JP3366350B2 - Ｈｐｖ‐１６ ｅ６およびｅ７‐遺伝子由来ペプチドの、診断のための使用 - Google Patents

Ｈｐｖ‐１６ ｅ６およびｅ７‐遺伝子由来ペプチドの、診断のための使用

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトパピローマウイルス
１６（ＨＰＶ‐１６）関連侵襲性頸癌の診断確認のため
のＨＰＶ‐１６Ｅ６及びＥ７‐遺伝子由来ペプチドの使
用に関する。更に、本発明は、ＨＰＶ‐１６侵襲性癌の
治療用薬剤の製造のための物質であって特異的ＨＰＶ‐
１６ Ｅ６又はＥ７‐遺伝子由来ペプチドに親和性を有
する抗体にも関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＰＶ‐１６はProc.Natl.Acad.Sci.US
A,80,3813-3815(1983) で最初に記載されたヒトパピロ
ーマウイルスの１タイプである。ＨＰＶ‐１６のＤＮＡ
配列及びゲノム構成はVirology,145,181-185(1985)で公
表されている。ＨＰＶゲノム配列は大部分の前侵襲性及
び侵襲性頸癌から回収され、ＨＰＶ‐１６は世界中のす
べての研究においてこれらの腫瘍で優勢なＨＰＶタイプ
であると認識されている（１）。ＨＰＶ‐１６ゲノムは
頸癌の約５０％に存在し、その細胞ＤＮＡ中にしばしば
組み込まれる（２）。ＨＰＶ関連癌の血清学的マーカー
を確認（固定）するために多くの試みが行われた。以
前、ＨＰＶ‐１６ Ｅ７融合タンパク質に対する血清抗
体は侵襲性頸癌症例の２０．５％で、但しコントロール
対象の１．４〜３．８％でもわずかに検出されることが
報告された〔J.Natl.Cancer Inst.,81, page 1698 (198
9)〕。欧州特許出願（ＥＰ−Ａ−）９０ １０５ ２２
２．５号明細書ではＨＰＶ‐１６タンパク質Ｅ４、Ｅ
６、Ｅ７及びＬ１における特異的血清反応領域とＨＰＶ
‐１６ Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７及びＬ１タンパク質に対する
特異的抗体の確認用診断キットについて開示している。
しかしながら、すべての前記研究における血清学的デー
タの解釈は困難であったが、その理由は血清ドナーがウ
イルス学的又は疫学的に充分特徴付けられていないため
であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的はＨＰＶ‐１６関連侵襲性頸癌用の信頼できる診断
マーカーとしての使用のためのウイルス構造の確認であ
った。更に、本発明の目的はＨＰＶ‐１６関連侵襲性癌
の治療コントロールのための特異的手段を提供すること
であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】これら目的の解決法はＨ
ＰＶ‐１６関連侵襲性頸癌の診断確認のための、ＨＰＶ
‐１６遺伝子由来ペプチドの使用である。好ましいペプ
チドはJ.Gen.Virol.,71,page 2709(1990) で開示された
エピトープにまたがるＨＰＶ‐１６ Ｅ７ａａ６‐３
５、ＨＰＶ‐１６ Ｅ７ａａ２９‐５２、ＨＰＶ‐１６
Ｅ６ａａ１‐２３及びＨＰＶ‐１６ Ｅ６ａａ８‐３
７である（表３）。更に、ＨＰＶ‐１６ Ｅ６又はＥ７
‐遺伝子由来ペプチドに親和性を有するモノクローナル
又はポリクローナル抗体は頸癌の治療用薬剤の製造のた
めの物質として使用しうることがわかった。本発明の好
ましい局面は腫瘍増殖をコントロールするために使用で
きる細胞毒性化合物（例えば、コレラ毒素）に結合され
た上記親和性を有する抗体である。頸癌の症例‐コント
