FI97426C

FI97426C - Menetelmä ihmisen papilloomaviruksen (HPV) toteamiseksi diagnostista käyttöä varten

Info

Publication number: FI97426C
Application number: FI912050A
Authority: FI
Inventors: Joakim Dillner; Lena Dillner
Original assignee: Ferring Ab
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1996-12-10
Also published as: JP3117695B2; WO1990004790A1; AU639666B2; FI912050A0; JPH04506562A; SE8803870D0; DE68912342T2; AU4481589A; EP0440700B1; DE68912342D1; EP0440700A1; FI97426B; US5629146A

Description

97426

MENETELMÄ IHMISEN PAPILLOOMAVIRUKSEN (HPV) TOTEAMISEKSI DIAGNOSTISTA KÄYTTÖÄ VARTEN

Keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen pa-5 pilloomaviruksen (HPV) vasta-aineiden toteamiseksi kehon nesteestä tai kudoksesta, HPV-assosioidun neo-plasian diagnosoimiseksi.

Kohdunkaulan ihmisen papilloomavirus(HPV)-infektio on yhteydessä kohdunkaulan syöpään. Yli 50 10 erilaista HPV-tyyppiä on identifioitu. HPV-tyyppien 6, 11, 16, 18, 31, 33 ja 51 on havaittu infektoivan genitaalialuetta. Tyypit 6 ja 11 aiheuttavat hyvänlaatuisia proliferatiivisia leesioita (visvasyyliä) genitaalialueella, condylomata acuminata. Tyyppejä 16, 18, 31 ja 33 15 on havaittu syövän esiasteisissa leesioissa ja suurimmassa osassa kohdunkaulan syövistä. Ihmisen papillooma-virukset ovat immunologisesti läheisiä naudan papil-loomaviruksille: molemmille virusryhmille reaktiivinen vasta-aine voidaan valmistaa helposti. Papilloomaviruk-20 sen kapsidin (viruksen kuoriosa) antigeenejä on osoitettu syövän esiasteisista leesioista ja kondylomatoo-sisesta kudoksesta käyttämällä sellaista ryhmäspesifis-tä antiseerumia, joka on valmistettu viruskapsidien vastaiseksi. Potilailla, joilla on genitaalisyyliä, 25 kohdun intraepiteliaalinen neoplasia (CIN) ja kohdunkaulan syöpä, on esitetty olevan korkeampia seerumin IgG-vasta-ainetasoja ryhmäspesifiselle kapsidin antigeenille kuin kontrolliryhmillä.

Keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin edellä 30 esitetty menetelmätyyppi syövän, erityisesti kohdun syövän, sen esiasteen tai syövän kehittymisriskin to-;; teamisen helpottamiseksi.

Keksinnön tarkoituksena on tuoda edelleen esiin edellä esitetty menetelmätyyppi, jonka avulla 35 syövän, sen esivaiheen esiintyminen tai syövän kehitty-misriski voidaan saada selville yksinkertaisella ja nopealla tavalla toteamalla ihmisen papilloomaviruksen 2 97426 (HPV) vastaisten vasta-aineiden esiintyminen kehon nesteissä .

Näiden tarkoitusten ja selitysosassa vielä myöhemmin ilmenevien tarkoitusten saavuttamiseksi kek-5 sinnön mukainen menetelmä omaa ne erityispiirteet, jotka on esitetty patenttivaatimuksissa.

Julkaisussa EP-A-0 257 754 on esitetty syntetisoituja papilloomaviruspeptidejä, jotka ovat hyödyllisiä hyperimmuuniseerumin valmistamiseksi eläimissä, 10 mainitun seerumin ollessa reaktiivinen papilloomavirus-proteiinien kanssa.

Keksintöä selostetaan seuraavassa yksityiskohtaisemmin viitaten seuraaviin kuviin, joissa kuvassa 1 on esitetty papilloomaviruksen vastaisten 15 igA-vasta-aineiden toteaminen kohdun eritteistä, kuvassa 2 on esitetty papilloomavirusten vastaisten

IgA-vasta-aineiden korrelaatio seerumeissa ja kohdun eritteissä, kuvassa 3 on esitetty papilloomaviruksen vastaisten 20 IgG-vasta-aineiden vertailu seerumissa ja emättimen eritteissä, kuvassa 4 on esitetty papilloomaviruksen vastaisten

IgA- ja IgG-vasta-aineiden vertailu emättimen eritteissä, 25 kuvissa 5 ja 6 on esitetty IgA- ja IgG-vasta-aineiden toteaminen immunoblotting-määrityksellä, kuvassa 7 on esitetty ikään ja sukupuoleen liittyvän PV: n vastaisten seerumin IgA-vasta-aineiden jakautuminen normaaliväestössä, 30 kuvassa 8 on esitetty ikään ja sukupuoleen liittyvän PV:n vastaisen seerumin IgG-vasta-aineiden jakautuminen • normaaliväestössä, kuvassa 9 on esitetty PV:n vastaisten IgA-vasta-aineiden toteaminen seerumista, joka on saatu CIN:ä tai 35 kohdunkaulan syöpää sairastavilta potilailta, kuvassa 10 on esitetty PV:n vastaisten IgG-vasta-aineiden toteaminen seerumista, joka on saatu CIN:ä tai 3 97426 kohdunkaulan syöpää sairastavilta potilailta, kuvassa 11 on esitetty PV:n vastaisten IgM-vasta-ai-neiden toteaminen seerumista, joka on saatu CIN:ä tai kohdunkaulan syöpää sairastavilta potilailta, 5 kuvassa 12 on esitetty IgA:n ja IgG:n PV:lie kohdistuvien vasteiden välinen ero suhteessa tautiin, kuvassa 13 on esitetty IgA:n reaktiivisuus L1-prote iinille, kuvassa 14 on esitetty IgA:n reaktiivisuus L2-prote- 10 iinille, kuvassa 15 on esitetty IgA:n reaktiivisuus L1-prote- iinille, kuvassa 16 on esitetty IgG:n reaktiivisuus L2-prote- iinille, 15 kuvassa 17 on esitetty IgM:n reaktiivisuus L1-prote iinille, kuvassa 18 on esitetty IgM:n reaktiivisuus L2-prote- iinille, ja kuvassa 19 on esitetty tautiin yhteydessä olevien syn-20 teettisten peptidien reaktiivisuus.

Taulukossa IA on esitetty PV:n vastaisten IgA- ja IgG-vasta-aineiden vertailu seerumissa ja kohdun eritteissä .

Taulukossa 1 on esitetty kohdun syövän yhteydessä 25 esiintyvien vasta-aineiden toteaminen.

Taulukossa 2 on esitetty synteettisten peptidien kaavat .

Taulukossa 3 on esitetty synteettisten peptidien aminohapposekvenssejä.

30 Sen tutkimiseksi, esiintyykö papilloomavirus- ten vastaisia IgA-vasta-aineita ja onko niillä korre-laatiota pahanlaatuiseksi kehittymisessä, tutkittiin kohtu-emätineritteitä potilailta, joilla oli kondylo-maatta ja CIN, käyttäen modifioitua ELISA-menetelmää.

35 Kokeeseen otti osaa neljäkymmentäkaksi 20-50 vuotiasta naista. Heillä oli ollut epänormaali emättimestä saatu sivelynäyte ja/tai kondyloomia tai he oli- 4 97426 vat ottaneet osaa seulontaohjelmaan. Kaikille potilail-tehtiin kolposkopiatutkimus. Tavallinen Papanicolau-sivelynäyte otettiin kolposkopiapäivänä ja eräissä tapauksissa otettiin näytepaloja (näytteet otettu elä-5 västä kudoksesta) kolposkopian avulla varmistetuista leesioista. Tehtiin sytologiset ja histologiset tutkimukset ja ne sovitettiin ELISA-tuloksiin kokeen lopussa. HPV-infektion morfologiset kriteerit määritettiin Meisels et ai. (1979) esittämän mukaisesti. Aktiiviseen 10 papilloomavirusinfektioon viittasi koilosytoottisten solujen löytyminen. Tyypillinen koilosytoottinen solu on välituotesolu, jossa on suurentunut hyperkromaatti-nen tuma, jota ympäröi kirkas sytoplasma-alue. Kohtu-emätineritteet kerättiin endo-ektoserviksistä ja emät-15 timestä pienellä pumpulitikulla. Tikku asetettiin lasiputkeen, joka oli täytetty 0.5 ml PBSrllä ja jota sekoitettiin Vortex-sekoittimella. Näytteitä säilytettiin -20°C analysointiin asti. Eritteen tarkka määrä määritettiin punnitsemalla putki ennen ja jälkeen näyt-20 teenoton. Ennen analysointia näytteet sentrifugoitiin debriksen poistamiseksi. Näytteitä kerättiin kuukautiskierron päivästä riippumatta jättämällä väliin vain varsinaiset kuukautispäivät. Verellä värjäytyneet näytteet hylättiin.

