagtctatt gctctcccct ctctcctttt gtgtctctat ttttaattga caaaaaagca 74100
aatgtgaaga ttcctggggt acaatgcaaa gtgacaatgc ctgtctatat tgtgggatga 74160
ttaaaacaag gtaagtggca tatccatcac ctcacacact tatcattttg tggtgagaac 74220
atttaaaatc tcatctttta gcaattttga aatagtcatt attgttaact atagtcacca 74280
tgctgtgcaa cagatcaaaa gaactgactc ctcccatcag cagaaacttc atgccctttg 74340
accagcatct ctcctttccc cgtccacgac taacccccag cccaagagaa cagccaacac 74400
ccacctcgct gctgccacac gacatgtcgg gctttgatgg gatggaggtg agggtgggga 74460
agacaattcc aaagctggag cactggcctc acagctcaga cactcttcta cttatcctga 74520
gagaatgatg tgctgagacc aactaaacct cccctgctct tcccacatgg cagaaaagag 74580
gcaacccagg gaagccattg ccaggacatc atggtcaccc aacccttgtg cagaaaggaa 74640
gcacctgccc aggatgccat agcacccaac cctcatcccc aaggaaacac agcccagggc 74700
accatggaca cccaaccgtc atccccaggg gaggacacag cccagggcac catggacacc 74760
caaccctcat ccccagggga ggacacagcc cagggtatct tggacaccca gccctcattc 74820
ctaggggagt acacagccca gggcatcttg gacatccaac cctcatcccc agggaaggac 74880
acagcccagg gcatcttgga cacccaaccc tcattcccat aagagcacac agcccagggc 74940
atcgtggagg cccgaccctc atccctaggg gaggacacag cccagggcac catggacacc 75000
caaccctcat ccccagggga agacacaacc caggccacca ttaacaccca atcatgtgca 75060
gggagggtgt ccttggagcc tgggactctt gccagtgaag cggtggacaa gaaactgagg 75120
atgcgatcag cacacagaaa tctcaggcag cctaggatac atgaggcctc tcacccctgg 75180
gaacactgag cagccaccag gagcccacac cttgaggtac agcaggagcc atgcgctctt 75240
gctcttgctc actcacactc ctgcacacag ccactgacac acgccctcgt gcacgttgca 75300
gattaactcc actggccttg cacttgcaac gctggaggct gagaggtatc cccaggttct 75360
tttctcgtga gaggggcagg ctgactttca ctctcctcca tgtgctagag gcagctccac 75420
caacactggc tgccctgagt ggatgcacct ggctctggaa ttcctgtcat ttgctttgga 75480
tccaggagcc cctgcctcat gtagctactt aacagaaagg aggaatccac ccaggacatg 75540
cccagacggg agcctcacag gatggacagt ggtgtctggg gtcacgggca gccctgaccc 75600
agcagcgcca gcaccagcac acccagtggg gaaggcgggg aggcccaaac gccacccaca 75660
gtttgttact ccactgggtg ggacccggca cccctgcctt cctgacaccc tggagtccct 75720
gcctcctcct agagccccca agcccatctg cctcagagca tccagagaca gacctgggga 75780
gccatttcct caggccctgg acaaggaaac agggaattcc aggttatggg tgcctggggc 75840
aggtctcagg caggtgctgg gaaccagaga gaggggtcac cgcgaggcct caggcctggc 75900
accagcactt tgagcctcag tttaccagcc cacgaggtgc tgagtctgga ctggatgacc 75960
ttcccacccc cagtgacctc tgccctttcc cgagcatgtc agctctgctc cagcatcctg 76020
gtgtgagcgc aatgccactt tttttctcaa caaatacgaa aggaggaagg tgcccccagg 76080
gccctgtgcc ctgaggatgc ctgtgtggag gggtccattt catcactggt gtcactcaca 76140
ggaagggacg aagccacctg ccttgacgga gcttactcca cctccgccga aggccgggga 76200
ggtccctcac agagaacctg aggcccagca ggctgcagag gtgctggcat ggaatgactg 76260
ctcagacgcc cggggccggc agagaggacg gatgtggggg aggtgcacac tgaggagcct 76320
ctccttggag gtggagacac gtgcaccaca tggaccagga cacagtccac gaagcctcgc 76380
atccccctga gctgcagctc aagggcctct ctctgagccc agagtcccac ccctgggagg 76440
cagctgcccc agctctgagg gaggagggca tccaccaggc cctccatctc ctgggggcac 76500
cagcccagcc cagaggctct gcaggactct gcacctccaa ttcatggcca ggactttctg 76560
gatgtatctt aaggactgag gactccacat cagggaccac acaagaccgg ggtcccggac 76620
acgggggttg ggggtgagca tgtcaccggg atgggctgtg gcgtcactct ggtacttcat 76680
ccggacagcc agggaccaaa gccacgccct cagccccacc ccacccctgc ctcacatggc 76740
aacgcagggt ctgcagatgc aggagagtga gaagcatggt agccaggcag actagaggac 76800
ccgagctggg gttgagcacc tccctgtcta cccagggcat ggcctgtgag actgcaggtg 76860
gcctagtgtg tgctgcaggc tcaaggtcct gccccaggga gcatgacatt caggcccaga 76920
aattgcatcg tgctgcacac agtccaaggg gataaccctg tgaagttcag gtcaccagca 76980
ggcttggggt caagaccgag ctgcagagga caggtttctg gaaggcacag catcatgggt 77040
ggagggactt ggagcaaggt ccttagcccc gggaccagtg aatgtgtgcc cttataggga 77100
aagggggtct gtgcagaagc aagttagctg aaaatcatga agtggagagg ctcccctgga 77160
ttaaaggggt gagccctaat gtaatcacaa gtgtccttct aggaggttgg cagagggaga 77220
ctgacataga cagaagccag gtgaggtggg aagcggaggc agaggccgag agagcagacg 77280
ctacgccctg gccctgaaga cggaggagga gccgagagct cagggatgga gagactggag 77340
gaggcaggga agttctcccc gcaagcctgg agggagcatg gcctccagca cccccagacc 77400
ttggccctgc aggattcatc tggacctgtg gtataaatgg tgtttaagcc actgggctgt 77460
gcaaattgtc atagcagcca tggcgcattc ctagagggag ccctggtggg gacccagcag 77520
gcagcgacgg ggccctcaca agcctgtgag ccactcagag ccgcgagagt ggctaggctt 77580
ggtgaggtgc aggccacgcg cacctccact aaggcagcct tagggcccac acttcctctc 77640
tctctctctc tctctctatc tctctccctc cctccttccc tccctcccgc tctcttggtt 77700
ggacagctct ccatcatccc cctggacatg accacctccc aaggccgagc tggggcgctt 77760
tgctcgaggt gagcactgac atcctggggg tgtgaggggc acctgcccag cggccccgtg 77820
tgcaggatgg gcggtgggcc ctagctggca ctgggcatat ggcccggctg gtgcctgcag 77880
gctgcagctt ttctggggtg gctgggatca gtgaaggcct ccagagtctg ggcctgggat 77940
ccctgcagtg ctggctgagg acaggcgggg ctgggcagtg agggcactgg gtcactatca 78000
ccacccacgg tttattactt cactaggtgg gacctggcac ccctgccttc ctgacaccct 78060
ggaatccctg cctcctccta cagcccccaa gcccatctcc ctcagagcct ccagagacag 78120
acctggggag gcatttcttc tgcccccagc agaagcccgg gaggccggga aggcacagtg 78180
ggtctaaagg agaggatccc aggactgcct gaggggtgac tccgacgagg caagcataga 78240
gcccactgag aagcggggtg ggagccccac cagggatggg ctagttcctc atgaaggacc 78300
aggacccagg aaggacaagg gggcctgctg gggcagggtc tgctatgccg gagtccctgt 78360
gagcctggcc cagacctgcc tctctctttc ctcattggtc cccacaggtc cgtggtggtt 78420
gccgtatcgg gaggccccat ggtggcaggg gtgggacacc tggtatacgt cgccaggtgt 78480
gtccaatagg ctcatgctca caccttctcc tggcacctgg gcaaagcctg agcacccagg 78540
cactgaagtg agggcaaggc ctcggggccc cacaggatgg ccgaggagac agctgcaggg 78600
cgcctgggac ccctgggctc aggaggtaga aggatacagc ctgaaaaccc acaccacaag 78660
ctcaccggcc agtgcaggcc cacagagctc gaggaggcag ccctgagcct cccagggaga 78720
gatgctctgt gcacgccggc acaggccctg ggttacaaac cctaggcaca gcccaggaga 78780
ggcccaggcc ccagtccagc aaggggttgc aggaagcaag aggtccccgg ccacagcatg 78840
agataagccc atcaagccag ggccaggtgg gcaatgggag gcaggcaggg cttgggggtg 78900
agtccctgct gcagcgccgt ccactgtcga ccggaggagt ttcttccctg tgcggagtcc 78960
acgggcctcc tgtgagtgtg tgcatgggca caagtgtgtg tgtggctctg ctgtgtgtct 79020
gtacacacat atgttttggg tttttttgtg tctcagacca cagagtctgc ccctcccacc 79080
aaagcccagg cagaaggatg aacccacgcc cctggggccc aggcctcagc agcctctgcg 79140
ggatcattgt tcccagttgt cacttgcctt tgccacagcc ctatttctcc acaattcctt 79200
aaagtcctca acatgcattt aaggcacaaa ggtgaaactg cccagaaaca tctgactccg 79260
ccgtggaacc caggagcaag ctgggttagc taaggagcgg ggccgttggc agaggctggg 79320
gatccaggct gaactttgga ggaggcatgt cccagcatgg gctcctgact atgtcctcct 79380
gggacaaacc caaacccgct ctttgaatat gggagggact ttgctggccc cggccctgac 79440
cgcagcactt ggaaactgag gagtggtcgc ctcctccgtg tcacagctgc ccgttcacca 79500
tcatagaagc aactctgtca cctccatggg cccctctgtg gctgctgcct gggtccaagc 79560
tgagcccagc tgcccaggcc cagaaggaaa gcccaggcca ggtgcccagc acagaggcag 79620
tcacataccc cggggagagc cacagcaagc agccaatatt gcccaggaga ggagtagctg 79680
acaaggcaga acgtgagctg ccatcggctc gagaggcttt gctggtcctc ctggggctct 79740
ggacatgacc aggaggagcg agggaagaag tcgcatggtg gtcccatcct gggtggggcc 79800
tgatggcagc tggccacccg tcccagagtg gcagccagat gccagcgcca ttcccacagt 79860
cacatcattg gtcacagaat gcaggacata gagtgtcttc tttccatcac agtgctgtcc 79920
agacccatag cctagggtag acctggaaga ttcaatgtcc acacccgggg ctggagcgta 79980
gccatgagcc acgccccctg cccgtgcatg gaaagccagc ccaagctctg ctccatccct 80040
agccaaagtc agtgtccttt ccccttctcc caagtgagct ctagccacct gcctaccctg 80100
ccatctgagg atgacagcct tcattccatt ggaacctggc tctgccacca gcaggcttgc 80160
agtcctgggc agactccgtc acctctctat gcctcagcct ttccatctgc acaggaggaa 80220
gatgatgatg gtggtgatga tgatggcgat ggtttccttt tgcatctgag gcaaggacta 80280
attgagatga tacacatcag gcactgggta tggtgctggt ccttcctgag cactcaatct 80340
atgtgagctg tccttgtgaa atgggtgtca ccacatttcc ccacgcagaa catcctttgt 80400
ctgccatact tgaaacgtct gccccaatac taacagctcc tcatggaaga tgtgcacacc 80460
cacccaccct catactccca aaggtgcccg tgctttatca agccaaagtc cagccaggaa 80520
ctttacagca gcatcccttt ccctctccaa gcaccaagga gcaaggcaaa gcactacatc 80580
ttccatctgg aggcaatgcc accctcttct cccattttca ctgccatccc taagaggcag 80640
tgcttcccca aaaggttcca tagcagcctg cctacagcaa ctctgttcac acgagtttca 80700
gcatccttgc agtggctccc ctgccatgct gtggctcttc attcaccctc ttctcctgct 80760
ccccgtgaca ggcatagatt ctgagtgatc tggatacatt gctttgttta ataacattac 80820
agcttctgtg ctgaaaaaga tacagcagat agagaaggca attgttgaac acaaaatagt 80880
gacagcagag atgacggcaa gttggcattt ttcttttcta gcaataaaac ttaaagctga 80940
ctcaaggaga aatggaaatc ataattggaa cagtaatcct caagaaagca ttaagattat 81000
taaataattg ccctcacaga tgacttcagg ccaagatggc tttatgggtg aagtttagac 81060
tttcacaaaa ctaatcagtt cccataagaa ctgctccagg atttggagga acatgggaaa 81120
gtctattaaa gggatcacaa ttcacagtcc ccagagtaaa acatgggcta acttgcattt 81180
tggcaaagag ccaaatgtta taaatgacat cctagaaggc caaattctgt ccatctcgtt 81240
gaacaaggac ttacaccagg aatttagaac tatttatagc tcatcccacc actcaggcca 81300
atgatgaccc atgatcatct caccagaaat ggaaagactc agatgattaa tagagtctca 81360
atttctctga gacatctaag agcccagccc aagcccagac ccaggagggc acccaggcct 81420
ggacagagaa cactgatatc acaccagccc tccagaggga agcagagact ccttcaagct 81480
ctggaaacac aggcccagac agctgcccaa agttgggcag gcttcactgc aaacccaaat 81540
catgaagcta ggtaacacct ttacagattc tttacattta aaaatcatca aaacaagagt 81600
aaataataaa ctcaaataat attaatctaa tatgtaaagg tcttgtacca ttattatgca 81660
aacaacatac ataagctaat aagaaaaaga acaaatccct taagaaatcg gcaaaaagga 81720
tataacacaa tttctaaaag aaaacaaatg gctagcacac ataaggaaaa cactttgtga 81780
acagacattc ttcagaacat tatttataat tataaaatag ttgaaagcaa gatagtgcct 81840
gaagaaatta tggtgcatac attagtggga ctattctgca aacattccca attatacttg 81900
tcacatatct gtgataacgt gacagccagc attcatgggg tgacctcatt tggtaaaagg 81960
gtgcaaagct caacacgcat tgtgagatga ctgtggtgta aaattagtgg gattattccg 82020
caaacattcc caattatact taccgcatat ctgtgataac atgacagcat tcatggggtg 82080
acctcatttg gtaaaagggt gcaaagctca acacgcattg tgagatgact ggtgtaaata 82140
caaagaccaa actgtgaaaa ggagtccatc aattaatcga tgcttacctt cagttttggg 82200
ctaattttta aagtatgcta taagcatatg ctcctgttat aacagaatgg agggattatg 82260
agagatgatg caggtgtgtc ctgggcctcc cctggcccac tgggccctag agatgccttc 82320
ccaggcatcg ctgtcagggc ttccctcaga gggagtcctg tattgacctc accaccaagg 82380
tctggagcag gggatcctta gatattggtt ggggttatct caccttaggt ctgaatatgg 82440
ggttgtctta gactgttttg tgctgttaga atagaatacc caagactggg aaatttatac 82500
tgaacggaaa tttatttctc acagttctag aggctgtgaa gtccaagagc acaggtgcca 82560
gagcaagtcc aagagcaagg gaaagtccaa agcaagtcca ggagcatctg gcgaggacct 82620
tcttgctgtg tcatcacatg gcggaaggca agaaagagag caagaggggg ccgaactcac 82680
ccttttataa cagcaccaat cccacccatg aggtggggac cttatgacct aatcactctt 82740
catactgtta caatggcaat gaaatttcaa catgagtttt ggaggagaga agcattcaaa 82800
ccacagcaag ggtgctccta cctcctctct cagggcatct gcagaaagag ctgcaactgc 82860
acgtccttcc tccgtccatc ctccatccct tcccaatgtc cgtgcatatc ctgtgaccca 82920
ggaggtctgg catagggggt gctcctgcct taggtctgag gccctgtctg aagaggggta 82980
ggtgaggagg ccatctgatg gtctgggcca agacagtcac aggacgcatc atttatcatc 83040
aaggaggctg agggttgagt ctccaggtcc agggaactcc ccacaaagtg ggaaccctgc 83100
ccagctccac acagcctctg ctgggggacc ctgctctggt gcagagcctg gggacaggtc 83160
ttgagctcag ccagagtctg cctccctgtc atttaggaac taaaccaagc ggcaggatgc 83220
tggagcccag cccccatctg accttacagg gccaaggctg gggccctggg ttcccctcaa 83280
ggcgcagcag gactggagcc ccaggcagtg caggagtggc caaagctggg gcttcctcca 83340
gagcccccaa gcatcacggc accaagaagg gtaggaccct ggcctgagga attggcacca 83400
aagccccaga aactaccctg gacaccatgg agagaggcct ggaggggaag caccaggcac 83460
tgcctcccct tctgatccca cctgaggtgg ctgccaagcc cagagagccg ctctgatgtc 83520
ccccagccct gcagcccagg gatacctgta ctgtgcccct gggggacccc tggccagtct 83580
gtgcaaagaa gtcaccaccc tacactcaga gacagtgggg gtcctcgtcc cacatcctca 83640
gagcatggcc cggctgctgc agggatggtc tcctggtcct cagagcatgg cccggctgct 83700
gcagggatgg tctcctggtc ctcagagcat ggcccagctg ctgcagggat ggtctcctgg 83760
aggcccccca gtgctctatt gtcagggctc cctccacccc cccgcaccaa gagagagcca 83820
gaccccagca aggcttccag tggcttcagg tcacacccct aggctgaccc cagccccatt 83880
aacacctgcc tgagaaagct ccacgcacca gaactgaccg tctgctccaa ctcttgacct 83940
cccgttctca gggcgtctgc tgaaaaggct gcaactgcac atccttcctc cgtccgttcc 84000
cgatgtccgt gtgtctcctg tggccaggaa ggtctttctc gggacctgag agccgctccc 84060
tgaagtgtcc ccattgggaa ggatggggcc tgtgtctcca ggctctggga ggacagaatc 84120
ctgacctcaa cagtggccgg cacggacaca actggcccca tcccggggac gctgaccagc 84180
gctgggcaac ttttcccttc cccgacgact gagccccgag caccctccct gctcccctac 84240
cacctccctt tacaaggctg tggcctctgc acagatgata atggagcttg gctcattccc 84300
ctagagtcgg tagggagtta aggacaaaac tcagtttcct ccacctgaac tcaagtctgc 84360
ctatgtttac ctaatcacac ctggtggaca gtttggacaa acttgcacac tcagagacac 84420
agacacttct agaaatcatt atctccctgc cccggggacc ccactccagc agaagtctgc 84480
taggcactgg cctgggccct cctgctgtcc taggaggctg ctgacctcct gcctggctcc 84540
tgtccccagg tccagagtca gagcagactc cagggacgct gcaggctagg aagccgcccc 84600
ctccaggcca gggtctagtg caggtgccca ggacaagaaa gattgtgaat gcaggaatga 84660
ctgggccaca cccctcccgt gcacgccccc tcttgccctg caccccacag cccagccccc 84720
cgtgctggat gcccccccac agcagaggtg ctgttctgtg atcccctggg aaagacgccc 84780
tcaacctcca ccctgtccca cggcccaagg aagacaagac acaggccctc tcctcacagt 84840
ctccccacct ggctcctgct gggaccctca aggtgtgaac agggaggatg gttgtctggg 84900
tggcccctag gagcccagat cttcactcta cagaccccaa cccaagcacc cccttctgca 84960
gggcccagct catccccctc ctcctccctc tgctctcctc tcgtcgcctc tacgggaaat 85020
ccgggactca gcagtaaccc tcaggaagca gggcccaggc gccgtttaat aggaggcttc 85080
ctcacaatga aacttttaga aagccttgac tacaatgatg accttggtgt ggctgtgaac 85140
actgtcagct cccacagctg ctgcagcaaa aaatgtccat agacagggtg ggggcccggg 85200
gtcgtctgct gtcctgctca gcccacagca cgcatggagg atctgaggtg ccacacctga 85260
cgcccaggcc agaacatgcc tccctccagg gtgacctgcc atgtcctgca ttgctggagg 85320
gacaggggca gcctatgagg atctggggcc aggagatgaa tcctattaac ccagaggaaa 85380
actaacagga cccaagcacc ctccccgttg aagctgacct gcccagaggg gcctgggccc 85440
accccacaca ccggggcgga atgtgtacag gccccggtct ctgtgggtgt tccgctaact 85500
ggggctccca gtgctcaccc cacaactaaa gcgagcccca gcctccagag cccccgaagg 85560
agatgccgcc cacaagccca gcccccatcc aggaggcccc agagctcagg gcgccggggc 85620
agattctgaa cagccccgag tcacggtggg tacaactgga acgaccaccg tgagaaaaac 85680
tgtgtccaaa actgtctcct ggcccctgct ggaggccgcg ccagagaggg gagcagccgc 85740
cccgaaccta ggtcctgctc agctcacacg acccccagca cccagagcac aacggagtcc 85800
ccattgaatg gtgaggacgg ggaccagggc tccagggggt catggaaggg gctggacccc 85860
atcctactgc tatggtccca gtgctcctgg ccagaactga ccctaccacc gacaagagtc 85920
cctcagggaa acgggggtca ctggcacctc ccagcatcaa ccccaggcag cacaggcata 85980
aaccccacat ccagagccga ctccaggagc agagacaccc cagtaccctg ggggacaccg 86040
accctgatga ctccccactg gaatccaccc cagagtccac caggaccaaa gaccccgccc 86100
ctgtctctgt ccctcactca ggacctgctg cggggcgggc catgagacca gactcgggct 86160
tagggaacac cactgtggcc ccaacctcga ccaggccaca ggcccttcct tcctgccctg 86220
cggcagcaca gactttgggg tctgtgcaga gaggaatcac agaggcccca ggctgaggtg 86280
gtgggggtgg aagaccccca ggaggtggcc cacttccctt cctcccagct ggaacccacc 86340
