JP3117695B2 - 医療目的の人体の乳頭腫ヴィールス（ｈｐｖ）防止方法 - Google Patents
医療目的の人体の乳頭腫ヴィールス（ｈｐｖ）防止方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 この発明は診断目的で乳頭腫ヴィールスによる感染を
探知する方法に関するものであり、さらに詳しくは医療
のために人体の乳頭腫ヴィールスによる感染を探知する
方法に関するものである。
探知する方法に関するものであり、さらに詳しくは医療
のために人体の乳頭腫ヴィールスによる感染を探知する
方法に関するものである。
子宮頚部のSV感染は子宮頚部のガン腫を伴うものであ
る。50タイプを超えるHPVが既に識別されている。HPVタ
イプ６、11、16、18、31、33および51が生殖器官を感染
することが発見されている。タイプ６、11は生殖器官や
尖点コンジローマに緩やかな増殖病巣を引き起こし、タ
イプ16、18、31および33は前ガン病巣や多くの場合頸部
のガン種に発見されている。牛科の乳頭腫やいずれのグ
ループのヴィールスとも反応する抗血清に免疫学的に関
係する人体の乳頭腫は容易に準備できる。ヴィールスタ
ンパク保護膜に対して形成されたグループ特定抗血清を
用いることにより、乳頭腫タンパク質保護膜抗原は前ガ
ン病巣やコンジローマ組織にに認められる。生殖器イ
ボ、生殖器内部上皮腫瘍（CIN）および生殖器の腫を持
った患者はグループ特定タンパク保護膜抗体に対し比較
グループより高い血清IgG抗体レベルを持っていること
が報告されている。
る。50タイプを超えるHPVが既に識別されている。HPVタ
イプ６、11、16、18、31、33および51が生殖器官を感染
することが発見されている。タイプ６、11は生殖器官や
尖点コンジローマに緩やかな増殖病巣を引き起こし、タ
イプ16、18、31および33は前ガン病巣や多くの場合頸部
のガン種に発見されている。牛科の乳頭腫やいずれのグ
ループのヴィールスとも反応する抗血清に免疫学的に関
係する人体の乳頭腫は容易に準備できる。ヴィールスタ
ンパク保護膜に対して形成されたグループ特定抗血清を
用いることにより、乳頭腫タンパク質保護膜抗原は前ガ
ン病巣やコンジローマ組織にに認められる。生殖器イ
ボ、生殖器内部上皮腫瘍（CIN）および生殖器の腫を持
った患者はグループ特定タンパク保護膜抗体に対し比較
グループより高い血清IgG抗体レベルを持っていること
が報告されている。
この発明の目的は上記のような方法を提供して、ガン
種、特に頸部のまたは前ガン症状の発見を早期に可能と
し、ガン種の培養の危険を回避することにある。
種、特に頸部のまたは前ガン症状の発見を早期に可能と
し、ガン種の培養の危険を回避することにある。
この発明の他の目的は、HPVに対する体液中の抗体の
存在を探知することにより、ガン種または前ガン症状ま
たはガン種の培養の危険を簡単迅速に確認する方法を提
供することにある。
存在を探知することにより、ガン種または前ガン症状ま
たはガン種の培養の危険を簡単迅速に確認する方法を提
供することにある。
このためこの発明においては請求範囲１、11、21およ
び31に記載するような特徴を有するものである。
び31に記載するような特徴を有するものである。
以下図面によりさらに詳細にこの発明について説明す
る。
る。
第１図は頸部分泌物中の乳頭腫ヴィールスに対するIg
A抗体の探知を示すグラフ、 第２図は血清および頸部分泌物中の乳頭腫ヴィールス
に対するIgA抗体の相関関係を示すグラフ、 第３図は血清および生殖器分泌物中の乳頭腫ヴィール
スに対するIgG抗体の比較を示すグラフ、 第４図は生殖器分泌物中の乳頭腫ヴィールスに対する
IgG抗体およびIgA抗体の比較を示すグラフ、 第５、６図は免疫ブロッティング（blotting）による
IgG抗体およびIgA抗体の探知を示すグラフ、 第７図は通常人口中におけるPVに対する血清IgA抗体
の年齢性別分布を示すグラフ、 第８図は通常人口中におけるPVに対する血清IgG抗体
の年齢性別分布を示すグラフ、 第９図はCINまたは頸部ガン腫を有した患者からの血
清中のPVに対するIgA抗体の探知を示すグラフ、 第10図はCINまたは頸部ガン腫を有した患者からの血
清中のPVに対するIgG抗体の探知を示すグラフ、 第11図はCINまたは頸部ガン腫を有した患者からの血
清中のPVに対するIgM抗体の探知を示すグラフ 第12図は病気との関係でPVに対するIgAとIgGとの間の
反応の差を示すグラフ、 第13図はL1タンパクに対するIgA反応性を示すグラ
フ、 第14図はL2タンパクに対するIgA反応性を示すグラ
フ、 第15図はL1タンパクに対するIgA反応性を示すグラ
フ、 第16図はL2タンパクに対するIgG反応性を示すグラ
フ、 第17図はL1タンパクに対するIgM反応性を示すグラ
フ、 第18図はL2タンパクに対するIgM反応性を示すグラ
フ、 第19図は合成ペプチドの病気を伴った反応性を示すグ
ラフ、 第1A表は血清および頸部分泌物中のPVに対するIgA、I
gG抗体の比較を示すグラフ、 第１表は頸部ガン腫を伴った抗体の探知を示すグラ
フ、 第２表は合成ペプチドに用いられる式を説明するグラ
フ、 第３表は合成ペプチドのアミノ酸順列を示すグラフ、 乳頭腫に対するIgG抗体が存在するか否かおよび悪化
進行に関係あるか否か調査するには、コンジローマおよ
びCINを持った患者からのヴァギナ分泌物を変更ELISA方
法により検査した。
A抗体の探知を示すグラフ、 第２図は血清および頸部分泌物中の乳頭腫ヴィールス
に対するIgA抗体の相関関係を示すグラフ、 第３図は血清および生殖器分泌物中の乳頭腫ヴィール
スに対するIgG抗体の比較を示すグラフ、 第４図は生殖器分泌物中の乳頭腫ヴィールスに対する
IgG抗体およびIgA抗体の比較を示すグラフ、 第５、６図は免疫ブロッティング（blotting）による
IgG抗体およびIgA抗体の探知を示すグラフ、 第７図は通常人口中におけるPVに対する血清IgA抗体
の年齢性別分布を示すグラフ、 第８図は通常人口中におけるPVに対する血清IgG抗体
の年齢性別分布を示すグラフ、 第９図はCINまたは頸部ガン腫を有した患者からの血
清中のPVに対するIgA抗体の探知を示すグラフ、 第10図はCINまたは頸部ガン腫を有した患者からの血
清中のPVに対するIgG抗体の探知を示すグラフ、 第11図はCINまたは頸部ガン腫を有した患者からの血
清中のPVに対するIgM抗体の探知を示すグラフ 第12図は病気との関係でPVに対するIgAとIgGとの間の
反応の差を示すグラフ、 第13図はL1タンパクに対するIgA反応性を示すグラ
フ、 第14図はL2タンパクに対するIgA反応性を示すグラ
フ、 第15図はL1タンパクに対するIgA反応性を示すグラ
フ、 第16図はL2タンパクに対するIgG反応性を示すグラ
フ、 第17図はL1タンパクに対するIgM反応性を示すグラ
フ、 第18図はL2タンパクに対するIgM反応性を示すグラ
フ、 第19図は合成ペプチドの病気を伴った反応性を示すグ
ラフ、 第1A表は血清および頸部分泌物中のPVに対するIgA、I
gG抗体の比較を示すグラフ、 第１表は頸部ガン腫を伴った抗体の探知を示すグラ
フ、 第２表は合成ペプチドに用いられる式を説明するグラ
フ、 第３表は合成ペプチドのアミノ酸順列を示すグラフ、 乳頭腫に対するIgG抗体が存在するか否かおよび悪化
進行に関係あるか否か調査するには、コンジローマおよ
びCINを持った患者からのヴァギナ分泌物を変更ELISA方
法により検査した。
20〜50歳の女性42人が研究に参加した。彼女らは前に
異常なヴァギナの汚染およびまたはコンジローマを持っ
ていたかスクリーンプログラムに参加していた。全ての
患者はヴァギナ鏡（colscope）検査に掛けられた。ヴァ
ギナ鏡検査の日に方形の汚染を採り、場合によってはヴ
ァギナ鏡により確認された病巣から生検体（biopusy）
が採られた。細胞学および組織医学的な検査が行なわ
れ、最後にELISA結果と照合された。HPV感染の形態学的
判断はマイセル他（1979年）により行なわれた。陽性乳
頭腫ヴィールス感染が中空胞状（koilocytotic）細胞に
より示唆された。この典型的な中空胞状細胞は拡大した
過染色性のな核が明かな細胞質的な領域により囲まれて
いる。ヴァギナ頸部病巣が内外（endo−ecto）頸部から
小さな消毒綿とともに採取された。この消毒綿は0.5ml
のPBSを入れたガラス管に入れられ、渦巻ミキサーによ
り混合された。使用するまで試料を20℃で貯蔵した。採
取の前後に管を秤量することにより正確な量の分泌物が
推定された。使用前にこれらを遠心処理して屑片を除い
た。実際の月経の日を除く月経サイクル中の日に関係な
く試料を採取した。血で汚染された試料は破棄された。
異常なヴァギナの汚染およびまたはコンジローマを持っ
ていたかスクリーンプログラムに参加していた。全ての
患者はヴァギナ鏡（colscope）検査に掛けられた。ヴァ
ギナ鏡検査の日に方形の汚染を採り、場合によってはヴ
ァギナ鏡により確認された病巣から生検体（biopusy）
が採られた。細胞学および組織医学的な検査が行なわ
れ、最後にELISA結果と照合された。HPV感染の形態学的
判断はマイセル他（1979年）により行なわれた。陽性乳
頭腫ヴィールス感染が中空胞状（koilocytotic）細胞に
より示唆された。この典型的な中空胞状細胞は拡大した
過染色性のな核が明かな細胞質的な領域により囲まれて