25 BPV oli puhdistettu seuraavasti: Naudan iho- syyliä, joita oli säilytetty glyserolifosfaatti-pusku-

• I

roidussa suolaliuoksessa (1:1) +4°C, homogenisoitiin 0.1 M Tris-HCl liuoksessa, pH 7.5, ultra turrax-sekoit-timessa. Valmistettiin 10 % suspensio ja tareosyyli- ja 30 freonlisäyksen jälkeen suspensiota sentrifugoitiin 11 950 g 30 min ajan Sorvali SS-34 roottorilla. Saatua supernatanttia sentrifugoitiin 35 000 rpm 60 min MSE 8x40 ml titaaniroottorilla. Pelletti suspendoitiin 0.1 M Tris-HCl liuokseen ja sekoitettiin CsCl:n kanssa.

35 Liuos sentrifugoitiin tasapainoon 35 000 rpm MSE SW50 roottorilla yön yli. Virusjuovat kerättiin, dialysoi-tiin TE-puskuria vasten (0.01 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA) 5 97426 ja säilytettiin jäädytettynä -70°C. Ihosyylien uutteet puhdistettiin tasapainosentrifugoimalla 2 kertaa CsCl:n kanssa. Gradienteissa voitiin nähdä kaksi erillistä juovaa. Heikomman juovan bouyant-tiheys oli 1.29 g/ml; 5 se koostui tyhjistä viruspartikkeleista elektronimikroskoopilla (EM) määritettäessä. Voimakkaan juovan bouyant-tiheys oli 1.34 g/ml ja se sisälsi kokonaisia viruspartikkeleita, joilla oli tyypillinen papovavirus-morfologia EM-määrityksen mukaisesti.

10 Hyperimmuuniseerumi puhdistetuille naudan papilloomaviruksille oli valmistettu kaniineissa inoku-loimalla intramuskulaarisesti n. 100 pg puhdistettua virusta Freundin täydelliseen adjuvanttiin emulgoituna (Difco laboratories, Detroit, Mich.). Kaksi seuraavaa 15 inokulaatiota tehtiin kahden viikon välein käyttäen samaa virusmäärää, mutta ilman adjuvanttia. Kaniinien veret vuodatettiin 1 viikon kuluttua viimeisestä inoku-laatiosta.

Käytettiin aikaisemmin kuvattujen ELISA-mene-20 telmien muunnelmaa. BPV-virionit laimennettiin PBS:ään ja ne laitettiin 96-kuopan mikrotiitterilevyihin, jossa niitä pidettiin yön yli +4°C sovitussa konsentraatiossa 0.06 pg/kuoppa. PBS:llä, joka sisälsi 0.05 % Tween (PBS-Tween), kolmen pesun jälkeen levyt blokattiin 4 % 25 naudan seerumialbumiinilla (BSA) ja 0.1 % gelatiinin PBS-liuoksella 6 h ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen ne jätettiin seisomaan yön yli +4°C. Ennen käyttöä levyjä pestiin 5 kertaa PBS-Tween-liuoksella. Kohtu-emätineritteet laimennettiin 1/40 ja seerumi 30 laimennettiin 1/100 4 % BSArlla, 0.1 % gelatiinilla ja 0.05 % Tween-liuoksella. Sidottujen vasta-aineiden to-· teamiseen käytettiin affiniteettipuhdistettua biotiny- loitua anti-ihmis-IgA-vasta-ainetta (alfa-ketjuspesifi-nen) tai biotinyloitua anti-ihmis-IgG-vasta-ainetta 35 (molemmat Sigmalta) laimennoksena 1/1000, 4 h huoneenlämpötilassa. Peroksidaasi-konjugoitu avidiini lisättiin tämän jälkeen 1/400 laimennoksena, 2 h huoneenläm- t 6 97426

Potilassa. Substraattina käytettiin 0.4 % o-feny- leenidiamiinia (Sigma), 0.012 % H202, 50 mM fosfaatti-puskuriliuoksessa, pH 5.0. Positiivisena kontrollina oli kaniinin antiseerumi, joka oli kohdistettu BPV-vi-5 rioneille ja/tai kaniinin antiseerumi, joka oli kohdistettu hirven papilloomavirukselle. Ihmisen vastasyntyneen seerumi ja kaniinin esi-immuuniseerumi olivat negatiivisenä kontrollina.

BPV-virioneille suoritettiin elektroforeesi 5-10 20 % polyakryyliamidin gradienttigeelillä. N. 5 pg virioneita saatettiin jokaiseen näytekohtaan. Siirto nitroselluloosalevyille tehtiin Towbin et ai. esittämän menetelmän mukaisesti. Levyt leikattiin suikaleiksi ja ne blokattiin 2 % Tween-80:n, 50 mM Trisin pH 10.2, 150 15 mM NaCl:n ja 5 mM NaN3:n liuoksella 15 min ajan. Nitro-selluloosasuikaleita inkuboitiin yön yli potilaiden seerumin kanssa, joka oli laimennettu 1/100 pesupus-kurilla (50 mM Tris pH 10.2, 150 mM NaCl, 5 mM NaN3, 0.1 % Tween-20). Yön yli inkuboinnin jälkeen täpliä pestiin 20 samalla puskurilla. PV:n vastaista kaniinin antiseerumia käytettiin positiivisena kontrollina ja kaniinin esi-immuuniseerumia käytettiin negatiivisena kontrollina. Sidottujen vasta-aineiden toteamiseen käytettiin biotinyloitua vuohen anti-ihmis-IgA:ta tai biotinyloi-25 tua vuohen anti-ihmis-IgG:ta laimennettuna 1/1000 pesu-puskurilla. Tämän jälkeen täpliä inkuboitiin peroksi-daasi-konjugoidulla avidiinilla, joka oli laimennettu 1/400 pesupuskurilla. Kaniinin antiseerumille käytettiin peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kaniini-30 IgGrtä, joka oli laimennettu 1/1000 pesupuskurilla.

Kaikki täplät kehitettiin 0.02 % karbatsolilla (Sigma) • 50 mM natriumasetaatissa, pH 5.5.

Kuvassa 1 on esitetty papilloomaviruksen vastaisten IgA-vasta-aineiden toteaminen.

35 Kohdun eritteitä, laimennettuna 1/40, saatet tiin ELISA-maljoille, jotka oli päällystetty puhdistetuilla ja rikotuilla BPV-virioneilla. IgA-vasta-ai- 7 97426 neet todettiin IgA-spesifisellä biotinyloidulla toisella vasta-aineella ja avidiiniperoksidaasinkonjugaatil-la. Substraatin lisäyksen jälkeen absorbanssit rekisteröitiin 15 min kuluttua aallonpituudella 490 nm. Absor-5 banssiarvot, jotka ylittivät taustan (ihmisen vastasyntyneen seerumi) yli 0.1:llä, katsottiin positiivisiksi.

IgA-vasta-aineita PV:lie havaittiin kohdun eritteistä 17:llä 42:sta naisesta. Kuvan 1 kuvaajassa kukin piste edustaa jokaisen potilaan kaksoisnäytteiden 10 absorbanssien keskiarvoa. Yhdeksästä naisesta, joilla oli CIN, kahdeksalla oli PV:n vastaisia IgA-vasta-aineita kohdun eritteissä, ryhmä I (potilaat, joilla histologisesti todettu intra-epiteliaalinen neoplasia, CIN). Pap-sivelynäytteestä todettu koilosytoosi ja 15 kolposkopisesti todetut kondyloomat ilman CIN:iä havaittiin 9 potilaalla, ja näistä kolmella oli PV:n vastaisia IgA-vasta-aineita, ryhmä II (potilaat, joilla oli koilosytoosi ja/tai kondylooma, mutta ei histologista näyttöä CINrstä). Kuudella 24:stä naisesta, joil-20 la oli normaalit koetulokset, oli PV-vastaisia vasta-aineita, ryhmä III (potilaat ilman patologisia havaintoja). IgA-ELISA-absorbanssit testattiin näiden kolmen ryhmän välisten merkittävien erojen suhteen. Kolmiosaisessa ei-parametrisessä jatkuvassa kokeessa (Kruskal-25 Wallis-koe), CIN-ryhmällä oli merkittävästi korkeammat absorbanssiarvot normaaliin kontrolliryhmään verrattuna (p<0.015). IgA-positiivisten kohdun eritteiden osuus havaittiin myös merkittävästi suuremmaksi CIN-ryhmässä (kahdeksan kymmenestä) kuin normaalissa ryhmässä (6 30 24:stä), (p<0.005, Chi2-koe). Vastakkaisesti, kondyloo- ma/koilosytoosi-ryhmän ja normaaliryhmän välillä ei ;j havaittu eroja (p>0.05; absorbanssikeskiarvo= 0.109 versus 0.104).

