RU2251699C1 - Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака - Google Patents

Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака Download PDF

Info

Publication number
RU2251699C1
RU2251699C1 RU2003128660/15A RU2003128660A RU2251699C1 RU 2251699 C1 RU2251699 C1 RU 2251699C1 RU 2003128660/15 A RU2003128660/15 A RU 2003128660/15A RU 2003128660 A RU2003128660 A RU 2003128660A RU 2251699 C1 RU2251699 C1 RU 2251699C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hpv
protein
cervical cancer
monoclonal antibodies
sample
Prior art date
Application number
RU2003128660/15A
Other languages
English (en)
Inventor
В.И. Киселев (RU)
В.И. Киселев
П.Г. Свешников (RU)
П.Г. Свешников
Original Assignee
Киселев Всеволод Иванович
Свешников Петр Георгиевич
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to RU2003128660/15A priority Critical patent/RU2251699C1/ru
Application filed by Киселев Всеволод Иванович, Свешников Петр Георгиевич filed Critical Киселев Всеволод Иванович
Priority to AT04775280T priority patent/ATE427963T1/de
Priority to JP2006527937A priority patent/JP2007537705A/ja
Priority to AU2004274368A priority patent/AU2004274368B2/en
Priority to CNA2004800349074A priority patent/CN1886425A/zh
Priority to PCT/RU2004/000373 priority patent/WO2005028510A2/en
Priority to EA200600646A priority patent/EA010506B1/ru
Priority to EP04775280A priority patent/EP1673393B1/en
Priority to US10/573,478 priority patent/US20080267982A1/en
Priority to CA002539562A priority patent/CA2539562A1/en
Priority to KR1020067005913A priority patent/KR20060079239A/ko
Priority to DE602004020489T priority patent/DE602004020489D1/de
Application granted granted Critical
Publication of RU2251699C1 publication Critical patent/RU2251699C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2872—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against prion molecules, e.g. CD230
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids

Abstract

Изобретение относится к области медицинской биохимии и касается способа ранней и доклинической диагностики цервикального рака. Сущность изобретения заключается в определении в биопсийной пробе онкобелка Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам, выбранных из групп: 716-321, 716-325, 716-332, 716-343, 716-281, 716-288, одно из которых предназначено для первичного связывания белка, другое, представляющее конъюгат антитела с ферментной меткой, - для выявления образующихся комплексов. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.