ロール研究の関係者からの血清が、ＨＰＶ‐１６ Ｅ６
及びＥ７ペプチド並びにインビトロ翻訳完全長ＨＰＶ‐
１６ Ｅ６又はＥ７ポリペプチドとの反応性に関して試
験された。Ｅ６及びＥ７ポリペプチド上のエピトープに
対する血清反応性はＨＰＶ‐１６関連侵襲性頸癌のマー
カーであるが、但しＨＰＶ‐１６関連前侵襲性疾患又は
ＨＰＶ‐１６と無関係の侵襲性頸癌のマーカーではない
ことが意外にもわかった。ＥＬＩＳＡ研究において、症
例とコントロール間の最も明確な差異はペプチドＥ７ａ
ａ６‐３５（３７％対９％）、ペプチドＥ７ａａ６‐３
５又はＥ７ａａ２９‐５２（４９％対１７％）、ペプチ
ドＥ７ａａ６‐３５及びＥ７ａａ２９‐５２（１６％対
０％）に対する反応性からわかった。ＨＰＶ‐１６が回
収されない侵襲症例及び数ヵ月ないし数年にわたりおそ
らくＨＰＶ‐１６を保有する頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩ
Ｎ）症例はＥ６及びＥ７ペプチドに対するそれらの反応
性に関してコントロールと似ていた。ＨＰＶ‐１６関連
侵襲癌の症例は、ＨＰＶ‐１６がサザンハイブリッド形
成で確認された症例（グループ１Ａ、ｎ＝３９）及びＨ
ＰＶ‐１６がサザンハイブリっド形成ではなくＰＣＲで
確認された症例（グループ１Ｂ、ｎ＝６７）に細分割で
きた。Ｅ６及びＥ７ペプチドに対する抗体優勢はグルー
プ１Ｂよりもグループ１Ａでより高かった（Ｅ７ａａ６
‐３８に関して４９％対３０％；Ｅ７ａａ２９‐５２に
関して２８％対１６％；Ｅ６又はＥ７ペプチドに関して
６４％対３９％；いずれのペプチドに関しても７０％対
５１％）。これは、ＨＰＶ‐１６関連侵襲癌において抗
体優勢が高くなるほど生殖器路試料における多量のＨＰ
Ｖ‐１６と関連しており、ひいては大きな腫瘍負担を反
映することを示唆した。免疫学的介入はウイルス病因の
腫瘍のコントロールに関して大きな可能性を与える。Ｅ
６及びＥ７抗原はＨＰＶ‐１６関連癌の診断及びイメー
ジングにとり有用な標的である。コレラ毒素のような細
胞毒性分子で標識された抗Ｅ６／Ｅ７抗体は治療可能性
を有する。形質転換ウイルスの初期タンパク質に対する
予防接種は腫瘍進行を妨げて、一部の症例では腫瘍の退
行を誘導することが示された。Ｅ７及びＥ６タンパク質
は自然感染の関係で抗原性である。これは、これらのタ
ンパク質を発現する細胞が免疫エフェクターメカニズム
に接近しうることを意味する。これはＨＰＶ関連癌の診
断、予防及びコントロールに関する免疫学的アプローチ
を追求するための理論的根拠に対して支持を与える。
【０００５】
【実施例】例 例１ ヒト血清によるＥＬＩＳＡで使用のためＥ６上の２つの
エピトープ（Ｅ６ａａ１‐２３及びＥ６ａａ８‐３７）
及びＥ７上の２つ（Ｅ７ａａ６‐３５及びＥ７ａａ２９
‐５２）を表す４種の合成ペプチドを製造した。これら
のペプチドはＥ６及びＥ７上におけるエピトープにまた
がっていた（表３）。血清ドナーはスペイン及びコロン
ビアにおいて頸癌の研究に付され、その場合に侵襲性頸
癌及び頸部上皮内腫瘍形成グレード１‐３（ＣＩＮ１‐
３）の発生症例を挙動的及びウイルス学的特徴に関して
それらの各コントロールと比較された。コントロールは
侵襲癌症例に関して母集団に基づき、ＣＩＮ１‐３症例
に関して個別的に適合させた。病状は病理学者のグルー
プにより確認された。剥離された頸部細胞はＨＰＶに関
して、その研究の侵襲性要素について ViraPapR 、サザ
ンハイブリッド形成及びポリメラーゼ鎖反応技術で並び
にＣＩＮ症例及びコントロールについて ViraPapR 及び
サザンハイブリッド形成で試験した。症例は下記のよう