Viidentoista potilaan IgG- ja IgA-tasoja see-35 rumissa (laimennos 1/1000) ja eritteissä (laimennos 1/40) verrattiin. IgA-vasta-ainetasot seerumissa ja eritteissä korreloivat suhteellisen hyvin: p<0.001, 8 97426 kuten näkyy kuvassa 2. IgG-vasta-ainetasot seerumissa ja eritteissä eivät korreloineet merkittävästi: 0.05<p<0.1, kuten näkyy kuvassa 3. IgA- ja igG-tasojen välillä eritteissä ei havaittu merkittävää korrelaa-5 tiota (p>0.1), kuten nähdään kuvasta 4, eikä myöskään seerumissa (ei esitetty).

Tutkittaessa, mihin virionin polypeptideihin PV-vasta-aineet olivat kohdistuneet, tehtiin puhdistettujen BPV-virionien immunoblotting-määritys.

10 Viitataan kuviin 5 ja 6. Puhdistetuille BPV- virioneille tehtiin elektroforeesi 5-20 % polyakryy-liamidigeelillä ja ne siirrettiin nitroselluloosalle. Suikaleita inkuboitiin kaniinin hyperimmuuniseerumin kanssa, joka oli kohdistettu puhdistetulle naudan viri-15 oneille (+), ihmisen vastasyntyneen seerumille (-) ja 10 potilaan seerumille (1-10). Sidotut vasta-aineet todettiin biotinyloidulla vuohen anti-ihmis-IgG:11a (kuva 5) tai biotinyloidulla vuohen anti-ihmis-IgA:11a (kuva 6) sekä peroksidaasi-konjugoidulla avidiinillä.

20 IgA-kokeessa potilaiden seerumia sisältävät suikaleet no 2-9 olivat yhtä negatiivisia kuin seerumi no 1 eikä niitä ole esitetty. Kuvissa 5 ja 6 nuolet ilmaisevat todettuja pääasiallisia proteiineja, K = molekyylipaino kilodaltoneina ja MW = molekyylipainomerkkiaineet.

25 Merkkiaineiden molekyylipainot olivat 200, 116, 92, 66, 44 ja 29 kilodaltonia (kDa).

Kaniinin hyperimmuuniseerumilla, joka oli valmistettu puhdistettuja naudan virioneita vastaan, todettiin neljä polypeptidiä: pääasiallinen 14 kDa 30 proteiini, 28 kDa ja 54 kDa proteiinit sekä 64 KDa proteiini. Kuvassa 4 esitetyn mukaisesti 10:llä 10:stä t testatusta potilaasta oli seerumin IgG-vasta-aineita 54 kDa proteiinille. Kahdella potilaalla oli seerumin IgG-vasta-aineita 64 kDa proteiinille ja kahdella potilaal-35 la oli seerumin IgG-vasta-aineita 28 kDa proteiinille. IgA-spesifisellä konjugaatilla testattaessa vain yhdellä kymmenestä potilaasta oli todettavissa olevia IgA- 9 97426 vasta-ainetasoja immunoblotting-määrityksessä, kuva 6.

Tällä seerumilla oli poikkeuksellisen korkea IgA-anti-BPV-reaktiivisuus, kun toteaminen suoritettiin ELISA-menetelmällä (vert. kuva 2). Immunoblotting-määrityk-5 sessä se reagoi 14 kDa, 28 kDa ja 54 kDa polypeptidien kanssa ja heikosti 64 kDa polypeptidin kanssa (kuva 6).

On osoitettu, että on olemassa paikallisia genitaalialueen papillomavirusvasta-aineita ja ne voidaan todeta ja mitata helposti. Voimakas korrelaatio 10 havaittiin kohdun eritteissä olevien PV-vastaisten IgA-vasta-aineiden esiintymisen ja CIN:n histologisen diagnoosin välillä. Kuitenkin kuudella 24:stä naisesta, joilla oli normaali Pap-sivelynäyte ja kolposkopia, oli myös PV-vastaisia IgA-vasta-aineita. Ei tiedetä, esiin-15 tyikö potilailla, joilla tavattiin IgA-vasta-aineita, vaikka heillä ei ollut CIN:ä, histologisesti ei-todet-tavissa olevia CIN-leesioita. Aikaisemmissa tutkimuksissa on ehdotettu, että IgG-vasta-aineet papillooma-viruksen ryhmäspesifiselle antigeenille ovat koholla 20 CIN:n tapauksessa. Seerumin IgG-vasta-ainetasot PV:lie kohosivat kuitenkin myös potilailla, joilla oli ihosyy-liä. Tämä ongelma selvitettiin mittaamalla vain sellaiset vasta-aineet, jotka liittyvät genitaalialueen PV-infektioon eli mittaamalla hakemuksen yhteydessä kuva-25 tut IgA-vasta-aineet. On syytä painottaa, että hakemuksen yhteydessä kuvatun kokeen ei havaittu korreloivan aikaisemmin kuvatun, IgG-vasta-aineita käyttävän kokeen kanssa. Tämä päätelmä on tehty tuloksista, joiden mukaan seerumin ja eritteiden HPV:n vastaiset IgA-vasta-30 aineet korreloivat keskenään (kuva 2), mutta IgA- ja IgG-vasta-aineet HPVrlle eivät korreloi keskenään erit-teissä (kuva 4) eikä seerumissa (taulukko 1A). Seerumin * ja eritteiden IgA-vasta-ainetasojen välillä havaittiin korrelaatiota. Täten on mahdollista, että seerumin IgA-35 vasta-aineiden avulla voidaan saada genitaalialuespe-sifinen testi, jota voidaan soveltaa helposti osana kliinistä rutiinia.

10 97426

Havainto, että normaalit henkilöt ja potilaat, joilla oli näyttöä virusreplikaatiosta (koilosytoosi ja/tai kondylooma), omasivat igA-vasta-ainetaso ja, jotka olivat samankaltaisia kuin normaalien henkilöiden 5 vasta-ainetasot, voi näyttää yllättävältä. Samanlainen tilanne vallitsee kuitenkin myös Epstein-Barr viruksen tapauksessa, jolloin anti-viruskapsidi-IgA-vasta-aineet eivät liity viruksen tuotantotasoon vaan ainoastaan viruksen kanssa yhteydessä olevaan syöpään. Immunoblot-10 ting-määrityksellä todettiin neljä virionin yhteydessä olevaa polypeptidiä. 54 kDa proteiinin vastaisten IgG-vasta-aineiden esiintyminen vastaa aikaisempia tutkimuksia: 56 kDa säännöllisesti IgG-immunogeeninen pro teiini, joka on L1 avoimen lukukehyksen koodaama, on 15 identifioitu kapsidin pääasialliseksi komponentiksi. Vähäisempi n. 70 kDa kapsidiproteiini on L2 avoimen lukukehyksen koodaama. Tämän proteiinin pitäisi vastata toteamaamme 64 kDa proteiinia. 28 kDa proteiinin ja 14 kDa proteiinien identtisyyttä ei tiedetä. Yksittäinen 20 IgA-positiivinen seerumi omasi IgA-vasteen 54, 28 ja 14 kDa polypeptideille, kun taas saman seerumin IgG-vaste kohdistui ainoastaan 54 kDa polypeptidille. Tämä osoittaa, että PV-epitoopit, jotka aiheuttavat IgA:n ja IgG:n muodostumisen, eivät ole aina identtisiä.

25 Ryhmäspesifisiä PV-kapsidiantigeeneja vas taan olevan seerumin vasta-ainevasteen analysoimiseksi tutkittiin PV-vastaisten seerumivasta-aineiden levinneisyyttä normaalissa terveessä väestössä verrattuna seerumivasta-ainetittereihin seerumissa, joka oli saatu 30 CIN:ä tai kohdun syöpää sairastavilta naisilta.