いる。ヴァギナ頸部病巣が内外（endo−ecto）頸部から
小さな消毒綿とともに採取された。この消毒綿は0.5ml
のPBSを入れたガラス管に入れられ、渦巻ミキサーによ
り混合された。使用するまで試料を20℃で貯蔵した。採
取の前後に管を秤量することにより正確な量の分泌物が
推定された。使用前にこれらを遠心処理して屑片を除い
た。実際の月経の日を除く月経サイクル中の日に関係な
く試料を採取した。血で汚染された試料は破棄された。
BPVは以下のようにして精製された。牛科の皮膚コブ
をグリセロリン酸塩緩衝塩水（1:1）中で、＋４℃で貯
蔵してウルトラタラックスミキサー中で0.1モルトリス
−HCl中で均質にした。10％の懸濁液を用意し、タレオ
シルとフレオンを加えた後懸濁液をソルバールSS−34ロ
ーターにより11.950gで30分遠心処理した。得られたも
のをさらにMSEチタンローター中で35,000rpmで50分遠心
処理した。このペレットを0.1MトリスHCl中で懸濁さ
せ、CsClと混合した。平衡のために35,000rpmでMSEロー
ター中で終夜溶液を遠心処理した。ヴィールス環帯を採
取し、TE緩衝液（0.01MトリスHCl、0.0001MEDTA）に対
して透析し、−70℃で冷凍貯蔵した。皮膚コブの抽出物
を２回のCaCl平衡遠心処理により精製した。２種の異な
る環帯が成分中に認められた。軽い方の環帯は浮遊密度
1.29g/mlであり、電子顕微鏡（EM）で確認したところ空
のヴィールス粒子が含まれていた。重い方の環帯は浮遊
密度が1.34g/mlでEMで検査したら典型的な乳頭腫ヴィー
ルス形態を有した完全なヴィールス粒子を含んでいた。
をグリセロリン酸塩緩衝塩水（1:1）中で、＋４℃で貯
蔵してウルトラタラックスミキサー中で0.1モルトリス
−HCl中で均質にした。10％の懸濁液を用意し、タレオ
シルとフレオンを加えた後懸濁液をソルバールSS−34ロ
ーターにより11.950gで30分遠心処理した。得られたも
のをさらにMSEチタンローター中で35,000rpmで50分遠心
処理した。このペレットを0.1MトリスHCl中で懸濁さ
せ、CsClと混合した。平衡のために35,000rpmでMSEロー
ター中で終夜溶液を遠心処理した。ヴィールス環帯を採
取し、TE緩衝液（0.01MトリスHCl、0.0001MEDTA）に対
して透析し、−70℃で冷凍貯蔵した。皮膚コブの抽出物
を２回のCaCl平衡遠心処理により精製した。２種の異な
る環帯が成分中に認められた。軽い方の環帯は浮遊密度
1.29g/mlであり、電子顕微鏡（EM）で確認したところ空
のヴィールス粒子が含まれていた。重い方の環帯は浮遊
密度が1.34g/mlでEMで検査したら典型的な乳頭腫ヴィー
ルス形態を有した完全なヴィールス粒子を含んでいた。
フロイドの完全な補助薬中に懸濁させたほぼ100μｇ
の精製されたヴィールスの組織内接種により純化した牛
科の乳頭腫ヴィールスに対する超免疫の血清が兎に用意
された。同様なヴィールスを用い補助薬なしで２週間間
をおいて続いて２回の接種が行なわれた。兎は１週間後
最後の接種の後採血された。
の精製されたヴィールスの組織内接種により純化した牛
科の乳頭腫ヴィールスに対する超免疫の血清が兎に用意
された。同様なヴィールスを用い補助薬なしで２週間間
をおいて続いて２回の接種が行なわれた。兎は１週間後
最後の接種の後採血された。
前記したELISA方法を変更して用いた。BPVヴィールス
をPBS中で希釈して96ウエルのミクロ滴定板に加え0.06
μG/ウエルの一定の濃度で＋４℃で終夜保持した。0.05
％ツイーンを含むPBSで３回洗浄した後、プレートを４
％ウシ血清アルブミンと0.1％ゼラチンで６時間室温で
ブロックした。その後＋４℃で終夜放置した。使用前に
プレートをPESツイーンで５回洗浄した。ヴァギナ分泌
物を1/40に希釈し、血清は４％BSA、0.1％ツイーン中で
1/100希釈した。抗体を探知するために、親和精製ビオ
チン化した抗人体IgAおよびIgGを1/1000で４時間室温で
希釈して用いた。過酸化物結合アビジンを1/400希釈で
２時間室温で加えた。生地としては0.4％オーフェニレ
ンジアミン、0.02％H2O2を50mMリン酸・クエン酸緩衝
液、PH50中に用いた。ポジチブ比較としては兎抗血清対
BPVヴィールスおよび／または兎抗血清対エルク乳頭腫
ヴィールスを用いた。人体の新しく生まれた血清と兎の
前免疫血清とがネガチブ比較として用いられた。
をPBS中で希釈して96ウエルのミクロ滴定板に加え0.06
μG/ウエルの一定の濃度で＋４℃で終夜保持した。0.05
％ツイーンを含むPBSで３回洗浄した後、プレートを４
％ウシ血清アルブミンと0.1％ゼラチンで６時間室温で
ブロックした。その後＋４℃で終夜放置した。使用前に
プレートをPESツイーンで５回洗浄した。ヴァギナ分泌
物を1/40に希釈し、血清は４％BSA、0.1％ツイーン中で
1/100希釈した。抗体を探知するために、親和精製ビオ
チン化した抗人体IgAおよびIgGを1/1000で４時間室温で
希釈して用いた。過酸化物結合アビジンを1/400希釈で
２時間室温で加えた。生地としては0.4％オーフェニレ
ンジアミン、0.02％H2O2を50mMリン酸・クエン酸緩衝
液、PH50中に用いた。ポジチブ比較としては兎抗血清対
BPVヴィールスおよび／または兎抗血清対エルク乳頭腫
ヴィールスを用いた。人体の新しく生まれた血清と兎の
前免疫血清とがネガチブ比較として用いられた。
BPVウイリオン（VIRION）を５〜20％ポリアクリルア
ミド成分ゲル上に電気泳動した。約５μｇのビリオンを
各試料に施した。トービン他の方法によりニトロセルロ
ーズシートに移した。このシートを帯に切断して２％ト
イーン80で50mMトリスPH10.2、150mMNaCl,5mMNaN3中で1
5分間放置した。ニトロセルローズ帯は終夜患者の緩衝
液で1/100に希釈した血清中に置いた。一晩過ぎた後ブ
ロットを同じ緩衝液中で洗浄した。PVに対する兎の抗血
清がポジチブ比較として用いられ、兎の前免疫血清がネ
ガチブ比較として用いられた。結合抗体の探知のために
は山羊の抗人体またはIgGが緩衝液に1/1000に希釈して
用いられた。ついでブロットは過酸化物結合アビジン希
釈1/400緩衝液中で放置された。兎の抗血清については
山羊抗兎IgGパーオキシターゼが緩衝液に1/1000希釈し
て用いられた。全てのブロットは50mM酢酸ナトリウムPH
50中でカルバゾールにより培養された。
ミド成分ゲル上に電気泳動した。約５μｇのビリオンを
各試料に施した。トービン他の方法によりニトロセルロ
ーズシートに移した。このシートを帯に切断して２％ト
イーン80で50mMトリスPH10.2、150mMNaCl,5mMNaN3中で1
5分間放置した。ニトロセルローズ帯は終夜患者の緩衝
液で1/100に希釈した血清中に置いた。一晩過ぎた後ブ
ロットを同じ緩衝液中で洗浄した。PVに対する兎の抗血
清がポジチブ比較として用いられ、兎の前免疫血清がネ
ガチブ比較として用いられた。結合抗体の探知のために
は山羊の抗人体またはIgGが緩衝液に1/1000に希釈して
用いられた。ついでブロットは過酸化物結合アビジン希
釈1/400緩衝液中で放置された。兎の抗血清については
山羊抗兎IgGパーオキシターゼが緩衝液に1/1000希釈し
て用いられた。全てのブロットは50mM酢酸ナトリウムPH
50中でカルバゾールにより培養された。
第１図に乳頭腫ヴィールスに対するIgA抗体の探知を
示す。頸部分泌物1/40を精製ウイリオンでコーチングし
たELISAプレートに施した。IgA抗体はIgA特定第２抗体
および過酸化物結合アビジンにより探知した。生地を加
えた後、490nmにおける吸収が15分後に記録された。背
景上の吸収値＞0.1がポジチブと記録された。
示す。頸部分泌物1/40を精製ウイリオンでコーチングし
たELISAプレートに施した。IgA抗体はIgA特定第２抗体
および過酸化物結合アビジンにより探知した。生地を加
えた後、490nmにおける吸収が15分後に記録された。背
景上の吸収値＞0.1がポジチブと記録された。
PVに対するIgA抗体が17〜42の女性の頸部分泌物から
発見された。第１図のグラフにおいて各点は患者からの
試料の平均吸収を示す。CIN8を有した９人の女性が頸部
分泌物中にIgA抗体を有していた。Pap汚染中の中空胞お
よびヴァギナ鏡により確認された非CIN症状が９人の患
者に認められ、これらの３人がIgA抗体を有していた。2
4人の女性中６人が正常な検査結果であって、IgA抗体を
有していた。IgAELISA吸収がこれらのグループ間の顕著
な差異について検査された。３通りの非パラメトリック
テストにおいて、正常なグループに比べてCINグループ
は顕著に高い吸収値を示した。IgAポジチブ頸部分泌物
の比率もまたCINグループにおいて正常グループより顕
著に高いことが認められた。この比較により、コンジロ
ーマ／中空胞を有したグループと正常グループとの間に
は差がないことが認められた（ｐ＞0.05;吸収平均＝0.1
09対0.104）。
発見された。第１図のグラフにおいて各点は患者からの
試料の平均吸収を示す。CIN8を有した９人の女性が頸部
分泌物中にIgA抗体を有していた。Pap汚染中の中空胞お
よびヴァギナ鏡により確認された非CIN症状が９人の患
者に認められ、これらの３人がIgA抗体を有していた。2
4人の女性中６人が正常な検査結果であって、IgA抗体を
有していた。IgAELISA吸収がこれらのグループ間の顕著
