LT5228B - Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas - Google Patents

Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas Download PDF

Info

Publication number
LT5228B
LT5228B LT2003069A LT2003069A LT5228B LT 5228 B LT5228 B LT 5228B LT 2003069 A LT2003069 A LT 2003069A LT 2003069 A LT2003069 A LT 2003069A LT 5228 B LT5228 B LT 5228B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
hpv
protein
monoclonal antibodies
enzyme
oncobalt
Prior art date
Application number
LT2003069A
Other languages
English (en)
Other versions
LT2003069A (lt
Inventor
Vsevolod Ivanovič KISELIOV
Piotr Georgijevič SVEŠNIKOV
Original Assignee
Uždaroji akcinė bendrovė Melofarma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uždaroji akcinė bendrovė Melofarma filed Critical Uždaroji akcinė bendrovė Melofarma
Priority to LT2003069A priority Critical patent/LT5228B/lt
Priority to AU2003295246A priority patent/AU2003295246A1/en
Priority to PCT/LT2003/000004 priority patent/WO2005008246A1/en
Publication of LT2003069A publication Critical patent/LT2003069A/lt
Publication of LT5228B publication Critical patent/LT5228B/lt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Išradimas priskiriamas žmogaus sveikatos apsaugos sričiai. Panaudojus genų inžinerijos metodus, nustatoma ankstyva navikinė žmogaus papilomos virusų (ŽPV) vystymosi kryptis, leidžianti sustabdyti onkologinės ligos išsivystymą, laiku skiriant gydymo bei profilaktikos priemones.@Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su ŽPV, ankstyvos diagnostikos in vitro būdu atlieka ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 kiekio nustatymą, panaudojant du tipus - porą fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų, atpažįstančių skirtingus ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 antigenines determinantes, koreliuoja ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymą E7 kaip epitelinių ląstelių navikinės transformacijos biocheminį žymenį (markerį) ir, esant ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 40 pg/ml - 50 ng/ml skaitinei reikšmei, liudija gimdos kaklelio displazijų ir vėžio vystymosi užuomazgą. Monokloninių antikūnų porą sudaro fermentu pažymėti monokloniniai antikūnai 716-281 ir 716-332.@Naudoja fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų perteklių, didinančių ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų nkobaltymo E7 aptikimo intervalą 40 pg/ml - 50 ng/ml. ą