に病状及びウイルス学的診断に基づき分類した： グループ１：ＨＰＶ‐１６の侵襲症例（Ｉｎｖ‐ＨＰＶ
‐１６）； グループ２：他のＨＰＶの侵襲症例（Ｉｎｖ‐他のＨＰ
Ｖ）； グループ３：ＨＰＶが確認されなかった侵襲症例（Ｉｎ
ｖ‐無ＨＰＶ）；及び グループ５：ＨＰＶ‐１６保有ＣＩＮ症例（ＣＩＮ‐Ｈ
ＰＶ‐１６）。 侵襲症例に関するコントロールグループ４（Ｉｎｖ‐コ
ントロール）及びＣＩＮ症例に関するコントロールグル
ープ６（ＣＩＮ‐コントロール）はコロンビア‐スペイ
ン研究の対応コントロールから選択した。グループ４コ
ントロールはグループ１、２及び３の年齢分布及び居住
国と適合し、グループ６コントロールはグループ５にお
けるＣＩＮ症例の個別的に適合されたコントロールであ
った。侵襲性症例及びコントロール（平均年齢、５０
歳）はＣＩＮ症例及びコントロール（平均年齢、３３
歳）よりも年長であった。血清試料はＥ６及びＥ７合成
ペプチドでＥＬＩＳＡにおいて１：２５希釈で二重に試
験した。マイクロタイタープレート〔イムノールII(Imm
unol II)，ダイナテック・ラボラトリーズ(Dynatech La
boratories) ，アーリントン，ＶＡ〕のウェルをｐＨ
７．２のリン酸緩衝液中１０μg/mlのＥ７ａａ６‐３８
もしくは２０μg/mlのＥ７ａａ２９‐５２で又はｐＨ
９．６の０．０６Ｍ炭酸緩衝液中２５μg/mlのＥ６ａａ
１‐２３もしくは１０μg/mlのＥ６ａａ８‐３７でコー
トした。アッセイは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合
された抗ヒトＩｇＧ及びＡＢＴＳ基質溶液で完了させ
た。各血清に関して、緩衝液ウェルの平均反応性は最終
的な吸光度値を計算するためペプチドでコートされたウ
ェルの平均反応性から差し引いた。症例（グループ１、
２、３及び５）の吸光度値の分布をマン・ホイットニー
(Mann Whitney)検定でそれらの各コントロール（グルー
プ４及び６）の場合と比較した。吸光度値に関する有意
差はグループ１症例とグループ４コントロールとの比較
で４種中３種のＥ６及びＥ７ペプチドに関してみられ
た。その差異はペプチドＥ７ａａ６‐３５で最も顕著で
あった（図１〜２）。グループ１血清に関するペプチド
Ｅ７ａａ６‐３５の中央吸光度値はグループ４血清に関
する対応値０．００９（０．０６９）と比較して０．０
８９（０．４８２）であり、この差異は非常に高度に有
意であった（ｐ＜０．００００１）。グループ１におい
て１００血清中１８はグループ４の１７７血清中で最高
の吸光度値０．７６９よりも高い吸光度値をペプチドＥ
７ａａ６‐３５に対して有した。グループ１においてペ
プチドＥ７ａａ６‐３５に対する吸光度値の分布もグル
ープ２（ｐ＜０．０５）、グループ３（ｐ＜０．０
５）、グループ５（ｐ＜０．００１）及びグループ６
（ｐ＜０．０００３）の場合と有意に異なっていた。グ
ループ１とグループ４の血清との間における顕著ではな
いが高度な有意差は、ペプチドＥ７ａａ２９‐５２（ｐ
＜０．００００１）（図１〜２）及びペプチドＥ６ａａ
８‐３７（ｐ＜０．００１）（データは示されていな
い）に対する反応性に関してもみられた。グループ１血
清においてペプチドＥ６ａａ１‐２３に対する吸光度値
の分布はグループ４血清の場合と有意には異なっていな
かった（ｐ＝０．１３７）。図１〜２において四分位数
間領域（ボックスの大きさ）により判断したところ、ペ
プチドＥ７ａａ２９‐５２ではなくペプチドＥ７ａａ６
‐３５の場合にグループ１血清の吸光度値に関して顕著
な変動があった。グループ２（Ｉｎｖ‐他のＨＰＶ）、
３（Ｉｎｖ‐無ＨＰＶ）及び５（ＣＩＮ‐１６）の症例