な差異について検査された。３通りの非パラメトリック
テストにおいて、正常なグループに比べてCINグループ
は顕著に高い吸収値を示した。IgAポジチブ頸部分泌物
の比率もまたCINグループにおいて正常グループより顕
著に高いことが認められた。この比較により、コンジロ
ーマ／中空胞を有したグループと正常グループとの間に
は差がないことが認められた（ｐ＞0.05;吸収平均＝0.1
09対0.104）。
15人の患者について血清および分泌物中のIgA、IgGレ
ベルを比較した。第２図に示すようにIgA抗体レベルは
には比較的相関関係があった。第３図に示すようにIgG
抗体レベルはあまり相関関係がなかった。第４図に示す
ように両レベル間には相関関係は認められなかった。
ベルを比較した。第２図に示すようにIgA抗体レベルは
には比較的相関関係があった。第３図に示すようにIgG
抗体レベルはあまり相関関係がなかった。第４図に示す
ように両レベル間には相関関係は認められなかった。
いずれのポリペプチドにPV抗体が向けられるかを調べ
るために、精製PBVウイリオンの免疫プロッチングが行
なわれた。
るために、精製PBVウイリオンの免疫プロッチングが行
なわれた。
第５、６図において純化BPVウイリオンは５〜20％ポ
リアクリルアミド上で電気泳動されて、ニトロセルロー
ズに移された。帯は精製牛ウイリオン、人体新生血清お
よび10患者血清に対する兎高度免疫血清中に入れられ
た。山羊抗人体IgG（第５図）または山羊抗人体IgA（第
６図）および過酸化物結合アビジンにより結合抗体が探
知された。IgAテストにおいては血清NO.2〜９の患者の
帯はNo.1と同じにネガチブであった。第５、６図におい
て矢印は主たる探知されたPVタンパクを示し、Ｋ＝重量
Kg、MW＝マーカーの分子量である。マーカーの分子量は
200;116;92;66;44および29キロダルトンであった。
リアクリルアミド上で電気泳動されて、ニトロセルロー
ズに移された。帯は精製牛ウイリオン、人体新生血清お
よび10患者血清に対する兎高度免疫血清中に入れられ
た。山羊抗人体IgG（第５図）または山羊抗人体IgA（第
６図）および過酸化物結合アビジンにより結合抗体が探
知された。IgAテストにおいては血清NO.2〜９の患者の
帯はNo.1と同じにネガチブであった。第５、６図におい
て矢印は主たる探知されたPVタンパクを示し、Ｋ＝重量
Kg、MW＝マーカーの分子量である。マーカーの分子量は
200;116;92;66;44および29キロダルトンであった。
精製牛ウイリオンに対して用意された兎ハイパー免疫
血清は４種のポリペプチド（14kDaタンパク、28kDaタン
パク、64Kタンパクおよび54kDaタンパク）を探知した。
54kDaタンパクに対しては10人のテストされた患者のう
ち10人が血清IgG抗体を有していた。２人が血清IgG抗体
を64kDaタンパクに対して有していた。２人が血清IgG抗
体を28kDaタンパクに対して有していた。IgA特定結合物
についてテストした結果では、10人中１人のみが探知で
きるIgA抗体レベルを免疫ブロッチングで示した（第６
図）。ELISAによったところこの血清は例外的に高いIgA
抗BPV反応性を示した。免疫ブロッチングにおいてこれ
は14kDa、28kDaおよび54kDaと反応し、64kDaとは弱く反
応した。
血清は４種のポリペプチド（14kDaタンパク、28kDaタン
パク、64Kタンパクおよび54kDaタンパク）を探知した。
54kDaタンパクに対しては10人のテストされた患者のう
ち10人が血清IgG抗体を有していた。２人が血清IgG抗体
を64kDaタンパクに対して有していた。２人が血清IgG抗
体を28kDaタンパクに対して有していた。IgA特定結合物
についてテストした結果では、10人中１人のみが探知で
きるIgA抗体レベルを免疫ブロッチングで示した（第６
図）。ELISAによったところこの血清は例外的に高いIgA
抗BPV反応性を示した。免疫ブロッチングにおいてこれ
は14kDa、28kDaおよび54kDaと反応し、64kDaとは弱く反
応した。
局部的な生殖器収縮乳頭腫ヴィールス抗体が存在しか
つ容易に探知測定できることが明らかにされた。頸部分
泌物中のPVに対するIgA抗体とCINの組織学的な診断との
間に強い相関関係があることが明らかになった。しかし
24人中６人の正常なPap汚染とヴァギナ検査の女性がIgA
抗体を有していた。IgA抗体を有しているがCINは有して
いない患者が組織学的に探知できないCIN病巣を有して
いるか否かは未知である。これまでの研究によると乳頭
腫ヴィールスグループ特定抗原に対するIgG抗体がCIN中
で高くなることを示唆している。しかしPVに対する血清
IgG抗体レベルは皮膚のコブを有した患者においても高
くなる。この問題は、ここに記載されたIgAを測定して
生殖器収縮PV感染に関係のある抗体を測定することによ
り、解決される。ここに記載したテストは前記したIgG
を用いたテストとは相関関係のないことを強調したい。
このことは、血清中のHPVに対するIgA抗体と分泌物との
間に相関関係があり（第２図）、HPVに対する分泌物ま
たは血清中のIgA、IgG抗体間には簡易は相関関係がない
（第４図、第１表）ことから結論される。血清中のIgA
抗体のレベルと分泌物との間には相関関係があった。し
たがって血清中のIgA抗体が生殖器収縮特定テストを与
え、これが日常の医療に応用できるという可能性があ
る。
つ容易に探知測定できることが明らかにされた。頸部分
泌物中のPVに対するIgA抗体とCINの組織学的な診断との
間に強い相関関係があることが明らかになった。しかし
24人中６人の正常なPap汚染とヴァギナ検査の女性がIgA
抗体を有していた。IgA抗体を有しているがCINは有して
いない患者が組織学的に探知できないCIN病巣を有して
いるか否かは未知である。これまでの研究によると乳頭
腫ヴィールスグループ特定抗原に対するIgG抗体がCIN中
で高くなることを示唆している。しかしPVに対する血清
IgG抗体レベルは皮膚のコブを有した患者においても高
くなる。この問題は、ここに記載されたIgAを測定して
生殖器収縮PV感染に関係のある抗体を測定することによ
り、解決される。ここに記載したテストは前記したIgG
を用いたテストとは相関関係のないことを強調したい。
このことは、血清中のHPVに対するIgA抗体と分泌物との
間に相関関係があり（第２図）、HPVに対する分泌物ま
たは血清中のIgA、IgG抗体間には簡易は相関関係がない
（第４図、第１表）ことから結論される。血清中のIgA
抗体のレベルと分泌物との間には相関関係があった。し
たがって血清中のIgA抗体が生殖器収縮特定テストを与
え、これが日常の医療に応用できるという可能性があ
る。
正常な主体とヴィールス写しを有した患者が正常な主
体と同様なIgA抗体レベルを有しているということは驚
くべきことである。しかしこのような状況はエプスタイ
ンバー（Epstein−Barr）ヴィールスについても見られ
るもので、ここでは抗ヴィールスタンパク保護膜IgA抗
体がヴィールス生産レベルには関係なく、ヴィールスを
伴ったガンにのみ関係がある。免疫ブロッチングは４個
のビリオンを伴ったポリペプチドを探知した。54kDaに
対するIgG抗体の存在は前の研究と合致する。56kDaIgG
免疫タンパクコード11オープンリーヂングフレームがタ
ンパク保護膜の主たる成分として識別された。ほぼ70kD
aタンパク保護膜タンパクはコードL2オープンリーヂン
グフレームである。このタンパクは我々が探知した64kD
aタンパクに相当する。28kDaタンパク14kDaタンパクの
身元は知られていない。単独のIgAポジチブ血清は54、2
8、および14kDaポリペプチドに対してIgA反応を有して
いたが、この血清のIgG反応は54kDaポリペプチドにのみ
向けられた。このことからしてIgA、IgGを高くするPV選
択は常に同じではないことが分かる。
体と同様なIgA抗体レベルを有しているということは驚
くべきことである。しかしこのような状況はエプスタイ
ンバー（Epstein−Barr）ヴィールスについても見られ
るもので、ここでは抗ヴィールスタンパク保護膜IgA抗
体がヴィールス生産レベルには関係なく、ヴィールスを
伴ったガンにのみ関係がある。免疫ブロッチングは４個
のビリオンを伴ったポリペプチドを探知した。54kDaに
対するIgG抗体の存在は前の研究と合致する。56kDaIgG
免疫タンパクコード11オープンリーヂングフレームがタ
ンパク保護膜の主たる成分として識別された。ほぼ70kD
aタンパク保護膜タンパクはコードL2オープンリーヂン
グフレームである。このタンパクは我々が探知した64kD
aタンパクに相当する。28kDaタンパク14kDaタンパクの
身元は知られていない。単独のIgAポジチブ血清は54、2
8、および14kDaポリペプチドに対してIgA反応を有して
いたが、この血清のIgG反応は54kDaポリペプチドにのみ
向けられた。このことからしてIgA、IgGを高くするPV選
択は常に同じではないことが分かる。
グループ特定PVタンパク保護膜抗原に対する血清抗体
の反応を分析すべく、正常で健康な患者PVに対する血清
抗体の割り合いをCINまたは頸部ガン腫を持った女性の
それと比較した。
の反応を分析すべく、正常で健康な患者PVに対する血清
抗体の割り合いをCINまたは頸部ガン腫を持った女性の
それと比較した。
健康な性女性から合計139の比較血清を得た。産婦人