Description

Изобретение относится к области медицинской биохимии, конкретно к способам ранней диагностики цервикального рака и рисков перерождения эпителиальных дисплазий в цервикальный рак. Изобретение может быть использовано также для оценки эффективности лечения рака и эпителиальных дисплазий.
Рак шейки матки является вторым по частоте онкологическим заболеванием, регистрируемым у женщин. В настоящее время на основе эпидемиологических и вирусологических исследований можно считать установленной взаимосвязь инвазийного цервикального рака с вирусами папилломы человека (ВПЧ) /Фиг.1/. Установлена также корреляция между ВПЧ и неоплазиями и инвазийным раком матки, наружных половых органов, ануса /Sexually transmitted disease “Vaccines, prevention and control”, 2000, Edited by D.I.Bernstein, Academic Press.; В.И.Киселев и др. “Взаимосвязь вирусных инфекций, передаваемых половым путем, и онкологических заболеваний урогенитального тракта”. Вестник дерматологии, 2000 г., №6, с.20-23/.
Многие годы для ранней диагностики цервикального рака используются цитологические исследования (являющиеся в отечественной медицине базовым методом лабораторной диагностики и в настоящее время), так называемые Рар-мазки, выявляющие атипичные, многоядерные клетки. Однако эта методика выявляет не более 30% носителей инфекции, не отвечает современным требованиям и не может предсказать риски развития заболевания.
Изучение структуры ДНК ВПЧ, в том числе кодирующей девять иммуногенных белков, закономерностей репликации вируса, иммортализации и трансформации им эпителиальных клеток, дали возможность разрабатывать скрининговые системы, в основе которых лежат выявленные биохимические, иммунологические, генетические параметры, имеющие отклонения при патологиях от их значений в норме.
Такие данные не всегда удается интерпретировать в сторону ранней диагностики или риска развития цервикального рака, оценки эффективности лечения в виду того, что либо используемые методы измерения не обладают необходимой чувствительностью и/или специфичностью, либо сами измеряемые параметры непосредственно не отображают процесса перерождения клеток, либо отображают, но не в пропорциональном виде.
Таким образом, выбор маркера и метода его определения (разработка такого метода) являются на настоящий момент времени актуальной задачей, требующей изобретательского уровня решений.
Прежде всего, описаны методы диагностики цервикального рака по определению титра антител к белкам HPV методами иммуноферментного и радиоиммунного анализов /см., например, ЕР №№386734, 375555, 406542, 523391/ в сыворотке крови пациентов. Однако этот подход не оправдал ожиданий, так как не была обнаружена достоверная корреляция между титром антител и цервикальным раком.
Известны также методы диагностики и прогноза развития цервикального рака на основе типирования и количественного определения уровня ДНК ВПЧ в исследуемом образце, например, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) /В.И.Киселев и др. “Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций”. Пособие для врачей, Москва, 2000, WO №00506645, пат. США №5679509/.
Однако использование этих методов приводит к значительной гипердиагностике, так как примерно в 80% случаев инфицирование ВПЧ имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. Таким образом, положительный результат на ДНК ВПЧ не позволяет в большинстве случаев прогнозировать развитие цервикального рака.
Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению является способ ранней диагностики цервикального рака и определения риска его развития путем количественного иммунологического определения онкобелков Е6/Е7 ВПЧ в биопсийной клеточной пробе /WО №0154713, А 61 К 38/18, 2001-08-02, Methods for determining risk of developing cervical cancer/.
В качестве маркеров ВПЧ использовались Е6/Е7 белки, которые определялись иммунофлюоресцентным методом из гистологических депарафинизированных проб с использованием (для количественного определения) цифровых компьютерных технологий для анализа многомерных визуализированных образов. При превышении содержания белков Е6/Е7 в лабораторных пробах по сравнению с нормой свыше 54% делали вывод об увеличенном риске развития цервикального рака.