Kaikkiaan 139 kontrolliseerumia saatiin ter- : veiltä aikuisilta naisilta. 62 seerumia oli naisilta, « # ,, jotka olivat käyneet gynekologian poliklinikalla. Joukossa oli naisia, joilla ei ollut patologisia löytöjä 35 (48 naista) tai naisia, joilla oli kondylooma, mutta ei histopatologista näyttöä CIN:stä (14 naista). 59 seerumia saatiin terveiltä naisilta, jotka työskentelivät 97426 1 1 laboratoriossa ja 18 seerumia naisilta, jotka kävivät vuositarkastuksessa.

Potilasryhmä koostui 114 naisesta, joilla oli hoitamaton, histopatologisesti todettu kohdun neoplasia 5 ja näistä 13:n leesiot luokiteltiin CIN 1:ksi, 16:n leesiot olivat CIN 2:ta, 16:n leesiot olivat CIN 3:a ja loppujen 69:n leesiot olivat invasiivejä kohdun syöpiä. Edelleen saatiin 83 seerumia eri ikäisiltä lapsilta sekä molempia sukupuolia edustavilta aikuisilta.

10 Viruksen eristys ja puhdistus suoritettiin kuten edellä on kuvattu.

Naudan papilloomaviruksen valmistus on esitetty kuvassa 5 ja 6 ja se koostuu neljästä proteiinista, joista jokainen sisältää ihmisen seerumin kanssa im-15 munoreaktiivisia epitooppeja, kuten on osoitettu im-munoblotting-määrityksen avulla.

Puhdistettu BPV rikottiin viidellä jäädytys-sulatus jaksolla ja laimennettiin 10 mM karbonaattipus-kurilla, pH 9.6 sekä saatettiin puoli-ala-96-kuopan 20 mikrotitterilevyihin konsentraatiossa 0.15 pg/kuoppa.

BPV:ta sisältävät levyt pidettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Yhden PBS-0.05 % Tween 20 (PBS-T) pesukerran jälkeen levyt blokattiin 10 % lampaan seerumilla (lämmöllä inaktivoitu; Flow) PBS-liuoksessa ja inkuboitiin 25 60 min 37°C. Blokkausliuos poistettiin ja levyjä tapu teltiin huolellisesti paperia vasten. Ihmisen seerumi laimennettiin 1:20 10 % lampaan seerumi/PBS:llä, lisättiin levyihin kaksoiskuoppiin ja annettiin reagoida 120 min 37°C. Levyjä pestiin sen jälkeen viisi kertaa PBS-30 T:llä. Sidottujen vasta-aineiden toteamiseen käytettiin piparjuuriperoksidaasilla leimattua ihmisen IgA:n vas-. täistä monoklonaalista vasta-ainetta (Janssen) (kuva ' 3), joka oli laimennettu 1:500 10 % lampaan seeru- mi/PBS-liuoksella ja jota inkuboitiin levyissä 120 min 35 ajan 37°C. Levyjä pestiin sen jälkeen viisi kertaa PBS-T kanssa ja ne kehitettiin 20 mg/ml 2,2'-atsino-di (3-etyylibentstiatsoliinisulfonaatti (6)) deammonium- 12 97426

suolalla (ABTS), joka oli laimennoksena 1:50 0.1 M

sitraattipuskurissa, pH 4, yhdessä 0.9 % vetyperoksidin kanssa. Absorbanssi rekisteröitiin 30 min (kuvat 7,8) tai 60 min (kuvat 9-12) kuluttua aallonpituudella 415 5 nm. IgG:n toteamiseksi levyt pestiin ja blokattiin 10 % lampaan seerumi-PBS 60 min ajan 37°C.

Tämän jälkeen käytettiin kaniinin anti-ihmis-IgG-alkalifosfataasikonjugaattia (Dako) laimennoksena 1:1000 10 % lampaan seerumi PBS:ssä 120 min 37°C (kuvat 10 9-12) tai piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua ihmisen

IgG:n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta (Janssen) laimennoksena 1:2000 (kuvat 7,8). PBS-T:llä viisi kertaa suoritetun pesun jälkeen lisätiin 1 mg/ml fosfataa-sisubstraattia (Sigma) 0.1 M dietanoliamiinipuskurissa, 15 pH 9.6/1 mM MgCl2 ja levyt luettiin aallonpituudella 405 nm 90 min kuluttua. Käytettäessä peroksidaasi-konjugoi-tua vasta-ainetta levyjä kehitettiiin 30 min ajan IgA-konjugaatille kuvatun menetelmän mukaisesti. IgM-vasta-aineiden toteamiseksi levyt pestiin ja blokattiin edel-20 lä kuvatun mukaisesti, jonka jälkeen levyjä inkuboitiin anti-ihmis-IgM-glukoosioksidaasikonjugaatin kanssa (Sera-lab), joka oli laimennoksena 1:800 10 % lampaan seerumi/PBS:ssä, 120 min ajan. Substraattina käytettiin 0.36 mg/ml ABTS, 2.4 % glukoosia, 8 pg/ml piparjuuripe-25 roksidaasia (Sigma) 0.1 M fosfaattipuskurissa, pH 6.0.

Levyt luettiin aallonpituudella 415 nm 60 min kuluttua. Kaikkien ELISA-määritysten tapauksessa absorbanssia, joka ylitti taustan (sama seerumi päällystämättömissä kuopissa) 0.15:llä tai enemmällä, pidettiin positii-30 visena reaktiona. Kahta CIN-potilaan seerumia, joissa oli tunnettu reaktiiivisuus, käytettiin sisäisenä stan-dardina jokaisessa kokeessa. Negatiivisena kontrollina e » toimi päällystämättömät kuopat, jotka olivat kaksois-näytteinä.

35 Kaksoisabsorbanssien keskiarvo, josta oli vähennetty päällystämättömien kuoppien kaksoisabsorbanssien keskiarvo, analysoitiin potilasryhmän ja ter- 97426 13 veen kontrolliryhmän välisen, tilastollisesti merkittävän eron suhteen kaksipuolisella, ei-parametrisellä ranking-kokeella (Mann-Whitney koe).

Tulokset olivat seuraavat: 83 seerumista, 5 jotka oli saatu normaaliväestöltä, joka koostui molem-paa sukupuolta edustavista lapsista ja aikuisista, 24:ssä oli IgA-vasta-aineita ja 46:ssa oli IgG-vasta-aineita PV:lle. IgA-anti-BPV-tittereiden havaittiin olevan enemmän koholla (p<0.002, Mann-Whitney koe) 10 terveillä miehillä verrattuna terveisiin naisiin, kuten on esitetty kuvassa 7, josta näkyy PV:n vastaisten seerumin IgA-vasta-aineiden ikään ja sukupuoleen liittyvä jakautuminen normaaliväestössä. Seerumi laimennettiin 1:20 ja BPV vastaiset IgA-vasta-aineet todettiin 15 alfa-ketjuspesifisellä piparjuuriperoksidaasilla konju-goidulla monoklonaalisella vasta-aineella. Substraatin lisäyksen jälkeen absorbanssit rekisteröitiin 30 min kuluttua aallonpituudella 415 nm. Jokainen piste edustaa kaksoisnäytteiden keskimääräistä absorbanssia, 20 josta on vähennetty kaksoisnollakokeiden keskiarvo, jokaisen potilaan tapauksessa. IgA-vasta-ainetasot olivat hyvin samanlaiset lapsilla (<20 vuotta) aikuisiin verrattuna sekä miesten että naisten tapauksessa (keskiarvo aikuisille 0.79; keskiarvo lapsille 0.103).

25 Samasta seerumista, josta tutkittiin BPV:n vastaiset .. IgA-vasta-aineet, tutkittiin myös IgG-vasta-aineiden esiintyminen kuvan 8 mukaisesti, josta näkyy PV:n vastaisten seerumin IgG-vasta-aineiden ikään ja sukupuoleen liittyvä jakautuminen normaaliväestössä. Samasta 30 seerumista, josta tutkittiin BPV vastaisten IgA-vasta-aineiden esiintymistä, tutkittiin IgG-vasta-aineiden esiintymistä samaan tapaan kuin kuvassa 7 on esitetty, mutta käyttäen anti-IgG-piparjuuriperoksidaasi-konju-goitua monoklonaalista vasta-ainetta. IgG-vasta-aineet 35 olivat voimakkaasti koholla lapsilla aikuisiin verrattuna (p<0.0015). Havaittiin myös suuntausta, ei kuitenkaan merkittävää, että IgG-anti-BPV titterit olivat • 1 4 97426 koholla normaaleilla miehillä naisiin verrattuna (0.1>-p< 0.05).