Description

Išradimas priskiriamas žmogaus sveikatos apsaugos sričiai. Panaudojus genų inžinerijos v
metodus, nustatoma ankstyva navikinė žmogaus papilomos virusų (ZPV) vystymosi kryptis, leidžianti sustabdyti onkologinės ligos išsivystymą, laiku skiriant gydymo bei profilaktikos priemones.
Papilomavirusinė infekcija - viena labiausiai išplitusių virusinių infekcijų. Per 50 % seksualiai aktyvių pasaulio gyventojų gyvenimo eigoje užsikrečia žmogaus papilomos virusais (ZPV - žmogaus papilomos virusas, HPV - human papilloma virus, angį.). Šios infekcijos pasėkoje gali vystytis anogenitalinės srities ligos: gimdos kaklelio, vulvos, makšties, perianalinės srities vėžys bei genitalijų kondilomos (B. H. KnceneB, Γ. A. ^MHTpneB, A. A. KySaHOBa. B3aHM0CBH3B BnpycHBix ΚΗφεκμηπ nepe;ĮaBaeMBix nojioBbiM nyTeM, h OHKOJioranecKHX 3a6ojieBaHHH yporeHHTantHoro Tpaicra. BecTHHK ^epMaTonorHH h BeHepojiorHH. 2000, No. 6, psl. 20-23).
Fig. 1 parodytas papilomavirusinės infekcijos vystymasis.
Daugeliu atvejų ši virusinė infekcija praeina be pasekmių, ir pacientas savaime pagyja, tačiau 10 % atvejų infekcija tampa lėtine.
Gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų kasmet pasaulyje užregistruojama apie 500000 šios ligos atvejų. Per pastaruosius 25 metus sergamumas ŽPV sąlygotu tiesiosios žarnos vėžiu išaugo 2 kartus. Vykdomos skryningo programos, siekiančios diagnozuoti ligą ankstyvoje stadijoje, daugeliu atvejų nėra veiksmingos dėl jų atsitiktinio pobūdžio ir informatyvumo stokos.
Gimdos kaklelio vėžys - antra pagal dažnumą moterų onkologinė liga. Nustatyta, kad dviejų onkobaltymų E6 ir E7, kuriuos koduoja ŽPV genomas, sintezė sąlygoja infekuotų ŽPV virusu epitelinių ląstelių malignizaciją. Pagrindinis vaidmuo indukuojant navikinę transformaciją tenka onkobaltymui E7.
Laboratorinė diagnostika
Papilomavirusinės infekcijos laboratorinė diagnostika, skirta ankstyvam viruso nešiojimo nustatymui, yra svarbi priemonė, leidžianti kontroliuoti infekcijos paplitimą ir savalaikį kompleksinį gydymo-profilaktikos priemonių panaudojimą, apsaugojant) nuo onkologinės ligos išsivystymo.
Tuo tikslu buvo naudojami citologiniai tyrimai (taip vadinami Pap-tepinėliai), nustatantys atipines, daugiabranduoles ląsteles. Tačiau, daugelio autorių nuomone, ši metodika išaiškina ne daugiau 30 % infekcijos nešiotojų ir nebeatitinka šiuolaikiniams reikalavimams.
Ryšium su tuo buvo pradėta ieškoti laboratorinės analizės metodo, leidžiančio diagnozuoti ankstyvąsias gimdos kaklelio displazijos stadijas. Viena iš šios paieškos krypčių - serologiniai analizės metodai, siekiantys ligonio serume aptikti antikūnus ŽPV onkobaltymams (Patent EP0406542 A method for detecting precancerous and cancerous cervical intraepithelium. Patent EP0523391 Ūse of HPV-16 E6 and E7-gene derivated peptides for diagnostic purpose).
Šiuose darbuose specifinių antikūnų nustatymui imunofermentinės ir radioimuninės analizių metodais buvo panaudotos ŽPV baltymų peptidinės determinantės. Tačiau šis būdas nepasiteisino, kadangi nebuvo nustatyta patikima koreliacija tarp antikūnų titro ir gimdos kaklelio vėžio.
Plačiai paplito ŽPV tipų nustatymo metodas panaudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR) (B. H. KnceneB, Γ. A. ^MHTpueB, Μ.Φ. JlaTtinoBa. riojiHMepa3Haa uemiaa peaKmra b fluarHocTHKe yporeHHTajit>Hbix ΗΗφεκίίΗΗ. IlocoSne &rw epauen. MocKBa. 2000; U. Wieland, H.Pfister “Molecular diagnosis of persistent human papilloma virus infections”. tntervirology, 1996,v.39, pp. 145-157). Metodas turi didelę diagnostinę vertę ir leidžia nustatyti atskirus ŽPV tipus (Patent W000506645 Method and KIT for early cancer prediction, Patent US5679509 Methods and diagnostic aid for distinguishing a subset of HPV that is associated with an increased risk of developing cervical cancer dysplasia and cervical cancer).
Tačiau šio metodo panaudojimas veda prie hiperdiagnostikos, kadangi apie 80 % atvejų asmens infekavimas ŽPV yra trumpalaikis ir baigiasi savaimiu pasveikimu ir viruso eliminacija. Tokiu būdu, teigiamas rezultatas, gautas atliekant laboratorinį ŽPV DNR tyrimą neleidžia daugeliu atveju prognozuoti gimdos kaklelio vėžio išsivystymo.
Pastaraisiais metais papilomavirusinės infekcijos mechanizmų tyrimai parodė, kad infekciniame procese išskiriamos dvi stadijos: 1 - viruso reprodukcinio dauginimosi stadija ir 2 — integracinės infekcijos stadija, kurios metu viruso DNR įsiterpia (integruojasi) į infekuotų ląstelių genomą.