atgaccttct taagataggg gtgtcatccg aggcaggtcc tccatggagc tcccttcagg 86400
ctcctccccg gtcctcacta ggcctcagtc ccggctgcgg gaatgcagcc accacaggca 86460
caccaggcag cccagaccca gccagcctgc agtgcccaag cccacattct ggagcagagc 86520
aggctgtgtc tgggagagtc tgggctcccc accgcccccc cgcacacccc acccacccct 86580
gtccaggccc tatgcaggag ggtcagagcc ccccatgggg tatggactta gggtctcact 86640
cacgtggctc ccctcctggg tgaaggggtc tcatgcccag atccccacag cagagctggt 86700
caaaggtgga ggcagtggcc ccagggccac cctgacctgg accctcaggc tcctctagcc 86760
ctggctgccc tgctgtccct gggaggcctg gactccacca gaccacaggt ccagggcacc 86820
gcccataggt gctgcccaca ctcagttcac aggaagaaga taagctccag acccccaaga 86880
ctgggacctg ccttcctgcc accgcttgta gctccagacc tccgtgcctc ccccgaccac 86940
ttacacacgg gccagggagc tgttccacaa agatcaaccc caaaccggga ccgcctggca 87000
ctcgggccgc tgccacttcc ctctccattt gttcccagca cctctgtgct ccctccctcc 87060
tccctccttc aggggaacag cctgtgcagc ccctccctgc accccacacc ctggggaggc 87120
ccaaccctgc ctccagccct ttctcccccg ctgctcttcc tgcccatcca gacaaccctg 87180
gggtcccatc cctgcagcct acaccctggt ctccacccag acccctgtct ctccctccag 87240
acacccctcc caggccaacc ctgcacatgc aggccctccc cttttctgct gccagagcct 87300
cagtttctac cctctgtgcc taccccctgc ctcctcctgc ccacaactcg agctcttcct 87360
ctcctggggc ccctgagcca tggcactgac cgtgcactcc cacccccaca ctgcccatgc 87420
cctcaccttc ctcctggaca ctctgacccc gctcccctct tggacccagc cctggtattt 87480
ccaggacaaa ggctcaccca agtcttcccc atgcaggccc ttgccctcac tgcccggtta 87540
cacggcagcc tcctgtgcac agaagcaggg agctcagccc ttccacaggc agaaggcact 87600
gaaagaaatc ggcctccagc accctgatgc acgtccgcct gtgtctctca ctgcccgcac 87660
ctgcagggag gctcggcact ccctgtaaag acgagggatc caggcagcaa catcatggga 87720
gaatgcaggg ctcccagaca gcccagccct ctcgcaggcc tctcctggga agagacctgc 87780
agccaccact gaacagccac ggagcccgct ggatagtaac tgagtcagtg accgacctgg 87840
agggcagggg agcagtgaac cggagcccag accataggga cagagaccag ccgctgacat 87900
cccgagcccc tcactggcgg ccccagaaca ccgcgtggaa acagaacaga cccacattcc 87960
cacctggaac agggcagaca ctgctgagcc cccagcacca gccctgagaa acaccaggca 88020
acggcatcag agggggctcc tgagaaagaa aggaggggag gtctccttca ccagcaagta 88080
cttcccttga ccaaaaacag ggtccacgca actcccccag gacaaaggag gagccccctg 88140
tacagcactg ggctcagagt cctctcccac acaccctgag tttcagacaa aaaccccctg 88200
gaaatcatag tatcagcagg agaactagcc agagacagca agaggggact cagtgactcc 88260
cgcggggaca ggaggatttt gtgggggctc gtgtcactgt gaggatattg tagtagtacc 88320
agctgctata cccacagtga cacagcccca ttcccaaagc cctgctgtaa acgcttccac 88380
ttctggagct gaggggctgg ggggagcgtc tgggaagtag ggcctagggg tggccatcaa 88440
tgcccaaaac gcaccagact cccccccaga catcacccca ctggccagtg agcagagtaa 88500
acagaaaatg agaagcagct gggaagcttg cacaggcccc aaggaaagag ctttggcggg 88560
tgtgcaagag gggatgcggg cagagcctga gcagggcctt ttgctgtttc tgctttcctg 88620
tgcagatagt tccataaact ggtgttcaag atcgatggct gggagtgagc ccaggaggac 88680
agtgtgggaa gggcacaggg aaggagaagc agccgctatc ctacactgtc atctttcaag 88740
agtttgccct gtgcccacaa tgctgcatca tgggatgctt aacagctgat gtagacacag 88800
ctaaagagag aatcagtgaa atggatttgc agcacagatc tgaataaatt ctccagaatg 88860
tggagccaca cagaagcaag cacaaggaaa gtgcctgatg caagggcaaa gtacagtgtg 88920
taccttcagg ctgggcacag acactctgaa aagccttggc aggaactccc tgcaacaaag 88980
cagagccctg caggcaatgc cagctccaga gccctccctg agagcctcat gggcaaagat 89040
gtgcacaaca ggtgtttctc atagccccaa actgagaatg aagcaaacag ccatctgaag 89100
gaaaacaggc aaataaacga tggcaggttc atgaaatgca aacccagaca gccagaagga 89160
caacagtgag ggttacaggt gactctgtgg ttgagttcat gacaatgctg agtaattgga 89220
gtaacaaagg aaagtccaaa aaatactttc aatgtgattt cttctaaata aaatttacag 89280
ccggcaaaat gaactatctt cttaagggat aaactttcca ctaggaaaac tataaggaaa 89340
atcaagaaaa ggatgatcac ataaacacag tggtcgttac ttctactggg gaaggaagag 89400
ggtatgaact gagacacaca gggttggcaa gtctcctaac aagaacagaa caaatacatt 89460
acagtacctt gaaaacagca gttaaaattc taaattgcaa gaagaggaaa atgcacacag 89520
ctgtgtttag aaaattctca gtccagcact gttcataata gcaaagacat taacccaggt 89580
tggataaata aacgatgaca caggcaattg cacaatgata cagacataca ttcagtatat 89640
gagacattga tgatgtatcc ccaaagaaat gactttaaag agaaaaggcc tgatatgtgg 89700
tggcactcac ctccctgggc atccccggac aggctgcagg cacactgtgt ggcagggcag 89760
gctggtacct gctggcagct cctggggcct gatgtggagc aggcacagag ccgtatcccc 89820
ccgaggacat atacccccaa ggacggcaca gttggtacat tccggagaca agcaactcag 89880
ccacactccc aggccagagc ccgagaggga cgcccatgca cagggaggca gagcccagct 89940
cctccacagc cagcagcacc cgtgcagggg ccgccatctg gcaggcacag agcatgggct 90000
gggaggaggg gcagggacac caggcagggt tggcaccaac tgaaaattac agaagtctca 90060
tacatctacc tcagccttgc ctgacctggg cctcacctga cctggacctc acctggcctg 90120
gacctcacct ggcctagacc tcacctctgg gcttcacctg agctcggcct cacctgactt 90180
ggaccttgcc tgtcctgagc tcacatgatc tgggcctcac ctgacctggg tttcacctga 90240
cctgggcttc acctgacctg ggcctcatct gacctgggcc tcactggcct ggacctcacc 90300
tggcctgggc ttcacctggc ctcaggcctc atctgcacct gctccaggtc ttgctggaac 90360
ctcagtagca ctgaggctgc aggggctcat ccagggttgc agaatgactc tagaacctcc 90420
cacatctcag ctttctgggt ggaggcacct ggtggcccag ggaatataaa aagcctgaat 90480
gatgcctgcg tgatttgggg gcaatttata aacccaaaag gacatggcca tgcagcgggt 90540
agggacaata cagacagata tcagcctgaa atggagcctc agggcacagg tgggcacgga 90600
cactgtccac ctaagccagg ggcagacccg agtgtccccg cagtagacct gagagcgctg 90660
ggcccacagc ctcccctcgg tgccctgcta cctcctcagg tcagccctgg acatcccggg 90720
tttccccagg cctggcggta ggtttggggt gaggtctgtg tcactgtggt attacgattt 90780
ttggagtggt tattataccc acagtgtcac agagtccatc aaaaacccat ccctgggaac 90840
cttctgccac agccctccct gtggggcacc gccgcgtgcc atgttaggat tttgactgag 90900
gacacagcac catgggtatg gtggctaccg cagcagtgca gcccgtgacc caaacacaca 90960
gggcagcagg cacaacagac aagcccacaa gtgaccaccc tgagctcctg cctgccagcc 91020
ctggagacca tgaaacagat ggccaggatt atcccatagg tcagccagac ctcagtccaa 91080
caggtctgca tcgctgctgc cctccaatac cagtccggat ggggacaggg ctggcccaca 91140
ttaccatttg ctgccatccg gccaacagtc ccagaagccc ctccctcaag gctgggccac 91200
atgtgtggac cctgagagcc ccccatgtct gagtaggggc accaggaagg tggggctggc 91260
cctgtgcact gtccctgccc ctgtggtccc tggcctgcct ggccctgaca cctgggcctc 91320
tcctgggtca tttccaagac agaagacatt cccaggacag ctggagctgg gagtccatca 91380
tcctgcctgg ccgtcctgag tcctgcgcct ttccaaacct cacccgggaa gccaacagag 91440
gaatcacctc ccacaggcag agacaaagac cttccagaaa tctctgtctc tctccccagt 91500
gggcaccctc ttccagggca gtcctcagtg atatcacagt gggaacccac atctggatcg 91560
ggactgcccc cagaacacaa gatggcccac agggacagcc ccacagccca gcccttccca 91620
gacccctaaa aggcgtccca ccccctgcat ctgccccagg gctcaaactc caggaggact 91680
gactcctgca caccctcctg ccagacatca cctcagcccc tcctggaagg gacaggagcg 91740
cgcaagggtg agtcagaccc tcctgccctc gatggcaggc ggagaagatt cagaaaggtc 91800
tgagatcccc aggacgcagc accactgtca atgggggccc cagacgcctg gaccagggcc 91860
tgcgtgggaa aggcctctgg gcacactcag gggctttttg tgaagggtcc tcctactgtg 91920
tgactacagt aactaccaca gtgatgaacc cagcagcaaa aactgaccgg actcccaagg 91980
tttatgcaca cttctccgct cagagctctc caggatcaga agagccgggc ccaagggttt 92040
ctgcccagac cctcggcctc tagggacatc ttggccatga cagcccatgg gctggtgccc 92100
cacacatcgt ctgccttcaa acaagggctt cagagggctc tgaggtgacc tcactgatga 92160
ccacaggtgc cctggcccct tccccaccag ctgcaccaga ccccgtcatg acagatgccc 92220
cgattccaac agccaattcc tggggccagg aatcgctgta gacaccagcc tccttccaac 92280
acctcctgcc aattgcctgg attcccatcc cggttggaat caagaggaca gcatccccca 92340
ggctcccaac aggcaggact cccacaccct cctctgagag gccgctgtgt tccgtagggc 92400
caggctgcag acagtccccc tcacctgcca ctagacaaat gcctgctgta gatgtcccca 92460
cctggaaaat accactcatg gagcccccag ccccaggtac agctgtagag agagtctctg 92520
aggcccctaa gaagtagcca tgcccagttc tgccgggacc ctcggccagg ctgacaggag 92580
tggacgctgg agctgggccc atactgggcc acataggagc tcaccagtga gggcaggaga 92640
gcacatgccg gggagcaccc agcctcctgc tgaccagagg cccgtcccag agcccaggag 92700
gctgcagagg cctctccagg gggacactgt gcatgtctgg tccctgagca gccccccacg 92760
tccccagtcc tgggggcccc tggcacagct gtctggaccc tctctattcc ctgggaagct 92820
cctcctgaca gccccgcctc cagttccagg tgtggttatt gtcagggggt gtcagactgt 92880
ggtggataca gctatggtta ccacagtggt gctgcccata gcagcaacca ggccaagtag 92940
acaggcccct gctgtgcagc cccaggcctc cagctcacct gcttctcctg gggctctcaa 93000
ggctgctgtt ttctgcactc tcccctctgt ggggagggtt ccctcagtgg gagatctgtt 93060
ctcaacatcc cacggcctca ttcctgcaag gaaggccaat ggatgggcaa cctcacatgc 93120
cgcggctaag atagggtggg cagcctggcg gggacaggac atcctgctgg ggtatctgtc 93180
actgtgccta gtggggcact ggctcccaaa caacgcagtc cttgccaaaa tccccacggc 93240
ctcccccgct aggggctggc ctgatctcct gcagtcctag gaggctgctg acctccagaa 93300
tggctccgtc cccagttcca gggcgagagc agatcccagg ccggctgcag actgggaggc 93360
caccccctcc ttcccagggt tcactgcagg tgaccagggc aggaaatggc ctgaacacag 93420
ggataaccgg gccatccccc aacagagtcc accccctcct gctctgtacc ccgcaccccc 93480
caggccagcc catgacatcc gacaacccca caccagagtc actgcccggt gctgccctag 93540
ggaggacccc tcagccccca ccctgtctag aggactgggg aggacaggac acgccctctc 93600
cttatggttc ccccacctgg ctctggctgg gacccttggg gtgtggacag aaaggacgct 93660
tgcctgattg gcccccagga gcccagaact tctctccagg gaccccagcc cgagcacccc 93720
cttacccagg acccagccct gcccctcctc ccctctgctc tcctctcatc accccatggg 93780
aatccagaat ccccaggaag ccatcaggaa gggctgaggg aggaagtggg gccactgcac 93840
caccaggcag gaggctctgt ctttgtgaac ccagggaggt gccagcctcc tagagggtat 93900
ggtccaccct gcctatggct cccacagtgg caggctgcag ggaaggacca gggacggtgt 93960
gggggagggc tcagggcccc gcgggtgctc catcttggat gagcctatct ctctcaccca 94020
cggactcgcc cacctcctct tcaccctggc cacacgtcgt ccacaccatc ctaagtccca 94080
cctacaccag agccggcaca gccagtgcag acagaggctg gggtgcaggg gggccgactg 94140
ggcagcttcg gggagggagg aatggaggaa ggggagttca gtgaagaggc ccccctcccc 94200
tgggtccagg atcctcctct gggacccccg gatcccatcc cctccaggct ctgggaggag 94260
aagcaggatg ggagaatctg tgcgggaccc tctcacagtg gaatacctcc acagcggctc 94320
aggccagata caaaagcccc tcagtgagcc ctccactgca gtgctgggcc tgggggcagc 94380
cgctcccaca caggatgaac ccagcacccc gaggatgtcc tgccaggggg agctcagagc 94440
catgaaggag caggatatgg gacccccgat acaggcacag acctcagctc cattcaggac 94500
tgccacgtcc tgccctggga ggaacccctt tctctagtcc ctgcaggcca ggaggcagct 94560
gactcctgac ttggacgcct attccagaca ccagacagag gggcaggccc cccagaacca 94620
gggatgagga cgccccgtca aggccagaaa agaccaagtt gcgctgagcc cagcaaggga 94680
aggtccccaa acaaaccagg aagtttctga aggtgtctgt gtcacagtgg agtatagcag 94740
ctcgtcccac agtgacactc gccaggccag aaaccccatc ccaagtcagc ggaatgcaga 94800
gagagcaggg aggacatgtt taggatctga ggccgcacct gacacccagg ccagcagacg 94860
tctcctgtcc acggcaccct gccatgtcct gcatttctgg aagaacaagg gcaggctgaa 94920
gggggtccag gaccaggaga tgggtccgct ctacccagag aaggagccag gcaggacaca 94980
agccccctcc ccattgaggc tgacctgccc agagggtcct gggcccaccc aacacaccgg 95040
ggcggaatgt gtgcaggcct cggtctctgt gggtgttccg ctagctgggg ctcacagtgc 95100
tcaccccaca cctaaaacga gccacagcct ccggagcccc tgaaggagac cccgcccaca 95160
agcccagccc ccacccagga ggccccagag cacagggcgc cccgtcggat tctgaacagc 95220
cccgagtcac agtgggtata actggaacta ccactgtgag aaaagcttcg tccaaaacgg 95280
tctcctggcc acagtcggag gccccgccag agaggggagc agccacccca aacccatgtt 95340
ctgccggctc ccatgacccc gtgcacctgg agccccacgg tgtccccact ggatgggagg 95400
acaagggccg ggggctccgg cgggtcgggg caggggcttg atggcttcct tctgccgtgg 95460
ccccattgcc cctggctgga gttgaccctt ctgacaagtg tcctcagaga gtcagggatc 95520
agtggcacct cccaacatca accccacgca gcccaggcac aaaccccaca tccagggcca 95580
actccaggaa cagagacacc ccaataccct gggggacccc gaccctgatg actcccgtcc 95640
catctctgtc cctcacttgg ggcctgctgc ggggcgagca cttgggagca aactcaggct 95700
taggggacac cactgtgggc ctgacctcga gcaggccaca gacccttccc tcctgccctg 95760
gtgcagcaca gactttgggg tctgggcagg gaggaacttc tggcaggtca ccaagcacag 95820
agcccccagg ctgaggtggc cccaggggga accccagcag gtggcccact acccttcctc 95880
ccagctggac cccatgtctt ccccaagata ggggtgccat ccaaggcagg tcctccatgg 95940
agcccccttc aggctcctct ccagacccca ctgggcctca gtccccactc taggaatgca 96000
gccaccacgg gcacaccagg cagcccaggc ccagccaccc tgcagtgccc aagcccacac 96060
cctggaggag agcagggtgc gtctgggagg ggctgggctc cccaccccca cccccacctg 96120
cacaccccac ccacccttgc ccgggccccc tgcaggaggg tcagagcccc catgggatat 96180
ggacttaggg tctcactcac gcacctcccc tcctgggaga aggggtctca tgcccagatc 96240
cccccagcag cgctggtcac aggtagaggc agtggcccca gggccaccct gacctggccc 96300
ctcaggctcc tctagccctg gctgccctgc tgtccctggg aggcctgggc tccaccagac 96360
cacaggtcta gggcaccgcc cacactgggg ccgcccacac acagctcaca ggaagaagat 96420
aagctccaga cccccaggcc cgggacctgc cttgctgcta cgacttcctg ccccagacct 96480
cgttgccctc ccccgtccac ttacacacag gccaggaagc tgttcccaca cagaccaacc 96540
ccagacgggg accacctggc actcaggtca ctgccatttc cttctccatt cacttccaat 96600
gcctctgtgc ttcctccctc ctccttcctt cgggggagca ccctgtgcag ctcctccctg 96660
cagtccacac cctggggaga cccgaccctg cagcccacac cctggggaga cctgaccctc 96720
ctccagccct ttctcccccg ctgctcttgc cacccaccaa gacagccctg gggtcctgtc 96780
cctacagccc ccacccagtt ctctacctag acccgtcttc ctccctctaa acacctctcc 96840
caggccaacc ctacacctgc aggccctccc ctccactgcc aaagaccctc agtttctcct 96900
gcctgtgccc acccccgtgc tcctcctgcc cacagctcga gctcttcctc tcctagggcc 96960
cctgagggat ggcattgacc gtgccctcgc acccacacac tgcccatgcc ctcacattcc 97020
tcctggccac tccagcccca ctcccctctc aggcctggct ctggtatttc tgggacaaag 97080
ccttacccaa gtctttccca tgcaggcctg ggcccttacc ctcactgccc ggttacaggg 97140
cagcctcctg tgcacagaag cagggagctc agcccttcca caggcagaag gcactgaaag 97200
aaatcggcct ccagcgcctt gacacacgtc tgcctgtgtc tctcactgcc cgcacctgca 97260
gggaggctcg gcactccctc taaagacgag ggatccaggc agcagcatca caggagaatg 97320
cagggctacc agacatccca gtcctctcac aggcctctcc tgggaagaga cctgaagacg 97380
cccagtcaac ggagtctaac accaaacctc cctggaggcc gatgggtagt aacggagtca 97440
ttgccagacc tggaggcagg ggagcagtga gcccgagccc acaccatagg gccagaggac 97500
agccactgac atcccaagcc actcactggt ggtcccacaa caccccatgg aaagaggaca 97560
gacccacagt cccacctgga ccagggcaga gactgctgag acccagcacc agaaccaacc 97620
aagaaacacc aggcaacagc atcagagggg gctctggcag aacagaggag gggaggtctc 97680
cttcaccagc aggcgcttcc cttgaccgaa gacaggatcc atgcaactcc cccaggacaa 97740
aggaggagcc ccttgttcag cactgggctc agagtcctct ccaagacacc cagagtttca 97800
gacaaaaacc ccctggaatg cacagtctca gcaggagagc cagccagagc cagcaagatg 97860
gggctcagtg acacccgcag ggacaggagg attttgtggg ggctcgtgtc actgtgagga 97920
tattgtacta atggtgtatg ctatacccac agtgacacag ccccattccc aaagccctac 97980
tgcaaacgca ttccacttct ggggctgagg ggctggggga gcgtctggga aatagggctc 98040
aggggtgtcc atcaatgccc aaaacgcacc agactcccct ccatacatca cacccaccag 98100
ccagcgagca gagtaaacag aaaatgagaa gcaagctggg gaagcttgca caggccccaa 98160
ggaaagagct ttggcgggtg tgtaagaggg gatgcgggca gagcctgagc agggcctttt 98220
gctgtttctg ctttcctgtg cagagagttc cataaactgg tgttcgagat caatggctgg 98280
gagtgagccc aggaggacag cgtgggaaga gcacagggaa ggaggagcag ccgctatcct 98340
acactgtcat ctttcgaaag tttgccttgt gcccacactg ctgcatcatg ggatgcttaa 98400
cagctgatgt agacacagct aaagagagaa tcagtgagat ggatttgcag cacagatctg 98460
aataaattct ccagaatgtg gagcagcaca gaagcaagca cacagaaagt gcctgatgca 98520
aggacaaagt tcagtgggca ccttcaggca ttgctgctgg gcacagacac tctgaaaagc 98580