は対応コントロールの場合と有意には異ならないＥ６及
びＥ７ペプチドに対する反応性を有していた。２つのコ
ントロールグループ４及び６の反応性に関する差異も統
計学的に有意ではなかった。これらのデータは、ＨＰＶ
‐１６ Ｅ６‐Ｅ７ペプチドに対する高い反応性がＨＰ
Ｖ‐１６関連前侵襲性疾患又はＨＰＶ‐１６と関連して
いることが示されない侵襲性疾患とではなくＨＰＶ‐１
６関連侵襲癌と関連していることを示した。
【０００６】例２ 個々の血清は、コントロール血清の吸光度値の分布に基
づきアウトライアーを除いたカットオフ吸光度値を用い
て各ペプチドに関し抗体陽性又は抗体陰性として評点し
た。コントロール血清の吸光度値の平均及び標準偏差を
（グループ４及び６に関して別々に）計算し、平均＋３
ＳＤ以上の値を有する血清は除いた。次いで平均及び標
準偏差を再計算し、余分な血清を必要であれば同基準に
より除いた。このプロセスは残りの血清が除かれなくな
るまで繰返し、最終平均＋３標準偏差をカットオフ値と
して採用した。個別的ペプチド及び選択されたペプチド
の組合せに対する抗体について６グループにおける血清
の％は表１で示されている。症例‐コントロール比較に
おいて、有意差は４種のＥ６及びＥ７ペプチドの各々と
Ｅ６‐Ｅ７ペプチドのいくつかの組合せに対する抗体優
勢の点でみられた。これらの差異はグループ１とグルー
プ４との比較においてだけ顕著であった（表１）。グル
ープ１血清の４９％及びコントロール血清の１７％は少
なくとも１つのＥ６‐Ｅ７ペプチドに対する抗体を有し
ていた（ｐ＜０．００００１）。個々のペプチドに対す
る抗体を有するグループ１の血清の％はペプチドＥ７ａ
ａ６‐３５に関する３７％の高さからペプチドＥ６ａａ
８‐３７に関する１０％の低さまでにわたり、グループ
４における対応％は９％及び１％であった（双方の比較
に関して＜０．００００１のｐ値）。症例グループ３及
び５はＥ６‐Ｅ７ペプチドに対する抗体優勢に関してそ
れらの対応コントロールと異ならなかったが、但しコン
トロールグループ４の場合と同様にグループ１と異なっ
ていた。２種以上のペプチドに対する抗体はグループ１
で共通であったが、但し他のすべてのグループでは非常
にまれであった。Ｅ７の双方のペプチド、Ｅ６の双方の
ペプチド及び４種全部のＥ６‐Ｅ７ペプチドに対する抗
体はグループ１血清において各々１６％、５％及び２％
でみられたが、但し他のすべての症例又はコントロール
グループからの単一血清においてみられなかった（３種
すべての症例‐コントロール比較に関してｐ＜０．００
００１）。
【０００７】例３ ＥＬＩＳＡにおいてＥ７ペプチドとの血清反応性の独立
的確認を得るため、グループ１のすべての入手した血清
（ｎ＝９８）及びグループ４の６０血清（２６試料中２
４を含むが、そのグループはペプチドＥ７ａａ６‐３５
又はＥ７ａａ２９‐５２と反応性である）を放射線免疫
沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）においてインビトロ転写及び
翻訳系で合成された標識完全長Ｅ７ポリペプチドで試験
した（ＴＴ‐ＲＩＰＡ）。グループ１及びグループ４血
清の反応性に関して顕著な差異があった；グループ４血
清のわずか３％と比較してグループ１血清の５０％がＥ
７ポリペプチドを免疫沈降させた（ｐ＜０．００００
１）。完全長Ｅ７ ＴＴ‐ＲＩＰＡとＥ７ペプチドＥＬ
ＩＳＡ結果との相関関係はグループ１で高く、グループ
４血清で低かった（表２）。双方のＥ７ペプチドと反応
した１５のグループ１血清のうちすべてがＴＴ‐ＲＩＰ
Ａで確認された。グループ４における血清がいずれも双
方のＥ７ペプチドと反応しなかったため、グループ４に