科の女性から62を得た。いずれの女性も病理上の発見は
なくまたはコンジローマを持っていたが、CINの組織学
的な証拠はなかった。59の血清を年間定期検査を受けた
健康な女性実験室従業員から得た。
科の女性から62を得た。いずれの女性も病理上の発見は
なくまたはコンジローマを持っていたが、CINの組織学
的な証拠はなかった。59の血清を年間定期検査を受けた
健康な女性実験室従業員から得た。
処置してない組織学的に確認された頸部腫瘍を持った
114の女性からなるグループ、13の病巣がCIN1として分
類され、16の病巣がCIN2として分類され、16の病巣がCI
N3として分類され、残りの69の病巣が侵略性の頸部ガン
腫として分類された。種々の年齢の児童および男女の成
人から83の血清が得られた。
114の女性からなるグループ、13の病巣がCIN1として分
類され、16の病巣がCIN2として分類され、16の病巣がCI
N3として分類され、残りの69の病巣が侵略性の頸部ガン
腫として分類された。種々の年齢の児童および男女の成
人から83の血清が得られた。
ヴィールスの隔離の精製とは上記のように行なった。
ウシ乳頭腫ヴィールスの用意は第５、６図に示す。４
個のタンパクは全て免疫ブロッチングで示すような人体
血清を免疫反応性のエピトーペを含んでいた。
個のタンパクは全て免疫ブロッチングで示すような人体
血清を免疫反応性のエピトーペを含んでいた。
精製されたBPVを５回の冷凍／解凍（thoawing）によ
り分裂させ、10mMカーボネイト緩衝液PH9.6により希釈
し、半域96ウエルミクロ滴定板に0.15μg/ウエルの一定
濃度で加えた。BPVを含んだプレートを室温で終夜保
ち、その後0.05PESトウイーン20で洗浄し、プレートをP
ES中の10％ラム血清中に入れ、37℃で60分放置した。こ
の溶液を廃棄してプレートを紙で完全に包んだ。人体血
清を10％ラム血清/PESで1:20に希釈し、プレートに加え
37℃で120分間反応させた。それからプレートをPBS−Ｔ
で５回洗浄した。結合抗体を探知するために、プレート
上に120分37℃で放置した10％ラム血清/PBSに希釈した
人体IgAに対する西洋わさびペルオキシダーゼ単クロー
ン抗体を用いた。ついでプレーとをPBS−Ｔで５回洗浄
し、0.1Mクエン酸緩衝液1:50希釈した20mg/m12,2−アジ
ノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−サルフォナット
（６））ジアンモニア塩により培養させた。吸収は30分
後（第７、８図）または60分後（第９〜12図）で415nm
であった。IgGの探知のためにプレートを洗浄してから1
0ラム血清PBSで60分間37℃で放置した。
り分裂させ、10mMカーボネイト緩衝液PH9.6により希釈
し、半域96ウエルミクロ滴定板に0.15μg/ウエルの一定
濃度で加えた。BPVを含んだプレートを室温で終夜保
ち、その後0.05PESトウイーン20で洗浄し、プレートをP
ES中の10％ラム血清中に入れ、37℃で60分放置した。こ
の溶液を廃棄してプレートを紙で完全に包んだ。人体血
清を10％ラム血清/PESで1:20に希釈し、プレートに加え
37℃で120分間反応させた。それからプレートをPBS−Ｔ
で５回洗浄した。結合抗体を探知するために、プレート
上に120分37℃で放置した10％ラム血清/PBSに希釈した
人体IgAに対する西洋わさびペルオキシダーゼ単クロー
ン抗体を用いた。ついでプレーとをPBS−Ｔで５回洗浄
し、0.1Mクエン酸緩衝液1:50希釈した20mg/m12,2−アジ
ノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−サルフォナット
（６））ジアンモニア塩により培養させた。吸収は30分
後（第７、８図）または60分後（第９〜12図）で415nm
であった。IgGの探知のためにプレートを洗浄してから1
0ラム血清PBSで60分間37℃で放置した。
ついで10％ラム血清PESまたは人体IgGに対するモノク
ロナル抗体西洋わさびパーオキシターゼ結合物で1:1000
に30℃で120分希釈された兎抗人体IgGアルカリリン酸結
合物が使用された（第９〜12図）。0.1Mジエタノールア
ミンPH9.6/1mMMgCl緩衝中のPBS−T1mg/mlフォスファタ
ーゼ生地で洗浄してから、プレートを90分後に405nmで
読んだ。ペルオキシターゼ結合物抗体が用いられたとき
には、プレートはIgA結合物のために30分培養された。I
gM抗体の探知のためにププレートは上記のように放置し
て抗人体IgMグルコーズオキシダーゼとともに10％ラム
血清/PBS中に1:800希釈で120分放置された。60分後プレ
ートは415nmで読まれた。全てのELISAについて0.15以上
の吸収がポジチブ反応と考えられた。反応性の知られて
いる２個のCIN患者血清を内部標準として全てのテスト
に用いた。ネガチブ比較としてはコーチングされないウ
エルが複数用いられた。
ロナル抗体西洋わさびパーオキシターゼ結合物で1:1000
に30℃で120分希釈された兎抗人体IgGアルカリリン酸結
合物が使用された（第９〜12図）。0.1Mジエタノールア
ミンPH9.6/1mMMgCl緩衝中のPBS−T1mg/mlフォスファタ
ーゼ生地で洗浄してから、プレートを90分後に405nmで
読んだ。ペルオキシターゼ結合物抗体が用いられたとき
には、プレートはIgA結合物のために30分培養された。I
gM抗体の探知のためにププレートは上記のように放置し
て抗人体IgMグルコーズオキシダーゼとともに10％ラム
血清/PBS中に1:800希釈で120分放置された。60分後プレ
ートは415nmで読まれた。全てのELISAについて0.15以上
の吸収がポジチブ反応と考えられた。反応性の知られて
いる２個のCIN患者血清を内部標準として全てのテスト
に用いた。ネガチブ比較としてはコーチングされないウ
エルが複数用いられた。
患者グループと健康な比較グループとの間の確率的に
顕著な差異について複吸収の平均を分析した。
顕著な差異について複吸収の平均を分析した。
結果は以下のようであった。
児童と男女の成人とからなる83の血清から24がIgA抗
体を、46がIgG抗体を有していた。IgA抗BPVタイター（t
iters）が健康な女子に比べて健康な男子について上が
ったことが認められた（第７図）。この図は正常な対象
中における血清IgA抗体の年齢性別分布を示す。血清は
1:20に希釈され、IgA抗体はアルファチェイン特定西洋
わさびペルオキシターゼ結合単クローン抗体について探
知された。生地の追加に続ずいて、30分後に415nmの吸
収が記録された。各点は各患者についての平均比較とと
もに試料の平均吸収を示している。男女いずれの場合も
IgA抗体レベルは成人に比べて児童において非常に同じ
であった。IgA抗体についててテストされた同じ血清が
第８図に示すようにIgGについてもテストされた。これ
は健康な対象中における年齢および性別の血清IgG分布
を示す。同じ血清をIgGの存在について第７図のように
テストした。ただし抗IgG西洋わさびパーオキシターゼ
単クローン抗体が用いられた。成人に比べて児童におい
てIgG抗体が強く上がった。しかし顕著ではないもの
の、IgG抗体タイターが女性よりも正常な弾性において
上がる傾向が認められた。
体を、46がIgG抗体を有していた。IgA抗BPVタイター（t
iters）が健康な女子に比べて健康な男子について上が
ったことが認められた（第７図）。この図は正常な対象
中における血清IgA抗体の年齢性別分布を示す。血清は
1:20に希釈され、IgA抗体はアルファチェイン特定西洋
わさびペルオキシターゼ結合単クローン抗体について探
知された。生地の追加に続ずいて、30分後に415nmの吸
収が記録された。各点は各患者についての平均比較とと
もに試料の平均吸収を示している。男女いずれの場合も
IgA抗体レベルは成人に比べて児童において非常に同じ
であった。IgA抗体についててテストされた同じ血清が
第８図に示すようにIgGについてもテストされた。これ
は健康な対象中における年齢および性別の血清IgG分布
を示す。同じ血清をIgGの存在について第７図のように
テストした。ただし抗IgG西洋わさびパーオキシターゼ
単クローン抗体が用いられた。成人に比べて児童におい
てIgG抗体が強く上がった。しかし顕著ではないもの
の、IgG抗体タイターが女性よりも正常な弾性において
上がる傾向が認められた。
健康な成人女性からの139血清、CINグレード１の女性
からの13血清、CINグレード２の女性からの16血清、CIN
グレード３の女性からの16血清および頸部の侵略性細胞
ガン腫の女性からの69血清をIgA、IgGおよびIgM抗体に
ついて分析した。確率的な分析のためにCINおよびSCCグ
ループを１個の単独頸部腫瘍グループに組合せた。年齢
および性別が合致するCINを持たない比較に比べて、第
９図に示すようにIgA抗体レベルはCINまたはガン腫患者
グループにおいて顕著に上がった。この図はCINを持っ
たかまたは頸部のガン腫を持った患者からの血清中のIg
A抗体の探知を示すものである。血清は1:20に希釈され
てBPVでコーチングした板に加えられた。西洋わさびパ
ーオキシターゼ単クローン抗体でIgA抗体は探知され
た。生地を加えた後60分後に415nmで吸収が読まれた。
各点は平均吸収を示す。CINなしのグループに比べて、C
INおよびガン腫グループのタイターが上がった（ｐ＜0.