cctggcagga actccctgtg acaaagcaga accctcaggc aatgccagcc ccagagccct 98640
ccctgagagc ctcatgggca aagatgtgca caacaggtgt ttctcatagc cccaaactga 98700
gagcaaagca aacgtccatc tgaaggagaa caggcaaata aacgatggca ggttcatgaa 98760
atgcaaaccc agacagccac aagcacaaaa gtacagggtt ataagcgact ctggttgagt 98820
tcatgacaat gctgagtaat tggagtaaca aagtaaactc caaaaaatac tttcaatgtg 98880
atttcttcta aataaaattt acaccctgca aaatgaactg tcttcttaag ggatacattt 98940
cccagttaga aaaccataaa gaaaaccaag aaaaggatga tcacataaac acagtggtgg 99000
ttacttctgc tggggaagga agagggtatg aactgagata cacagggtgg gcaagtctcc 99060
taacaagaac agaacgaata cattacagta ccttgaaaac agcagttaaa cttctaaatt 99120
gcaagaagag gaaaatgcac acagttgtgt ttagaaaatt ctcagtccag cactgttcat 99180
aatagcaaag acattaaccc aggtcggata aataagcgat gacacaggca attgcacaat 99240
gatacagaca tatatttagt atatgagaca tcgatgatgt atccccaaat aaacgacttt 99300
aaagagataa agggctgatg tgtggtggca ttcacctccc tgggatcccc ggacaggttg 99360
caggctcact gtgcagcagg gcaggcgggt acctgctggc agttcctggg gcctgatgtg 99420
gagcaagcgc agggccatat atcccggagg acggcacagt cagtgaattc cagagagaag 99480
caactcagcc acactcccca ggcagagccc gagagggacg cccacgcaca gggaggcaga 99540
gcccagcacc tccgcagcca gcaccacctg cgcacgggcc accaccttgc aggcacagag 99600
tgggtgctga gaggaggggc agggacacca ggcagggtga gcacccagag aaaactgcag 99660
acgcctcaca catccacctc agcctcccct gacctggacc tcactggcct gggcctcact 99720
taacctgggc ttcacctgac cttggcctca cctgacttgg acctcgcctg tcccaagctt 99780
tacctgacct gggcctcaac tcacctgaac gtctcctgac ctgggtttaa cctgtcctgg 99840
aactcacctg gccttggctt cccctgacct ggacctcatc tggcctgggc ttcacctggc 99900
ctgggcctca cctgacctgg acctcatctg gcctggacct cacctggcct ggacttcacc 99960
tggcctgggc ttcacctgac ctggacctca cctggcctcg ggcctcacct gcacctgctc 100020
caggtcttgc tggagcctga gtagcactga gggtgcagaa gctcatccag ggttggggaa 100080
tgactctaga agtctcccac atctgacctt tctgggtgga ggcagctggt ggccctggga 100140
atataaaaat ctccagaatg atgactctgt gatttgtggg caacttatga acccgaaagg 100200
acatggccat ggggtgggta gggacatagg gacagatgcc agcctgaggt ggagcctcag 100260
gacacaggtg ggcacggaca ctatccacat aagcgaggga tagacccgag tgtccccaca 100320
gcagacctga gagcgctggg cccacagcct cccctcagag ccctgctgcc tcctccggtc 100380
agccctggac atcccaggtt tccccaggcc tggcggtagg tttagaatga ggtctgtgtc 100440
actgtggtat tacgatattt tgactggtta ttataaccac agtgtcacag agtccatcaa 100500
aaacccatgc ctggaagctt cccgccacag ccctccccat ggggccctgc tgcctcctca 100560
ggtcagcccc ggacatcccg ggtttcccca ggctgggcgg taggtttggg gtgaggtctg 100620
tgtcactgtg gtattactat ggttcgggga gttattataa ccacagtgtc acagagtcca 100680
tcaaaaaccc atccctggga gcctcccgcc acagccctcc ctgcagggga ccggtacgtg 100740
ccatgttagg attttgatcg aggagacagc accatgggta tggtggctac cacagcagtg 100800
cagcctgtga cccaaacccg cagggcagca ggcacgatgg acaggcccgt gactgaccac 100860
gctgggctcc agcctgccag ccctggagat catgaaacag atggccaagg tcaccctaca 100920
ggtcatccag atctggctcc gaggggtctg catcgctgct gccctcccaa cgccagtcca 100980
aatgggacag ggacggcctc acagcaccat ctgctgccat caggccagcg atcccagaag 101040
cccctccctc aaggctgggc acatgtgtgg acactgagag ccctcatatc tgagtagggg 101100
caccaggagg gaggggctgg ccctgtgcac tgtccctgcc cctgtggtcc ctggcctgcc 101160
tggccctgac acctgagcct ctcctgggtc atttccaaga cagaagacat tcctggggac 101220
agccggagct gggcgtcgct catcctgccc ggccgtcctg agtcctgctc atttccagac 101280
ctcaccgggg aagccaacag aggactcgcc tcccacattc agagacaaag aaccttccag 101340
aaatccctgc ctctctcccc agtggacacc ctcttccagg acagtcctca gtggcatcac 101400
agcggcctga gatccccagg acgcagcacc gctgtcaata ggggccccaa atgcctggac 101460
cagggcctgc gtgggaaagg cctctggcca cactcgggct ttttgtgaag ggccctcctg 101520
ctgtgtgact acagtaacta ccatagtgat gaacccagtg gcaaaaactg gctggaaacc 101580
caggggctgt gtgcacgcct cagcttggag ctctccagga gcacaagagc cgggcccaag 101640
gatttgtgcc cagaccctca gcctctaggg acacctgggt catctcagcc tgggctggtg 101700
ccctgcacac catcttcctc caaatagggg cttcagaggg ctctgaggtg acctcactca 101760
tgaccacagg tgacctggcc cttccctgcc agctatacca gaccctgtct tgacagatgc 101820
cccgattcca acagccaatt cctgggaccc tgaatagctg tagacaccag cctcattcca 101880
gtacctcctg ccaattgcct ggattcccat cctggctgga atcaagaagg cagcatccgc 101940
caggctccca acaggcagga ctcccgcaca ccctcctctg agaggccgct gtgttccgca 102000
gggccaggcc ctggacagtt cccctcacct gccactagag aaacacctgc cattgtcgtc 102060
cccacctgga aaagaccact cgtggagccc ccagccccag gtacagctgt agagacagtc 102120
ctcgaggccc ctaagaagga gccatgccca gttctgccgg gaccctcggc caggccgaca 102180
ggagtggacg ctggagctgg gcccacactg ggccacatag gagctcacca gtgagggcag 102240
gagagcacat gccggggagc acccagcctc ctgctgacca gaggcccgtc ccagagccca 102300
ggaggctgca gaggcctctc cagggagaca ctgtgcatgt ctggtaccta agcagccccc 102360
cacgtcccca gtcctggggg cccctggctc agctgtctgg gccctccctg ctccctggga 102420
agctcctcct gacagccccg cctccagttc caggtgtggt tattgtcagg cgatgtcaga 102480
ctgtggtgga tatagtggct acgattacca cagtggtgcc gcccatagca gcaaccaggc 102540
caagtagaca ggcccctgct gcgcagcccc aggcatccac ttcacctgct tctcctgggg 102600
ctctcaaggc tgctgtctgt cctctggccc tctgtgggga gggttccctc agtgggaggt 102660
ctgtgctcca gggcagggat gattgagata gaaatcaaag gctggcaggg aaaggcagct 102720
tcccgccctg agaggtgcag gcagcaccac ggagccacgg agtcacagag ccacggagcc 102780
cccattgtgg gcatttgaga gtgctgtgcc cccggcaggc ccagccctga tggggaagcc 102840
tgtcccatcc cacagcccgg gtcccacggg cagcgggcac agaagctgcc aggttgtcct 102900
ctatgatcct catccctcca gcagcatccc ctccacagtg gggaaactga ggcttggagc 102960
accacccggc cccctggaaa tgaggctgtg agcccagaca gtgggcccag agcactgtga 103020
gtaccccggc agtacctggc tgcagggatc agccagagat gccaaaccct gagtgaccag 103080
cctacaggag gatccggccc cacccaggcc actcgattaa tgctcaaccc cctgccctgg 103140
agacctcttc cagtaccacc agcagctcag cttctcaggg cctcatccct gcaaggaagg 103200
tcaagggctg ggcctgccag aaacacagca ccctccctag ccctggctaa gacagggtgg 103260
gcagacggct gtggacggga catattgctg gggcatttct cactgtcact tctgggtggt 103320
agctctgaca aaaacgcaga ccctgccaaa atccccactg cctcccgcta ggggctggcc 103380
tggaatcctg ctgtcctagg aggctgctga cctccaggat ggctccgtcc ccagttccag 103440
ggcgagagca gatcccaggc aggctgtagg ctgggaggcc acccctgccc ttgccggggt 103500
tgaatgcagg tgcccaaggc aggaaatggc atgagcacag ggatgaccgg gacatgcccc 103560
accagagtgc gccccttcct gctctgcacc ctgcaccccc caggccagcc cacgacgtcc 103620
aacaactggg cctgggtggc agccccaccc agacaggaca gacccagcac cctgaggagg 103680
tcctgccagg gggagctaag agccatgaag gagcaagata tggggccccc gatacaggca 103740
cagatgtcag ctccatccag gaccacccag cccacaccct gagaggaacg tctgtctcca 103800
gcctctgcag gtcgggaggc agctgacccc tgacttggac ccctattcca gacaccagac 103860
agaggcgcag gccccccaga accagggttg agggacgccc cgtcaaagcc agacaaaacc 103920
aaggggtgtt gagcccagca agggaaggcc cccaaacaga ccaggaggtt tctgaaggtg 103980
tctgtgtcac agtggggtat agcagcagct ggtaccacag tgacactcac ccagccagaa 104040
accccattcc aagtcagcgg aagcagagag agcagggagg acacgtttag gatctgagac 104100
tgcacctgac acccaggcca gcagacgtct cccctccagg gcaccccacc ctgtcctgca 104160
tttctgcaag atcaggggcg gcctgagggg gggtctaggg tgaggagatg ggtcccctgt 104220
acaccaagga ggagttaggc aggtcccgag cactctcccc attgaggctg acctgcccag 104280
agagtcctgg gcccacccca cacaccgggg cggaatgtgt gcaggcctcg gtctctgtgg 104340
gtgttccgct agctggggct cacagtgctc accccacacc taaaatgagc cacagcctcc 104400
ggagcccccg caggagaccc cgcccacaag cccagccccc acccaggagg ccccagagct 104460
cagggcgccc cgtcggattc cgaacagccc cgagtcacag cgggtataac cggaaccacc 104520
actgtcagaa tagctacgtc aaaaactgtc cagtggccac tgccggaggc cccgccagag 104580
agggcagcag ccactctgat cccatgtcct gccggctccc atgaccccca gcacgcggag 104640
ccccacagtg tccccactgg atgggaggac aagagctggg gattccggcg ggtcggggca 104700
ggggcttgat cgcatccttc tgccgtggct ccagtgcccc tggctggagt tgacccttct 104760
gacaagtgtc ctcagagaga caggcatcac cggcgcctcc caacatcaac cccaggcagc 104820
acaggcacaa accccacatc cagagccaac tccaggagca gagacacccc aataccctgg 104880
gggaccccga ccctgatgac ttcccactgg aattcgccgt agagtccacc aggaccaaag 104940
accctgcctc tgcctctgtc cctcactcag gacctgctgc cgggcgaggc cttgggagca 105000
gacttgggct taggggacac cagtgtgacc ccgaccttga ccaggacgca gacctttcct 105060
tcctttcctg gggcagcaca gactttgggg tctgggccag gaggaacttc tggcaggtcg 105120
ccaagcacag aggccacagg ctgaggtggc cctggaaaga cctccaggag gtggccactc 105180
cccttcctcc cagctggacc ccatgtcctc cccaagataa gggtgccatc caaggcaggt 105240
gctccttgga gccccattca gactcctccc tggaccccac tgggcctcag tcccagctct 105300
ggggatgaag ccaccacaag cacaccaggc agcccaggcc cagccaccct gcagtgccca 105360
agcacacact ctggagcaga gcagggtgcc tctgggaggg gctgagctcc ccaccccacc 105420
cccacctgca caccccaccc acccctgccc agcggctctg caggagggtc agagccccac 105480
atggggtatg gacttagggt ctcactcacg tggctcccat catgagtgaa ggggcctcaa 105540
gcccaggttc ccacagcagc gcctgtcgca agtggaggca gaggcccgag ggccaccctg 105600
acctggtccc tgaggttcct gcagcccagg ctgccctgct gtccctggga ggcctgggct 105660
ccaccagacc acaggtccag ggcaccgggt gcaggagcca cccacacaca gctcacagga 105720
agaagataag ctccagaccc ccagggccag aacctgcctt cctgctactg cttcctgccc 105780
cagacctggg cgccctcccc cgtccactta cacacaggcc aggaagctgt tcccacacag 105840
aacaacccca aaccaggacc gcctggcact caggtggctg ccatttcctt ctccatttgc 105900
tcccagcgcc tctgtcctcc ctggttcctc cttcggggga acagcctgtg cagccagtcc 105960
ctgcagccca caccctgggg agacccaacc ctgcctgggg cccttccaac cctgctgctc 106020
ttactgccca cccagaaaac tctggggtcc tgtccctgca gtccctaccc tggtctccac 106080
ccagacccct gtgtatcact ccagacaccc ctcccaggca aaccctgcac ctgcaggccc 106140
tgtcctcttc tgtcgctaga gcctcagttt ctcccccctg tgcccacacc ctacctcctc 106200
ctgcccacaa ctctaactct tcttctcctg gagcccctga gccatggcat tgaccctgcc 106260
ctcccaccac ccacagccca tgccctcacc ttcctcctgg ccactccgac cccgccccct 106320
ctcaggccaa gccctggtat ttccaggaca aaggctcacc caagtctttc ccaggcaggc 106380
ctgggctctt gccctcactt cccggttaca cgggagcctc ctgtgcacag aagcagggag 106440
ctcagccctt ccacaggcag aaggcactga aagaaatcgg cctccagcac cttgacacac 106500
gtccgcccgt gtctctcact gcccgcacct gcagggaggc tccgcactcc ctctaaagac 106560
aagggatcca ggcagcagca tcacgggaga atgcagggct cccagacatc ccagtcctct 106620
cacaggcctc tcctgggaag agacctgcag ccaccaccaa acagccacag aggctgctgg 106680
atagtaactg agtcaatgac cgacctggag ggcaggggag cagtgagccg gagcccatac 106740
catagggaca gagaccagcc gctgacatcc cgagctcctc aatggtggcc ccataacaca 106800
cctaggaaac ataacacacc cacagcccca cctggaacag ggcagagact gctgagcccc 106860
cagcaccagc cccaagaaac accaggcaac agtatcagag ggggctcccg agaaagagag 106920
gaggggagat ctccttcacc atcaaatgct tcccttgacc aaaaacaggg tccacgcaac 106980
tcccccagga caaaggagga gccccctata cagcactggg ctcagagtcc tctctgagac 107040
accctgagtt tcagacaaca acccgctgga atgcacagtc tcagcaggag aacagaccaa 107100
agccagcaaa agggacctcg gtgacaccag tagggacagg aggattttgt gggggctcgt 107160
gtcactgtga ggatattgta gtggtggtag ctgctactcc cacagtgaca cagacccatt 107220
cccaaagccc tactgcaaac acacccactc ctggggctga ggggctgggg gagcgtctgg 107280
gaagtagggt ccaggggtgt ctatcaatgt ccaaaatgca ccagactccc cgccaaacac 107340
caccccacca gccagcgagc agggtaaaca gaaaatgaga ggctctggga agcttgcaca 107400
ggccccaagg aaagagcttt ggcgggtgtg caagagggga tgcaggcaga gcctgagcag 107460
ggccttttgc tgtttctgct ttcctgtgca gagagttcca taaactggtg ttcaagatca 107520
gtggctggga atgagcccag gagggcagtc tgtgggaaga gcacagggaa ggaggagcag 107580
ccgctatcct acactgtcat ctttcaaaag tttgccttgt gaccacacta ttgcatcatg 107640
ggatgcttaa gagctgatgt agacacagct aaagagagaa tcagtgagat gaatttgcag 107700
catagatctg aataaactct ccagaatgtg gagcagtaca gaagcaaaca cacagaaagt 107760
gcctgatgca aggacaaagt tcagtgggca ccttcaggca ttgctgctgg gcacagacac 107820
tctgaaaagc cttggcagga tctccctgcg acaaagcaga accctcaggc aatgccagcc 107880
ccagagccct ccctgagagc gtcatgggga aagatgtgca gaacagctga ttatcataga 107940
ctcaaactga gaacagagca aacgtccatc tgaagaacag tcaaataagc aatggtaggt 108000
tcatgcaatg caaacccaga cagccagggg acaacagtag agggctacag gcggctttgc 108060
ggttgagttc atgacaatgc tgagtaattg gagtaacaga ggaaagccca aaaaatactt 108120
ttaatgtgat ttcttctaaa taaaatttac accaggcaaa atgaactgtc ttcttaaggg 108180
ataaactttc ccctggaaaa actacaagga aaattaagaa aacgatgatc acataaacac 108240
agttgtggtt acttctactg gggaaggaag agggtatgag ctgagacaca cagagtcggc 108300
aagtctccaa gcaagcacag aacgaataca ttacagtacc ttgaatacag cagttaaact 108360
tctaaatcgc aagaacagga aaatgcacac agctgtgttt agaaaattct cagtccagca 108420
ctattcataa tagcaaagac attaacccag gttggataaa taaatgatga cacaggcaat 108480
tgcacaatga tacagacata catttagtac atgagacatc gatgatgtat ccccaaagaa 108540
atgactttaa agagaaaagg cctgatgtgt ggtggcactc acctccctgg gatccccgga 108600
caggttgcag gcacactgtg tggcagggca ggctggtaca tgctggcagc tcctggggcc 108660
tgatgtggag caagcgcagg gctgtatacc cccaaggatg gcacagtcag tgaattccag 108720
agagaagcag ctcagccaca ctgcccaggc agagcccgag agggacgccc acgtacaggg 108780
aggcagagcc cagctcctcc acagccacca ccacctgtgc acgggccacc accttgcagg 108840
cacagagtgg gtgctgagag gaggggcagg gacaccaggc agggtgagca cccagagaaa 108900
actgcagaag cctcacacat ccacctcagc ctcccctgac ctggacctca cctggtctgg 108960
acctcacctg gcctgggcct cacctgacct ggacctcacc tggcctgggc ttcacctgac 109020
ctggacctca cctggcctcc ggcctcacct gcacctgctc caggtcttgc tggaacctga 109080
gtagcactga ggctgcagaa gctcatccag ggttggggaa tgactctgga actctcccac 109140
atctgacctt tctgggtgga ggcatctggt ggccctggga atataaaaag ccccagaatg 109200
gtgcctgcgt gatttggggg caatttatga acccgaaagg acatggccat ggggtgggta 109260
gggacatagg gacagatgcc agcctgaggt ggagcctcag gacacagttg gacgcggaca 109320
ctatccacat aagcgaggga cagacccgag tgttcctgca gtagacctga gagcgctggg 109380
cccacagcct cccctcggtg ccctgctgcc tcctcaggtc agccctggac atcccgggtt 109440
tccccaggcc agatggtagg tttgaagtga ggtctgtgtc actgtggtat tatgattacg 109500
tttgggggag ttatcgttat acccacagca tcacacggtc catcagaaac ccatgccaca 109560
gccctccccg caggggaccg ccgcgtgcca tgttacgatt ttgatcgagg acacagcgcc 109620
atgggtatgg tggctaccac agcagtgcag cccatgaccc aaacacacag ggcagcaggc 109680
acaatggaca ggcctgtgag tgaccatgct gggctccagc ccgccagccc cggagaccat 109740
gaaacagatg gccaaggtca ccccacagtt cagccagaca tggctccgtg gggtctgcat 109800
cgctgctgcc ctctaacacc agcccagatg gggacaaggc caaccccaca ttaccatctc 109860
ctgctgtcca cccagtggtc ccagaagccc ctccctcatg gctgagccac atgtgtgaac 109920
cctgagagca ccccatgtca gagtaggggc agcagaaggg cggggctggc cctgtgcact 109980
gtccctgcac ccatggtccc tcgcctgcct ggccctgaca cctgagcctc ttctgagtca 110040
tttctaagat agaagacatt cccggggaca gccggagctg ggcgtcgctc atcccgcccg 110100
gccgtcctga gtcctgcttg tttccagacc tcaccaggga agccaacaga ggactcacct 110160
cacacagtca gagacaaaga accttccaga aatccctgtc tcactcccca gtgggcacct 110220
tcttccagga cattcctcgg tcgcatcaca gcaggcaccc acatctggat caggacggcc 110280
cccagaacac aagatggccc atggggacag ccccacaacc caggccttcc cagaccccta 110340
aaaggcgtcc caccccctgc acctgcccca gggctaaaaa tccaggaggc ttgactcccg 110400
cataccctcc agccagacat cacctcagcc ccctcctgga ggggacagga gcccgggagg 110460
gtgagtcaga cccacctgcc ctcgatggca ggcggggaag attcagaaag gcctgagatc 110520
cccaggacgc agcaccactg tcaatggggg ccccagacgc ctggaccagg gcctgcgtgg 110580
gaaaggccgc tgggcacact caggggcttt ttgtgaaggc ccctcctact gtgtgactac 110640
ggtgactacc acagtgatga aactagcagc aaaaactggc cggacaccca gggaccatgc 110700