関する対応値は得られなかった。ペプチドＥ７ａａ６‐
３５単独とＥＬＩＳＡで反応する血清の場合にＴＴ‐Ｒ
ＩＰＡではグループ１の８１％を確認したが、但しグル
ープ４血清ではわずか７％であり（ｐ＜０．００００
１）、ＥＬＩＳＡで双方のペプチドと陰性である血清の
場合にＴＴ‐ＲＩＰＡはグループ１の３０％及びグルー
プ４血清の０％で陽性であった（ｐ＜０．００１）。ペ
プチドＥ７ａａ２９‐５２単独と反応したわずかな血清
の場合に、ＴＴ‐ＲＩＰＡではグループ１血清の２０％
及びグループ４血清の１１％を確認した。この差異は有
意でなかった（ｐ＝０．６）。グループ２、３、５及び
６からの２７のＥ６又はＥ７ペプチド反応性血清のうち
８つはＴＴ‐ＲＩＰＡで陽性結果を示した（データは示
されていない）。
【０００８】例４ ＴＴ‐ＲＩＰＡ結果はシグナルの存在及び強度に基づき
陰性、陽性及び強い陽性として類別した。ペプチドＥ７
ａａ６‐３５ＥＬＩＳＡでの吸光度値の分布はこれらの
ＴＴ‐ＲＩＰＡ結果と対応させてグループ１及びグルー
プ４血清に関して図３で示されている。グループ１血清
において、ＥＬＩＳＡで高い吸光度値ほどＴＴ‐ＲＩＰ
Ａで強いシグナルと非常によく相関しており；陰性、陽
性及び強い陽性のＲＩＰＡスコアに関する平均吸光度値
は各々０．０５６、０．１５９及び１．０５であった。
逆に、グループ４において２つの血清のみがＴＴ‐ＲＩ
ＰＡで陽性であり、強い陽性はなかった。グループ４に
おけるＴＴ‐ＲＩＰＡ陰性血清の平均吸光度値は、グル
ープ１における０．０５６の値に対して０．１１４５で
あった。比較吸光度値（０．１８〜０．８）におけるＥ
ＬＩＳＡ陽性血清の試験において、ＴＴ‐ＲＩＰＡはグ
ループ４の場合（１５血清中１）よりもグループ１の場
合（１９血清中１５）においてはるかに多く陽性であっ
た（図３）。Ｅ６及びＥ７ペプチドに関するＥＬＩＳＡ
からの上記データは、ＨＰＶ‐１６Ｅ６及びＥ７上のエ
ピトープに対する抗体がＨＰＶ‐１６関連侵襲癌に関す
るマーカーであることを明らかに証明している。
【０００９】
【表１】 1ペプチドＥ７ａａ６‐３５、Ｅ７ａａ２９‐５２、Ｅ
６ａａ１‐２３及びＥ６ａａ８‐３７に関するカットオ
フ値はグループ４における分布に基づき各々０．１８、
０．１２、０．３６及び０．５１であり、グループ４に
おける分布に基づき各々０．１１、０．１２、０．５５
及び０．６２であった。2 平均年齢 症例‐コントロール比較は、必要な場合にフィッシャー
の正確な確率を用いてカイ二乗検定で行った。** はｐ＜０．０１を表し、****はｐ＜０．０００１を表
す。
【００１０】
【表２】 ****は症例及びコントロールの比較においてｐ＜０．０
０１を表す。 ＴＴ‐ＲＩＰＡの記載
【００１１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドＥ７ａａ６‐３５に対する血清の吸光
度値の分布を示す説明図。各分布の要約統計がボックス
プロットで示されている。ボックスの長さは四分位数間
領域に対応し、ボックスの上限は百分順位の７５番目を
表し、下限は百分順位の２５番目を表す。ボックス中に
おける水平実線は中央値を表す。百分順位の９０番目は
ボックスプロットから上方に伸びる線の末端において小
さなバーで示される。各アウトライアー吸光度値は白丸
で個別的に示される。ボックスプロットにおける中央値
に加えて、平均吸光度値がボックスの内側又は外側に存
在する破線で示されている。症例及び対応コントロール
の分布はマン・ホイットニー検定で比較された。
【図２】図１に続く同様の図で、ペプチドＥ７ａａ２９
−５２に対する血清の吸光度値の分布を示す説明図。