025）。
からの13血清、CINグレード２の女性からの16血清、CIN
グレード３の女性からの16血清および頸部の侵略性細胞
ガン腫の女性からの69血清をIgA、IgGおよびIgM抗体に
ついて分析した。確率的な分析のためにCINおよびSCCグ
ループを１個の単独頸部腫瘍グループに組合せた。年齢
および性別が合致するCINを持たない比較に比べて、第
９図に示すようにIgA抗体レベルはCINまたはガン腫患者
グループにおいて顕著に上がった。この図はCINを持っ
たかまたは頸部のガン腫を持った患者からの血清中のIg
A抗体の探知を示すものである。血清は1:20に希釈され
てBPVでコーチングした板に加えられた。西洋わさびパ
ーオキシターゼ単クローン抗体でIgA抗体は探知され
た。生地を加えた後60分後に415nmで吸収が読まれた。
各点は平均吸収を示す。CINなしのグループに比べて、C
INおよびガン腫グループのタイターが上がった（ｐ＜0.
025）。
第10図に示すように比較に比べて頸部腫瘍患者におい
ては対PVIgG抗体タイターが顕著に減少した（ｐ＜0.00
1）。この図はCINまたは頸部ガン腫を持った患者からの
血清中のIgG抗体の探知を示す。兎抗人体IgGアルカリフ
ォスファターゼを用いて対BPVIgG抗体の存在について第
９図と同じ血清をテストした。生地を加えた後90分後に
405で吸収を記録した。
ては対PVIgG抗体タイターが顕著に減少した（ｐ＜0.00
1）。この図はCINまたは頸部ガン腫を持った患者からの
血清中のIgG抗体の探知を示す。兎抗人体IgGアルカリフ
ォスファターゼを用いて対BPVIgG抗体の存在について第
９図と同じ血清をテストした。生地を加えた後90分後に
405で吸収を記録した。
第11図によれば比較グループに比べて頸部腫瘍患者グ
ループの対PVIgMタイターにおいて顕著な減少が認めら
れた。この図はCINまたは頸部ガン腫を持った患者から
の血清中の対PVIgM抗体の探知を示す。第９図を同じ血
清をIgM抗体の存在に関してテストした。抗人体IgMグル
コーズオキシターゼ結合物を用い、培養の後プレートを
60分後に415nmで読んだ。IgA反応とIgG反応との間の差
異をCINまたはガン腫グループと比較したところ、CINま
たはガン腫グループに驚くべき上昇が認められた。第12
図は病気との関係で上記の反応の差を示すものである。
第９、10図の場合と同じ吸収値がIgGで引かれたIgAとし
て記録された。
ループの対PVIgMタイターにおいて顕著な減少が認めら
れた。この図はCINまたは頸部ガン腫を持った患者から
の血清中の対PVIgM抗体の探知を示す。第９図を同じ血
清をIgM抗体の存在に関してテストした。抗人体IgMグル
コーズオキシターゼ結合物を用い、培養の後プレートを
60分後に415nmで読んだ。IgA反応とIgG反応との間の差
異をCINまたはガン腫グループと比較したところ、CINま
たはガン腫グループに驚くべき上昇が認められた。第12
図は病気との関係で上記の反応の差を示すものである。
第９、10図の場合と同じ吸収値がIgGで引かれたIgAとし
て記録された。
全てのHPVゲノム（genomes）が８個のタンパクと認め
られる領域、オープンリーディングフレームを有してい
る。２個のORF、L1とL2とがタンパク保護膜タンパクを
コードするものとして示された。L1タンパクは約54kDa
余分なタンパク保護膜タンパクで、IgGとIgAの両抗体に
対して免疫性である。L2タンパクに対する抗体は少なく
ともBPV−１についてはヴィールス中立活性を有してい
る。単クローンなどを用いた従来からの種々の研究によ
り、L1タンパクが全てのタイプのPVに対して共通にいわ
ゆるグループ特定エピトープ（epitope）を有してお
り，各HPVタイプについてもエピトープを有している。
小さな溶融タンパクを用いて、１グループ特定および１
タイプ特定エピトープがマップされた。L2ORFはほぼ70k
Daタンパク保護膜タンパクをコードし、我々によってほ
ぼ64kDaタンパクと呼ばれた。これは比較的余分が低い
ものである。L2タンパクはタイプ特定エピトーペを持っ
ていると報告されてきた。HPV16主タンパク保護膜タン
パクの線形エピトープの完全なマップを得るためにこれ
ら２種のタンパクのアミノ酸順列を５アミノ酸重複を有
した20アミノ酸合成ペプチドとして合成した。HPV16頸
部腫瘍を有した患者の血清からのIgA、IgGまたはIgM抗
体と反応した順列特定エピトープの位置を第13〜19図に
示す。
られる領域、オープンリーディングフレームを有してい
る。２個のORF、L1とL2とがタンパク保護膜タンパクを
コードするものとして示された。L1タンパクは約54kDa
余分なタンパク保護膜タンパクで、IgGとIgAの両抗体に
対して免疫性である。L2タンパクに対する抗体は少なく
ともBPV−１についてはヴィールス中立活性を有してい
る。単クローンなどを用いた従来からの種々の研究によ
り、L1タンパクが全てのタイプのPVに対して共通にいわ
ゆるグループ特定エピトープ（epitope）を有してお
り，各HPVタイプについてもエピトープを有している。
小さな溶融タンパクを用いて、１グループ特定および１
タイプ特定エピトープがマップされた。L2ORFはほぼ70k
Daタンパク保護膜タンパクをコードし、我々によってほ
ぼ64kDaタンパクと呼ばれた。これは比較的余分が低い
ものである。L2タンパクはタイプ特定エピトーペを持っ
ていると報告されてきた。HPV16主タンパク保護膜タン
パクの線形エピトープの完全なマップを得るためにこれ
ら２種のタンパクのアミノ酸順列を５アミノ酸重複を有
した20アミノ酸合成ペプチドとして合成した。HPV16頸
部腫瘍を有した患者の血清からのIgA、IgGまたはIgM抗
体と反応した順列特定エピトープの位置を第13〜19図に
示す。
HPV16のL1およびL2ORFの推論されたアミノ酸順列によ
って５個のアミノ酸重複を有した66個の20アミノ酸タン
パクの合成を行なった。タンパク中の位置を表示するた
めに、推定の監視コードがアミノ酸No.1とされた。合成
ペプチド番号１はL1ORF中のアミノ酸２−21に相当し、
ペプチド番号２はアミノ酸17〜36に対応し、番号３はア
ミノ酸32〜51に対応し、L1カーボキシターミナルペプチ
ド（35番）はアミノ酸512〜531に対応する。ペプチド番
号36はL2ORF（アミノ酸２〜21）アミノターミナルに対
応する。番号37はアミノ酸17〜36に対応する。L2カーボ
キシ付着端（番号65、66）における２個のペプチドは21
残基ペプチドとして合成された。これによりこれらのア
ミノ酸位置が4327〜457および453〜473となる。多くの
免疫活性ペプチドのアミノ酸順列を第１表に示す。そこ
の記号は第２表に説明されている。第13〜19図に用いら
れた全てのペプチドのアミノ酸順列を第13〜19図に示
す。ペプチドはｔ−BOCアミノ酸（バハム アーゲー、
ブーベンドルフ、スイス）とｐ−メチルベンジハイドリ
アミン樹脂（フルカアーゲ、バッハ、スイス）を用いて
複固相ペプチド合成法により合成された。フォルミルト
リペトファンおよびメチオニンスルホキシド残基からの
保護グループの除去は25％フッ化水素により分裂させる
ことにより達成された。それからペプチドは液体フッ化
水素とともに複槽装置を用いて樹脂から分裂された。
って５個のアミノ酸重複を有した66個の20アミノ酸タン
パクの合成を行なった。タンパク中の位置を表示するた
めに、推定の監視コードがアミノ酸No.1とされた。合成
ペプチド番号１はL1ORF中のアミノ酸２−21に相当し、
ペプチド番号２はアミノ酸17〜36に対応し、番号３はア
ミノ酸32〜51に対応し、L1カーボキシターミナルペプチ
ド（35番）はアミノ酸512〜531に対応する。ペプチド番
号36はL2ORF（アミノ酸２〜21）アミノターミナルに対
応する。番号37はアミノ酸17〜36に対応する。L2カーボ
キシ付着端（番号65、66）における２個のペプチドは21
残基ペプチドとして合成された。これによりこれらのア
ミノ酸位置が4327〜457および453〜473となる。多くの
免疫活性ペプチドのアミノ酸順列を第１表に示す。そこ
の記号は第２表に説明されている。第13〜19図に用いら
れた全てのペプチドのアミノ酸順列を第13〜19図に示
す。ペプチドはｔ−BOCアミノ酸（バハム アーゲー、
ブーベンドルフ、スイス）とｐ−メチルベンジハイドリ
アミン樹脂（フルカアーゲ、バッハ、スイス）を用いて
複固相ペプチド合成法により合成された。フォルミルト
リペトファンおよびメチオニンスルホキシド残基からの
保護グループの除去は25％フッ化水素により分裂させる
ことにより達成された。それからペプチドは液体フッ化
水素とともに複槽装置を用いて樹脂から分裂された。
ガン腫（CINグレード３）または侵略性頸部ガン腫を
持った患者からの62個の血清を得た。クローンHPV16お
よびHPV18のソーザンブロット（32ケース）またはドッ
トブロット（32ケース）により対応する頸部生検体（bi
opsies）がHPVDNAの存在について分析された。HPV16は3
2ケース中にHPV18は４ケース中に探知された。hpv16感
染頸部腫瘍を持った患者からの30個の血清を採れば全て
の異なる合成ペプチドについてテストには充分であっ
た。
持った患者からの62個の血清を得た。クローンHPV16お
よびHPV18のソーザンブロット（32ケース）またはドッ
トブロット（32ケース）により対応する頸部生検体（bi
opsies）がHPVDNAの存在について分析された。HPV16は3
2ケース中にHPV18は４ケース中に探知された。hpv16感
染頸部腫瘍を持った患者からの30個の血清を採れば全て
の異なる合成ペプチドについてテストには充分であっ
た。
他の腫瘍を持った患者から22個の血清が得られた。38
個の血清が健康な女性から得られた。
個の血清が健康な女性から得られた。
合成ペプチドは10mM炭酸緩衝液で希釈され、20μｇペ
プチド/mlの濃度でハーフアレア96ウエルミクロ滴定板
に加えられた。プレートは室温で終夜保持された。PPBS
0.05％トイーンによる１回の洗浄の後、プレートはPBS
中の10％ラム血清でブロックされた。その後60分37℃で
放置された。ブロック用溶液をその後廃棄し、プレート
を紙で完全に包んだ。10％ラム血清/PBSで人体血清を1:
30に希釈し、37℃で120分間反応させた。ついでPBS−Ｔ
でプレートを５回洗浄した。結合抗体の探知のために、
10％ラム血清/PBS中で抗人体IgA西洋わさびパーオキシ