acacttctca gcttggagct ctccaggacc agaagagtca ggtctgaggg tttgtagcca 110760
gaccctcggc ctctagggac accctggcca tcacagcgga tgggctggtg ccccacatgc 110820
catctgctcc aaacaggggc ttcagagggc tctgaggtga cttcactcat gaccacaggt 110880
gccctggccc cttccccgcc agctacaccg aaccctgtcc caacagctgc cccagttcca 110940
acagccaatt cctggggccc agaattgctg tagacaccag cctcgttcca gcacctcctg 111000
ccaattgcct ggattcacat cctggctgga atcaagaggg cagcatccgc caggctccca 111060
acaggcagga ctcccgcaca ccctcctctg agaggccgct gtgttccgca gggccaggcc 111120
ctggacagtt cccctcacct gccactagag aaacacctgc cattgtcgtc cccacctgga 111180
aaagaccact cgtggagccc ccagccccag gtacagctgt agagagactc cccgagggat 111240
ctaagaagga gccatgcgca gttctgccgg gaccctcggc caggccgaca ggagtggaca 111300
ctggagctgg gcccacactg ggccacatag gagctcacca gtgagggcag gagagcacat 111360
gccggggagc acccagcctc ctgctgacca gaggcccgtc ccagagccca ggaggctgca 111420
gaggcctctc cagggggaca ctgtgcatgt ctggtccctg agcagccccc cacgtcccca 111480
gtcctggggg cccctggcac agctgtctgg accctccctg ttccctggga agctcctcct 111540
gacagccccg cctccagttc caggtgtggt tattgtcagg gggtgtcaga ctgtggtgga 111600
tacagctatg gttaccacag tggtgctgcc catagcagca accaggccaa gtagacaggc 111660
ccctgctgtg cagccccagg cctccacttc acctgcttct cctggggctc tcaaggtcac 111720
tgttgtctgt actctgccct ctgtggggag ggttccctca gtgggaggtc tgttctcaac 111780
atcccagggc ctcatgtctg cacggaaggc caatggatgg gcaacctcac atgccgcggc 111840
taagataggg tgggcagcct ggcgggggac agtacatact gctggggtgt ctgtcactgt 111900
gcctagtggg gcactggctc ccaaacaacg cagtcctcgc caaaatcccc acagcctccc 111960
ctgctagggg ctggcctgat ctcctgcagt cctaggaggc tgctgacctc cagaatgtct 112020
ccgtccccag ttccagggcg agagcagatc ccaggccggc tgcagactgg gaggccaccc 112080
cctccttccc agggttcact ggaggtgacc aaggtaggaa atggccttaa cacagggatg 112140
actgcgccat cccccaacag agtcagcccc ctcctgctct gtaccccgca ccccccaggc 112200
cagtccacga aaaccagggc cccacatcag agtcactgcc tggcccggcc ctggggcgga 112260
cccctcagcc cccaccctgt ctagaggact tggggggaca ggacacaggc cctctcctta 112320
tggttccccc acctgcctcc ggccgggacc cttggggtgt ggacagaaag gacacctgcc 112380
taattggccc ccaggaaccc agaacttctc tccagggacc ccagcccgag caccccctta 112440
cccaggaccc agccctgccc ctcctcccct ctgctctcct ctcatcaccc catgggaatc 112500
cggtatcccc aggaagccat caggaagggc tgaaggagga agcggggccg tgcaccaccg 112560
ggcaggaggc tccgtcttcg tgaacccagg gaagtgccag cctcctagag ggtatggtcc 112620
accctgcctg gggctcccac cgtggcaggc tgcggggaag gaccagggac ggtgtggggg 112680
agggctcagg gccctgcggg tgctcctcca tcttcggtga gcctccccct tcacccaccg 112740
tcccgcccac ctcctctcca ccctggctgc acgtcttcca caccatcctg agtcctacct 112800
acaccagagc cagcaaagcc agtgcagaca aaggctgggg tgcagggggg ctgccagggc 112860
agcttcgggg agggaaggat ggagggaggg gaggtcagtg aagaggcccc cttcccctgg 112920
gtccaggatc ctcctctggg acccccggat cccatcccct cctggctctg ggaggagaag 112980
caggatggga gaatctgtgc gggaccctct cacagtggaa tatccccaca gcggctcagg 113040
ccagacccaa aagcccctca gtgagccctc cactgcagtc ctgggcctgg gtagcagccc 113100
ctcccacaga ggacagaccc agcaccccga agaagtcctg ccagggggag ctcagagcca 113160
tgaaagagca ggatatgggg tccccgatac aggcacagac ctcagctcca tccaggccca 113220
ccgggaccca ccatgggagg aacacctgtc tccgggttgt gaggtagctg gcctctgtct 113280
cggaccccac tccagacacc agacagaggg gcaggccccc caaaaccagg gttgagggat 113340
gatccgtcaa ggcagacaag accaaggggc actgacccca gcaagggaag gctcccaaac 113400
agacgaggag gtttctgaag ctgtctgtat cacagtgggg tatagcagtg gctggtacca 113460
cagtgacact cgccaggcca gaaaccccgt cccaagtcag cggaagcaga gagagcaggg 113520
aggacacgtt taggatctga ggccgcacct gacacccagg gcagcagacg tctcccctcc 113580
agggcaccct ccaccgtcct gcgtttcttc aagaataggg gcggcctgag ggggtccagg 113640
gccaggcgat aggtcccctc taccccaagg aggagccagg caggacccga gcaccgtccc 113700
cattgaggct gacctgccca gacgggcctg ggcccacccc acacaccggg gcggaatgtg 113760
tgcaggcccc agtctctgtg ggtgttccgc tagctggggc ccccagtgct caccccacac 113820
ctaaagcgag ccccagcctc cagagccccc taagcattcc ccgcccagca gcccagcccc 113880
tgcccccacc caggaggccc cagagctcag ggcgcctggt cggattctga acagccccga 113940
gtcacagtgg gtataactgg aacgaccacc gtgagaaaaa ctgtgtccaa aactgactcc 114000
tggcagcagt cggaggcccc gccagagagg ggagcagccg gcctgaaccc atgtcctgcc 114060
ggttcccatg acccccagca cccagagccc cacggtgtcc ccgttggata atgaggacaa 114120
gggctggggg ctccggtggt ttgcggcagg gacttgatca catccttctg ctgtggcccc 114180
attgcctctg gctggagttg acccttctga caagtgtcct cagaaagaca gggatcaccg 114240
gcacctccca atatcaaccc caggcagcac agacacaaac cccacatcca gagccaactc 114300
caggagcaga gacaccccaa cactctgggg gaccccaacc gtgataactc cccactggaa 114360
tccgccccag agtctaccag gaccaaaggc cctgccctgt ctctgtccct cactcagggc 114420
ctcctgcagg gcgagcgctt gggagcagac tcggtcttag gggacaccac tgtgggcccc 114480
aactttgatg aggccactga cccttccttc ctttcctggg gcagcacaga ctttggggtc 114540
tgggcaggga agaactactg gctggtggcc aatcacagag cccccaggcc gaggtggccc 114600
caagaaggcc ctcaggaggt ggccactcca cttcctccca gctggacccc aggtcctccc 114660
caagataggg gtgccatcca aggcaggtcc tccatggagc ccccttcaga ctcctcccgg 114720
gaccccactg gacctcagtc cctgctctgg gaatgcagcc accacaagca caccaggaag 114780
cccaggccca gccaccctgc agtgggcaag cccacactct ggagcagagc agggtgcgtc 114840
tgggaggggc taacctcccc accccccacc ccccatctgc acacagccac ctaccactgc 114900
ccagaccctc tgcaggaggg ccaagccacc atggggtatg gacttagggt ctcactcacg 114960
tgcctcccct cctgggagaa ggggcctcat gcccagatcc ctgcagcact agacacagct 115020
ggaggcagtg gccccagggc caccctgacc tggcatctaa ggctgctcca gcccagacag 115080
cactgccgtt cctgggaagc ctgggctcca ccagaccaca ggtccagggc acagcccaca 115140
ggagccaccc acacacagct cacaggaaga agataagctc cagaccccag ggcgggacct 115200
gccttcctgc caccacttac acacaggcca gggagctgtt cccacacaga tcaaccccaa 115260
accgggactg cctggcacta gggtcactgc catttccctc tccattccct cccagtgcct 115320
ctgtgctccc tccttctggg gaacaccctg tgcagcccct ccctgcagcc cacacgctgg 115380
ggagacccca ccctgcctcg ggccttttct acctgctgca cttgccgccc acccaaacaa 115440
ccctgggtac gtgaccctgc agtcctcacc ctgatctgca accagacccc tgtccctccc 115500
tctaaacacc cctcccaggc caactctgca cctgcaggcc ctccgctctt ctgccacaag 115560
agcctcaggt tttcctacct gtgcccaccc cctaacccct cctgcccaca acttgagttc 115620
ttcctctcct ggagcccttg agccatggca ctgaccctac actcccaccc acacactgcc 115680
catgccatca ccttcctcct ggacactctg accccgctcc cctccctctc agacccggcc 115740
ctggtatttc caggacaaag gctcacccaa gtcttcccca tgcaggccct tgccctcact 115800
gcctggttac acgggagcct cctgtgcgca gaagcaggga gctcagctct tccacaggca 115860
gaaggcactg aaagaaatca gcctccagtg ccttgacaca cgtccgcctg tgtctctcac 115920
tgcctgcacc tgcagggagg ctccgcactc cctctaaaga tgagggatcc aggcagcaac 115980
atcacgggag aatgcagggc tcccagacag cccagccctc tcgcaggcct ctcctgggaa 116040
gagacctgca gccaccactg aacagccacg gaggtcgctg gatagtaacc gagtcagtga 116100
ccgacctgga gggcagggga gcagtgaacc ggagcccata ccatagggac agagaccagc 116160
cgctaacatc ccgagcccct cactggcggc cccagaacac cccgtggaaa gagaacagac 116220
ccacagtccc acctggaaca gggcagacac tgctgagccc ccagcaccag ccccaagaaa 116280
cactaggcaa cagcatcaga gggggctcct gagaaagaga ggaggggagg tctccttcac 116340
catcaaatgc ttcccttgac caaaaacagg gtccacgcaa ctcccccagg acaaaggagg 116400
agccccctgt acagcactgg gctcagagtc ctctctgaga caggctcagt ttcagacaac 116460
aacccgctgg aatgcacagt ctcagcagga gagccaggcc agagccagca agaggagact 116520
cggtgacacc agtctcctgt agggacagga ggattttgtg ggggttcgtg tcactgtgag 116580
catattgtgg tggtgactgc tattcccaca gtgacacaac cccattccta aagccctact 116640
gcaaacgcac ccactcctgg gactgagggg ctgggggagc gtctgggaag tatggcctag 116700
gggtgtccat caatgcccaa aatgcaccag actctcccca agacatcacc ccaccagcca 116760
gtgagcagag taaacagaaa atgagaagca gctgggaagc ttgcacaggc cccaaggaaa 116820
gagctttggc aggtgtgcaa gaggggatgt gggcagagcc tcagcagggc cttttgctgt 116880
ttctgctttc ctgtgcagag agttccataa actggtattc aagatcaatg gctgggagtg 116940
agcccaggag gacagtgtgg gaagagcaca gggaaggagg agcagccgct atcctacact 117000
gtcatctttt gaaagtttgc cctgtgccca caatgctgca tcatgggatg cttaacagct 117060
gatgtagaca cagctaaaga gagaatcagt gaaatgcatt tgcagcacag atctgaataa 117120
atcctccaga atgtggagca gcacagaagc aagcacacag aaagtgcctg atgccaaggc 117180
aaagttcagt gggcaccttc aggcattgct gctgggcaca gacactctga aaagcactgg 117240
caggaactgc ctgtgacaaa gcagaaccct caggcaatgc cagccctaga gcccttcctg 117300
agaacctcat gggcaaagat gtgcagaaca gctgtttgtc atagccccaa actatggggc 117360
tggacaaagc aaacgtccat ctgaaggaga acagacaaat aaacgatggc aggttcatga 117420
aatgcaaact aggacagcca gaggacaaca gtagagagct acaggcggct ttgcggttga 117480
gttcatgaca atgctgagta attggagtaa cagaggaaag cccaaaaaat acttttaatg 117540
tgatttcttc taaataaaat ttacacccgg caaaatgaac tatcttctta agggataaac 117600
tttcccctgg aaaaactata aggaaaatca agaaaacgat gatcacataa acacagtggt 117660
ggttacttct actggggaag gaagagggta tgagctgaga cacacagagt cggcaagtct 117720
cctaacaaga acagaacaaa tacattacag taccttgaaa acagcagtta aacttctaaa 117780
tcgcaagaag aggaaaatgc acacacctgt gtttagaaaa ttctcagtcc agcactgttc 117840
ataatagcaa agacattaac ccaggttgga taaataagcg atgacacagg caattgcaca 117900
atgatacaga catacattca gtatatgaga catcgatgat gtatccccaa agaaatgact 117960
ttaaagagaa aaggcctgat gtgtggtggc aatcacctcc ctgggcatcc ccggacaggc 118020
tgcaggctca ctgtgtggca gggcaggcag gcacctgctg gcagctcctg gggcctgatg 118080
tggagcaggc acagagctgt atatccccaa ggaaggtaca gtcagtgcat tccagagaga 118140
agcaactcag ccacactccc tggccagaac ccaagatgca cacccatgca cagggaggca 118200
gagcccagca cctccgcagc caccaccacc tgcgcacggg ccaccacctt gcaggcacag 118260
agtgggtgct gagaggaggg gcagggacac caggcagggt gagcacccag agaaaactgc 118320
agaagcctca cacatccacc tcagcctccc ctgacctgga cctcacctgg cctgggcctc 118380
acctgacctg gacctcacct ggcctgggct tcacctggcc tgggcttcac ctgacctgga 118440
cctcacctgg cctcgggcct cacctggcct gggcttcacc tggcctgggc ttcacctgac 118500
ctggacctca cctggcctgg gcctcacctg acctggacct cacctggcct gggcttcacc 118560
tggcctgggc ttcacctggc ctgggcttca cctgacctgg acctcacctg gcctgggctt 118620
cacctgacct ggacctcacc tggcctcggg cctcacctgc acctgctcca ggtcttgctg 118680
gagcctgagt agcactgagg ctgtagggac tcatccaggg ttggggaatg actctgcaac 118740
tctcccacat ctgacctttc tgggtggagg cacctggtgg cccagggaat ataaaaagcc 118800
ccagaatgat gcctgtgtga tttgggggca atttatgaac ccgaaaggac atggccatgg 118860
ggtgggtagg gacagtaggg acagatgtca gcctgaggtg aagcctcagg acacaggtgg 118920
gcatggacag tgtccaccta agcgagggac agacccgagt gtccctgcag tagacctgag 118980
agcgctgggc ccacagcctc ccctcggggc cctgctgcct cctcaggtca gccctggaca 119040
tcccgggttt ccccaggcct ggcggtaggt ttgaagtgag gtctgtgtca ctgtggtatt 119100
actatgatag tagtggttat tactaccaca gtgtcacaga gtccatcaaa aactcatgcc 119160
tgggagcctc ccaccacagc cctccctgcg ggggaccgct gcatgccgtg ttaggatttt 119220
gatcgaggac acggcgccat gggtatggtg gctaccacag cagtgcagcc catgacccaa 119280
acacacgggg cagcagaaac aatggacagg cccacaagtg accatgatgg gctccagccc 119340
accagcccca gagaccatga aacagatggc caaggtcacc ctacaggtca tccagatctg 119400
gctccaaggg gtctgcatcg ctgctgccct cccaacgcca aaccagatgg agacagggcc 119460
ggccccatag caccatctgc tgccgtccac ccagcagtcc cggaagcccc tccctgaacg 119520
ctgggccacg tgtgtgaacc ctgcgagccc cccatgtcag agtaggggca gcaggagggc 119580
ggggctggcc ctgtgcactg tcactgcccc tgtggtccct ggcctgcctg gccctgacac 119640
ctgagcctct cctgggtcat ttccaagaca ttcccaggga cagccggagc tgggagtcgc 119700
tcatcctgcc tggctgtcct gagtcctgct catttccaga cctcaccagg gaagccaaca 119760
gaggactcac ctcacacagt cagagacaac gaaccttcca gaaatccctg tttctctccc 119820
cagtgagaga aaccctcttc cagggtttct cttctctccc accctcttcc aggacagtcc 119880
tcagcagcat cacagcggga acgcacatct ggatcaggac ggcccccaga acacgcgatg 119940
gcccatgggg acagcccagc ccttcccaga cccctaaaag gtatccccac cttgcacctg 120000
ccccagggct caaactccag gaggcctgac tcctgcacac cctcctgcca gatatcacct 120060
cagccccctc ctggagggga caggagcccg ggagggtgag tcagacccac ctgccctcaa 120120
tggcaggcgg ggaagattca gaaaggcctg agatccccag gacgcagcac cactgtcaat 120180
gggggcccca gacgcctgga ccagggcctg tgtgggaaag gcctctggcc acactcaggg 120240
gctttttgtg aagggccctc ctgctgtgtg actacggtgg taactcccac agtgatgaaa 120300
ccagcagcaa aaactgaccg gactcgcagg gtttatgcac acttctcggc tcggagctct 120360
ccaggagcac aagagccagg cccgagggtt tgtgcccaga ccctcggcct ctagggacac 120420
ccgggccatc ttagccgatg ggctgatgcc ctgcacaccg tgtgctgcca aacaggggct 120480
tcagagggct ctgaggtgac ttcactcatg accacaggtg ccctggtccc ttcactgcca 120540
gctgcaccag accctgttcc gagagatgcc ccagttccaa aagccaattc ctggggccgg 120600
gaattactgt agacaccagc ctcattccag tacctcctgc caattgcctg gattcccatc 120660
ctggctggaa tcaagagggc agcatccgcc aggctcccaa caggcaggac tcccacacac 120720
cctcctctga gaggccgctg tgttccgcag ggccaggccg cagacagttc ccctcacctg 120780
cccatgtaga aacacctgcc attgtcgtcc ccacctggca aagaccactt gtggagcccc 120840
cagccccagg tacagctgta gagagagtcc tcgaggcccc taagaaggag ccatgcccag 120900
ttctgccggg accctcggcc aggccgacag gagtggacgc tggagctggg cccacactgg 120960
gccacatagg agctcaccag tgagggcagg agagcacatg ccggggagca cccagcctcc 121020
tgctgaccag agacccgtcc cagagcccag gaggctgcag aggcctctcc agggggacac 121080
agtgcatgtc tggtccctga gcagccccca ggctctctag cactgggggc ccctggcaca 121140
gctgtctgga ccctccctgt tccctgggaa gctcctcctg acagccccgc ctccagttcc 121200
aggtgtggtt attgtcaggg ggtgccaggc cgtggtagag atggctacaa ttaccacagt 121260
ggtgccgccc atagcagcaa ccaggccaag tagacagacc cctgccacgc agccccaggc 121320
ctccagctca cctgcttctc ctggggctct caaggctgct gtctgccctc tggccctctg 121380
tggggagggt tccctcagtg ggaggtctgt gctccagggc agggatgact gagatagaaa 121440
tcaaaggctg gcagggaaag gcagcttccc gccctgagag gtgcaggcag caccacagag 121500
ccatggagtc acagagccac ggagccccca gtgtgggcgt gtgagggtgc tgggctcccg 121560
gcaggcccag ccctgatggg gaagcctgcc ccgtcccaca gcccaggtcc ccaggggcag 121620
caggcacaga agctgccaag ctgtgctcta cgatcctcat ccctccagca gcatccactc 121680
cacagtgggg aaactgagcc ttggagaacc acccagcccc ctggaaacaa ggcggggagc 121740
ccagacagtg ggcccagagc actgtgtgta tcctggcact aggtgcaggg accacccgga 121800
gatccccatc actgagtggc cagcctgcag aaggacccaa ccccaaccag gccgcttgat 121860
taagctccat ccccctgtcc tgggaacctc ttcccagcgc caccaacagc tcggcttccc 121920
aggccctcat ccctccaagg aaggccaaag gctgggcctg ccaggggcac agtaccctcc 121980
cttgccctgg ctaagacagg gtgggcagac ggctgcagat aggacatatt gctggggcat 122040
cttgctctgt gactactggg tactggctct caacgcagac cctaccaaaa tccccactgc 122100
ctcccctgct aggggctggc ctggtctcct cctgctgtcc taggaggctg ctgacctcca 122160
ggatggcttc tgtccccagt tctagggcca gagcagatcc caggcaggct gtaggctggg 122220
aggccacccc tgtccttgcc gaggttcagt gcaggcaccc aggacaggaa atggcctgaa 122280
cacagggatg actgtgccat gccctaccta agtccgcccc tttctactct gcaaccccca 122340
ctccccaggt cagcccatga cgaccaacaa cccaacacca gagtcactgc ctggccctgc 122400
cctggggagg acccctcagc ccccaccctg tctagaggag ttggggggac aggacacagg 122460
ctctctcctt atggttcccc cacctggctc ctgccgggac ccttggggtg tggacagaaa 122520
ggacgcctgc ctaattggcc cccaggaacc cagaacttct ctccagggac cccagcccga 122580
gcaccccctt acccaggacc cagccctgcc cctcctcccc tctgctctcc tctcatcact 122640
ccatgggaat ccagaatccc caggaagcca tcaggaaggg ctgaaggagg aagcggggcc 122700
gctgcaccac cgggcaggag gctccgtctt cgtgaaccca gggaagtgcc agcctcctag 122760
agggtatggt ccaccctgcc tggggctccc accgtggcag gctgcgggga aggaccaggg 122820