Pirmoji stadija yra grįžtama, ir daugelis infekuotų asmenų patiria spontaninę remisiją. Integracinės infekcijos stadija - tai pirmas žingsnis ląstelės navikinės transformacijos link ir labai dažnai baigiasi karcinomos išsivystymu (R.W. Tinkle “Immune evasion in human papillomavirusassociated cervical cancer”. Nature reviews, 2002, v.2, ppl-7).
Neseniai išaiškinta, kad ŽPV DNR integraciją į ląstelės genomą lydi aktyvi viruso onkobaltymų gamyba, tarp jų ir baltymo E7. Baltymo E7 buvimas gimdos kaklelio mėginiuose mūsų teigimu laikomas vienareikšmiu liudijimu apie epitelio ląstelių, turinčių integruotą ŽPV genomo kopiją prasidėjusią malignizaciją Šis teiginys dera su rezultatais, pateiktais Patente WO0154713 Method for determining risk of developing cervical cancer. Autoriai nustatinėjo onkobaltymų E6 ir E7 kiekį gimdos kaklelio mėginiuose, tam tikslui naudodami imunohistochemijos metodą kuris ženkliai nusileidžia mūsų pritaikytam imunofermentinės analizės metodui.
Išradimo tikslas - panaudojus imunofermentinės analizės metodą nustatyti ankstyvą navikinę ŽPV virusų vystymosi kryptį skirti savalaikį gydymą apsaugantį nuo onkologinės ligos išsivystymo.
Tikslas pasiekiamas tuo, kad gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais (ŽPV), ankstyvos diagnostikos in vitro būdu atlieka ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 kiekio nustatymą panaudojant du tipus-porą fermentu pažymėtų monokloninių antikūną atpažįstančių skirtingus ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 antigeninius determinantus, koreliuoja ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymą E7 kaip epitelinių ląstelių navikinės transformacijos biocheminį žymenį (markerį) ir, esant ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 40 pg/ml -50 ng/ml skaitinei reikšmei, liudija gimdos kaklelio displazijų ir vėžio vystymosi užuomazgą.
Monokloninių antikūnų porą sudaro fermentu pažymėti monokloniniai antikūnai 716-281 ir 716-332.
Naudoja fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų perteklią didinančiu ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 aptikimo intervalą 40 pg/ml - 50 ng/ml.
pavyzdys
Rekombinantinių plazmidžių, koduojančių ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 sintezę, sudarymas
Geno E7 šaltiniu panaudota gimdos kaklelio biopsinė medžiaga, paimta iš ligonią kurioms diagnozuota gimdos kaklelio displazija. Panaudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR), paimti klinikiniai mėginiai ištirti ŽPV infekcijos buvimo atžvilgiu. Atrinkti mėginiai, kuriuose nustatyta ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų DNR, po to, panaudojant genospecifmius pradmenis, PGR metodu amplifikuoti ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų genai E7 (303 bp DNR fragmentas - ŽPV-16 ir 324 bp fragmentas - ŽPV-18) ir klonuoti plazmidėje pBluescipt SK(+) (Stratagene) įterpiant EcoRIBamHI kirpimo vietose. Klonuotų genų oligonukleotidinių sekų nustatymas parodė visišką atitikimą GenBank duomenims (pavyzdžiui, AF125673).
Sekančiame darbo etape geno struktūrinės dalies 3’ galo srityje buvo įjungtos transliacijos terminacijos sekos.
Fig. 2 pateikta gauto genetinio darinio plazmidės sandara.
Fig. 3 parodyta ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų baltymo E7 sintezė E. coli ląstelėse pHE716 koduoja hibridinį baltymą e716: Met(His)6-GluPheIle-E716-GlySer (111 a.l.,
12.5 kDa, IET 4,6). Būtina pažymėti, kad šis baltymas elektroforezės metu SDS-PAAG pagal Lemli pasižymi anomaliniu judrumu (apie 21 kDa) ir tai atitinka literatūros duomenis.
PHE718 koduoja hibridinį baltymą e718: Met(His)6-GluPheSer-E718-GlySer (117 a.l.,
13.5 kDa, IET 5,4).
Gautų genų ekspresijai panaudotas kamienas BL21 (DE3). Indukciją ir ląstelių suardymą atlikome pagal standartinę schemą. Po suardymo e716 ir e718 randami tirpių ląstelės baltymų frakcijoje, todėl chromatografijąNi-IHA-agarozėje atlikome natyviose sąlygose nepridėjus šlapalo.
pavyzdys
Pelių monokloninių antikūnų ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų rekombinantiniams baltymams E7 gavimas
Balb/c linijos pelės (patelės, 16-18 g) buvo dukart imunizuotos (intervalas dvi savaitės), suleidžiant į letenėlių pagalvėles išgrynintus ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų baltymo E7 preparatus, gautus iš rekombinantiniu E.coli lizatų panaudojus vienastadijinės metalochelatinės chromatografijos metodą. Vienai imunizacijai panaudota 20 mkg baltymo suspensijos pavidalu leidžiant drauge su tokiu pat tūrio kiekiu pilno (1-a imunizacija) arba nepilno (2-a imunizacija) Freundo adjutanto.