ターゼ単クローン抗体を1:500に希釈し、プレート上で3
7℃で120分放置した。それからPBS−Ｔでプレートを５
回洗浄し、20mg/mlの２、２′−アジノ−ジ（３−エチ
ルベンズチアソリｎ−サルフォナット（６））ジアンモ
ニア塩（0.1Mシトレート緩衝中で1;50希釈）で培養し
た。
プチド/mlの濃度でハーフアレア96ウエルミクロ滴定板
に加えられた。プレートは室温で終夜保持された。PPBS
0.05％トイーンによる１回の洗浄の後、プレートはPBS
中の10％ラム血清でブロックされた。その後60分37℃で
放置された。ブロック用溶液をその後廃棄し、プレート
を紙で完全に包んだ。10％ラム血清/PBSで人体血清を1:
30に希釈し、37℃で120分間反応させた。ついでPBS−Ｔ
でプレートを５回洗浄した。結合抗体の探知のために、
10％ラム血清/PBS中で抗人体IgA西洋わさびパーオキシ
ターゼ単クローン抗体を1:500に希釈し、プレート上で3
7℃で120分放置した。それからPBS−Ｔでプレートを５
回洗浄し、20mg/mlの２、２′−アジノ−ジ（３−エチ
ルベンズチアソリｎ−サルフォナット（６））ジアンモ
ニア塩（0.1Mシトレート緩衝中で1;50希釈）で培養し
た。
吸収は415nmで60分後に記録された。IgGの探知のため
にプレートを洗浄して10％ラム血清−PBSで37℃で60分
ブロックした。その後兎抗人体IgGアルカリリン酸結合
物（10％ラム血清−PBS中で1:1000希釈）を37℃で120分
施した。PBS−Ｔで５回と0.1Mジエタノールアミン緩衝
で１回洗浄した後、0.1Mジエタノールアミン緩衝中の1m
g/mlフォスファターゼ生地を加え、プレートを90分後に
404nmで読んだ。
にプレートを洗浄して10％ラム血清−PBSで37℃で60分
ブロックした。その後兎抗人体IgGアルカリリン酸結合
物（10％ラム血清−PBS中で1:1000希釈）を37℃で120分
施した。PBS−Ｔで５回と0.1Mジエタノールアミン緩衝
で１回洗浄した後、0.1Mジエタノールアミン緩衝中の1m
g/mlフォスファターゼ生地を加え、プレートを90分後に
404nmで読んだ。
IgM抗体の探知のために、プレートを洗浄し上記のよ
うにブロックしてから10％ラム血清−PBS1:800希釈中抗
人体IgMグルコーズオキシダーゼ結合物で120分放置し
た。生地としては0.36mg/mlのABTS2.4％グルコーゼ、0.
1Mリン酸塩緩衝液中の８μg/ml西洋わさびパーオキシタ
ーゼを用いた。プレートを60分後に415nmで読んだ。0.1
以上の吸収をポジチブ反応とした。内部基準として、16
ポジチブ血清が各テストにおいてHPV16のE2ORFからの抗
原ペプチドHKSAIVTLYYDSEWQRDQCと反応した。ELISA吸収
は内部基準にあわせて調製して分析物間の変動を補償し
た。
うにブロックしてから10％ラム血清−PBS1:800希釈中抗
人体IgMグルコーズオキシダーゼ結合物で120分放置し
た。生地としては0.36mg/mlのABTS2.4％グルコーゼ、0.
1Mリン酸塩緩衝液中の８μg/ml西洋わさびパーオキシタ
ーゼを用いた。プレートを60分後に415nmで読んだ。0.1
以上の吸収をポジチブ反応とした。内部基準として、16
ポジチブ血清が各テストにおいてHPV16のE2ORFからの抗
原ペプチドHKSAIVTLYYDSEWQRDQCと反応した。ELISA吸収
は内部基準にあわせて調製して分析物間の変動を補償し
た。
HPV感染頸部腫瘍を有した患者グループと比較グルー
プととの間の確率的に顕著な差異についてELISA吸収
を、コーチングされてないウエル生地と反応した同じ血
清の吸収とともに、分析した。
プととの間の確率的に顕著な差異についてELISA吸収
を、コーチングされてないウエル生地と反応した同じ血
清の吸収とともに、分析した。
一連の66合成ペプチド、20アミノ酸長で５残基重複と
してHPVタイプ16のL1、L2タンパクのアミノ酸順列を合
成した。全てのペプチドが、HPV16感染頸部腫瘍患者か
らの30血清中のIgAまたはIgG抗体との反応性について,E
LISAでテストされた。第13図に示すようにL1タンパクの
いくつかの領域は反応性を示した。この図はL1タンパク
に対するIgA反応性を示す。各点は横軸上に示した番号
のペプチドと反応した１この血清についての吸収値を示
す。コーチングされないウエルと反応したときの同じ血
清の吸収値を差し引いた。HPV16感染頸部腫瘍を持った
患者からの30個の血清を1:30希釈し、HPV16のL1ORFの全
てのアミノ酸順列を代表する35個の20残基合成ペプチド
と反応させた。IgA特定酵素結合単クローン抗体により
結合ａ抗体が探知された。タンパク展開アミノ酸167〜2
71（ペプチド12〜18に対応する）の内部領域からのペプ
チドに対してはIgA反応が特に強かった。この主たる免
疫活性領域外には、いくつかの追加的な免疫活性なエピ
トープがあった。特にタンパクのアミノ端末（ペプチド
１）、ペプチド８（アミノ酸102〜121）およ主たる免疫
活性領域のカルボキシル端末に位置するいくつかのエピ
トーペ、ペプチド21と31（アミノ酸302〜321、452〜471
に対応する）などが認められた。
してHPVタイプ16のL1、L2タンパクのアミノ酸順列を合
成した。全てのペプチドが、HPV16感染頸部腫瘍患者か
らの30血清中のIgAまたはIgG抗体との反応性について,E
LISAでテストされた。第13図に示すようにL1タンパクの
いくつかの領域は反応性を示した。この図はL1タンパク
に対するIgA反応性を示す。各点は横軸上に示した番号
のペプチドと反応した１この血清についての吸収値を示
す。コーチングされないウエルと反応したときの同じ血
清の吸収値を差し引いた。HPV16感染頸部腫瘍を持った
患者からの30個の血清を1:30希釈し、HPV16のL1ORFの全
てのアミノ酸順列を代表する35個の20残基合成ペプチド
と反応させた。IgA特定酵素結合単クローン抗体により
結合ａ抗体が探知された。タンパク展開アミノ酸167〜2
71（ペプチド12〜18に対応する）の内部領域からのペプ
チドに対してはIgA反応が特に強かった。この主たる免
疫活性領域外には、いくつかの追加的な免疫活性なエピ
トープがあった。特にタンパクのアミノ端末（ペプチド
１）、ペプチド８（アミノ酸102〜121）およ主たる免疫
活性領域のカルボキシル端末に位置するいくつかのエピ
トーペ、ペプチド21と31（アミノ酸302〜321、452〜471
に対応する）などが認められた。
これに比較してL2タンパクから引きだされたペプチド
は第14図に示す血清中のIgA抗体とはほとんど反応しな
かった。この図はL2タンパクに対するIga反応性を示
す。HPVのL2ORFの全てのアミノ酸順列を代表する31個の
20残基合成ペプチドと血清が反応した点を別とすれば、
た第13図と同様な実験が行なわれた。主たるエピトープ
がタンパク（ペプチド49、アミノ酸197〜216）の中間に
位置していた。他のエピトーペはタンパク（ペプチド37
〜38、アミノ酸17〜41）のアミノ端末部分に位置してい
ることが探知された。L2のカルボキシル端末は反応性が
より低いものであった。L1タンパクのIgG反応性はIgA反
応性よりも低い。第15図にL1タンパクに対するIgG反応
性を示す。第13図の実験と同様に実験が行なわれたが、
IgG（ガンマー鎖）特定酵素結合物兎抗体が用いられた
点を別とする。主たるIgA免疫活性領域（ペプチド12〜1
8）がIgG抗体と免疫活性であり、IgG反応性はこの領域
外（例えばペプチド24（アミノ酸347〜366））のいくつ
かのエピトープと同じであった。
は第14図に示す血清中のIgA抗体とはほとんど反応しな
かった。この図はL2タンパクに対するIga反応性を示
す。HPVのL2ORFの全てのアミノ酸順列を代表する31個の
20残基合成ペプチドと血清が反応した点を別とすれば、
た第13図と同様な実験が行なわれた。主たるエピトープ
がタンパク（ペプチド49、アミノ酸197〜216）の中間に
位置していた。他のエピトーペはタンパク（ペプチド37
〜38、アミノ酸17〜41）のアミノ端末部分に位置してい
ることが探知された。L2のカルボキシル端末は反応性が
より低いものであった。L1タンパクのIgG反応性はIgA反
応性よりも低い。第15図にL1タンパクに対するIgG反応
性を示す。第13図の実験と同様に実験が行なわれたが、
IgG（ガンマー鎖）特定酵素結合物兎抗体が用いられた
点を別とする。主たるIgA免疫活性領域（ペプチド12〜1
8）がIgG抗体と免疫活性であり、IgG反応性はこの領域
外（例えばペプチド24（アミノ酸347〜366））のいくつ
かのエピトープと同じであった。
L2タンパクは第16図に示すように僅かにIgG反応性エ
ピトープを有していた。この図はL2に対するIgG反応性
を示す。IgG（ガンマー鎖）特定酵素結合物兎抗体を用
い、血清を全てのHPVのL2ORのアミノ酸順列を代表するF
31個の20残基合成ペプチドと反応させた点を別として、
第13図と同じ実験を行なった。この結果はこのタンパク
のIgA反応性について発見したものと類似であった。こ
のタンパクの主たるIgA反応性エピトープであるペプチ
ド49も主たるIgG反応性エピトープであることが確認さ
れた。L2（ペプチド37〜38）のアミノ端末におけるIgA
反応性エピトープIgG反応性であることが確認された
（第４図）。
ピトープを有していた。この図はL2に対するIgG反応性
を示す。IgG（ガンマー鎖）特定酵素結合物兎抗体を用
い、血清を全てのHPVのL2ORのアミノ酸順列を代表するF
31個の20残基合成ペプチドと反応させた点を別として、
第13図と同じ実験を行なった。この結果はこのタンパク
のIgA反応性について発見したものと類似であった。こ
のタンパクの主たるIgA反応性エピトープであるペプチ
ド49も主たるIgG反応性エピトープであることが確認さ
れた。L2（ペプチド37〜38）のアミノ端末におけるIgA
反応性エピトープIgG反応性であることが確認された
（第４図）。
L1タンパクに対するIgM反応性は第17図に示すように
タンパクの全長に沿っていくつかのエピトープに分散さ
れていた。この図はL1タンパクに対するIgM反応性を示
す。IgM（mu鎖）特定酵素結合物山羊抗体が用いられた
点を別として、第13図と同様な実験が行なわれた。興味
あることには、IgGまたはIgA抗体に対してあまり免疫活
性でないペプチドに対して主たるIgM反応性が確認され
た。
タンパクの全長に沿っていくつかのエピトープに分散さ