Satakolmekymmentäyhdeksän seerumia, jotka oli saatu terveiltä aikuisilta naisilta, 13 seerumia, jotka 5 oli saatu 1-asteista CIN:ä sairastavilta naisilta, 16 seerumia, jotka oli saatu 2-asteista CIN:ä sairastavilta naisilta, 16 seerumia, jotka oli saatu 3-asteista CIN:ä sairastavilta naisilta, ja 69 seerumia, jotka oli saatu kohdunkaulan invasiivista suomusolusyöpää (SCC) 10 sairastavilta naisilta, analysoitiin niiden PV:n vastaisten IgA-, IgG- ja IgM-vasta-aineiden suhteen. Tilastollista analyysiä varten eri CIN-ryhmät ja SCC-ryhmä yhdistettiin yhdeksi, kohdun neoplasiaryhmäksi.

IgA vasta-ainetasot olivat merkittävästi koholla CIN-15 tai syöpäpotilasryhmässä, kun niitä verrattiin iältään ja sukupuoleltaan vastaavien kontrolleihin, joilla ei oltu havaittu CIN:ä (p<0.025), kuten nähdään kuvan 9 esityksestä, jossa on todettu PV:n vastaiset IgA-vasta-aineet seerumista, joka on saatu CIN:ä tai kohdunkaulan 20 syöpää sairastavilta potilailta. Seerumi laimennettiin 1:20 ja saatettiin BPVrllä päällystettyihin levyihin. IgA-vasta-aineet todettiin piparjuuriperoksidaasilla leimatulla monoklonaalisella vasta-aineella, joka oli kohdistettu ihmisen IgA:ta vastaan. Substraatin lisäyk-25 sen jälkeen absorbanssit luettiin aallonpituudella 415 . nm 60 min kuluttua. Jokainen piste edustaa kaksoisko- keiden absorbanssien keskiarvoa, josta on vähennetty seeruminollakokeiden kaksoisnäytteiden keskiarvo. "Ei CIN"-ryhmään verrattaessa titterit CIN ja karsinooma-30 ryhmässä ovat kohonneet (p<0.025).

PV:n vastaisten IgG-vasta-aineiden titterit olivat merkittävästi laskeneet kohdun neoplasiapoti-lailla kontrolleihin verrattuna (p<0.001), kuten nähdään kuvan 10 esityksestä, jossa on todettu PV:n vas-35 taistet IgG-vasta-aineet seerumissa, joka on saatu CIN:ä tai kohdunkaulan syöpää sairastavilta potilailta.

Samasta seerumista kuin kuvan 9 tapauksessa tutkittiin 1 5 97426 BPV:n vastaisten IgG-vasta-aineiden esiintymistä käyttäen kaniinin anti-ihmis-IgG-alkalifosfataasikonjugaat-tia. Substraatin lisäyksen jälkeen absorbanssit rekisteröitiin aallonpituudella 405 nm 90 min kuluttua.

5 Kohdun neoplasiapotilasryhmällä oli myös mer kittävä PV:n vastaisten IgM tittereiden lasku kontrolleihin verrattuna (p<0.005), kuten nähdään kuvasta 11, jossa esitetty seerumin PV:n vastaiset IgM-vasta-ai-neet, joka seerumi on saatu CIN tai kohdunkaulan syöpää 10 sairastavilta potilailta. Samasta seerumista kuin kuvan 9 tapauksessa tutkittiin myös PV:n vastaisten IgM-vas-ta-aineiden esiintymistä. Konjugaattina käytettiin anti-ihmis-IgM-glukoosioksidaasikonjugaattia, ja levyjen kehityksen jälkeen levyt luettiin aallonpituudella 15 415 nm 60 min kuluttua. Kun IgA- ja IgG-vasteiden vä listä eroa (IgA-IgG) verrattiin ryhmän, jolla ei oltu havaittu CIN:ä, ja CIN- tai syöpäpotilasryhmän kesken, CIN- tai syöpäpotilasryhmällä havaittiin vasteiden välisen eron silmiinpistävä kohoaminen (p<0.0001).

20 Kuvassa 12 nähdään IgA- ja IgG-vasteiden PV:lie välinen ero (IgA-IgG) tautiin nähden. Kuvassa 9 ja 10 esitetyistä absorbanssiarvoista muodostettiin kuvaaja IgA vähennettynä IgG:llä- muodossa.

Kaikilla HPV-genomeilla on ainakin kahdeksan 25 potentiaalisesti proteiinia koodaavaa aluetta, avointa lukukehystä (open reading frames, ORF:iä). Kahden ORF:- in, L1 ja L2, on osoitettu koodaavan viruskapsidiprote- iineja. L1-proteiini on n. 54 kDa runsaasti esiintyvä kapsidiproteiini, joka on säännöllisesti immunogeeninen 30 molemmille vasta-aineille, IgG:lle ja IgA:lle. L1-pro- teiinin vastaisilla vasta-aineilla on virusneutraloivaa :* aktiivisuutta, ainakin BPV-1:lle. Useat tutkimukset, ♦ * joissa on käytetty monoklonaalisia vasta-aineita tai bakteerien avulla ilmennettyjä fuusioproteiineja, ovat 35 osoittaneet, että Ll-proteiinilla on sekä sellaisia epitooppeja, jotka ovat yhteisiä kaikille PV-tyypeille, ns. ryhmäspesifisiä epitooppeja, että kullekin HPV- 16 97426 tyypille spesifisiä epitooppeja. HPV:n L1 :n yksi ryh-mäspesifinen ja yksi tyyppispesifinen epitooppi on kartoitettu käyttämällä pienten fuusioproteiinien sarjaa.

L2 ORF koodaa n. 70 kDa kapsidiproteiinia, johon viit-5 taamme tässä hakemuksessa n. 64 kDa proteiinina, jota esiintyy suhteellisen vähän. L2-proteiinin on esitetty sisältävän tyyppispesifisiä epitooppeja. HPV:n 16 pääasiallisten kapsidiproteiinien lineaaristen epitooppien täydellisemmän kartan saamiseksi syntetisoitiin näiden 10 kahden proteiinin kaikki aminohapposekvenssit 20 aminohapon synteettisen peptidin sarjana, joissa peptideissä on 5 aminohapon päällekkäisyys. Paikat sekvenssis-pesifisille epitoopeille, jotka reagoivat IgA-, IgG-tai IgM-vasta-aineiden kanssa HPV 16 kohdun neoplasiaa 15 sairastavilta potilailta saadussa seerumissa, on esitetty kuvissa 13-19.

Kuusikymmentäkuusi 20 aminohapon peptidiä, joissa on 5 aminohapon päällekkäisyys toisiinsa nähden, syntetisoitiin HPV 16:n L1 ja L2 0RF:lle johdetun ami-20 nohapposekvenssin mukaisesti. Paikan ilmaisemiseksi proteiinissa oletettu aloituskodoni merkittiin aminohapoksi numero 1. Synteettinen peptidi numero 1 vastaa aminohappoja 2-21 L1 0RF:ssä, peptidi numero 2 vastaa aminohappoja 17-36, numero 3 aminohappoja 32-51 jne., 25 kunnes päädytyään L1 -karboksiterminaalipeptidiin (nume-ro 35), joka vastaa aminohappoja 512-531. Peptidi numero 36 vastaa L2 ORF:n aminoterminaalia (aminohapot 2-21), numero 37 on aminohapot 17-36 jne. Kaksi peptidiä L2 karboksiterminaalin kohdassa (numero 65 ja 66) syn-30 tetisoitiin 21 tähteen peptideinä, jolloin niiden ami-nohappopaikat ovat 437-457 ja vast. 453-473. Kaikkein immunoreaktiivisimpien peptidien aminohapposekvenssit on luetteloitu taulukossa 1 . Niiden symbolit on selitetty taulukossa 2. Kaikkien kuvissa 13-19 esitettyjen 35 peptidien aminohapposekvenssit on luetteloitu taulukossa 3. Peptidit syntetisoitiin käyttäen t-Boc aminohappoja (Bachem AG, Bubendorf, Sveitsi) ja p-metyyli- 17 97426 bentshydryyliamiinihartsia (Fluka AG, Buchs, Sveitsi) moninkertaisella ki inteäfaasipeptidisynteesimenetelmällä. Suojaryhmien poistaminen formyylitryptofaani- ja metioniinisulfoksiditähteistä saatiin lohkaisemalla 25 5 % vetyfluoridilla. Tämän jälkeen peptidit katkaistiin hartsista nestemäisellä vetyfluoridilla käyttäen moni as ti ala i te t ta .