【図３】ＨＰＶ‐１６保有癌症例及びコントロールにお
けるＴＴ‐ＲＩＰＡ及びペプチドＥ７ａａ６‐３５ＥＬ
ＩＳＡ結果の比較を示す説明図。水平ダッシュ線はＥＬ
ＩＳＡにおいて血清陽性に関するカットオフを表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 平２−291297（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−289600（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−183600（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ＨＰＶ−１６関連侵襲性頸癌の診断的確認
    のための少なくとも一つのＨＰＶ−１６遺伝子由来ペプ
    チドを使用する方法であって、ペプチドがアミノ酸配列
    PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEを有するＥ７ａａ６−
    ３５またはアミノ酸配列NDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNを
    有するＥ７ａａ２９−５２またはアミノ酸配列MHQKRTAM
    FQDPQERPRKLPQLCを有するＥ６ａａ１−２３またはアミ
    ノ酸配列MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECを有するＥ６
    ａａ８−３７である使用方法。
  2. 【請求項２】アミノ酸配列PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDS
    SEEEを有するＨＰＶ−１６Ｅ７ａａ６−３５およびアミ
    ノ酸配列NDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNを有するＨＰＶ−
    １６Ｅ７ａａ２９−５２を含むペプチドの組合せが適用
    される、請求項１に記載の使用方法。
  3. 【請求項３】アミノ酸配列MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCを
    有するＨＰＶ−１６Ｅ６ａａ１−２３およびアミノ酸配
    列MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECを有するＨＰＶ−１
    ６Ｅ６ａａ８−３７を含むペプチドの組合せが適用され
    る、請求項１に記載の使用方法。
  4. 【請求項４】アミノ酸配列PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDS
    SEEEを有するＨＰＶ−１６Ｅ７ａａ６−３５およびアミ
    ノ酸配列NDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNを有するＨＰＶ−
    １６Ｅ７ａａ２９−５２およびアミノ酸配列MHQKRTAMFQ
    DPQERPRKLPQLCを有するＨＰＶ−１６Ｅ６ａａ１−２３
    およびアミノ酸配列MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECを
    有するＨＰＶ−１６Ｅ６ａａ８−３７を含むペプチドの
    組合せが適用される、請求項１に記載の使用方法。
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