れていた。この図はL1タンパクに対するIgM反応性を示
す。IgM（mu鎖）特定酵素結合物山羊抗体が用いられた
点を別として、第13図と同様な実験が行なわれた。興味
あることには、IgGまたはIgA抗体に対してあまり免疫活
性でないペプチドに対して主たるIgM反応性が確認され
た。
L2タンパクのIgM免疫活性はL2ペプチドがL1ペプチド
より反応性が低いIgAおよびIgGについてと似ていた。第
18図にL2タンパクに対するIgM反応性を示す。IgM（mu
鎖）特定酵素結合物山羊抗体が用いられかつ血清がHPV1
6のL2ORFの全てのアミノ酸順列を代表する31個の20残基
合成ペプチドと反応した点を別とすれば第13図と同様な
実験が行なわれた。
より反応性が低いIgAおよびIgGについてと似ていた。第
18図にL2タンパクに対するIgM反応性を示す。IgM（mu
鎖）特定酵素結合物山羊抗体が用いられかつ血清がHPV1
6のL2ORFの全てのアミノ酸順列を代表する31個の20残基
合成ペプチドと反応した点を別とすれば第13図と同様な
実験が行なわれた。
30血清からの４個以上において１個のL2ペプチトもIg
Mとは免疫活性ではなかった。７個の最も免疫活性なペ
プチド（８、12、13、14、16、17および24）をIgA、IgG
およびIgM反応性を60比較血清のパネルを用いてテスト
した。このうち22は関係のない腫瘍を持った患者から38
は健康な対象から得られた。これらの患者のほとんどは
顕著な免疫活性を示した。比較血清については10％以下
であった。第19図は合成ペプチドの病気対反応性を示
す。
Mとは免疫活性ではなかった。７個の最も免疫活性なペ
プチド（８、12、13、14、16、17および24）をIgA、IgG
およびIgM反応性を60比較血清のパネルを用いてテスト
した。このうち22は関係のない腫瘍を持った患者から38
は健康な対象から得られた。これらの患者のほとんどは
顕著な免疫活性を示した。比較血清については10％以下
であった。第19図は合成ペプチドの病気対反応性を示
す。
第19図に示すように高度に免疫活性な合成ペプチドの
４個が、30HPV16感染頸部腫瘍血清（HPV16SCC）と他の
腫瘍を持った患者からかまたは健康な対象からの60個の
血清からなる比較グループとの間で、反応性の非常な差
異を示した。各点はコーチングされないウエルの吸収値
を差し引いたELISA中の吸収値を示す。ペプチド8:70％
に対するIgM反応性とともに、HPV16感染頸部腫瘍探知に
ついて高度な感度が認められた。このテストの特性値
（specificity）は95％（3/60比較血清が反応性であっ
た）。ペプチド24に対するIgM反応性は高度な特性値を
示した:97％（2/60比較血清が反応性であった）、しか
し感度は低かった:53％（16/30患者血清が反応した）。
ペプチド14、16に対するIgA反応性は感度約60％で特性
値が90％より若干上であった（第19図）、ポジチブ血清
中の免疫活性は最も高く探知されたものの中にあった
（第１〜６図と比較）。
４個が、30HPV16感染頸部腫瘍血清（HPV16SCC）と他の
腫瘍を持った患者からかまたは健康な対象からの60個の
血清からなる比較グループとの間で、反応性の非常な差
異を示した。各点はコーチングされないウエルの吸収値
を差し引いたELISA中の吸収値を示す。ペプチド8:70％
に対するIgM反応性とともに、HPV16感染頸部腫瘍探知に
ついて高度な感度が認められた。このテストの特性値
（specificity）は95％（3/60比較血清が反応性であっ
た）。ペプチド24に対するIgM反応性は高度な特性値を
示した:97％（2/60比較血清が反応性であった）、しか
し感度は低かった:53％（16/30患者血清が反応した）。
ペプチド14、16に対するIgA反応性は感度約60％で特性
値が90％より若干上であった（第19図）、ポジチブ血清
中の免疫活性は最も高く探知されたものの中にあった
（第１〜６図と比較）。
ペプチドが免疫活性であることを示すことにより、人
体血清と反応するエピトープを含んでいるとしたのであ
る。このペプチド順列に含まれたエピトープはペプチド
の正確な順列に絶対的に依存するものではないが、当初
のペプチドの若干変態したものにも含まれ得るものであ
る。このような変態としては伸長、収縮収縮、環化およ
びアミノ酸の置換などがある。時にはそのように変態さ
れたペプチドが新しいエピトープを含んだ新しいペプチ
ドと考えられるのではないかという疑問がある。当初の
ペプチドと変態ペプチドとの比較免疫分析により、変態
ペプチドが当初のペプチドに抗体に対して実質的に免疫
活性でありしたがって同じエピトープを含んでいるか否
かを決定するのは簡単である。ペプチドは種々な方法で
製造できる点は強調されるべきである。有機化学的方法
によるペプチド合成が採用されてきたが、同じペプチド
を他の方法、例えば再結合DNA表現システムなどでも製
造できるのである。
体血清と反応するエピトープを含んでいるとしたのであ
る。このペプチド順列に含まれたエピトープはペプチド
の正確な順列に絶対的に依存するものではないが、当初
のペプチドの若干変態したものにも含まれ得るものであ
る。このような変態としては伸長、収縮収縮、環化およ
びアミノ酸の置換などがある。時にはそのように変態さ
れたペプチドが新しいエピトープを含んだ新しいペプチ
ドと考えられるのではないかという疑問がある。当初の
ペプチドと変態ペプチドとの比較免疫分析により、変態
ペプチドが当初のペプチドに抗体に対して実質的に免疫
活性でありしたがって同じエピトープを含んでいるか否
かを決定するのは簡単である。ペプチドは種々な方法で
製造できる点は強調されるべきである。有機化学的方法
によるペプチド合成が採用されてきたが、同じペプチド
を他の方法、例えば再結合DNA表現システムなどでも製
造できるのである。
この発明は以上の記載に限定されるものではない。免
疫分析は例えば種々の方法で行なうことができる。特定
の抗原に結合された抗体の探知は例えば種々の抗体対抗
体（抗抗体）やペプチドＡやペプチドＢなどのような抗
体に親和性を有した他の化合物を用いても達成できる。
これらの反応剤のラベリング（labelling）も、例えば
フルオレセイン（フルオロ免疫分析）や酵素（酵素連結
免疫分性、ELISAまたはEIA）に放射性（放射免疫分析）
などによってもできるのである。特殊なエンジーム免疫
分析としては、抗原−抗体複合体が筋肉上に探知される
場合がある。このような手法は免疫染または免疫組織化
学などと呼ばれているが、その原理はELISAと同じであ
る。
疫分析は例えば種々の方法で行なうことができる。特定
の抗原に結合された抗体の探知は例えば種々の抗体対抗
体（抗抗体）やペプチドＡやペプチドＢなどのような抗
体に親和性を有した他の化合物を用いても達成できる。
これらの反応剤のラベリング（labelling）も、例えば
フルオレセイン（フルオロ免疫分析）や酵素（酵素連結
免疫分性、ELISAまたはEIA）に放射性（放射免疫分析）
などによってもできるのである。特殊なエンジーム免疫
分析としては、抗原−抗体複合体が筋肉上に探知される
場合がある。このような手法は免疫染または免疫組織化
学などと呼ばれているが、その原理はELISAと同じであ
る。
ELISA法は種々のフォーマットで行なうことができ
る。複層の抗抗体、アビジンビオチン複合体および酵素
抗酵素複合体を用いた方法が公知である。抗体を固定す
る剛性の支持体は通常プラスチックである。しかしその
他にもラテックスやアガロースも使われている。また抗
体を直接剛性の支持体に固定する必要はない。例えばキ
ャッチングまたはサンドイッチELISAと呼ばれる固相固
定抗原抗体を用いてもよい。
る。複層の抗抗体、アビジンビオチン複合体および酵素
抗酵素複合体を用いた方法が公知である。抗体を固定す
る剛性の支持体は通常プラスチックである。しかしその
他にもラテックスやアガロースも使われている。また抗
体を直接剛性の支持体に固定する必要はない。例えばキ
ャッチングまたはサンドイッチELISAと呼ばれる固相固
定抗原抗体を用いてもよい。
シート状の剛性支持体に抗原をブロットする免疫分析
は免疫ブロッチングと呼ばれている。典型的にはこの剛
性の支持体はニトロセルローズまたはナイロンシートで
あるが、他の支持体を用いてもよい。この場合にはブロ
ッチング前に抗原を寸法に応じてゲル電気泳動により分
けてやる。シート上の特定の抗原に対する抗体の結合の
探知は免疫分析の場合と同じに行なう。
は免疫ブロッチングと呼ばれている。典型的にはこの剛
性の支持体はニトロセルローズまたはナイロンシートで
あるが、他の支持体を用いてもよい。この場合にはブロ
ッチング前に抗原を寸法に応じてゲル電気泳動により分
けてやる。シート上の特定の抗原に対する抗体の結合の
探知は免疫分析の場合と同じに行なう。
診断方法は一般にいくつかの方法を組合せることによ
り感度と特性値のよりよい方法が生み出されるのである
から、以上記載した種々の手法は適宜組合せることが可
能である。
り感度と特性値のよりよい方法が生み出されるのである
から、以上記載した種々の手法は適宜組合せることが可
能である。
血清および分泌物中の対PVIgA、IgG抗体の測定。ELIS
Aからの消去係数は15患者を基礎とする。この情報の一
部は第２、３、４図に示す。データの確率的分析による
と対PVIgA抗体は、血清中であろうと分泌物中であろう
と、対PVIgG抗体テストの結果と相関関係なし。
Aからの消去係数は15患者を基礎とする。この情報の一
部は第２、３、４図に示す。データの確率的分析による
と対PVIgA抗体は、血清中であろうと分泌物中であろう
と、対PVIgG抗体テストの結果と相関関係なし。
16の頸部所要を有した30の患者からの血清中の顕著に
上がった対HPV16合成ペプチド抗体タイターを他の腫瘍
などを有した患者からの60血清と比較。図はこれら２個
のパラメータ中の顕著な差異ｐ値を示す NS＝顕著でない
上がった対HPV16合成ペプチド抗体タイターを他の腫瘍
などを有した患者からの60血清と比較。図はこれら２個
のパラメータ中の顕著な差異ｐ値を示す NS＝顕著でない
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/569 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (52)
- 【請求項１】（ｉ）（ａ）L2オープンリーディングフレ
ームによりコード化された約64kDaの乳頭腫ヴィールス