Limfocitai paimti iš pakinklinių limfinazgių ketvirtą dieną po antros imunizacijos, panaudojus PEG 4000, buvo sulieti su mielomos ląstelėmis Sp 2/0 -Agl4, hibridomos atrinktos selektyvine terpe HAT, o po to atliktas skryningas netiesioginės IFA būdu ir teigiamos kultūros dukart klonuotos ribinių skiedimų būdu.
Atliekant EFA, 2 mkg/ml koncentracijos tirpale esantys ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų rekombinantiniai baltymai E7 sorbcijos būdu buvo prikabinti (imobilizuoti) prie polistireno plokštelių, po to ant jų 1 vai. prie 37°C temperatūros inkubacijai buvo užlieti neskiesti kultūrų supematantai. Susijungę su imobilizuotu antigenu, monokloniniai antikūnai aptikti inkubuojant 1 vai. prie 37°C temperatūros su konjuguotais su peroksidaze ožkos antikūnais pelės IgG (H+L).
Substratu naudotas TMB tirpalas su vandenilio peroksidu. Optinis tankis matuotas prie 450 nm. Darbo eigoje ŽPV 16 tipo baltymui E7 gautos dvi hibridomų grupės: 716-281, 716-288 (IgG2b) ir 716-321, 716-325, 716-332, 716-343 (IgG2a), kurios, atliekant netiesioginę IFA, vienodai gerai reagavo su ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų baltymu E7.
lentelėje pateikti optinio tankio rodikliai, gauti matuojant prie 450 nm netiesioginės IFA būdu titruojant monokloninius antikūnus sąveikoje su imobilizuotais ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų baltymu E7.
pavyzdys
Imunofermentinės analizės, skirtos kiekybiniam ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 nustatymui monokloninių antikūnų (MoAk) pagrindu, atlikimo sąlygų optimizacija
Monokloniniai antikūnai ŽPV 16 tipo baltymui E7 buvo išskirti iš ascitinių skysčių afininės chromatografijos būdu baltymo G sefarozėje (grynumas daugiau 95%) ir pažymėti naudojant peijodato metodą.
“Sendvič” (“sumuštinio”)-IFA būdu poromis patikrintas visų MoAk derinių (kombinacijų) gebėjimas kiekybiškai nustatyti ŽPV 16 tipo baltymą E7. Tam tikslui kiekvienos rūšies MoAk buvo imobilizuoti polistireno plokštelėse, po to pridėti ŽPV 16 tipo baltymo E7 septyni dukartiniai skiedimai (koncentracijų diapazonas 0,039-5,0 ng/ml), susidarę imuniniai kompleksai aptikti panaudojant visus MoAk peroksidazinius konjugatus ir TMB kaip substratą.
Paaiškėjo, kad visos patikrintos MoAk poros pasižymi gebėjimu sudaryti trigubą kompleksą (“sumuštinį”): imobilizuotas antikūnas-E7-konjugatas, kas ir rodo, kad išvalytas ŽPV16 tipo baltymas E7 tirpale yra oligomero būklėje netgi esant koncentracijų diapazonui 10’12 - 10'9M.
Nežiūrint to, kad visi MoAk deriniai buvo veiklūs naudojant “sendvič”-IFA metodą poros, kurias sudarė tie patys antikūnai arba tai pačiai grupei priklausantys antikūnai, pasižymėjo mažesniu jautrumu (pagal optinio tankio rodiklį, esant fiksuotai ŽPV 16 tipo baltymo E7 koncentracijai, ir pagal kalibracinio grafiko kreivę), negu MoAk poros, sudarytos iš skirtingoms grupėms priklausančių antikūnų.
Pagal jautrumą ir fono nebuvimą geriausi rezultatai pasiekti plokštelių sensibilizacijai naudojant MoAk 716-281, o peroksidaziniam konjugatui - MoAk 716-332.
ŽPV 16 tipo baltymo E7 kiekybinės analizės, panaudojant šią MoAk porą atlikimo sąlygos buvo optimizuotos kaitaliojant antikūnų, naudotų sorbcijai, koncentracijas, konjugato skiedimus, buferinių tirpalų sudėtį, visų “sendvič”-IFA stadijų laiką ir temperatūrą.
Fig. 4 pateikiamas ŽPV 16 tipo baltymo E7 kiekybinio nustatymo “sendvič”-IFA būdu kalibracinis grafikas.
0.1 M karbonatiniame buferiniame tirpale esantys MoAk 716-288 (pH 9.6, koncentracija 5 mkg/ml) imobilizuoti sorbcijos būdu. MoAk 716-332 konjugato su peroksidaze darbinis skiedimas - 1/50000 PBS tirpale su 0,2% BSA ir 0.05 % Tween 20. Substratas TMB.
Abscisės ašyje - baltymo koncentracija, ng/ml. Ordinatės ašyje - optinis tankis prie 450 nm.
Grafike nurodyta bandymo paklaida skaičiuojant trims nepriklausomiems matavimams.
Kaip matyti iš paveikslo, kalibracinis grafikas antigeno koncentracijos diapazone 0,039-5,0 ng/ml praktiškai yra linijinis, pasižymi fono nebuvimu ir pasiekia ŽPV16 tipo baltymo E7 detekcijos ribą esant pastarojo koncentracijai - 40 pg/ml, o tai yra reikšminga aplinkybė, siekiant nustatyti ŽPV16 tipo onkobaltymą E7 ekspresijos lygį transfekuotose ląstelėse ir klinikiniuose mėginiuose.
pavyzdys v