64 seerumia saatiin potilailta, joilla oli joko in situ syöpä (CIN aste 3) tai invasiivinen kohdun 10 syöpä. Vastaavat kohdun näytepalat oli analysoitu HPV:n DNA:n esiintymisen suhteen joko Southern blot- (32 tapausta) tai dot-blot- (piste-täplitys) (32 tapausta) hybridisaatiolla kloonattujen HPV 16:n ja HPV 18:n 32-P-leimattujen koettimien kanssa, kuten aiemmin on ku-15 vattu. HPV 16 todettiin 32 tapauksessa ja HPV 18 4 tapauksessa. 30 seerumia, jotka oli saatu HPV-kohdun neoplasiaa kantavilta potilailta, oli saatavilla riittävästi kaikkien erilaisten synteettisten peptidien testausta varten.

20 22 seerumia saatiin potilailta, joilla oli muunlaisia kasvaimia. 38 seerumia saatiin terveiltä naisilta.

Synteettiset peptidit laimennettiin 10 mM karbonaattipuskurilla, pH 9.6, ja saatettiin puoli-ala-25 96-kuopan mikrotitterilevyihin (Costar) konsentraatios-sa 20 \xg peptidi/ml. Levyjä pidettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Yhden PBS-0.05 % Tween 20 (PBS-T) pesu-kerran jälkeen levyt blokattiin 10 % lampaan seerumilla (lämmöllä inaktivoitu; Flow) PBS-liuoksessa ja niitä 30 inkuboitiin 60 min ajan 37°C. Blokkausliuos poistettiin ja levyjä taputeltiin huolellisesti paperia vasten.

Ihmisen seerumi laimennettiin 1:30 10 % lampaan seeru-mi/PBS-liuoksella, laitettiin levyille ja annettiin reagoida 120 min 37°C. Levyt pestiin tämän jälkeen 35 viisi kertaa PBS-T:llä. Sidottujen vasta-aineiden toteamiseen käytettiin piparjuuriperoksidaasilla leimattua ihmisen IgA-vastaista monoklonaalista vasta-ainet- 18 97426 ta, joka laimennettiin 1:500 10 % lampaan seerumi/PBS-liuoksella ja inkuboitiin levyillä 120 min 37°C. Tämän jälkeen levyjä pestiin viisi kertaa PBS-T:llä ja kehitettiin 20 mg/ml 2,2'-atsino-di-(3-etyylibentstiatso-5 liinisulfonaatti-(6))-deammoniumsuolalla (ABTS), joka oli laimennettu 1:50 0.1 M sitraattipuskurilla, pH 4, joka sisälsi 0.9 % vetyperoksidia. Absorbanssit mitattiin aallonpituudella 415 nm 60 min kuluttua. IgG:n totamiseksi levyt pestiin ja blokattiin 10 % lampaan 10 seerumi-PBS 60 min ajan 37°C. Tämän jälkeen kaniinin anti-ihmis-IgG-alkalifosfataasikonjugaattia (Dako), laimennettuna 1:1000 10 % lampaan seerumi-PBS:llä, saatettiin 120 min ajaksi 37°C. Viisi kertaa PBS-T:llä ja kerran 0.1 M dietanoliamiinipuskurilla, pH 9.6, 15 pesun jälkeen lisättiin 1 mg/ml fosfataasisubstraattia (Sigma) 0.1 M dietanoliamiinipuskurissa, pH 9.6/1 mM MgCl2/ ja levyt luettiin aallonpituudella 405 nm 90 min kuluttua. IgM vasta-aineiden toteamista varten levyt pestiin ja blokattiin edellä kuvatun mukaisesti, jonka 20 jälkeen niitä inkuboitiin anti-ihmis-IgM-glukoosioksi-daasikonjugaatilla (Sera-lab), laimennettuna 1:800 10 % lampaan seerumi-PBS:llä, 120 min ajan. Substraattina käytettiin 0.36 mg/ml ABTS, 2.4 % glukoosia, 8 pg/ml piparjuuriperoksidaasia (Sigma) 0.1 M fosfaattipusku-25 rissa, pH 6.0. Levyt luettiin aallonpituudella 415 nm 60 min kuluttua. Absorbanssia, joka ylitti taustan (sama seerumi päällystämättömissä kuopissa) 0.1:llä tai enemmällä, pidettiin positiivisena reaktiona. Sisäisenä standardina 30 HPV 16-positiivisen seerumin annettiin 30 reagoida jokaisessa kokeessa tunnetun antigeenisen peptidin kanssa, HKSAIVTLTYDSEWQRDQC:n, joka oli saatu HPV 16:n E2 0RF:stä. ELISA-absorbanssit sovitettiin sisäisen standardin mukaan mahdollisten määritysten välisten vaihtelujen kompensoimiseksi.

35 ELISA-absorbanssit, joista oli vähennetty päällystämättömien kuoppien kanssa reagoineen, saman seerumin absorbanssit, analysoitiin HPV 16-kohdun neo- 19 97426 plasiaa sairastavien potilaiden ryhmän ja kontrolliryhmän välisten, tilastollisesti merkittävien erojen suhteen kaksipuolisella, ei-parametrisellä ranking-kokeella (Mann-Whitney koe).

5 HPV-tyyppi 16:n L1- ja L2-proteiinien täydel liset aminohapposekvenssit syntetisoitiin 66 synteettisen peptidin sarjana peptidien ollessa 20 aminohapon pituisia ja toisiinsa nähden 5 tähteen osalta päällekkäisiä. Kaikista peptideistä tutkittiin ELISAlla niiden 10 reaktiivisuutta joko IgA-, IgG- tai IgM-vasta-aineiden kanssa 30 seerumissa, jotka oli saatu HPV 16-kohdun neoplasiaa kantavilta potilailta. L1-proteiinin useat alueet olivat säännöllisesti reaktiivisia näissä seerumissa esiintyvien IgA-vasta-aineiden kanssa, kuten on 15 esitetty kuvassa 13, josta nähdään IgA:n reaktiivisuus L1 -proteiinille. Jokainen piste edustaa yhden seerumin, joka reagoi abskissalle numeroidun peptidin kanssa, absorbanssiarvoja (OD). Näistä on vähennetty saman seerumin, joka reagoi päällystämättömien kuoppien kans-20 sa, absorbanssiarvo. Kolmekymmentä seerumia, jotka oli saatu HPV 16-kohdun neoplasiaa kantavilta potilailta, laimennettiin 1:30 ja niiden annettiin reagoida 35 kahdenkymmenen tähteen synteettisten peptidien kanssa, jotka edustivat HPV 16:n L1 ORF:n koko aminohapposek-25 venssiä. Sidotut IgA-vasta-aineet määritettiin IgA-. (alfa-ketju)-spesifisellä entsyymikonjugoidulla raono- klonaalisella vasta-aineella. IgA-vaste oli erityisen voimakas peptideillä, jotka oli johdettu proteiinin sisäalueesta käsittäen aminohapot 167-271 ja vastaten 30 peptidejä 12-18. Tämän pääasiallisen immunoreaktiivisen alueen ulkopuolella oli vielä eräitä muita immunoreak-tiivisia epitooppeja, joista mainittakoon proteiinin aminoterminaali (peptidi 1), peptidi 8 (aminohapot 102-121) ja eräät epitoopit, jotka sijaitsivat pääasialli-35 sen immunoreaktiivisen alueen karboksiterminaalipuolel-la, joista mainittakoon peptidit 21 ja 31 (vastaa aminohappoja 302-321 ja vast. 452-471).

20 97426

Vastakkaisesti, L2-proteiinista johdetuista peptideistä hyvin harvat olivat reaktiivisia IgA vasta-aineiden kanssa näissä seerumeissa, kuten on esitetty kuvassa 14, josta nähdään IgA-reaktiivisuus L2-proteii-5 nille. Sama koe kuin kuvan 13 tapauksessa, paitsi että seerumin annettiin reagoida 31 kahdenkymmenen tähteen synteettisen peptidin kanssa, jotka edustivat HPV 16:n L2 0RF:n koko aminohapposekvenssiä. Pääasiallinen epi-tooppi sijaitsi proteiinin keskellä (peptidi 49, amino-10 hapot 197-216). Muita epitooppeja määritettiin myös proteiinin aminoterminaalisessa osassa (peptidit 37-38, aminohapot 17-41), kun taas L2:n karboksiterminaalinen osa oli vähemmän reaktiivinen.

LI-proteiinin IgG-reaktiivisuus oli pienempi 15 kuin IgA-reaktiivisuus. Kuvasta 15 näkyy IgG-reaktiivisuus L1 -proteiinille. Koe oli sama kuin kuvassa 13 esitetty, paitsi että käytettiin lgG-(gamma-ketju)-spesifisellä entsyymillä konjugoitua kaniinin vasta-ainetta. Vaikka pääasiallinen IgA-immunoreaktiivinen 20 alue (peptidit 12-18) oli immunoreaktiivinen myös IgG-vasta-aineiden kanssa, IgG-reaktiivisuus oli yhtä voimakasta myös useiden muiden tämän alueen ulkopuolisten epitooppien kanssa, esim. peptidin 24 kanssa (aminohapot 347-366).