（PV）タンパクおよび（ｂ）L1オープンリーディングフ
レームによりコード化された約54kDaのPVタンパクから
なる群から選ばれたエピトープに対するIgA抗体および （ii）（ｃ）約28kDaのPVウイリオンタンパク、（ｄ）
約14kDaのPVウイリオンタンパクおよび（ｅ）特定のア
ミノ酸順列のエピトープを有したペプチドからなる群か
ら選ばれたエピトープに対するIgA抗体の体液中および
組織上における存在を確認することにより乳頭腫ヴィー
ルス（PV）による感染の探知が行われ、かつ 上記の特定のアミノ酸順列は からなる群から選ばれた式により表わされかつ拮抗性免
疫分析により、原ペプチドに対する抗体に対して免疫反
応性であると、判定されたものである ことを特徴とする診断目的で乳頭腫ヴィールスによる感
染を探知する方法。 - 【請求項２】抗体が人体を源とし、探知されるべき感染
がHPV感染である ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】抗体が人体を源とし、探知されるべき感染
がHPVを伴う病気である ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】抗体の存在が免疫分析により行われる ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 【請求項５】免疫分析がELISAである ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 【請求項６】免疫分析が免疫ブロッチング（BLOTTING）
である ことを特徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】探知が分泌物について行われる ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 【請求項８】探知が子宮頚部の分泌物について行われる ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 【請求項９】探知が子宮頚部の腫瘍の探知のために行わ
れる ことを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】分泌物が消毒綿に採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】分泌物がブラシに採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】分泌物がへらに採られ、希釈液によりこ
れから洗除される ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１３】探知が血清について行われる ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 【請求項１４】エピトープに対するIgG抗体の体液中お
よび組織上における存在を確認することによりPVによる
感染の探知が行われ、 （ｆ）約28kDaのPVウイリオンタンパク、（ｇ）約14kDa
のPVウイリオンタンパクおよび（ｈ）特定のアミノ酸順
列のエピトープを有したペプチドからなる群からエピト
ープが選ばれ、かつ 上記のアミノ酸順列は からなる群から選ばれた式によって表わされかつ拮抗性
免疫分析により、原ペプチドに対する抗体に対して免疫
反応性であると、判定されたものである ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】IgG抗体が人体を源とし、探知されるべ
き感染がHPV感染である ことを特徴とする請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】IgG抗体が人体を源とし、探知されるべ
き感染がHPVを伴う病気である ことを特徴とする請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】抗体の存在が免疫分析により行われる ことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 【請求項１８】免疫分析がELISAである ことを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 【請求項１９】免疫分析が免疫ブロッチング（BLOTTIN
G）である ことを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 【請求項２０】探知が分泌物について行われる ことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 【請求項２１】探知が子宮頚部の分泌物について行われ
る ことを特徴とする請求項20に記載の方法。 - 【請求項２２】探知が子宮頚部腫瘍の探知のために行わ
れる ことを特徴とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項２３】分泌物が消毒綿に採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項20に記載の方法。 - 【請求項２４】分泌物がブラシに採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項20に記載の方法。 - 【請求項２５】分泌物がへらに採られ、希釈液によりこ
れから洗除される ことを特徴とする請求項20に記載の方法。 - 【請求項２６】探知が血清について行われる ことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 【請求項２７】ペプチドに対するIgM抗体の体液中およ
び組織上における存在を確認することによりPVによる感
染の探知が行われ、 該ペプチドは特定のアミノ酸順列のエピトープと同様な
エピトープを有しており、かつ 上記のアミノ酸順列は からなる群から選ばれた式によって表されかつ拮抗性免
疫分析により、原ペプチドに対する抗体に対して免疫反
応性であると、判定されたものである ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２８】IgM抗体が人体を源とし、探知されるべ
き感染がHPV感染である ことを特徴とする請求項27に記載の方法。 - 【請求項２９】IgM抗体が人体を源とし、探知されるべ
き感染がHPVを伴う病気である ことを特徴とする請求項27に記載の方法。 - 【請求項３０】抗体の存在が免疫分析により行われる ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 【請求項３１】免疫分析がELISAである ことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 【請求項３２】免疫分析が免疫ブロッチング（BLOTTIN
G）である ことを特徴とする請求項30に記載の方法。 - 【請求項３３】探知が分泌物について行われる ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 【請求項３４】探知が子宮頚部の分泌物について行われ
る ことを特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項３５】探知が子宮頚部腫瘍の探知のために行わ
れる ことを特徴とする請求項34に記載の方法。 - 【請求項３６】分泌物が消毒綿に採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項３７】分泌物がブラシに採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項３８】分泌物がへらに採られ、希釈液によりこ
れから洗除される ことを特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項３９】探知が血清について行われる ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 【請求項４０】エピトープに対するIgA抗体の体液中お
よび組織上における存在を確認することによりPVによる
感染の探知が行われ、 （ｉ）約28kDaのPVウイリオンタンパク、（ｊ）約14kDa
のPVウイリオンタンパクおよび（ｋ）特定のアミノ酸順
列のエピトープを有したペプチドからなる群からエピト
ープが選ばれ、かつ 上記アミノ酸順列は からなる群から選ばれた式によって表わされかつ拮抗性
免疫分析により、原ペプチドに対する抗体に対して免疫
反応性であると、判定されたものである ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４１】IgA抗体が人体を源とし、探知されるべ
き感染がHPV感染である ことを特徴とする請求項40に記載の方法。 - 【請求項４２】IgA抗体が人体を源とし、探知されるべ
き感染がHPVを伴う病気である ことを特徴とする請求項40に記載の方法。 - 【請求項４３】抗体の存在が免疫分析により行われる ことを特徴とする請求項40に記載の方法。
- 【請求項４４】免疫分析がELISAである ことを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 【請求項４５】免疫分析が免疫ブロッチング（BLOTTIN
G）である ことを特徴とする請求項43に記載の方法。 - 【請求項４６】探知が分泌物について行われる ことを特徴とする請求項40に記載の方法。
- 【請求項４７】探知が子宮頚部の分泌物について行われ
る ことを特徴とする請求項46に記載の方法。 - 【請求項４８】探知が子宮頚部腫瘍の探知のために行わ
れる ことを特徴とする請求項47に記載の方法。 - 【請求項４９】分泌物が消毒綿に採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項46に記載の方法。 - 【請求項５０】分泌物がブラシに採られ、希釈液により
これから洗除される ことを特徴とする請求項46に記載の方法。 - 【請求項５１】分泌物がへらに採られ、希釈液によりこ
れから洗除される ことを特徴とする請求項46に記載の方法。 - 【請求項５２】探知が血清について行われる ことを特徴とする請求項40に記載の方法。
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