В способе также предлагается использовать другие биохимические маркеры: рецептор эпидермального фактора роста, инсулин-подобный фактор роста.
Использование этих маркеров показывает достаточно хорошую сходимость результатов между собой и наблюдаемой клинической картиной.
Однако необходимо подчеркнуть тот факт, что применение иммуноферментного метода анализа для используемых маркеров из цитологических проб по запатентованному способу оказалось не состоятельным, так как приводило к ошибочным позитивным результатам.
Известный способ имеет существенные недостатки, так как требует дорогостоящей аппаратуры, высокой квалификации обслуживающего персонала, характеризуется сложной, а потому плохо стандартизируемой процедурой пробоподготовки. Эти недостатки лишают этот метод статуса мониторингового способа (как следует из п.п.2, 4, 6 формулы изобретения способ используется по показаниям - цервикальная интраэпителиальная неоплазия).
Изобретательской задачей является упрощение, удешевление способа, который может быть использован для скрининга большого количества проб и легко поддается стандартизации, благодаря высокой стандартности пробозабора и анализа, то есть создание скринингого способа.
Задача решается тем, что заявителю удалось разработать высокочувствительный (коррелирующий со способом-прототипом) иммуноферментный способ ранней диагностики цервикального рака из цитологических проб с использованием в качестве маркера онкобелка Е7 ВПЧ.
Таким образом, предлагается способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака путем количественного иммунологического определения онкобелка вируса папилломы человека (ВПЧ) в биопсийной клеточной пробе пациента, отличающейся тем, что биопсийную клеточную пробу лизируют, анализу подвергают надосадок клеточного лизата биопсийной пробы в забуференном физиологическом растворе на содержание в нем белка Е7 ВПЧ с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам и распознающих различные антигенные детерминанты белка Е7, выбранные из группы: 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a) и 716-281, 716-288 (IgG2b), одно из которых предназначено для первичного связывания белка, другое, представляющее собой конъюгат антитела с ферментной меткой, - для выявления образующихся комплексов при использовании многократного избытка последнего, и при концентрации Е7 белка в пробе большей, чем 0,05 нг/мл определяют раннюю стадию цервикального рака или риска его развития.
Способ характеризуется также тем, что для получения моноклональных антител используют рекомбинантные белки Е7 ВПЧ.
Наиболее предпочтителен вариант, когда для первичного связывания белка используют антитела 716-281, а для проявления образующихся комплексов - фермент-меченные антитела 716-332.
Используемые моноклональные антитела специфичны к Е7 HPV16, но перекрестно реагируют с Е7 HPV18 (двух наиболее распространенных типов ВПЧ "высокого риска").
При положительной пробе на белок Е7 желательно осуществить типирование ВПЧ, например, методом полимеразной цепной реакции, что позволит более точно интерпретировать результаты способа.
Решение поставленной задачи стало возможным, во-первых, благодаря выбору в качестве маркера белка Е7 ВПЧ (например, по сравнению с Е6 ВПЧ), как наиболее четко реагирующего на процесс перерождения эпителиальных клеток, которому предшествует процесс интеграции копии ДНК вируса в ДНК клетки, при этом наблюдается, как установил заявитель, пороговое увеличение синтеза этого белка.
С целью получения воспроизводимых результатов по измерению онкобелка Е7 ген Е7 был клонирован и экспрессирован в клетках E.coli. Выделенный из бактериальных клеток белок Е7 подвергался процедуре рефолдинга с целью восстановления его природной конформации. Этим белком иммунизировали мышей. В большинстве случаев антитела, полученные иммунизацией рекомбинантными белками, не взаимодействуют с природным белком, т.к. распознают другие детерминанты.
Заявителю же удалось получить два типа высокочувствительных моноклональных антител к белку Е7 природного происхождения, перекрестно реагирующих на два типа ВПЧ “высокого риска” (HPV16, HPV18), гарантированно обеспечив полноту охвата больных до 80-85%. Использование попарно двух типов моноклональных антител, реагирующих с различными антигенными детерминантами белка Е7, позволило повысить специфичность и обеспечить отсутствие фона при определении.