acggtgtggg ggagggctca gggccctgca ggtgctccat cttggatgag cccatccctc 122880
tcacccaccg acccgcccac ctcctctcca ccctggccac acgtcgtcca caccatcctg 122940
agtcccacct acaccagagc cagcagagcc agtgcagaca gaggctgggg tgcagggggg 123000
ccgccagggc agctttgggg agggaggaat ggaggaaggg gaggtcagtg aagaggcccc 123060
cctcccctgg gtctaggatc cacctttggg acccccggat cccatcccct ccaggctctg 123120
ggaggagaag caggatggga gattctgtgc aggaccctct cacagtggaa tacctccaca 123180
gcggctcagg ccagatacaa aagcccctca gtgagccctc cactgcagtg cagggcctgg 123240
gggcagcccc tcccacagag gacagaccca gcaccccgaa gaagtcctgc cagggggagc 123300
tcagagccat gaaggagcaa gatatgggga ccccaatact ggcacagacc tcagctccat 123360
ccaggcccac caggacccac catgggtgga acacctgtct ccggcccctg ctggctgtga 123420
ggcagctggc ctctgtctcg gacccccatt ccagacacca gacagaggga caggcccccc 123480
agaaccagtg ttgagggaca cccctgtcca gggcagccaa gtccaagagg cgcgctgagc 123540
ccagcaaggg aaggccccca aacaaaccag gaggtttctg aagctgtctg tgtcacagtc 123600
gggtatagca gcggctacca caatgacact gggcaggaca gaaaccccat cccaagtcag 123660
ccgaaggcag agagagcagg caggacacat ttaggatctg aggccacacc tgacactcaa 123720
gccaacagat gtctcccctc cagggcgccc tgccctgttc agtgttcctg agaaaacagg 123780
ggcagcctga ggggatccag ggccaggaga tgggtcccct ctaccccgag gaggagccag 123840
gcgggaatcc cagccccctc cccattgagg ccatcctgcc cagaggggcc cggacccacc 123900
ccacacaccc aggcagaatg tgtgcaggcc tcaggctctg tgggtgccgc tagctggggc 123960
tgccagtcct caccccacac ctaaggtgag ccacagccgc cagagcctcc acaggagacc 124020
ccacccagca gcccagcccc tacccaggag gccccagagc tcagggcgcc tgggtggatt 124080
ctgaacagcc ccgagtcacg gtgggtatag tgggagctac taccactgtg agaaaagcta 124140
tgtccaaaac tgtctcccgg ccactgctgg aggcccagcc agagaaggga ccagccgccc 124200
gaacatacga ccttcccaga cctcatgacc cccagcactt ggagctccac agtgtcccca 124260
ttggatggtg aggatggggg ccggggccat ctgcacctcc caacatcacc cccaggcagc 124320
acaggcacaa accccaaatc cagagccgac accaggaaca cagacacccc aataccctgg 124380
gggaccctgg ccctggtgac ttcccactgg gatccacccc cgtgtccacc tggatcaaag 124440
accccaccgc tgtctctgtc cctcactcag ggcctgctga ggggcgggtg ctttggagca 124500
gactcaggtt taggggccac cattgtgggg cccaacctcg accaggacac agatttttct 124560
ttcctgccct ggggcaacac agactttggg gtctgtgcag ggaggacctt ctggaaagtc 124620
accaagcaca gagccctgac tgaggtggtc tcaggaagac ccccaggagg gggcttgtgc 124680
cccttcctct catgtggacc ccatgccccc caagataggg gcatcatgca gggcaggtcc 124740
tccatgcagc caccactagg caactccctg gcgccggtcc ccactgcgcc tccatcccgg 124800
ctctggggat gcagccacca tggccacacc aggcagcccg ggtccagcaa ccctgcagtg 124860
cccaagccct tggcaggatt cccagaggct ggagcccacc cctcctcatc cccccacacc 124920
tgcacacaca cacctacccc ctgcccagtc cccctccagg agggttggag ccgcccatag 124980
ggtgggggct ccaggtctca ctcactcgct tcccttcctg ggcaaaggag cctcgtgccc 125040
cggtcccccc tgacggcgct gggcacaggt gtgggtactg ggccccaggg ctcctccagc 125100
cccagctgcc ctgctctccc tgggaggcct gggcaccacc agaccaccag tccagggcac 125160
agccccaggg agccgcccac tgccagctca caggaagaag ataagcttca gaccctcagg 125220
gccgggagct gccttcctgc caccccttcc tgccccagac ctccatgccc tcccccaacc 125280
acttacacac aagccaggga gctgtttcca cacagttcaa ccccaaacca ggacggcctg 125340
gcactcgggt cactgccatt tctgtctgca ttcgctccca gcgcccctgt gttccctccc 125400
tcctccctcc ttcctttctt cctgcattgg gttcatgccg cagagtgcca ggtgcaggtc 125460
agccctgagc ttggggtcac ctcctcactg aaggcagcct cagggtgccc aggggcaggc 125520
agggtggggg tgaggcttcc agctccaacc gctccactag ccgagactaa ggaagtgaga 125580
ggcagccaga aatccagacc attccatagc aaatggattt cattaaagtt accagacttc 125640
agtgtaagta acatgagccc catgcacaac aatcccttat gaaggggaag tcagtgtcgc 125700
ctcggatttc ttgaaaaaca caaaaactta tcaatgcctg taaaagtctg ttggaaagaa 125760
aatatgattc aagaatgtta tgcccaacaa agctggcata ttttctaccc ggacacactc 125820
agggaatgtg gtcccttgag tgcttctctc actgcgtaaa tcctacgtgg tgtttaagca 125880
tattcataaa tgtgtatgtc tatttttatg tgtaagatgg ttcattttta ttttatttat 125940
tcaatatgta caataaagaa tattgacaaa taggctggac atggtggctc ccacctgtaa 126000
tcccagccct ttgggaggcc gaggcgggca gatcacctga ggtctggagt tcgagaccag 126060
cctggccaac atgatgaaaa cccatctcta ctaaaaatac aaagattagc caggcatggt 126120
ggtgcatgcc tgtaatccca gccactcagg aggctgagac aggagaaatg cgtgaacccg 126180
gaaggcggag gttgcagtga gccgagatca caccactgca ctccagcctg gcgacagagc 126240
aagattccat ctcaaaaaaa aaaaaagaca aagaaatttg tttttttgaa taaagacaaa 126300
tttcatcaca cgaagataaa gatgcaaagc tccagacagg aaggcacgga cagcacagtg 126360
aagcccggag cgggcgctgg ggggccaggg gcatggcggg ggtgccagcg tctctcggtt 126420
cctaccatgg ccactccagc ctgtgttctc acgaggatgg ctgtgcaatg ctaggagcgt 126480
gttcgaagct ctagggcaac cactggaagt gaggctgagg agcagagccc agaggcccgt 126540
ggagctgatg aaaagaaagc tggagaaagt gtttgctgcc tcccaacatg gtaagaaaag 126600
atagaaagag agagcacacg gcaaagggag cttgctgagg gactctttac aatggcttgc 126660
acagagctca gggggtctgg gaggctaggg ccctgcgcag ggcagtcacc ccagcctgct 126720
gaccaaggtt tgctgcaggc agctctgggg gtggttgagg cgcggtccct ggagccaccc 126780
ctcaagggaa cgaggcagca gagtgggcca aggcccaggt cggctgcaag gctgcccagg 126840
acttggggtc cttacatcag cagccactga tgcagctggc ccagagagag gcgccgagca 126900
ggttgcctcc aggggacaaa ccaggtcgga gagggtgagg cagtggatgg agccacaaca 126960
accccgggca cgggtgacac gcacgttcat gcacatctga cccttcctcc ctcaccaaac 127020
aggtccccct gccttcccca tggttgcgaa aaagcaaaat gtagacgttt tttctttttt 127080
aattcatgtt ttaattgaca aatgaagccg tatatattta ttgtgtacaa catgatgctt 127140
taaaatatgt atacatcgtg gaacagcaac gttgagctaa tttaacacgc attacttcac 127200
atacttgtca tcttttgtgg cgagaatgct taaaatccac tctcttagta ttttttaaga 127260
atgcaataca ttgttgtcaa ctgtggtcac cgtcatgcat agccaagctc ccgacctcac 127320
cctcctgcca gctcaggctg tgcatccttt caccagcatc ccccaccccg gcccctggcc 127380
ctggtaacta ccactctata ctctacgtat gagttcagct ttttaagatt ccacagatga 127440
atgagatcat acagtatttg ctttctatgc ctggcttatt ttagttaaca cactgtcctc 127500
cagatccatc cgttgttgca aatgacaggg tttcattctt tttaaagtct aaagagtatt 127560
ccattgtgtc aatggacctc atttgcttta tccatgcatc aactatggac atttaggttg 127620
attccatttc ttagctgttg tggatggtgc tgcagtaaac atggggctgc agatgtctct 127680
tcaacatact gacatcatgt cctttggata aatacccagt agtgggatcg ctggatcaca 127740
atgtacagtt ttttttttaa tggaaacttt cattttttgg tgaaattagg aaaacagata 127800
aaacccacag aatccaaaat atatgtgaag atgccaaaaa cagttgacat tgggcagagg 127860
tcacatggaa ggaagtgaat acatgacggg gtgtgagggc ccagaggcag ctgaaatacg 127920
ctttctaaac acaaggacct cttctgagag ggcagaagtt ttatcctgca catgcaatga 127980
ccagcacagc taaaatacac tttctaaaca tgaggacctc ttctgagagg gcagctttat 128040
cctgcaaatg caatgaccag cacaggaccc agaataaaga gagttgccag cggacgcctg 128100
gtgtccatgt gtccaggtga gttcgagatg cggacggcgc tggccagcca gtcacaccct 128160
aagtcaatct gctgcatgca tttgtccttg ccacagcaga aaacgagaaa gcctttgggc 128220
tgcaaagctt cacaggctcc tcttctcccg actccatgga aacagctaca aagagcaggc 128280
ccagtagagc ttaattcatg aaaatgagta ataaacttga actggaacag tatcgacttt 128340
ttagaaacgg cagcaaagtg tataaaaaat attcaccaga acaatatttc caaacgatga 128400
gatgagaatt tcagccaagt aatcctccat ggatagaaaa taatgaaggg attggattta 128460
tgaaggaaaa tcatggagct caaatacaag aaaagagaat caaaaatgaa caggaggaga 128520
taaaatatgg tttggccaaa gttacaaaat aaatttttta aaaacccttc atcatggcaa 128580
gtagaaagag cgagaggaaa aacagatccc gtggaagaca caaataggac atggggagaa 128640
aaatgaatga gatgaaacag agcagaaata aaattttacg gaactaaaga caagtgatct 128700
gaacctgcct ggggcctggg ggacctcgcc accctgaagg gaaagaacat gcctggctgg 128760
ctttgccacc tgctcattgc agagccccac agcttgcaac aaacataggc ggtagccagg 128820
gagtggttac agcaggcctt gagcaagacc cagtgttgtg ctgacttcag gtctgaccca 128880
gcactgtcat agtggtggtg tccatagtgg tagtgggggt gcttgtgtca ctccaccccc 128940
atctccagga ggctcagaac agacagagag agactccatt tgtttgggag aaagtaaggg 129000
atgagaacaa gagtctctgc ctggtaatcc agagaattat tctagatctt ggccaagatt 129060
atcaaagcag tacctctatg agtcttttgg gcttggagtc cccctaaagc agatatagct 129120
aagatcacaa cacccaagtc cttttgaata tgtgggaaga cttcccaagg acaggagcaa 129180
acaaacaagc ccagactgca aaaaaacaag ccgagactgc aataaacacc tcactcttca 129240
atgcccaggc actgaagaac atctcctagc agcaacacca tccaggaaaa catggcctca 129300
accagtgaac taaataaggc accagggacc agtctcggag aaatagaggt atgttatctt 129360
tcagagaatt caaagtagct ttgttgagga aactcaaaga aattcaagat aacacagtga 129420
aggaattcag aatcctatcc gataaattta acagagattg aagcaattaa aaagaattaa 129480
gcagaaatta tggagctgaa aaatgcaatt ggcatactga aaaatgcatc agagtatttt 129540
catagcctca tatatcaagt agaagaaaga attagtgagc ttgaaaacag gctatttgga 129600
aaagcacgat aaaaggagac aaaagagaaa agaataaata acaatgaagc atatctacag 129660
gatctagaaa atagcctcaa aaggccaaat ctaagaatta ttagccttaa agaggaggta 129720
gagaaagagg gatggagagt ttattcaaag ggataataac agaaaacttc ccaaacctag 129780
agaaagatat caatatccaa atgcaagaag gatgtagtac accaaggaga tttaatgcaa 129840
agaagactac ctcaaggcat tcaatactca aactcccata tgacaaggac tttaaaaaga 129900
tcctaaaagc agcaaaagaa aagaaatgaa taaaatacta tggagctcca atatgtctgg 129960
cagcagactt ttcagtgaag actttatatg ccaggagaga gtgtcataat ggatttaaag 130020
tgctgaagga aaaaactttt accctcgaac agtatagctg gtgaaattat ccttcaaaca 130080
tgaaggagaa ataatttgtt tccagacaaa tgttgaggga tttcatgaac accagacctg 130140
tcttttaaga aatgctaaag ggagtacttc aatcagaaag aaacacgtta gtgaacaata 130200
agaaatcatc tgaaggcaca aaactcaccg gtaatagtaa gtacacagaa aaacacagaa 130260
tattataaca ctgtaactgt ggtgtgtaaa ctccttttgt ttgtttgttt gtttgtttgt 130320
ttgtttttgt ttttagacgg agttttgctc cagcccaggc tggagtgcaa tggcacaatc 130380
tcagctcact gcaacttcca cctcccgggt tcaagcaatt ctcctgcctc agcctcccaa 130440
gtagctggga ttacaggcat gtgctaccat gtccagctaa ttttgtattt tagtagagac 130500
ggtgtttcac catgttggtc aggctagcct tatcttgagt agaaaaacta aatgatgaag 130560
caatgaaaaa taataactac aacttttcaa gacatagtac aataagatat aaatcataac 130620
aaaaagttaa aaggtggagg gatgaagtta aggcatagag tctttattag ttttcttttt 130680
acttgtctgt ttatgcaaac agtgttaagt tgtcatcagt ttaaaataat gggtcataag 130740
atactatttg caagcctcat ggtaacgtca aaccaaaagc aatacaacag atacacaaaa 130800
aacaaaaagc aagaagctaa attacgtcat cagagaaaat caccttcact aaaaggaaga 130860
cggagaaaag aatgaagaga gagaagacca aaagcaaata gcaatatggc aggagtaagt 130920
ccttacttat caataatacc attgaatgta aatggactaa actctccaat caaaagacat 130980
agagtggctg aatcaattaa agaaaaaaca agacccattg atctgttgtc cacaagaaac 131040
acactttatc tataaagaca cacatagact gaaaacaaag ggatggaaaa agatactcca 131100
cgccaatgga aaccaaagaa agagcaggag tagctacact tatatcaggc aaaatagatt 131160
tcaagacaaa aactataaga agagacaagg tcactaatga taaacaggtc aattcagcaa 131220
gaggatataa caattgtaaa tatatatgca cccaatgctg gagcacccag atatataaag 131280
caagtattta ctagagctaa agagagaaat agactccaat gcaataatag ctggagattt 131340
caacatccca ctttcaacat tgaacagatc ctccagatag aaaatcaaca aagaaatatt 131400
ggacttaatc tgcactatcg accaaatgga tctaacagat atttacagaa catttcatcc 131460
aacagctgca gaacacacat tcttttcctc agcacataga tcattctcaa ggatagacca 131520
tatgttgggt cacaaaacaa gttttaaaat attcaaatac attgaaataa tatcaagcat 131580
cttctgtgac cacaatggac taaaactaga aatcaataac aagaggaatt ttggaaacta 131640
tataaatata tggaaattaa tgaatgctga gtgggtcaat gaagcaatta agaaggaaac 131700
tgaaattttt cttggaacga atgatcatgg aaacagaaaa taccaaaacc tatgggatac 131760
agcaaaagca gtactaagag ggaagtttac agctacaaat gcttacatta aaaaagaaga 131820
aaaacttcaa taaaaaaacc taacaatgca tcttaaagaa ctagaaaagc aagaggaaat 131880
caaatccaaa attagtagaa gaaaacagta aaggtcagag cagaaataag taaaattgaa 131940
atgaagaaaa caatacaaaa gatcaataaa acaacaggtt gttttcttga aaagttaaac 132000
aaaattgaca aacctttagc cagactaaga aaaaaagaca gaagatccaa ataaataaaa 132060
tcagagatga aaaaggtgac attacaactt acaccacaga aattcaaagg atcattagtg 132120
gctactataa gcaactatat gccaataaat tggaaaatct agaagaaatg cagaaattcc 132180
tagacacata caacctccca agattaaacc aagaagaaat tcaaaacctg aacagactga 132240
taacaagtaa tgagatcaaa gccgtaataa aaagcctccc agtaaagaga agcccaggac 132300
ccgacggctt cactgctgaa ttctaccaaa catttaaagt agaactaata ccaatcctac 132360
tcaaactatt ccaaaaaata gaggtggaag gaatacttca aaactcatta tacgaggcca 132420
gtattaacct gacaccaaaa ctagacaaag acacatgaaa aaaagaaaac tacaggccaa 132480
tatgtctgat gaatattgac acaaaaatcc tcaacaaaat actagcaaac caaattcaac 132540
tacacattag aaagttcact catcatgacc aagtggaatt tatctaactt gggatgcaaa 132600
gatggttcaa catatgcaaa tcaatcaatg tgatacatca tatcaacaga atgaacaaca 132660
aaaaccattt gatcatttaa ttgatactga aaaagcattt gataaaattc aacattcctt 132720
cataataaaa attctcttct atactaggta caaaagaaac ttacctcaac ataataaagc 132780
catatatgac agtcccacag tatgatacta aatgaggaaa aactgagagc ctttcctcta 132840
cgatctggaa catgacaaag atgcccactt tcatcactgt tattcaacat agtactggaa 132900
gtcctagctg gagcgatcag acaagagaaa gatataaaag acatccaaat tggaaaggaa 132960
taagtcaaat tatcctcatt tgcatatggt atgatcttct atttagagct aactaaagac 133020
tccaccaaaa aaagttatta gaactgacga acaaattcag taaagctgca ggatacaaaa 133080
tcaacataca aaaatcagta gcatttctat atgccaacaa tgaccaatgt gaaaaagaaa 133140
ttaaaaagta accctattta caataaccac aaataaacac ctaggaatta accaaagagg 133200
taaaagattt ctgtaatgaa aactataaaa cactgatgaa agaaattgaa gagtacacca 133260
aaaaatggaa agcaattgca tgttcatgga ttagaagaat cagtgttgtt ataatgtcca 133320
tactatccaa agcaatctac agattcaatg caatccttat caaaatacca atgacatcat 133380
tcacagaaat agaaaaaaaa aatcctaaaa tttacgtgga accacaaaga cccagaatag 133440
ccaaagctct cctaagcaaa aagaacgaaa ctgtaggaat gacattgcct gtcttcaaat 133500
tctactacag agctatagat agtaaccaaa acagcgtggt actggcataa aaacagacac 133560
agagacaaac agaacaaaat ttaaaaaccc agaaataaat ccacacacct acagcaaatt 133620
catttttgac aaagttgcca agaacatact ctggggaata gataatgata tctcttcaat 133680
aaatagtgtg gggaaaactg gatatccata tacataacag tgaaactaga cccctctctc 133740
tctcactata tacaaaaatc aaatcaaaat tgtttaagga cttaaatcta agacctcata 133800
ctatgaaacc actgcaagac aaccttggcg gaaactctcc aagacatcag tccaggcaaa 133860
gatttcttga gtaatatccc acaagcacag acaaccaaag caaaaatgga caaatgggat 133920
cacatcaagt taaaaagctt ctgcacagta agggaaacaa ccaacaaaat gaagagacaa 133980
cccacagaat gggagaaaat atttgaaaaa tacccatctg gcaagggatt aaaaaccaga 134040
atatatgcag aatatataag gagctcaaac agtgctatag aaaaaaaaat ctaataatct 134100
gatttaaaaa tgggaaaaat gttagaatag acatttctta aaataagaca tacagatggc 134160
aaaccgacat ggaacggtgc tcaacatcat ggattatcac agaaacacaa tcaatcaaaa 134220
ctaaaactaa aatgtgctat catctcaccc cagttaaaat ggctgatatc cagaagacag 134280
gcaataacaa atgctggcaa ggatgtgggg aaaagggagc ccccatacac tgttgctggg 134340
attgtaaatt agtacaacca ctgtggagag cagcatgaaa gttcctcaaa aaactgaaag 134400
aaagctacca taggatccag caatcccact gctgtgtata tactacaaaa gaaaggaagt 134460
cagtatatga agaggtatct gcactcccat gtttgttgca gccctgttca caacagccaa 134520
gatttggaag caacctaagt gtccatcagc agttgaatgt ataaagaaaa tgtggtgcat 134580
atacacaatg gagtattatt caataataaa aaggaatgag attgagtcat ttgcaacaac 134640
atggatggaa ctggagatca ttatgtgaag tgaaataagc caggcacaga aagacaaaca 134700
ttacaatgtt cttacttatt aatgagatct aaaaatcaaa acaattgcac ccatgttcat 134760
aaagagtaaa aggatggtta ccagatgctg agaacggtgg tggggggata gggaaaggtg 134820
gcagtggtta acgggtacaa aaaaatagaa agaatgaata agacttgcta cttgatagca 134880