25 L2-proteiinilla oli muutamia IgG-reaktiivisia . epitooppeja kuvassa 16 esitetyn mukaisesti, josta näh dään IgG-reaktiivisuus L2-proteiinille. Koe oli sama kuin kuvassa 13 esitetty, paitsi että käytetttiin igG-(gamma-ketju)-spesifisellä entsyymillä konjugoitua 30 kaniinin vasta-ainetta ja että seerumin annettiin reagoida 31 kahdenkymmen tähteen synteettisen peptidin kanssa, jotka edustivat HPV 16:n L2 ORF:n koko aminohapposekvenssiä. Tälle saatiin samankaltaisia havaintoja kuin tämän proteiiniin IgA-reaktiivisuuden yhteydes-35 sä. Peptidin 49, jonka havaittiin olevan tämän proteiinin pääasiallinen IgA-reaktiivinen epitooppi, havaittiin olevan myös pääasiallinen IgG-reaktiivinen epi- 21 97426 tooppi. L2:n amninoterminaalissa olevan IgA-reaktiivi-sen epitoopin (peptidit 37-38) havaittiin myös olevan IgG-reaktiivisia (kuva 4).

IgM-reaktiivisuus L1-proteiinille oli hajaan-5 tunut koko proteiinin pituudelle useiden epitooppien kesken kuvassa 17 esitetyn mukaisesti, josta nähdään IgM-reaktiivisuus L1-proteiinille. Koe oli sama kuin kuvassa 13 esitetty, paitsi että käytettiin IgM-(mu-ketju)-spesifisellä entsyymillä konjugoitua vuohen 10 vasta-ainetta. Kiinnostusta herättää, että pääasiallinen IgM-reaktiivisuus havaittiin sellaisia peptidejä kohtaan, jotka eivät olleet kovin immunoreaktiivisia IgG- tai IgA-vasta-aineiden kanssa, peptidien ollessa esim. peptidejä 9, 13 ja 23 (aminohappopaikat 122-142, 15 182-202 ja 332-352).

L2-proteiinin IgM-immunoreaktiivisuus oli samankaltainen kuin IgA:n ja IgG:n tapauksessa siten, että L2-peptidit olivat huomattavasti vähemmän reaktiivisia kuin L1-peptidit. Kuvasta 18 nähdään IgM-reaktii-20 visuus L2-proteiinille. Koe oli sama kuin kuvassa 13 esitetty, paitsi että käytettiin IgM-(mu-ketju)-spesifisellä entsyymillä konjugoitua vuohen vasta-ainetta ja että seerumien annettiin reagoida 31 kahdenkymmenen tähteen synteettisillä peptideillä, jotka edustivat HPV 25 16:n L2 0RF:n koko aminohapposekvenssiä. Itse asiassa yksikään L2-peptidi ei ollut immunoreaktiivinen IgM:n kanssa useammassa kuin neljässä seerumissa 30:stä.

Seitsemän kaikkein immunoreaktiivisinta peptidiä (peptidit 8, 12, 13, 14, 16, 17 ja 24) testattiin myös IgA-30 IgG- ja IgM-reaktiivisuuden suhteen 60 kontrollisee-rumisarjan kanssa, joista 22 oli saatu muunlaisia kas-vaimia omaavilta potilailta ja 38 oli saatu terveiltä luovuttajilta. Suurimmalla osalla näistä peptideistä oli merkittävää immunoreaktiivisuutta vain alle 10 35 %:lle näistä kontrolliseerumeista kuvassa 19 esitetyn mukaisesti, josta nähdään synteettisten peptidien tautiin yhteydessä oleva reaktiivisuus. Kuvassa 19 on 22 97426 esitetty erittäin immunoreaktiivisista synteettisistä peptideistä neljä, joilla oli silmiinpistävät erot reaktiivisuudessa 30 HPV-16 kohdun neoplasiaa kantavien seerumin (HPV 16 SCC) ja kontrolliryhmän 60 seerumin, 5 jotka oli saatu muita kasvaimia omaavilta potilailta tai terveiltä luovuttajilta (kontrolli), välillä. Jokainen piste ilmaisee ELISAssa saadun absorbanssiarvon, josta on vähennetty päällystämättömien kuoppien absor-banssiarvo. Suuri HPV 16-kohdun neoplasiaa kantavien 10 määritysherkkyys havaittiin IgM-reaktiivisuudessa peptidille 8: 70 %. Tämän kokeen spesifisyys oli 95 % (3/60 kontrolliseerumista oli reaktiivisia). IgG-reak-tiivisuus peptidille 24 osoitti korkeaa spesifisyyttä: 97 % (2/60 kontrolliseerumista oli reaktiivisia), mutta 15 alhaisempaa herkkyyttä, 53 % (16/30 potilaan seerumista reagoi). IgA-reaktiivisuuksien herkkyydet peptideille 14 ja 16 olivat molemmille n. 60 % ja spesifisyydet juuri yli 90 % (kuva 19), ja immunoreaktiivisuus positiivissa seerumeissa oli korkeimpien todettujen joukos-20 sa (vertaa kuvia 1-6).

Osoittamalla, että peptidi on immunoreaktiivi-nen, keksijät ovat määritelleet, että se sisältää ihmisen seerumin kanssa reaktiivisen epitoopin. Tämän pep-tidisekvenssin sisältämä epitooppi ei ole absoluuttisen 25 riippuvainen peptidin tarkasta sekvenssistä vaan se voi . sisältyä alkuperäisen peptidin erilaisiin pieniin modifikaatioihin. Tällaisiin modifikaatioihin kuuluu laajennukset, katkaisut, syklisaatiot ja aminohappokor-vaukset. Joskus herää kysymys, pitäisikö tällaista 30 modifioitua peptidiä pitää uuteena peptidinä, joka sisältää uuden epitoopin. Alkuperäisen peptidin ja sen ;* modifikaation kompetitiivisillä immunomäärityksillä • · voidaan määrittää suoraan, onko modifioitu peptidi oleellisesti immunoreaktiivinen alkuperäisen peptidin 35 vastaisille vasta-aineille sisältäen siten saman epitoopin. On syytä painottaa, että peptidi voidaan valmistaa monella eri tavalla. Tässä yhteydessä on käytet- 23 97426 ty orgaanisen kemian menetelmiä peptidin syntetisoimi-seksi, mutta samat peptidit voidaan valmistaa monella muulla tavoin, esim. yhdistelmä-DNA-ilmentämisjärjestelmillä .

5 On ymmärrettävä, että tämän hakemuksen seli tysosassa esitetyt menetelmät on tarkoitettu esimerkeiksi eikä rajoittamaan keksintöä. Immunomääritys voidaan toteuttaa lukuisilla eri tavoilla. Vasta-aineiden, jotka on sidottu spesifiseen antigeeniin, toteami-10 nen voidaan esim. toteuttaa erilaisilla vasta-aineiden vastaisilla vasta-aineilla (anti-vasta-aineet) tai muilla yhdisteillä, joilla on affiniteettia vasta-aineille, kuten proteiini A:lla tai proteiini G:llä. Nämä reagenssit voidaan leimata lukuisilla eri tavoilla, 15 esim. radioaktiivisesti (radioimmunomääritykset) tai fluoresoivasti (fluori-immunomääritykset) tai entsymaattisesti (entsyymi-sidotut immunomääritykset, ELISA tai EIA). Entsymaattisten immunomäärityksien eräässä erityistapauksessa antigeeni-vasta-ainekomplekseja 20 todetaan kudosleikkeistä. Tällaista menetelmää on kut suttu immunovärjäykseksi tai immunohistosytokemiaksi, vaikka pääperiaate on sama kuin ELISAn tapauksessa.

ELISA-menetelmä voidaan toteuttaa erilaisina muunnelmina. Menetelmät ELISAn herkkyyden lisäämiseksi 25 käyttäen useita anti-vasta-ainekerroksia, avidiini- . biotiinikomplekseja ja entsyymi-anti-entsyymivasta- ainekomplekseja, ovat alalla hyvin tunnettuja. Kiinteä kantaja antigeenin kiinnittämiseksi on tavallisesti muovia edellä kuvatun mukaisesti, mutta erilaisia muita 30 kiinteitä kantajia, kuten lateksi tai agaroosi, on myös kuvattu. Antigeeniä ei tarvitse välttämättä kiinnittää suoraan kiinteään kantajaan. On olemassa esim. yleisesti käytetty ELISA-muunnelma, jossa spesifinen antigeeni kiinnitetään kiinteään kantajaan antigeenin vastaisen 35 kiinteäfaasi-kiinnitetyn vasta-aineen välityksellä, ns.

sieppaava vasta-aine ELISA tai sandwich-ELISA.