Условия проведения количественного анализа были оптимизированы путем варьирования концентрации антител для сорбции, разведения конъюгата, состава буферных растворов, времени и температуры для всех стадий сэндвич-ИФА.
Аналогичной тест-системы для белка Е6 реализовать не удалось.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами:
На фиг.1 представлена схема развития папилломавирусной инфекции,
На фиг.2 представлена структура плазмид,
На фиг.3 - хроматограмма белков Е7 HPV16 и HPV18, полученных синтезом этих белков в клетках Е.соli
На фиг.4 - калибровочный график для количественного определения белка Е7 HPV16 в сэндвич-ИФА. МоАт 716-281 сорбировали из 0,1 М карбонатного буферного раствора, рН 9.6 с концентрацией 5 мкг/мл. Рабочее разведение конъюгата МоАт 716-332 с пероксидазой - 1/50000 в PBS, содержащем 0,2% БСА и 0,05% Tween 20. Субстрат - ТМВ. По оси абсцисс - концентрация белка, нг/мл. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм. На графике показана ошибка эксперимента для трех независимых измерений.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример I.
Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих синтез онкобелков Е7 ВПЧ 16 и 18 типов.
В качестве источника гена Е7 использовали биопсийный материал из шейки матки пациенток с диагнозом цервикальная дисплазия. Полученные клинические образцы исследовали на наличие ВПЧ методом полимеразной цепной реакции. Отбирались пробы, содержащие ДНК ВПЧ 16 и 18 типов, затем с помощью геноспецифических праймеров методом ПЦР амплифицировали гены Е7 16 и 18 типов (фрагмент ДНК 303 bp - HPV-16 и фрагмент 324 bp-HPV-18) и клонировали по сайтам EcoRI - ВаmHI в плазмиде pBluescipt SK (+) (Stratagene). Определение олигонуклеотидной последовательности клонированных генов показало полное соответствие данным GenBank (например, AF125673).
На следующем этапе в область 3' конца структурной части генов были встроены последовательности терминации трансляции. Структура полученной генетической конструкции представлена на фиг.2.
Синтез белков Е7 16 и 18 типов в клетках E.coli.
рНЕ716 кодирует белок е716: Met(His)6-GluPheIle-E716-GlySer (111 a.o., 12,5 кДа, ИЭТ 4,6). Необходимо отметить, что при электрофорезе в SDS-ПААГ по Лэммли этот белок обладает аномальной подвижностью (около 21 кДа), что соответствует литературным данным.
РНЕ718 кодирует белок е718: Met(His)6-GluPheSer-E718-GlySer (117 a.o., 13,5 кДа, ИЭТ 5,4).
Для экспрессии полученных генов использовали штамм BL21(DE3). Индукцию и разрушение клеток проводили по стандартной схеме. После озвучивания е716 и е718 обнаруживаются во фракции растворимых клеточных белков, поэтому хроматографию на Ni-ША-агарозе проводили в нативных условиях без добавления мочевины (фиг.3).
Пример 2
Получение мышиных моноклональных антител к рекомбинантным белкам Е7 HPV16 и HPV18.
Мыши линии Balb/c (самки, 16-18 г) были дважды иммунизированы с двухнедельным интервалом в подушечки лап высокоочищенными препаратами Е7 HPV16 и Е7 HPV18, полученными методом одностадийной металлохелатной хроматографии из лизатов рекомбинантных Е.соli. Количество белка на одну иммунизацию составляло 20 мкг в виде суспензии с равным объемом полного (1-я иммунизация) или неполного (2-я иммунизация) адъюванта Фрейнда. На четвертый день после второй иммунизации лимфоциты из подколенных узлов сливали с миеломными клетками Sp 2/0 - Ag14 при помощи PEG 4000, гибридомы отбирали на селективной среде HAT, а затем скринировали в непрямом ИФА и дважды клонировали позитивные культуры методом предельных разведений. Для проведения ИФА рекомбинантные белки Е7 HPV16 и HPV18 сорбировали на полистирольные планшеты из раствора с концентрацией 2 мкг/мл и затем вносили культуральные супернатанты на 1 час при 37°С без разведения. Связавшиеся с иммобилизованным антигеном моноклональные антитела выявляли при помощи козьих антител против IgG (H+L) мыши, конъюгированных с пероксидазой, в течение 1 часа при 37°С. В качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина (ТМВ) с перекисью водорода. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм. В результате на белок Е7 HPV16 были получены две группы гибридов, продуцирующих антитела 716-281, 716-288 (IgG2b) и 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a), которые одинаково хорошо взаимодействовали с Е7 HPV16 и HPV18 в непрямом ИФА (см. Таблицу 1).