cagcaaggtg gctatagtca gtaatttagt tgtatatttt taataatgaa aggtgtataa 134940
ttggattgtt tctaacacaa aggataatgc ttaagaggat ggatacccca ttttccatga 135000
tgtgattatt tcacattgca cgcctagatc aaaacatcca atgtacccca taaatatata 135060
catcttctat gtacccataa aaattctgta aaataaaata tataaaaaga ggtgacagat 135120
atggaagaca ggcaaagaag agacgacatc cacataatcc gagtacctaa gaaagaatgg 135180
agtccagtgc atctcaggag ccaccattct aagccaattt tctctggttc tctcagtcac 135240
cctaccaata cgtgggcaat cttgttttat ttcaggatag agtttttgaa attatagatt 135300
taagtatgct ttctgttcta ttacttttgg taattaattt tagaaagaac taatttgggc 135360
acaaatttga aaaaattcta aatccaaaaa aaaaaagaaa aaaacacaca cacaatcatc 135420
tataaggggg atgatgacca gtcctagatt tctcaccagc cacattcaag atcagtaaat 135480
ggtaggacaa aacctgtagg gtccttaagg gggaaagaag tagtggatag tccagagtct 135540
atatacagcc aactgttctt gaagaaaaaa ggctgctgaa aaggagttcc aaacattcta 135600
taatccataa tctcatgatg aaactactag aggaagacca ccagccatca aaaggtgctt 135660
ggagaaccca gggccaagaa ccaaaagtaa atattaagtg tccttaactg cgagactaag 135720
atagaaatga ctgtggggga ccatgtggcc tcaacagagg tgaaatggtg tctgcctgac 135780
aaagtggaca ttttacaatg atcaaaacac agaatatgag atagagagca cttctgaatt 135840
actgcctcac tccaaataac tctcagccaa aggacttcag taaaaccaaa ttgggcatat 135900
tagacagtac aaacaaattc taagaaaata atattactga ttacaatcac atgatgctag 135960
agatggaggg gaaaaggaag aggaaaccag gtaatttcat actcgtatat agtaaagaac 136020
taaagtacat tgtccaaaga agaacaaaga atattttgga aagttataaa ggtagccact 136080
acacatagaa gatagcaaag aacaagaaaa cttaagatgg aaaacttttt ggaagcataa 136140
gaatagaaaa tataaactac taagataaga ttgaagccaa acagatctat gaaaacaaca 136200
aacatcaatg gccttaactt gcctattaaa aggaagagac tttcaaattg gaccacaaga 136260
taaaacccaa ctctatatag catatgagta ttacacacaa aatgggaaaa gctgaaaaaa 136320
cttgggcaaa attcacccca agcaaattcc actgtttcct ttgggacaaa atgccaagct 136380
ccatgccagg gaagatgatt ctcctcagac cttctcctca ctctcccagt cctcttaggg 136440
aaggaattgg gtgttagagg agggagactc tgtcgattat cagctgaagc agtggtgtgc 136500
tcctgcgttg cttctgacct gggaaatgaa gcagcaagac tctttctgct gtgtctttgc 136560
ccagaagggc catcccccca gagcagagta cccaggccgg caggagcagt ggtggaagcg 136620
tggaaaccac gtctcctaca gcagagacca tcagaagcgg agcctcgggt ataagggaaa 136680
caacgcgttc tccctaacct gggagtgaca gacagcgtca ttcctcacag tgataccctg 136740
tgttctagcc atctggccca tgacagagcc agcccagagc cagcccagag ccagcccctc 136800
accatcctgg agcctggcca gctcgccaag ctgcaccata ggcctggaag gcgtggagac 136860
ctgcggcagt gccctgtcct cccgtgaggc ctgccatccc tgccaggggt cgcctctggc 136920
ttctccttct ccaggaccgc acggtccaga ggctcagtgc ctggagtagg tgttgcctcc 136980
ctgcttctag gcccagaccc tcccttgttc ctgaccccgg gcctttccct ctggcttgga 137040
catccagggc cctgtctcag ctggggagct gctcctgctc aaggactgtc ttccgcggga 137100
tcgaaaggcc gcgtcctgaa caatgcgtgg gccacgtaag cggagcaggc tctaaaggcc 137160
gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa 137220
cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg 137280
gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag 137340
cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc 137400
tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc 137460
gcgtcctaaa cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa 137520
cagtgcgtgg gccacgtgag cggagcaggc tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgcgtgg 137580
gccacgggag cggagcagac tctaaaggcc gcgtcctaaa cagtgtgtgg gccacgtgag 137640
cggagcgccc tctccactgc cctcggggcc gcagctccca gctcagctcc cagccctgct 137700
cagggcagcc aggccaggag gtaccatcca ggctaagtga ccctcagggg ggacaggtgc 137760
cccaggagat gccagctgtt gggagaggct gggggaccaa ctcgacctgg cctgtgggcc 137820
ctgccctggc cacccattgt aggatccagc cgccacgcct gtgacactcg tgtgctttcc 137880
ctggtgtgtg cttgtggcag gtgggggcag agggtcctca ggccagagag ccactccccc 137940
agcgccagac caccctcttc ctcactcccc cacctcaccc cctcacaggt gcctcccagg 138000
ccatcagggc ccaaccaccc ctaaacaaat gggttctcgg cccctcgtgg ctggaggtgg 138060
gttctctcac cattcccagc ctaagactcc atccccatgc tggcagctgt tcaaccatgt 138120
ctagagagat ccactgtccc agacagcacc tcagggtccc ccgtcctgcc tggaaccctg 138180
taggaaactc cacaaaccgc cgccattctg tccacacccc tacaggagcc ccaaccctct 138240
ccccacatcc aggcttccct cccagacccc tcatccctgc ccgcacggtg cctgaggggg 138300
ccttcttggg cagcgcctaa gcaagccccc agcacccttc ggccccttca aggcacacag 138360
gccccctttc cacccagcct caggaaacca cctgtgtcct ccaacgacag gtcccagcct 138420
cccagccttt gccttgcctg ttcctctccc tggaactctg ccccgacaca gaccctcccc 138480
agcaagcccg caggggcacc tcccctgccc ccagacaccc tgtgcccgtc agttcatccc 138540
cagcagaggc cctcaccagg cacaccccca tgctcacacc tggccccagg cctcagcctc 138600
cctgagggcc ccacccagcc cgcgtctggc cagtggtgcg tgcaaagccc ctcacccaga 138660
ctcggcggaa ggcagccagt gcaggcctgg ggaggggctc tccttagacc accttgcacc 138720
ttccctggca cccaccatgg gaagagctga gactcactga ggaccagctg aggctcagag 138780
aagggaccca gcactggtgg acacgcaggg agcccacgcc agggcgccgt ggtgagtgag 138840
gcccagtgcc acccactgag gcctcccgtt cagtgggacg acggtgaaca ggtggaacca 138900
accaggcaac ccccgccggg ccccacagac gggatcagag caggaaaggc ttcctgcccc 138960
tgcaggccag cgaggagccc tggcgggggc cgtggccctc caggcgagga ggctcccctg 139020
gccaccgcca cccgggcctc tctgctgctg ggaaaacaag tcagaaagca agtggatgag 139080
aggtggcgtg acagacccag cttcagatct gctctaattt acaaaagaaa aggaaaaaca 139140
cacttggcag ccttcagcac tctaatgatt cttaacagca gcaaattatt ggcacaagac 139200
tccagagtga ctggcagggt tgagggctgg ggtctcccac gtgttttggg gctaacagcg 139260
gaagggagag cactggcaaa ggtgctgggg gcccctggac ccgacccgcc ctggagaccg 139320
cagccacatc agcccccagc cccacaggcc ccctaccagc cgcagggttt tggctgagct 139380
gagaaccact gtgctaactg gggacacagt gattggcagc tctacaaaaa ccatgctccc 139440
ccgggacccc gggctgtggg tttctgtagc ccctggctca gggctgactc accgtggctg 139500
aatacttcca gcactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt gagtctgctg 139560
tctggggata gcggggagcc aggtgtactg ggccaggcaa gggctttggc ttcagacttg 139620
gggacaggtg ctcagcaaag gaggtcggca ggagggcgga gggtgtgttt ttgtatggga 139680
gaagcaggag ggcagaggct gtgctactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg 139740
gtcactgtct cctcaggtga gtcccactgc agccccctcc cagtcttctc tgtccaggca 139800
ccaggccagg tatctggggt ctgcagccgg cctgggtctg gcctgaggcc acaccagctg 139860
ccatccctgg ggtctccgcc atgggctgca tgccagagcc ctgctgtcac ttagccctgg 139920
ggccagctgg agcccccaag gacaggcagg gaccccgctg ggcttcagcc ccgtcaggga 139980
ccctccacag gtagcaagca ggccgagggc agggacggga aggagaagtt gtgggcagag 140040
cctgggctgg ggctgggcgc tggctgttca tgtgccgggg accaggcctg cgctttagtg 140100
tggctacaag tgcttggagc actggggcca gggcagcccg gccaccgtct ccctgggaac 140160
gtcacccctc cctgcctggg tctcagcccg ggggtctgtg tggctgggga cagggacgcc 140220
ggctgcctct gctctgtgct tgggccatgt gacccattcg agtgtcctgc acgggcacag 140280
gtttgtgtct gggcaggaac agggactgtg tccctgtgtg atgcttttga tatctggggc 140340
caagggacaa tggtcaccgt ctcttcaggt aagatggctt tccttctgcc tcctttctct 140400
gggcccagcg tcctctgtcc tggagctggg agataatgtc cgggggctcc ttggtctgcg 140460
ctgggccatg tggggccctc cggggctcct tctccggctg tttgggacca cgttcagcag 140520
aaggcctttc tttgggaact gggactctgc tgctggggca aagggtgggc agagtcatgc 140580
ttgtgctggg gacaaaatga ccttgggaca cggggctggc tgccacggcc ggcccgggac 140640
agtcggagag tcaggttttt gtgcacccct taatggggcc tcccacaatg tgactacttt 140700
gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag gtgagtcctc acaacctctc 140760
tcctgcttta actctgaagg gttttgctgc atttttgggg ggaaataagg gtgctgggtc 140820
tcctgccaag agagccccgg agcagcctgg ggggctcagg aggatgccct gaggcaacag 140880
cggccacaca gacgaggggc aagggctcca gatgctcctt cctcctgagc ccagcagcac 140940
gggtctctct gtggccaggg ccaccctagg cctctggggt ccaatgccca acaacccccg 141000
ggccctcccc gggctcagtc tgagagggtc ccagggacgt agcggggcgc cagttcttgc 141060
ctggggtcct ggcattgttg tcacaatgtg acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa 141120
ccctggtcac cgtctcctca ggtgagtcct caccaccccc tctctgagtc cacttaggga 141180
gactcagctt gccagggtct cagggtcaga gtcttggagg cattttggag gtcaggaaag 141240
aaagccgggg agagggaccc ttcgaatggg aacccagcct gtcctcccca agtccggcca 141300
cagatgtcgg cagctggggg gctccttcgg ctggtctggg gtgacctctc tccgcttcac 141360
ctggagcatt ctcaggggct gtcgtgatga ttgcgtggtg ggactctgtc ccgctccaag 141420
gcacccgctc tctgggacgg gtgccccccg gggtttttgg actcctgggg gtgacttagc 141480
agccgtctgc ttgcagttgg acttcccagg ccgacagtgg tctggcttct gaggggtcag 141540
gccagaatgt ggggtacgtg ggaggccagc agagggttcc atgagaaggg caggacaggg 141600
ccacggacag tcagcttcca tgtgacgccc ggagacagaa ggtctctggg tggctgggtt 141660
tttgtggggt gaggatggac attctgccat tgtgattact actactacta cggtatggac 141720
gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggta agaatggcca ctctagggcc 141780
tttgttttct gctactgcct gtggggtttc ctgagcattg caggttggtc ctcggggcat 141840
gttccgaggg gacctgggcg gactggccag gaggggacgg gcactggggt gccttgagga 141900
tctgggagcc tctgtggatt ttccgatgcc tttggaaaat gggactcagg ttgggtgcgt 141960
ctgatggagt aactgagcct ctagactgag cattgcagac taatcttgga tatttgtccc 142020
tgagggagcc ggctgagaga agttgggaaa taaactgtct agggatctca gagcctttag 142080
gacagattat ctccacatct ttgaaaaact aagaatctgt gtgatggtgt tggtggagtc 142140
cctggatgat gggataggga ctttggaggc tcatttgagg gagatgctaa aacaatccta 142200
tggctggagg gatagttggg gctgtagttg gagattttca gtttttagaa taaaagtatt 142260
agctgcggaa tatacttcag gaccacctct gtgacagcat ttatacagta tccgatgcat 142320
agggacaaag agtggagtgg ggcactttct ttagatttgt gaggaatgtt ccacactaga 142380
ttgtttaaaa cttcatttgt tggaaggaga gctgtcttag tgattgagtc aagggagaaa 142440
ggcatctagc ctcggtctca aaagggtagt tgctgtctag agaggtctgg tggagcctgc 142500
aaaagtccag ctttcaaagg aacacagaag tatgtgtatg gaatattaga agatgttgct 142560
tttactctta agttggttcc taggaaaaat agttaaatac tgtgacttta aaatgtgaga 142620
gggttttcaa gtactcattt ttttaaatgt ccaaaattct tgtcaatcag tttgaggtct 142680
tgtttgtgta gaactgatat tacttaaagt ttaaccgagg aatgggagtg aggctctctc 142740
ataacctatt cagaactgac ttttaacaat aataaattaa gtttcaaata tttttaaatg 142800
aattgagcaa tgttgagttg gagtcaagat ggccgatcag aaccagaaca cctgcagcag 142860
ctggcaggaa gcaggtcatg tggcaaggct atttggggaa gggaaaataa aaccactagg 142920
taaacttgta gctgtggttt gaagaagtgg ttttgaaaca ctctgtccag ccccaccaaa 142980
ccgaaagtcc aggctgagca aaacaccacc tgggtaattt gcatttctaa aataagttga 143040
ggattcagcc gaaactggag aggtcctctt ttaacttatt gagttcaacc ttttaatttt 143100
agcttgagta gttctagttt ccccaaactt aagtttatcg acttctaaaa tgtatttaga 143160
attcattttc aaaattaggt tatgtaagaa attgaaggac tttagtgtct ttaatttcta 143220
atatatttag aaaacttctt aaaattactc tattattctt ccctctgatt attggtctcc 143280
attcaattct tttccaatac ccgaagcatt tacagtgact ttgttcatga tcttttttag 143340
ttgtttgttt tgccttacta ttaagacttt gacattctgg tcaaaacggc ttcacaaatc 143400
tttttcaaga ccactttctg agtattcatt ttaggagaaa gacttttttt ttaaatgaat 143460
gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg tggttgagag gacactcagt 143520
cagtcagtga cgtgaagggc ttctaagcca gtccacatgc tctgtgtgaa ctccctctgg 143580
ccctgcttat tgttgaatgg gccaaaggtc tgagaccagg ctgctgctgg gtaggcctgg 143640
actttgggtc tcccacccag acctgggaat gtatggttgt ggcttctgcc acccatccac 143700
ctggctgctc atggaccagc cagcctcggt ggctttgaag gaacaattcc acacaaagac 143760
tctggacctc tccgaaacca ggcaccgcaa atggtaagcc agaggcagcc acagctgtgg 143820
ctgctgctct taaagcttgt aaactgtttc tgcttaagag ggactgagtc ttcagtcatt 143880
gctttagggg gagaaagaga catttgtgtg tcttttgagt accgttgtct gggtcactca 143940
catttaactt tccttgaaaa actagtaaaa gaaaaatgtt gcctgttaac caataatcat 144000
agagctcatg gtactttgag gaaatcttag aaagcgtgta tacaattgtc tggaattatt 144060
tcagttaagt gtattagttg aggtactgat gctgtctcta cttcagttat acatgtgggt 144120
ttgaattttg aatctattct ggctcttctt aagcagaaaa tttagataaa atggatacct 144180
cagtggtttt taatggtggg tttaatatag aaggaattta aattggaagc taatttagaa 144240
tcagtaagga gggacccagg ctaagaaggc aatcctggga ttctggaaga aaagatgttt 144300
ttagttttta tagaaaacac tactacattc ttgatctaca actcaatgtg gtttaatgaa 144360
tttgaagttg ccagtaaatg tacttcctgg ttgttaaaga atggtatcaa aggacagtgc 144420
ttagatccga ggtgagtgtg agaggacagg ggctggggta tggatacgca gaaggaaggc 144480
cacagctgta cagaattgag aaagaataga gacctgcagt tgaggccagc aggtcggctg 144540
gactaactct ccagccacag taatgaccca gacagagaaa gccagactca taaagcttgc 144600
tgagcaaaat taagggaaca aggttgagag ccctagtaag cgaggctcta aaaagcacag 144660
ctgagctgag atgggtgggc ttctctgagt gcttctaaaa tgcgctaaac tgaggtgatt 144720
actctgaggt aagcaaagct gggcttgagc caaaatgaag tagactgtaa tgaactggaa 144780
tgagctgggc cgctaagcta aactaggctg gcttaaccga gatgagccaa actggaatga 144840
acttcattaa tctaggttga atagagctaa actctactgc ctacactgga ctgttctgag 144900
ctgagatgag ctggggtgag ctcagctatg ctacgctgtg ttggggtgag ctgatctgaa 144960
atgagatact ctggagtagc tgagatgggg tgagatgggg tgagctgagc tgggctgagc 145020
tagactgagc tgagctaggg tgagctgagc tgggtgagct gagctaagct ggggtgagct 145080
gagctgagct tggctgagct agggtgagct gggctgagct ggggtgagct gagctgagct 145140
ggggtaagct gggatgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct 145200
gagctggggt gagctgggct gagctgggct gagctgggct gagctggggt gagctgagct 145260
ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct ggggtgagct 145320
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gagctgagct 145380
ggggtgagct gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct 145440
ggggtgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct gagctggggt 145500
gagctgggct gagctggggt gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct 145560
gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gggctgagct gagctgagct gagctgagct 145620
gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct 145680
ggggtgagct gagctgagct gggctgagct ggggtgagct gggctgagct gggctgagct 145740
gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctgggct gagctgagct 145800
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct ggggtgagct 145860
gagctgagct gggctgagca gggctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct 145920
gggctgagct gggctgagct gagctgagct gggctgagct gggctgagct gggctgagct 145980
gggctgagct gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctggggt gagctgagct 146040
ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct 146100
gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctagggt gaactgggct 146160
gggtgagctg gagtgagctg agctgaggtg aactggggtg agccgggatg ttttgagttg 146220
agctggggta agatgagctg aactggggta aactgggatg agctgtggtg agcggagctg 146280
gattgaactg agctgtgtga gctgagctgg ggtcagctga gcaagagtga gtagagctgg 146340
ctggccagaa ccagaatcaa ttaggctaag tgagccagat tgtgctggga tcagctgtac 146400
tcagatgagc tgggatgagg taggctggga tgagctgggc tagctgacat ggattatgtg 146460
aggctgagct agcatgggct ggcctagctg atgagctaag cttgaatgag cggggctgag 146520
ctggactcag atgtgctaga ctgagctgta ctggatgatc tggtgtaggg tgatctggac 146580
tcaactgggc tggctgatgg gatgcgccag gttgaactag gctcagataa gttaggctga 146640
gtagggcctg gttgagatgg ttcgggatga gctgggaaaa gatggactcg gaccatgaac 146700
tgggctgagc tgggttggga gaccatgaat tgagctgaac tgagtgcagc tgggataaac 146760
tgggttgagc taagaataga ctacctgaat tgtgccaaac tcggctggga tcaattggaa 146820
attatcagga tttagatgag ccggactaaa ctatgctgag ctggactggt tggatgtgtt 146880