ZPV 16 tipo onkobaltymo E7 kiekio nustatymas gimdos kaklelio mėginiuose
Gimdos kaklelio nuograndų medžiagą talpino 1 ml fiziologinio tirpalo, tris kartus užšaldėatitirpino ir centrifugavo mikrocentrifugoje (Eppendorf) 10 min., 10 000 aps./min. Gautą supematantą skiedė du kartus PBS-ΑΤ (PBS, 0,2% BSA, 0,1 % Tween), po to 200 mkl šio skiedinio įliejo į plokštelės šulinėlį, prieš tai padengtą sorbcijos būdu imobilizuotais monokloniniais antikūnais baltymui E7, ir pernešdami po ‘A kiekio titravo į sekančius 4 šulinėlius.
Toje pačioje plokštelėje kaip standartą titravo išvalytą rekombinantinį ŽPV 16 tipo onkobaltymą E7 nuo 4 ng/ml iki 0,062 ng/ml. Po 1 vai. inkubacijos ir plovimo į šulinėlius liejo peroksidaze pažymėtą monokloninių antikūnų ŽPV 16 tipo onkobaltymui E7 konjugatą, inkubavo 1 vai. ir reakciją išryškino pridėdami TMB. Optinį tankį matavo multiskanu prie 450 nm ilgio bangos.
Pagal standarto skiedimų optinį tankį sudarė kalibracinį grafiką, pagal kurį nustatė ŽPV 16 tipo onkobaltymo E7 koncentraciją mėginyje. Kontrole tarnavo gimdos kaklelio mėginiai, paimti iš 28 sveikų moterų. Visais šiais atvejais ŽPV 16 tipo onkobaltymo E7 testas buvo neigiamas.
ŽPV 16 tipo onkobaltymo E7 nustatymas gimdos kaklelio mėginiuose pateiktas 2 lentelėje.
Dvigubo antikūnų “sendvičo” (“sumuštinio”) metodas, pagrįstas fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų 716-281 ir 716-332 panaudojimu kiekybiniam ŽPV 16 tipo onkobaltymo E7 nustatymui klinikinėje medžiagoje, palyginus su kitais imunodiagnostikos metodais, tokiais kaip imunohistochemija, Westem blotingas, tėkmės citofluorimetrija ir kt., pasižymi eile neginčytinų privalumų:
1. Dideliu specifiškumu ir fono nebuvimu dėka vienu metu vykstančio dviejų monokloninių antikūnų susirišimo su tikslinio ŽPV 16 tipo antigeno E7 skirtingais epitopais.
2. Dideliu jautrumu (aptikimo riba 40 pg/ml) dėka to, kad panaudojamas didelis fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų perteklius ir šiuolaikiniai chromogeniniai substratai, pavyzdžiui, TMB.
3. Ištęstu dinaminiu diapazonu nuo 40 pg/ml iki 50 ng/ml, leidžiančiu kiekybiškai išmatuoti ŽPV 16 tipo onkobaltymo E7 koncentraciją naudojant minimalų mėginio skiedimo skaičių.
4. Nesudėtinga mėginio paruošimo procedūra, nereikalaujančia bandinio fiksacijos ir plovimų.
5. Galimybe vienu metu nustatyti ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymą E7 dėka to, kad monokloniniai antikūnai kryžminiai reaguoja su abiem baltymais.
6. Didelio mėginių kiekio skryningo ir individualaus ligonio gydymo efektyvumo monitoringo galimybe dėka to, kad mėginių paėmimas ir analizė pasižymi aukštu standartiškumu.
lentelė
Optinio tankio rodikliai, gauti matuojant prie 450 nm netiesioginės IFA būdu titruojant monokloninius antikūnus sąveikoje su imobilizuotu ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų baltymu E7
MoAk kone. ng/ml —v ........ .... . ..... .... . . ZPV 16 tipo onkobaltymo E7 sorbcija V ..... 1 1 1 1 ZPV 18 tipo onkobaltymo E7 sorbcija
716- 281 716- 288 716- 321 716- 325 716- 332 716- 343 716- 281 716- 288 716- 321 716- 325 716- 332 716- 343
100 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2 >2
30 1.777 1.515 1.382 1.131 1.393 1.737 1.807 1.709 >2 >2 >2 >2
10 0.947 0.705 0.462 0.375 0.473 0.652 1.010 0.939 1.331 1.194 1.350 1.672
3 0.398 0.301 0.160 0.117 0.168 0.265 0.445 0.412 0.508 0.425 0.526 0.839
1 0.154 0.091 0.047 0.030 0.045 0.003 0.176 0.170 0.176 0.145 0.190 0.365
0 0.017 0.007 0.013 -0.008 -0.012 0.0 0.029 0.026 0.021 0.020 0.025 0.028
lentelė
ŽPV 16 tipo onkobaltymo E7 nustatymas gimdos kaklelio mėginiuose
Ligonės Nr. Anti E7 IgG E7-16 Bendras baltymas OT 1/20 Mėginio infekcijos patvirtinimas Diagnozė
PI 0.678 0.418 0.1 ng/ml 0.084 ZPV 16,18 CINUI
P2 0.466 0.317 2.2 ng/ml 0.151 ŽPV 31 CINΙ-Π
P3 0.232 0.127 0.8 ng/ml 0.152 ŽPV didelės onkogeninės rizikos CINΙΙ-ΠΙ
P4 0.337 0.158 3.5 ng/ml 0.228 CIN ΠΙ, įtariamas gimdos kaklelio vėžys
P5 0.268 10 ng/ml 0.041 ŽPV 16,18 CIN ΙΠ, įtariamas gimdos kaklelio vėžys
P6 0.422 0.202 1 ng/ml 0.058 ŽPV 16,18 CINU
P7 0.215 0.06 ng/ml 0.174 ŽPV 16,18 CIN ΙΙ-ΠΙ
P8 0.357 0.164 0,3 ng/ml 0.089 ŽPV 16 CINI-Π
P9 0.412 0.197 1,6 ng/ml 0.096 ŽPV 18 cin n-m
P10 0.335 0.130 0,9 ng/ml 0.165 ŽPV 16 CIN ΙΠ, įtariamas gimdos kaklelio vėžys
Pll 0.280 1,2 ng/ml 0.180 ŽPV 16 CIN Π
P12 0.554 0.233 0,8 ng/ml 0.220 ŽPV 16 CIN n-m
P13 0.443 0,8 ng/ml 0.097 ŽPV 16 CINI-Π
P14 0.214 1,8 ng/ml 0.162 ŽPV 16 CIN Π