Figure 00000002
Figure 00000003
Пример 3
Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа для количественного определения белков Е7 HPV16 и HPV18 на основе моноклональных антител.
МоАт к Е7 HPV16 выделяли из асцитных жидкостей аффинной хроматографией на белок G-сефарозе (чистота более 95%) и метили пероксидазой хрена периодатным методом. Все комбинации МоАт попарно были проверены на предмет количественного определения Е7 HPV16 в сэндвич-ИФА. Для этого каждое МоАт иммобилизовали на полистирольных планшетах, затем вносили 7 двукратных разведений Е7 HPV16 в диапазоне концентраций 0.039-5.0 нг/мл и проявляли образовавшиеся иммунные комплексы при помощи всех пероксидазных конъюгатов МоАт, используя в качестве субстрата тетраметилбензидин (ТМВ). Оказалось, что все проверенные пары МоАт обладают способностью образовывать тройной комплекс (сэндвич): иммобилизованное антитело-Е7-конъюгат, что свидетельствует об олигомерном состоянии белка Е7 HPV16 в растворе даже в диапазоне концентраций 10-12-10-9 М. Несмотря на то, что все комбинации МоАт работали в сэндвич-ИФА, пары из одних и тех же антител или из антител, принадлежащих одной группе, демонстрировали меньшую чувствительность (величина оптической плотности при фиксированной концентрации Е7 HPV16 и наклон калибровочного графика), чем пары МоАт из разных групп. Наилучшие результаты в терминах чувствительности и отсутствия фона были получены, когда МоАт 716-281 использовали для сенсибилизации планшетов, а МоАт 716-332 - в качестве пероксидазного конъюгата. Условия проведения количественного анализа Е7 HPV16 с использованием этой пары МоАт были оптимизированы путем варьирования концентрации антител для сорбции, разведения конъюгата, состава буферных растворов, времени и температуры для всех стадий сэндвич-ИФА. Калибровочный график для количественного определения Е7 HPV16 при оптимальных условиях ИФА представлен на фиг.4. Как видно из рисунка, калибровочный график практически линеен в диапазоне концентраций антигена 0.039-5.0 нг/мл, характеризуются полным отсутствием фона и обеспечивает предел детекции для Е7 HPV16 - 40 пг/мл, что является достаточным для определения уровня экспрессии Е7 HPV16 в трансфицированных клетках и клинических образцах (см. фиг.4).
Пример 4
Измерение онкобелка Е7 в цервикальных пробах
Материал соскоба шейки матки помещали в 1 мл физиологического р-ра, трехкратно замораживали - оттаивали и центрифугировали в микроцентрифуге (Эппендорф) 10 мин при 10 000 об/мин. Надосадок разводили в два раза PBS-AT (PBS, 0,2% BSA, 0,1% Tween 20), 200 мкл вносили в лунку планшета, предварительно засорбированного моноклональными антителами против Е7-16, и титровали шагом 1/2 на 4 лунки. В этом же планшете в качестве стандарта титровали очищенный рекомбинантный белок Е7-16 типа от 4 нг/мл до 0,062 нг/мл. После часовой инкубации и отмывки вносили конъюгат моноклональных антител к Е7-16, меченый пероксидазой, инкубировали 1 час и проявляли реакцию ТМВ. Оптическую плотность измеряли на Мультискане ЕХ при длине волны 450 нм. По величине оптической плотности разведений стандарта строили калибровочный график, по которому определяли концентрации Е7 в пробе.
Были проведены скрининговые исследования (n=100). В качестве контроля исследовались образцы от здоровых пациентов, у которых ВПЧ не был обнаружен либо было выявлено инфицирование ВПЧ “низкого риска”(n=10).
Для всех здоровых пациенток проба по Е7 была отрицательной либо, в некоторых случаях, слабоположительной. Но во всех случаях содержание Е7 было меньше 0,05 нг/мл.
Для всех патологий пробы были положительными и превышали концентрационный порог 0,05 нг/мл. Полученные данные представлены в таблице 2.
Figure 00000004
Как следует из приведенной таблицы, данные ИФА полностью соответствуют медицинскому диагнозу. Данные по типированию вируса ВПЧ также коррелируют с ними и помогают прогнозировать риск развития цервикального рака.