gaactggcct gctgctgggc tggcatagct gagttgaact taaatgagga aggctgagca 146940
aggctagcct gcttgcatag agctgaactt tagcctagcc tgagctggac cagcctgagc 147000
tgagtaggtc taaactgagt taaaaatcaa cagggataat ttaacagcta atttaacaag 147060
cctgaggtct gagattgaat gagcagagct gggatgaact gaatgagttt caccaggcct 147120
ggaccagtta ggctaggacc tcgttctata gaggcagact gtgtgctaca gtggagtttc 147180
aagatgattc catgagtcct ccccgccccc aacataaccc accttcctcc taccctacac 147240
gcctgtctgg tgtgtaaatc ccagctttgt gtgctgatac agaagcctga gcccctcccc 147300
cacctccacc tacctattac tttgggatga gaatagttct cccagccagt gtctcagagg 147360
gaagccaagc aggacaggcc caaggctact tgagaagcca ggatctaggc ctctccctga 147420
gaacgggtgt tcatgcccct agagttggct gaagggccag atccacctac tctagaggca 147480
tctctccctg tctgtgaagg cttccaaagt cacgttcctg tggctagaag gcagctccat 147540
agccctgctg cagtttcgtc ctgtatacca ggttcaccta ctaccatatc tagccctgcc 147600
tgccttaaga gtagcaacaa ggaaatagca gggtgtagag ggatctcctg tctgacagga 147660
ggcaagaaga cagattctta cccctccatt tctcttttat ccctctctgg tcctcagaga 147720
gtcagtcctt cccaaatgtc ttccccctcg tctcctgcga gagccccctg tctgataaga 147780
atctggtggc catgggctgc ctggcccggg acttcctgcc cagcaccatt tccttcacct 147840
ggaactacca gaacaacact gaagtcatcc agggtatcag aaccttccca acactgagga 147900
cagggggcaa gtacctagcc acctcgcagg tgttgctgtc tcccaagagc atccttgaag 147960
gttcagatga atacctggta tgcaaaatcc actacggagg caaaaacaaa gatctgcatg 148020
tgcccattcc aggtaagaac caaaccctcc cagcaggggt gcccaggccc aggcatggcc 148080
cagagggagc agcggggtgg ggcttaggcc aagctgagct cacaccttga cctttcattc 148140
cagctgtcgc agagatgaac cccaatgtaa atgtgttcgt cccaccacgg gatggcttct 148200
ctggccctgc accacgcaag tctaaactca tctgcgaggc cacgaacttc actccaaaac 148260
cgatcacagt atcctggcta aaggatggga agctcgtgga atctggcttc accacagatc 148320
cggtgaccat cgagaacaaa ggatccacac cccaaaccta caaggtcata agcacactta 148380
ccatctctga aatcgactgg ctgaacctga atgtgtacac ctgccgtgtg gatcacaggg 148440
gtctcacctt cttgaagaac gtgtcctcca catgtgctgc cagtgagtgg cctgggctaa 148500
gcccaatgcc tagccctccc agattaggga agtcctccta caattatggc caatgccacc 148560
cagacatggt catttgctcc ttgaactttg gctccccaga gtggccaagg acaagaatga 148620
gcaataggca gtagaggggt gagaatcagc tggaaggacc agcatcttcc cttaagtagg 148680
tttgggggat ggagactaag cttttttcca acttcacaac tagatatgtc ataacctgac 148740
acagtgttct cttgactgca ggtccctcca cagacatcct aaccttcacc atccccccct 148800
cctttgccga catcttcctc agcaagtccg ctaacctgac ctgtctggtc tcaaacctgg 148860
caacctatga aaccctgaat atctcctggg cttctcaaag tggtgaacca ctggaaacca 148920
aaattaaaat catggaaagc cctcccaatg gcaccttcag tgctaagggt gtggctagtg 148980
tttgtgtgga agactggaat aacaggaagg aatttgtgcg tactgtgact cacagggatc 149040
tgccttcacc acagaagaaa ttcatctcaa aacccaatgg taggtatccc cccttccctt 149100
cccctccaat tgcaggaccc ttcctgtacc tcatagggag ggcaggtcct cttccaccct 149160
atcctcacta ctgtcttcat ttacagaggt gcacaaacat ccacctgctg tgtacctgct 149220
gccaccagct cgtgagcaac tgaacctgag ggagtcagcc acagtcacct gcctggtgaa 149280
gggcttctct cctgcagaca tcagtgtgca gtggcttcag agagggcaac tcttgcccca 149340
agagaagtat gtgaccagtg ccccgatgcc agagcctggg gccccaggct tctactttac 149400
ccacagcatc ctgactgtga cagaggagga atggaactcc ggagagacct atacctgtgt 149460
tgtaggccac gaggccctgc cacacctggt gaccgagagg accgtggaca agtccactgg 149520
taaacccaca ctgtacaatg tctccctgat catgtctgac acaggcggca cctgctattg 149580
accatgctag cgctcaacca ggcaggccct gggtgtccag ttgctctgtg tatgcaaact 149640
aaccatgtca gagtgagatg ttgcatttta taaaaattag aaataaaaaa aatccattca 149700
aacgtcactg gttttgatta tacaatgctc atgcctgctg agacagttgt gttttgcttg 149760
ctctgcacac accctgcata cttgcctcca ccctggccct tcctctacct tgccagtttc 149820
ctccttgtgt gtgaactcag tcaggcttac aacagacaga gtatgaacat gcgattcctc 149880
cagctacttc tagatatatg gctgaaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc 149940
cccgggtacc gagctcgaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg 150000
ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 150060
atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 150120
agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 150180
gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 150240
taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgaa ccccttgc 150288
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 71
ggaaggtgtg cacaccgctg gac 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 72
ggaaggtgtg cacaccactg gac 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 73
ggaaggtgtg cacactgctg gac 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 74
agactgtgcg cacaccgctg gac 23
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 75
tcttatcaga cagggggctc tc 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 76
aagaagcaca cgactgaggc ac 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> variation
<222> (12)...(12)
<223> w = a or t
<220>
<223> synthetic
<400> 77
agtggataga cwgatggggg tg 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 78
agtggataga ccgatggggc tg 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 79
aagggataga cagatggggc tg 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
ggaagacatt tgggaaggac tg 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 81
ggaagatgga tacagttggt gc 22
<---
Claims (41)
1. Грызун, который представляет собой крысу или мышь, для продуцирования вариабельного домена тяжелой цепи человека, содержащий в геноме своей зародышевой линии ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся наличием единственного нереаранжированного генного сегмента VH человека, одного или нескольких нереаранжированных генных сегментов DH человека и одного или нескольких нереаранжированных генных сегментов JH человека,
при этом единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека, один или несколько нереаранжированных генных сегментов DH человека и один или несколько нереаранжированных генных сегментов JH человека функционально связаны с эндогенной генной последовательностью константной области, содержащей эндогенный IgM ген,
при этом единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека является представителем семейства VH3-сегмента, и
при этом грызун дополнительно содержит разнообразный репертуар реаранжированных генов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, каждый из которых связан с эндогенной генной последовательностью константной области и происходит из ограниченного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.
2. Грызун по п. 1, при этом грызун содержит делецию эндогенных генных сегментов VH, DH и/или JH.
3. Грызун по п. 1 или 2, у которого единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека выбирают из VH3-7-генного сегмента, VH3-9-генного сегмента, VH3-11-генного сегмента, VH3-13-генного сегмента, VH3-15-генного сегмента, VH3-16-генного сегмента, VH3-20-генного сегмента, VH3-21-генного сегмента, VH3-23-генного сегмента, VH3-30-генного сегмента, a VH3-30-3-генного сегмента, VH3-30-5-генного сегмента, VH3-33-генного сегмента, VH3-35-генного сегмента, VH3-38-генного сегмента, VH3-43-генного сегмента, VH3-48-генного сегмента, VH3-49-генного сегмента, VH3-53-генного сегмента, VH3-64-генного сегмента, VH3-66-генного сегмента, VH3-72-генного сегмента, VH3-73-генного сегмента, VH3-74-генного сегмента и их полиморфных вариантов, способных к реаранжировке и образованию реаранжированного вариабельного домена тяжелой цепи с одним или несколькими сегментами DH и одним или несколькими сегментами JH.
4. Грызун по любому из пп. 1-3, у которого
(i) единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека,
(ii) один или несколько нереаранжированных генных сегментов DH человека и
(iii) один или несколько нереаранжированных генных сегментов JH человека замещают
(I) множество эндогенных генных сегментов VH,
(II) все эндогенные генные сегменты DH и
(III) все эндогенные генные сегменты JH соответственно.
5. Грызун по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащий один или несколько нереаранжированных генных сегментов VL иммуноглобулина человека, функционально связанных с одним или несколькими нереаранжированными генными сегментами JL человека.
6. Грызун по п. 5, у которого один или несколько нереаранжированных генных сегментов VL человека и/или один или несколько нереаранжированных генных сегментов JL человека выбирают из генных сегментов κ и λ человека.
7. Грызун по п. 6, у которого один или несколько нереаранжированных генных сегментов VL иммуноглобулина человека и один или несколько нереаранжированных генных сегментов JL человека функционально связаны с эндогенным геном константной области легкой цепи.
8. Грызун по п. 7, у которого эндогенный ген константной области легкой цепи представляет собой эндогенный ген константной области κ или λ.
9. Грызун по любому из пп. 1-8, дополнительно содержащий один или несколько нереаранжированных генных сегментов Vκ человека и один или несколько нереаранжированных генных сегментов Jκ человека, функционально связанных с эндогенным геном константной области κ.
10. Грызун по любому из предыдущих пунктов, у которого все или по существу все эндогенные генные сегменты VH, DH и JH в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина заменены на указанный единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека, указанный один или несколько нереаранжированных генных сегментов DH человека и указанный один или несколько нереаранжированных генных сегментов JH человека.
11. Грызун по п. 10, у которого все или по существу все эндогенные генные сегменты VH, DH и JH в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина заменены на указанный единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека, множество нереаранжированных генных сегментов DH человека и все нереаранжированные генные сегменты JH человека.
12. Грызун по п. 11, у которого все или по существу все эндогенные генные сегменты VH, DH и JH в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина заменены на указанный единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека, все нереаранжированные генные сегменты DH человека и все нереаранжированные генные сегменты JH человека.
13. Грызун по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий замену в эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VL и JL одним или несколькими нереаранжированными VL и одним или несколькими нереаранжированными JL генными сегментами человека.
14. Клетка для продуцирования вариабельного домена тяжелой цепи человека, полученная из грызуна по любому из пп. 1-13, при этом геном клетки содержит
ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся наличием единственного нереаранжированного генного сегмента VH человека, одного или нескольких нереаранжированных генных сегментов DH человека и одного или нескольких нереаранжированных генных сегментов JH человека,
при этом единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека, один или несколько нереаранжированных генных сегментов DH человека и один или несколько нереаранжированных генных сегментов JH человека функционально связаны с эндогенной генной последовательностью константной области, содержащей эндогенный IgM ген, и
при этом единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека является представителем семейства VH3-сегмента.
15. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, включающий:
(а) амплификацию нуклеиновой кислоты, содержащей реаранжированный ген вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека из лимфоцита грызуна по любому из пп. 1-13 или из гибридомы, полученной из указанного лимфоцита,
при этом указанный лимфоцит или гибридома, полученная из указанного лимфоцита содержит один из разнообразного репертуара реаранжированных генов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
16. Применение грызуна по любому из пп. 1-13 для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи человека.
17. Применение по п. 16, при котором вариабельный домен тяжелой цепи человека характеризуется наличием последовательностей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 человека, происходящих из полиморфного генного сегмента VH человека, способного к реаранжировке и образованию реаранжированного вариабельного домена тяжелой цепи с одним или несколькими сегментами DH и одним или несколькими сегментами JH.
18. Применение по п. 16 или 17, при котором генный сегмент VH человека выбран из VH3-7-генного сегмента, VH3-9-генного сегмента, VH3-11-генного сегмента, VH3-13-генного сегмента, VH3-15-генного сегмента, VH3-16-генного сегмента, VH3-20-генного сегмента, VH3-21-генного сегмента, VH3-23-генного сегмента, VH3-30-генного сегмента, а VH3-30-3-генного сегмента, VH3-30-5-генного сегмента, VH3-33-генного сегмента, VH3-35-генного сегмента, VH3-38-генного сегмента, VH3-43-генного сегмента, VH3-48-генного сегмента, VH3-49-генного сегмента, VH3-53-генного сегмента, VH3-64-генного сегмента, VH3-66-генного сегмента, VH3-72-генного сегмента, VH3-73-генного сегмента, VH3-74-генного сегмента человека.
19. Применение грызуна по любому из пп. 1-13 для получения антитела человека, при котором антитело человека содержит вариабельный домен тяжелой цепи, происходящий из реаранжированного представителя семейства VH3-сегмента или его полиморфного варианта, при этом полиморфный вариант способен к реаранжировке и образованию реаранжированного вариабельного домена тяжелой цепи с одним или несколькими сегментами DH и одним или несколькими сегментами JH.
20. Клетка по п. 14, при этом клетка представляет собой лимфоцит или гибридому, полученную из указанного лимфоцита.
21. Способ по п. 15, дополнительно включающий иммунизацию грызуна представляющим интерес антигеном перед амплификацией нуклеиновой кислоты.
22. Способ по п. 15, в котором реаранжированная последовательность гена области VH иммуноглобулина человека содержит по меньшей мере одну соматическую гипермутацию.
23. Способ по п. 15, в котором лимфоцит специфически связывает представляющий интерес антиген.
24. Тотипотентная клетка грызуна для получения грызуна, которая продуцирует вариабельный домен тяжелой цепи человека, содержащая в своем геноме ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся наличием единственного нереаранжированного генного сегмента VH человека, одного или нескольких нереаранжированных генных сегментов DH человека и одного или нескольких нереаранжированных генных сегментов JH человека,
при этом единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека, один или несколько нереаранжированных генных сегментов DH человека и один или несколько нереаранжированных генных сегментов JH человека функционально связаны с эндогенной генной последовательностью константной области тяжелой цепи, содержащей эндогенный IgM ген,
при этом единственный нереаранжированный генный сегмент VH человека является представителем семейства VH3-сегмента, при этом клетка грызуна представляет собой клетку крысы или клетку мыши.