Claims (3)

1. Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais (ŽPV), ankstyvos diagnostikos in vitro būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 kiekio nustatymą, panaudojant du tipus-porą fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų, atpažįstančių skirtingus ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 antigeninius determinantus, koreliuoja ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymą E7 kaip epitelinių ląstelių navikinės transformacijos biocheminį žymenį (markerį) ir, esant ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 40 pg/ml -50 ng/ml skaitinei reikšmei, liudija gimdos kaklelio displazijų ir vėžio vystymosi užuomazgą.
2. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad monokloninių antikūnų porą sudaro fermentu pažymėti monokloniniai antikūnai 716-281 ir 716-332.
3. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad naudoja fermentu pažymėtų monokloninių antikūnų perteklių, didinančiu ŽPV 16 ir ŽPV 18 tipų onkobaltymo E7 aptikimo intervalą 40 pg/ml - 50 ng/ml.
LT2003069A 2003-07-16 2003-07-16 Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas LT5228B (lt)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LT2003069A LT5228B (lt) 2003-07-16 2003-07-16 Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas
AU2003295246A AU2003295246A1 (en) 2003-07-16 2003-12-30 In vitro diagnosis method for early detection of cervical dysplasias and cancer, associated with hpv
PCT/LT2003/000004 WO2005008246A1 (en) 2003-07-16 2003-12-30 In vitro diagnosis method for early detection of cervical dysplasias and cancer, associated with hpv