Claims (6)

1. Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака путем количественного иммунологического определения онкобелка вируса папилломы человека (ВПЧ) в биопсийной клеточной пробе пациента, отличающийся тем, что биопсийную клеточную пробу лидируют, анализу подвергают надосадок клеточного лизата биопсийной пробы в забуференном физиологическом растворе на содержание в нем белка Е7 ВПЧ с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам и распознающих различные антигенные детерминанты белка Е7, выбранные из группы: 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a) и 716-381, 716-288 (IgG2b), одно из которых предназначено для первичного связывания белка, другое, представляющее собой конъюгат антитела с ферментной меткой, - для выявление образующихся комплексов при использовании многократного избытка последнего, и при концентрации Е7 белка в пробе, большей, чем 0,05 нг/мл, которую считают положительной, определяют раннюю стадию цервикального рака или риска его развития.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения моноклональных антител используют рекомбинантные белки Е7 ВПЧ.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют антитела 716-281 и фермент-конъюгированные антитела 716-332 соответственно.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют моноклональные антитела, специфичные к Е7 HPV16, но перекрестно реагирующие с Е7 HPV18.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при положительной пробе на белок Е7 осуществляют типирование ВПЧ.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что типирование проводят методом полимеразной цепной реакции.
RU2003128660/15A 2003-09-25 2003-09-25 Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака RU2251699C1 (ru)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003128660/15A RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2003-09-25 Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
JP2006527937A JP2007537705A (ja) 2003-09-25 2004-09-24 従来の低免疫原性の抗原に特異的なモノクローナル抗体の開発、及び使用のための方法、キット、及び組成物
AU2004274368A AU2004274368B2 (en) 2003-09-25 2004-09-24 Methods, kits, and compositions for the development and use of monoclonal antibodies specific to antigens of low immunogenicity
CNA2004800349074A CN1886425A (zh) 2003-09-25 2004-09-24 开发和使用对传统上低免疫原性的抗原具有特异性的单克隆抗体的方法、试剂盒和组合物
AT04775280T ATE427963T1 (de) 2003-09-25 2004-09-24 Verfahren, kits und zusammensetzungen zur entwicklung und anwendung von fur antigene niedriger immunogenizitat spezifischen monoklonalen antikírpern
PCT/RU2004/000373 WO2005028510A2 (en) 2003-09-25 2004-09-24 Methods, kits, and compositions for the development and use of monoclonal antibodies specific to antigens of low immunogenicity
EA200600646A EA010506B1 (ru) 2003-09-25 2004-09-24 Способы, наборы и композиции для разработки и применения моноклональных антител, специфичных к антигенам с низкой иммуногенностью
EP04775280A EP1673393B1 (en) 2003-09-25 2004-09-24 Methods, kits, and compositions for the development and use of monoclonal antibodies specific to antigens of low immunogenicity
US10/573,478 US20080267982A1 (en) 2003-09-25 2004-09-24 Methods Kits and Compositions for the Developement and Use of Monoclonal Antibodies Specific to Anbtigens of Low Immunogenicity
CA002539562A CA2539562A1 (en) 2003-09-25 2004-09-24 Methods, kits, and compositions for the development and use of monoclonal antibodies specific to antigens of low immunogenicity
KR1020067005913A KR20060079239A (ko) 2003-09-25 2004-09-24 전통적으로 면역원성이 낮은 항원에 특이적인 단클론 항체개발 및 이를 이용하는 방법, 키트 및 조성물
DE602004020489T DE602004020489D1 (de) 2003-09-25 2004-09-24 Verfahren, kits und zusammensetzungen zur entwicklung und anwendung von für antigene niedriger immunogenizität spezifischen monoklonalen antikörpern