25. Тотипотентная клетка грызуна по п. 24, при этом тотипотентная клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161547974P | 2011-10-17 | 2011-10-17 | |
| US61/547,974 | 2011-10-17 | ||
| US201261597969P | 2012-02-13 | 2012-02-13 | |
| US61/597,969 | 2012-02-13 | ||
| US201261658459P | 2012-06-12 | 2012-06-12 | |
| US61/658,459 | 2012-06-12 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014118869/10A Division RU2603090C2 (ru) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021103052A Division RU2021103052A (ru) | 2021-02-09 | Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016139418A RU2016139418A (ru) | 2018-12-13 |
| RU2016139418A3 RU2016139418A3 (ru) | 2020-03-20 |
| RU2743589C2 true RU2743589C2 (ru) | 2021-02-20 |
Family
ID=47144131
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014118869/10A RU2603090C2 (ru) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина |
| RU2016139418A RU2743589C2 (ru) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014118869/10A RU2603090C2 (ru) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US10246509B2 (ru) |
| EP (3) | EP2627773B1 (ru) |
| JP (6) | JP6271435B2 (ru) |
| KR (6) | KR20240006704A (ru) |
| CN (3) | CN108200885B (ru) |
| AU (4) | AU2012326283C1 (ru) |
| BR (1) | BR112014008775A8 (ru) |
| CA (1) | CA2850534A1 (ru) |
| CY (2) | CY1119335T1 (ru) |
| DK (2) | DK2627773T3 (ru) |
| ES (2) | ES2906462T3 (ru) |
| HR (2) | HRP20220253T1 (ru) |
| HU (2) | HUE034321T2 (ru) |
| IL (5) | IL292030B2 (ru) |
| IN (1) | IN2014CN03572A (ru) |
| LT (2) | LT3216871T (ru) |
| MX (1) | MX355062B (ru) |
| MY (1) | MY172946A (ru) |
| PL (2) | PL3216871T3 (ru) |
| PT (2) | PT3216871T (ru) |
| RS (2) | RS62942B1 (ru) |
| RU (2) | RU2603090C2 (ru) |
| SG (3) | SG11201401181YA (ru) |
| SI (2) | SI3216871T1 (ru) |
| WO (1) | WO2013059230A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201402455B (ru) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2564695T3 (en) | 2009-07-08 | 2015-05-26 | Kymab Ltd | Animal models and therapeutic molecules |
| US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| WO2011097603A1 (en) | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
| SG10201912639SA (en) | 2010-08-02 | 2020-02-27 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| ME02106B (me) | 2011-02-25 | 2015-10-20 | Regeneron Pharma | Miševi sa adam6 |
| IL273982B2 (en) | 2011-08-05 | 2023-03-01 | Regeneron Pharma | Humanized mice possess a universal light chain |
| CN107056936B (zh) | 2011-09-19 | 2021-09-03 | 科马布有限公司 | 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂 |
| WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| PT3216871T (pt) * | 2011-10-17 | 2022-03-15 | Regeneron Pharma | Ratos com cadeia pesada de imunoglobulina restrita |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| SG10201913164YA (en) | 2011-12-20 | 2020-03-30 | Regeneron Pharma | Humanized light chain mice |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
| CA2876172C (en) | 2012-06-12 | 2021-01-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci |
| JP5993102B2 (ja) * | 2013-02-20 | 2016-09-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 修飾された免疫グロブリン重鎖配列を有する非ヒト動物 |
| US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
| US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
| US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
| EP3051942B1 (en) | 2013-10-01 | 2020-09-02 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US10034463B2 (en) | 2014-01-24 | 2018-07-31 | Children's Medical Center Corporation | High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities |
| RU2016141307A (ru) | 2014-03-21 | 2018-04-24 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Отличные от человека животные, которые вырабатывают однодоменные связывающие белки |
| JP2017510273A (ja) | 2014-03-21 | 2017-04-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 異なる結合特性を示すｖｌ抗原結合タンパク質 |
| DK3248986T3 (da) | 2014-05-16 | 2022-04-04 | Ablynx Nv | Variable immunoglobulindomæner |
| SG10201810124PA (en) | 2014-05-16 | 2018-12-28 | Ablynx Nv | Improved immunoglobulin variable domains |
| AU2016232715A1 (en) | 2015-03-19 | 2017-09-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
| RU2763320C2 (ru) | 2016-01-13 | 2021-12-28 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Грызуны, имеющие сконструированный участок разнообразия тяжелой цепи |
| EP3416479A1 (en) | 2016-02-16 | 2018-12-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a mutant kynureninase gene |
| EP3457840B1 (en) | 2016-05-20 | 2024-04-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas |
| DK3462853T3 (da) | 2016-06-03 | 2023-04-03 | Regeneron Pharma | Gnavere, der udtrykker exogen, terminal deoxynukleotidyltransferase |
| WO2018128691A1 (en) | 2016-11-04 | 2018-07-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus |
| CN108265035A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 深圳先进技术研究院 | 一种进化噬菌体宿主特异性的方法 |
| JP7430636B2 (ja) | 2017-12-05 | 2024-02-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 操作された免疫グロブリンラムダ軽鎖を有する非ヒト動物及びその使用 |
| AU2019242551A1 (en) | 2018-03-24 | 2020-10-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified non-human animals for generating therapeutic antibodies against peptide-MHC complexes, methods of making and uses thereof |
| EP3772926A1 (en) | 2018-03-26 | 2021-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized rodents for testing therapeutic agents |
| HRP20220509T8 (hr) | 2018-06-14 | 2022-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ne-humane životinje sposobne za dh-dh preraspodjelu kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina |
| JP2022535418A (ja) | 2019-06-05 | 2022-08-08 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | カッパ遺伝子座から発現される限られたラムダ軽鎖レパートリーを有する非ヒト動物及びその使用 |
| JP2023504172A (ja) | 2019-12-02 | 2023-02-01 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ペプチド－ｍｈｃ ｉｉタンパク質構築物およびそれらの使用 |
| CA3187680A1 (en) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | Yashu Liu | Identification and production of antigen-specific antibodies |
| CN116848254A (zh) | 2020-12-16 | 2023-10-03 | 瑞泽恩制药公司 | 表达人源化Fcα受体的小鼠 |
| TW202241934A (zh) | 2020-12-23 | 2022-11-01 | 美商再生元醫藥公司 | 編碼錨定修飾抗體之核酸及其用途 |
| WO2023179620A1 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-28 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin and mhc loci |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009097006A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-08-06 | Medarex, Inc. | Hco32 and hco27 and related examples |
| RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
Family Cites Families (83)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| WO1991000906A1 (en) | 1989-07-12 | 1991-01-24 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies |
| US6657103B1 (en) | 1990-01-12 | 2003-12-02 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| JP3068180B2 (ja) | 1990-01-12 | 2000-07-24 | アブジェニックス インコーポレイテッド | 異種抗体の生成 |
| US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| US6255458B1 (en) * | 1990-08-29 | 2001-07-03 | Genpharm International | High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin |
| US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US7041871B1 (en) | 1995-10-10 | 2006-05-09 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| AU6819494A (en) | 1993-04-26 | 1994-11-21 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| CA2761116A1 (en) * | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| KR20080059467A (ko) | 1996-12-03 | 2008-06-27 | 아브게닉스, 인크. | 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체 |
| CN1203922A (zh) | 1997-03-21 | 1999-01-06 | 三共株式会社 | 人源化抗人fas抗体 |
| US20020062010A1 (en) | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| FI105105B (fi) * | 1998-02-27 | 2000-06-15 | Finnish Immunotechnology Ltd O | Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan |
| WO2000073323A2 (en) | 1999-05-27 | 2000-12-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Adam polynucleotides and polypeptides |
| RU2262511C2 (ru) * | 2000-05-18 | 2005-10-20 | Джапан Тобакко, Инк. | Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение |
| US20020028488A1 (en) * | 2000-06-19 | 2002-03-07 | Sujay Singh | Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies |
| AU2001284703B2 (en) | 2000-08-03 | 2007-03-22 | Therapeutic Human Polyclonals Inc. | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| TWI255272B (en) | 2000-12-06 | 2006-05-21 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
| US7034134B2 (en) | 2001-04-26 | 2006-04-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29 |
| AU2002309063B8 (en) | 2001-05-11 | 2008-04-24 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Artificial human chromosome containing human antibody lambda light chain gene |
| US20030108925A1 (en) | 2001-10-05 | 2003-06-12 | U.S. Epa | Genetic testing for male factor infertility |
| US20060199204A1 (en) | 2001-10-05 | 2006-09-07 | U.S. Epa | Genetic testing for male factor infertility |
| SI1523496T1 (sl) | 2002-07-18 | 2011-11-30 | Merus B V | Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles |
| GB0228210D0 (en) | 2002-12-03 | 2003-01-08 | Babraham Inst | Single chain antibodies |
| AR044388A1 (es) | 2003-05-20 | 2005-09-07 | Applied Molecular Evolution | Moleculas de union a cd20 |
| WO2004106375A1 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
| US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
| ES2473596T3 (es) | 2003-07-15 | 2014-07-07 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Loci de inmunoglobulina humanizada |
| US20050153392A1 (en) | 2003-08-11 | 2005-07-14 | Roland Buelow | Transgenesis with humanized immunoglobulin loci |
| EP2272566A3 (en) | 2003-08-18 | 2013-01-02 | MedImmune, LLC | Humanisation of antibodies |
| RU2251699C1 (ru) | 2003-09-25 | 2005-05-10 | Киселев Всеволод Иванович | Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака |
| WO2005038001A2 (en) | 2003-10-14 | 2005-04-28 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer |
| WO2006029459A1 (en) * | 2004-09-13 | 2006-03-23 | Evogenix, Inc | Antibodies specific for hepatocellular carcinoma and other carcinomas and uses thereof |
| US20080196112A1 (en) | 2005-04-29 | 2008-08-14 | Innate Pharma, S.A. | Transgenic Animals and Methods of Making Recombinant Antibodies |
| AU2007219159B8 (en) | 2006-01-25 | 2012-06-28 | Roger Kingdon Craig | Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals |
| EP2003960B1 (en) | 2006-03-31 | 2015-06-10 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies |
| ATE537190T1 (de) | 2006-06-02 | 2011-12-15 | Regeneron Pharma | Hochaffine antikörper gegen den humanen il-6- rezeptor |
| WO2009138519A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Ablynx Nv | AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST CXCR4 AND OTHER GPCRs AND COMPOUNDS COMPRISING THE SAME |
| DK2336329T3 (da) | 2007-06-01 | 2013-01-07 | Omt Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til hæmning af endogene immunglobulingener og til produktion af transgene, humane, idiotypiske antistoffer |
| WO2009013620A2 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Homologous recombination |
| EP2201040A1 (en) * | 2007-09-24 | 2010-06-30 | Vanderbilt University | Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and uses thereof |
| NZ586149A (en) | 2007-12-10 | 2012-05-25 | Ablexis Llc | Methods for sequential replacement of targeted region by homologous recombination |
| NZ602884A (en) | 2008-04-11 | 2014-08-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly |
| CA2721231C (en) | 2008-04-14 | 2015-10-06 | Innovative Targeting Solutions Inc. | Sequence diversity generation in immunoglobulins |
| US20110123527A1 (en) | 2008-05-23 | 2011-05-26 | Hiroaki Shizuya | Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals |
| KR101826224B1 (ko) | 2008-09-30 | 2018-02-06 | 아블렉시스, 엘엘씨 | 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물 |
| CA2747534C (en) | 2008-12-18 | 2020-08-18 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use therof |
| GB0905023D0 (en) | 2009-03-24 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules |
| CN102471378B (zh) * | 2009-06-26 | 2014-04-02 | 瑞泽恩制药公司 | 容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体 |
| US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| DK2564695T3 (en) * | 2009-07-08 | 2015-05-26 | Kymab Ltd | Animal models and therapeutic molecules |
| MY172472A (en) | 2009-12-10 | 2019-11-26 | Regeneron Pharma | Mice that make heavy chain antibodies |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| WO2011097603A1 (en) | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
| US20130185821A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-07-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common Light Chain Mouse |
| US20120021409A1 (en) | 2010-02-08 | 2012-01-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common Light Chain Mouse |
| AU2011266843C9 (en) | 2010-06-17 | 2018-03-01 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| SG10201912639SA (en) | 2010-08-02 | 2020-02-27 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| EP2638155A1 (en) | 2010-11-08 | 2013-09-18 | Kymab Limited | Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination |
| ME02106B (me) * | 2011-02-25 | 2015-10-20 | Regeneron Pharma | Miševi sa adam6 |
| IL273982B2 (en) * | 2011-08-05 | 2023-03-01 | Regeneron Pharma | Humanized mice possess a universal light chain |
| CN107056936B (zh) | 2011-09-19 | 2021-09-03 | 科马布有限公司 | 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂 |
| WO2013041845A2 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Animals, repertoires & methods |
| WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| PT3216871T (pt) | 2011-10-17 | 2022-03-15 | Regeneron Pharma | Ratos com cadeia pesada de imunoglobulina restrita |
| GB2496375A (en) | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
| GB201122047D0 (en) | 2011-12-21 | 2012-02-01 | Kymab Ltd | Transgenic animals |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| SG10201913164YA (en) * | 2011-12-20 | 2020-03-30 | Regeneron Pharma | Humanized light chain mice |
| RS57118B1 (sr) | 2012-03-16 | 2018-06-29 | Regeneron Pharma | Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| WO2013144567A1 (en) | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies |
| CA2876172C (en) * | 2012-06-12 | 2021-01-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci |
| JP5993102B2 (ja) | 2013-02-20 | 2016-09-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 修飾された免疫グロブリン重鎖配列を有する非ヒト動物 |
| EP4218409A3 (en) | 2013-03-13 | 2023-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
-
2012
- 2012-10-17 PT PT171631153T patent/PT3216871T/pt unknown
- 2012-10-17 WO PCT/US2012/060487 patent/WO2013059230A1/en active Application Filing
- 2012-10-17 CN CN201710933685.9A patent/CN108200885B/zh active Active
- 2012-10-17 JP JP2014535991A patent/JP6271435B2/ja active Active
- 2012-10-17 KR KR1020237045077A patent/KR20240006704A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-10-17 RU RU2014118869/10A patent/RU2603090C2/ru active
- 2012-10-17 DK DK12783456.2T patent/DK2627773T3/en active
- 2012-10-17 RS RS20220181A patent/RS62942B1/sr unknown
- 2012-10-17 SI SI201231981T patent/SI3216871T1/sl unknown
- 2012-10-17 EP EP12783456.2A patent/EP2627773B1/en active Active
- 2012-10-17 IL IL292030A patent/IL292030B2/en unknown
- 2012-10-17 RU RU2016139418A patent/RU2743589C2/ru active
- 2012-10-17 EP EP17163115.3A patent/EP3216871B1/en active Active
- 2012-10-17 DK DK17163115.3T patent/DK3216871T3/da active
- 2012-10-17 PL PL17163115T patent/PL3216871T3/pl unknown
- 2012-10-17 PL PL12783456T patent/PL2627773T3/pl unknown
- 2012-10-17 CA CA2850534A patent/CA2850534A1/en active Pending
- 2012-10-17 KR KR1020217028212A patent/KR20210113419A/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-10-17 MX MX2014004354A patent/MX355062B/es active IP Right Grant
- 2012-10-17 SG SG11201401181YA patent/SG11201401181YA/en unknown
- 2012-10-17 CN CN201710933842.6A patent/CN108207807B/zh active Active
- 2012-10-17 US US13/653,456 patent/US10246509B2/en active Active
- 2012-10-17 ES ES17163115T patent/ES2906462T3/es active Active
- 2012-10-17 HR HRP20220253TT patent/HRP20220253T1/hr unknown
- 2012-10-17 KR KR1020197021940A patent/KR102148683B1/ko active IP Right Grant
- 2012-10-17 RS RS20170893A patent/RS56458B1/sr unknown
- 2012-10-17 LT LTEP17163115.3T patent/LT3216871T/lt unknown
- 2012-10-17 EP EP21208060.0A patent/EP4074833A1/en active Pending
- 2012-10-17 PT PT127834562T patent/PT2627773T/pt unknown
- 2012-10-17 KR KR1020207012383A patent/KR20200047786A/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-10-17 HU HUE12783456A patent/HUE034321T2/en unknown
- 2012-10-17 LT LTEP12783456.2T patent/LT2627773T/lt unknown
- 2012-10-17 ES ES12783456.2T patent/ES2640139T3/es active Active
- 2012-10-17 MY MYPI2014000810A patent/MY172946A/en unknown
- 2012-10-17 SG SG10202010120XA patent/SG10202010120XA/en unknown
- 2012-10-17 KR KR1020147013282A patent/KR20140082824A/ko active Search and Examination
- 2012-10-17 IN IN3572CHN2014 patent/IN2014CN03572A/en unknown
- 2012-10-17 AU AU2012326283A patent/AU2012326283C1/en active Active
- 2012-10-17 CN CN201280062449.XA patent/CN104024418B/zh active Active
- 2012-10-17 HU HUE17163115A patent/HUE057680T2/hu unknown
- 2012-10-17 SG SG10201602904VA patent/SG10201602904VA/en unknown
- 2012-10-17 SI SI201231055T patent/SI2627773T1/sl unknown
- 2012-10-17 KR KR1020167021090A patent/KR20160098514A/ko active Search and Examination
- 2012-10-17 BR BR112014008775A patent/BR112014008775A8/pt not_active Application Discontinuation
-
2013
- 2013-07-17 US US13/944,286 patent/US9932398B2/en active Active
-
2014
- 2014-03-31 IL IL231819A patent/IL231819A0/en active IP Right Grant
- 2014-04-01 ZA ZA2014/02455A patent/ZA201402455B/en unknown
-
2015
- 2015-11-12 JP JP2015222017A patent/JP2016039820A/ja active Pending
-
2016
- 2016-06-17 AU AU2016204127A patent/AU2016204127C1/en active Active
-
2017
- 2017-09-11 HR HRP20171357TT patent/HRP20171357T1/hr unknown
- 2017-09-12 CY CY20171100960T patent/CY1119335T1/el unknown
- 2017-09-27 JP JP2017186356A patent/JP2017221223A/ja active Pending
-
2018
- 2018-05-30 AU AU2018203811A patent/AU2018203811B2/en active Active
- 2018-08-20 IL IL261242A patent/IL261242A/en active IP Right Grant
- 2018-12-27 JP JP2018244321A patent/JP6770568B2/ja active Active
-
2019
- 2019-02-01 US US16/265,825 patent/US11261248B2/en active Active
- 2019-04-11 IL IL265967A patent/IL265967B/en active IP Right Grant
-
2020
- 2020-04-17 US US16/851,902 patent/US20200277371A1/en not_active Abandoned
- 2020-09-25 JP JP2020161346A patent/JP7022803B2/ja active Active
- 2020-12-18 AU AU2020289846A patent/AU2020289846A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-04-08 IL IL282200A patent/IL282200B/en unknown
- 2021-12-29 JP JP2021215393A patent/JP2022048158A/ja not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-01-19 US US17/579,185 patent/US20220177572A1/en active Pending
- 2022-02-07 CY CY20221100102T patent/CY1124972T1/el unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009097006A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-08-06 | Medarex, Inc. | Hco32 and hco27 and related examples |
| RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JANSSENS R. et al., Generation of heavy-chain-only antibodies in mice, Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, Vol.103, N.41, pp.15130-15135. * |
| RIECHMANN L. et al., Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains, J Immunol Methods, 1999, Vol.231, N.1-2, pp.25-38. * |
| TAYLOR L.D. et al., A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res., 1992, Vol.20, N.23, pp.6287-6295. * |
| TAYLOR L.D. et al., A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res., 1992, Vol.20, N.23, pp.6287-6295. JANSSENS R. et al., Generation of heavy-chain-only antibodies in mice, Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, Vol.103, N.41, pp.15130-15135. RIECHMANN L. et al., Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains, J Immunol Methods, 1999, Vol.231, N.1-2, pp.25-38. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2016204127B2 (en) | Restricted immunoglobulin heavy chain mice | |
| KR102266274B1 (ko) | 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물 | |
| KR102239125B1 (ko) | 인간 이디오타입을 갖는 설치류 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 동물 | |
| AU2023274083A1 (en) | Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject | |
| RU2770016C2 (ru) | Гуманизированные грызуны, которые экспрессируют тяжелые цепи, содержащие домены vl | |
| KR20180054871A (ko) | 다중화 게놈 편집 | |
| CN1852925A (zh) | 人源化免疫球蛋白基因座 | |
| KR20200126997A (ko) | 인간 대상체에서의 비-노화-관련 청각 손상의 치료를 위한 조성물 및 방법 | |
| KR102616160B1 (ko) | 저하된 상위 및 하위 운동 뉴런 기능 및 감각 지각을 나타내는 비-인간 동물 | |
| KR20190120170A (ko) | Vhh-함유 중쇄 항체 및 이의 생산 | |
| KR20220157944A (ko) | 인간 대상체에서 비-연령-연관 청각 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
| KR20190104400A (ko) | 다중 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 설치류 기원의 인간 항체 | |
| RU2797272C1 (ru) | Генетически модифицированные в отношении t-клеточного рецептора мыши |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Changing information about inventors |