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LT2003069A LT5228B (lt) 2003-07-16 2003-07-16 Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LT2003069A LT2003069A (lt) 2005-01-25
LT5228B true LT5228B (lt) 2005-06-27

Family

ID=33550355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LT2003069A LT5228B (lt) 2003-07-16 2003-07-16 Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2003295246A1 (lt)
LT (1) LT5228B (lt)
WO (1) WO2005008246A1 (lt)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0406542A1 (en) 1989-05-11 1991-01-09 Biocheck, Inc. A method for detecting precancerous and cancerous cervical intraepithelium
EP0523391A1 (en) 1991-07-13 1993-01-20 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Use of HPV-16 E6 and E7-gene derived peptides for the diagnostic purpose
WO2001054713A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Musc Foundation For Research Development Methods for determining risk of developing cervical cancer
WO2005006645A1 (fr) 2003-07-04 2005-01-20 Thomson Licensing Procede de chiffrement/dechiffrement d'un message et dispositif associe

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995015497A1 (en) * 1993-11-30 1995-06-08 The University Of Queensland Immunoassay for cervical cancer
EP1487878A2 (en) * 2002-03-22 2004-12-22 Amynon BioTech GmbH Anti-hpv-16 e7 antibodies and their use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0406542A1 (en) 1989-05-11 1991-01-09 Biocheck, Inc. A method for detecting precancerous and cancerous cervical intraepithelium
EP0523391A1 (en) 1991-07-13 1993-01-20 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Use of HPV-16 E6 and E7-gene derived peptides for the diagnostic purpose
WO2001054713A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Musc Foundation For Research Development Methods for determining risk of developing cervical cancer
WO2005006645A1 (fr) 2003-07-04 2005-01-20 Thomson Licensing Procede de chiffrement/dechiffrement d'un message et dispositif associe

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003295246A1 (en) 2005-02-04
WO2005008246A1 (en) 2005-01-27
LT2003069A (lt) 2005-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7732166B2 (en) Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
US7972776B2 (en) Protein chips for HPV detection
US9568474B2 (en) In situ detection of early stages and late stages HPV infection
Meschede et al. Antibodies against early proteins of human papillomaviruses as diagnostic markers for invasive cervical cancer
JP5819851B2 (ja) Ｈｐｖ関連の癌の治療及びスクリーニングのための細胞に基づいた高処理能力ｈｐｖ免疫アッセイ
RU2251699C1 (ru) Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
US8916342B2 (en) Identification of high grade or ≧ CIN2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (HPV) and HPV-associated cancers
JP2007522108A (ja) Ｈｐｖの発癌性株に対する抗体およびそれらの使用方法
Awan et al. Comparison of polymerase chain reaction and immunohistochemistry assays for analysing human papillomavirus infection in oral squamous cell carcinoma
WO2012163263A1 (en) Reagents and methods for prrsv detection
Ewaisha et al. Serum immune profiling for early detection of cervical disease
Yang et al. Direct human papillomavirus E6 whole-cell enzyme-linked immunosorbent assay for objective measurement of E6 oncoproteins in cytology samples
US8968995B2 (en) Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
LT5228B (lt) Gimdos kaklelio displazijų ir vėžio, susijusių su žmogaus papilomos virusais ankstyvos diagnostikos in vitro būdas
EP0767381B1 (en) Detection, quantification and classification of ras proteins in body fluids and tissues
TW201043958A (en) Detection of early stages and late stages HPV infection
WO2010041349A1 (ja) 子宮頚部腺癌の診断又は子宮頸癌の予後の診断のためのマーカー
Jeon et al. Immunocytochemical detection of HPV16 E7 in cervical smear
Achour et al. Analysis of antibody response to HPV 16 and HPV 18 antigens in Tunisian patients
Benevolo et al. Comparative evaluation of nm23 and p16 expression as biomarkers of HR-HPV infection and CIN2+ lesions of the uterine cervix

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20060716