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003128660/15A RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2003-09-25 Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2251699C1 true RU2251699C1 (ru) 2005-05-10

Family

ID=34374510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2003128660/15A RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2003-09-25 Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20080267982A1 (ru)
EP (1) EP1673393B1 (ru)
JP (1) JP2007537705A (ru)
KR (1) KR20060079239A (ru)
CN (1) CN1886425A (ru)
AT (1) ATE427963T1 (ru)
AU (1) AU2004274368B2 (ru)
CA (1) CA2539562A1 (ru)
DE (1) DE602004020489D1 (ru)
EA (1) EA010506B1 (ru)
RU (1) RU2251699C1 (ru)
WO (1) WO2005028510A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2563359C2 (ru) * 2009-11-30 2015-09-20 Дженентек, Инк. Композиции и способы для диагностики и лечения опухоли

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
JP2006333801A (ja) * 2005-06-03 2006-12-14 Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine イヌ流産菌およびレプトスピラ菌の検出方法およびそれに用いるプライマーセット
GB0519198D0 (en) * 2005-09-20 2005-10-26 Univ Cambridge Tech Tse detection
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
US8916342B2 (en) 2006-11-13 2014-12-23 Oncohealth Corp. Identification of high grade or ≧ CIN2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (HPV) and HPV-associated cancers
US8968995B2 (en) * 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
US9128094B2 (en) 2010-01-08 2015-09-08 Oncohealth Corp. High throughput cell-based HPV immunoassays for diagnosis and screening of HPV-associated cancers
KR102434557B1 (ko) 2010-08-02 2022-08-23 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ｖｌ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 마우스
ES2770424T3 (es) 2011-02-25 2020-07-01 Regeneron Pharma Ratones ADAM6
US20140255449A1 (en) * 2011-07-21 2014-09-11 Biotech Tools S.A. Dosage of dnak
SG10201606158TA (en) 2011-08-05 2016-09-29 Regeneron Pharma Humanized universal light chain mice
PT2627773T (pt) 2011-10-17 2017-09-29 Regeneron Pharma Ratinhos de cadeia pesada de imunoglobulina restrita
BR112014015238B1 (pt) 2011-12-20 2022-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Método ex vivo para preparar um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse compreendendo identificar sequências de ácido nucleico a partir de linfócitos b de camundongo geneticamente modificado pela colocação de um gene adam6
PL3597037T3 (pl) 2012-06-12 2021-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizowane zwierzęta inne niż ludzie z ograniczonymi loci łańcucha ciężkiego immunoglobuliny
CN102879584A (zh) * 2012-09-26 2013-01-16 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种人血液hsp70抗体胶体金标检测试纸条及其制备方法
EP3351095A1 (en) 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
KR102601491B1 (ko) 2014-03-21 2023-11-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
SG11201607015VA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS
CN107438622A (zh) 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
CN113512107A (zh) * 2021-03-13 2021-10-19 杭州市公安局刑事科学技术研究所 一种杀鼠灵完全抗原及其制备方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4859613A (en) * 1986-11-12 1989-08-22 Lawrence David A Immunoassays for glutathione and antibodies useful therein
DE3722967A1 (de) * 1987-07-11 1989-01-19 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper gegen e7-protein des humanen papillomvirus typ 16, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
DE4224542A1 (de) * 1992-07-24 1994-01-27 Deutsches Krebsforsch Verfahren zur Herstellung von monoklonalen MHC Klasse I-puls-Peptid-restringierten Antikörpern
ATE212378T1 (de) * 1993-06-04 2002-02-15 Whitehead Biomedical Inst Stressproteine und ihre verwendung
JPH0984589A (ja) * 1995-07-14 1997-03-31 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 新規なタンパク質
JPH0987299A (ja) * 1995-07-14 1997-03-31 Fuji Yakuhin Kogyo Kk Ｍｍｐ−２活性化因子に特異的なモノクローナル抗体
EP0870826A4 (en) * 1995-07-14 2002-05-02 Daiichi Fine Chem Co Ltd NEW PROTEINS AND MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THESE
JP3174492B2 (ja) * 1995-11-09 2001-06-11 富士薬品工業株式会社 ウサギｍｍｐ−３に対するモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫学的測定法
US6319503B1 (en) * 1998-02-19 2001-11-20 Proteinix Company Heat shock fusion-based vaccine system
DE19918141A1 (de) * 1999-04-21 2000-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Verfahren zur Diagnose von übertragbaren Spongiformen Enzephalopathien
EP1194164B8 (en) * 1999-06-23 2007-03-21 IDEXX Laboratories Inc Prion protein peptides and uses thereof
US7041807B1 (en) * 1999-06-23 2006-05-09 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein
US8128922B2 (en) * 1999-10-20 2012-03-06 Johns Hopkins University Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen
US20020192205A1 (en) * 2001-05-11 2002-12-19 Francis Michon Immunogenic compositions of low molecular weight hyaluronic acid and methods to prevent, treat and diagnose infections and diseases caused by group A and group C streptococci

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WO/0154713 A, 02.08.2001. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2563359C2 (ru) * 2009-11-30 2015-09-20 Дженентек, Инк. Композиции и способы для диагностики и лечения опухоли

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005028510A3 (en) 2005-08-25
JP2007537705A (ja) 2007-12-27
WO2005028510A2 (en) 2005-03-31
CA2539562A1 (en) 2005-03-31
EA200600646A1 (ru) 2006-08-25
DE602004020489D1 (de) 2009-05-20
KR20060079239A (ko) 2006-07-05
EP1673393A2 (en) 2006-06-28
EP1673393B1 (en) 2009-04-08
US20080267982A1 (en) 2008-10-30
CN1886425A (zh) 2006-12-27
EA010506B1 (ru) 2008-10-30
ATE427963T1 (de) 2009-04-15
AU2004274368A1 (en) 2005-03-31
AU2004274368B2 (en) 2010-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2251699C1 (ru) Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
US7972776B2 (en) Protein chips for HPV detection
US7732166B2 (en) Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
JP5819851B2 (ja) Ｈｐｖ関連の癌の治療及びスクリーニングのための細胞に基づいた高処理能力ｈｐｖ免疫アッセイ
CN102105791A (zh) 新人乳头状瘤病毒单克隆抗体
Formichella et al. A novel line immunoassay based on recombinant virulence factors enables highly specific and sensitive serologic diagnosis of Helicobacter pylori infection
JP5030594B2 (ja) Ｈｐｖの発癌性株に対する抗体およびそれらの使用方法
JP3117695B2 (ja) 医療目的の人体の乳頭腫ヴィールス（ｈｐｖ）防止方法
Yu et al. Distinction between bacterial and viral infections by serum measurement of human neutrophil lipocalin (HNL) and the impact of antibody selection
Safaeian et al. Direct comparison of HPV16 serological assays used to define HPV-naive women in HPV vaccine trials
Syam et al. Validation of urine test for detection of Helicobacter pylori infection in Indonesian population
US6743593B2 (en) Immunological methodology for discerning human papillomavirus
JP2006234627A (ja) 体液中の結核菌抗原を検出する方法
JP5204036B2 (ja) 肺炎球菌の検出方法
US7439028B2 (en) Methods and compositions to correlate Trichomonas infection with prostate cancer
EP0863982A1 (en) Synthetic hpv11 virus-like particles
US9470684B2 (en) Outer membrane protein 18 as a diagnostic marker for campylobacter
KR102132964B1 (ko) 쯔쯔가무시균 유래 엑소좀을 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
WO2008095110A2 (en) Compositions and methods for detecting cancers in a subject
Ghose et al. Serological assays for identification of human gastric colonization by Helicobacter pylori strains expressing VacA m1 or m2
US5738853A (en) Synthetic HPV11 virus-like particles
Zheng et al. Preparation and evaluation of monoclonal antibodies against chlamydial protease-like activity factor to detect Chlamydia pneumoniae antigen in early pediatric pneumonia
WO2020158811A1 (ja) ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット
JP2001289856A (ja) クラミジアニューモニエの測定方法及び測定試薬
WO2005008246A1 (en) In vitro diagnosis method for early detection of cervical dysplasias and cancer, associated with hpv

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Invention patent assignment

Effective date: 20090818

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20130926