Immunomäärityksen erityistapausta, jossa anti- 24 97426 geeni saatetaan täplänä levyn muodossa olevaan kiinteään kantajaan, kutsutaan immunoblotting-määrityksek-si. Kiinteä kantaja on tyypillisesti nitroselluloosa-tai nailonlevy, mutta myös muita kantajia on kuvattu.

5 Tälle menetelmälle on tyypillistä, että ennen täplitys-tä antigeenit erotellaan koon perusteella geelielektro-foreesin avulla tai vastaavilla menetelmillä. Levyllä olevaan spesifiseen antigeeniin sidotun vasta-aineen toteaminen voidaan toteuttaa samalla tavoin kuin muiden 10 immunomäärityksien tapauksessa. Tässä hakemuksessa kuvattu totamismenetelmä, jossa käytetään anti-vasta-ainetta, biotiini-avidiinikompleksi-herkkyyden lisää-misvaihetta sekä entsymaattista leimausta, on vain yksi tällainen toteamisesimerkki.

15 Tarkasteltaessa diagnostisia menetelmiä yleen sä tiedetään, että useiden diagnostisten menetelmien yhdistäminen tuottaa diagnostisen menetelmän, jolla on parempi herkkyys ja/tai spesifisyys kuin yhdistelmään kuuluvilla yksittäisillä testeillä. On itsestään sel-20 vää, että mitkä tahansa tässä yhteydessä kuvatut vasta-ainetestit voidaan yhdistää keskenään tai muiden testien kanssa yhdistelmä-diagnostisen testin tuottamiseksi, jolla on optimaalinen herkkyys ja spesifisyys. 1 t

TAULUKKO IA

25 97426 E490

IgG seerumi eritteet 19084 .368 .184 5 19085 .592 .173 19086 1.041 .306 19087 .230 .073 19088 .770 .188 19089 .240 .180 19090 .253 .294 19091 .210 .032 Ί o 19092 .198 .060 19093 .660 .195 19094 .945 .281 19095 .224 .228 19096 .280 .278 19097 .259 .226 19098 .222 .134 15 IgA seerumi eritteet 19084 .298 .090 19085 .199 ,072 19°86 .327 131 ^087 .137 .056 3.9088 .235 .118 20 19089 .140 .053 19090 .153 .070 19091 .122 .076 19092 .119 .062 19093 1.021 .394 19094 .140 .066 19°95 .073 .099 25 19096 .136 .098 19097 .128 .096 19098 .098 .050 PV:n vastaisten IgA- ja IgG -vasta-aineiden mittaus 30 seerumista ja eritteistä. Ekstinktiokertoimet ELISA-tuloksista perustuvat 15 potilaaseen. Osa tästä infor-i. maatiosta on esitetty kuvissa 2, 3 ja 4. Tulosten ti lastollinen analyysi osoittaa, että PV:n vastaisten IgA-vasta-aineiden mittaus sekä seerumista että erit-35 teistä on koe, joka ei korreloi aikaisemmin kuvatun PV:n vastaisten igG-vasta-aineiden seerumi- eikä erite-kokeiden kanssa.

TAULUKKO 1 26 97426

Pepti- peptidisekvenssi IgA IgG IgM

5 di no.

8 NKFGFPDTSFYNPDTQRLVW <0.05 <0.0001 <0.0001 12 VDNRECISMDYKQTQLCLIG <0.002 <0.0001 <0.01 10

13 LCLIGCKPPIGEHWGKGSPC <0.02 <0.0001 NS

14 KGSPCTNVAVNPGDCPPLEL <0.0005 <0.0001 <0.0001 16 VHTGFGAMDFTTLQANKSEV <0.0001 <0.0001 <0.0001 15 17 NKSEVPLDICTSICKYPDYI <0.01 NS <0.0001 24 NGICWGNQLFVTWDTTRST <0.002 <0.0001 <0.001 20 30 HPV 16 kohdun neoplasiaa kantavien potilaiden seeru mien merkittävästi kohonneiden HPV 16 synteettisten peptidien vastaisten vasta-aineiden titterit verrattuna kontrollien (60) seerumeihin, jotka seerumit on saatu muita kasvaimia omaavilta potilailta tai terveiltä 25 luovuttajilta. Luvut tarkoittavat p-arvoja näiden kah-** den parametrin välisille merkittäville eroille (Mann-

Whitney koe).

NS = ei merkittävä TAULUKKO 2 27 97426

SYMBOLI_ AMINOHAPPO

1-kirjain 3-kiriain 5 Y Tyr L-tyrosiini G Gly glysiini F Phe L-fenyylialaniini M Met L-metioniini A Ala L-alaniini 10 S Ser L-seriini I Ile L-isoleusiini L Leu L-leusiini T Thr L-treoniini V Vai L-valiini 15 P Pro L-proliini K Lys L-lysiini H His L-histidiini Q Gin L-glutamiini E Glu L-glutamiinihappo 20 W Try L-tryptofaani R Arg L-arginiini D Asp L-asparagiinihappo N Asn L-asparagiini C Cys L-kysteiini 25 TAULUKKO 3 28 97426

Kuvissa 13-19 kuvatuissa kokeissa käytettyjen synteettisten peptidien aminohapposekvenssit.

Pep- Peptidi Sekvenssi tidi Sekvenssi

No. No.

1 QVTFIYILVITCYENDVNVY 41 TRPPTATDTLAPVRPPLTVD

2 DVNVYHIFFQMSLWLPSEAT 42 PLTVDPVGPSDPSIVSLVEE

3 PSEATVYLPPVPVSKWSTD 43 SLVEETSFIDAGAPTSVPSI

4 WSTDEYVARTNIYYHAGTS 44 SVPSIPPDVSGFSITTSTDT

5 HAGTSRLLAVGHPYFPIKKP 45 TSTDTTPAILDINNTVTTVT

6 PIKKPNNNKILVPKVSGLQY 46 VTTVTTHNNPTFTDPSVLQP

7 SGLQYRVFRIHLPDPNKFGF 47 SVLQP PTPAETGGHFTLS S S

8 NKFGFPDTSFYNPDTQELVW 48 TLSSSTISTHNYEEIPMDTF

9 QRLVWACVGVEVGRGQPLGV 49 PMDTFIVSTNPNTVTSSTPI

10 QPLGVGISGHPLLNKLDDTE 50 SSTPIPGSRPVARLGLYSRT

11 LDDTENASAYAANAGVDNRE 51 LYSRTTQQVKWDPAFVTTP

12 VDNRECISMDYKQTQLCLIG 52 FVTTPTKLITYDNPAYEGID

13 LCLIGCKPPIGEHWGKGSPC 53 YEGIDVDNTLYFSSNDNSIN

14 KGSPCTNVAVNPGDCPPLEL 54 DNSINIAPDPDFLDIVALHR

15 P P LELINTVXQDGDMVHTGF 55 VALHRPALTSRRTGIRYSRI

16 VHTGFGAMDFTTLQANKSEV 56 RYSRIGNKQTLRTRSGKSIG

17 NKSEVPLDICTSICKYPDYI 57 GKSIGAKVHYYYDLSTIDPA

18 YPDYIKMVSEPYGDSLFFYL 58 TIDPAEEIELQTITPSTYTT

19 LF F YLRREQMF VRHLFNRAG 59 STYTTTSHAAS PTS INNGLY *

20 FNRAGTVGENVPDDLYIKGS 6tJ NNGLYDIYADDFITDTSTTP

21 YIKGSGSTANLASSNYFPTP 61 TSTTPVPSVPSTSLSGYIPA

22 YFPTPSGSMVTSDAQIFNKP 62 GYIPANTTIPFGGAYNIPLV

23 IFNKPYWLQRAQGHNNGICW 63 NIPLVSGPDIPINITDQAPS

24 NGICWGNQLFVTWDTTRST 64 DQAPSLIPIVPGSPQYTIIA

25 TTRS TNMS LCAAI STS ETTY 65 YTIIADAGDFYLHPSYYMLRK

26 SETTYKNTNFKEYLRHGEEY 66 YMLRKRRKRLPYFFSDVSLAA

27 HGEEYDLQFIFQLCKITLTA

28 ITLTADVMTYIHSMNSTILE

29 STILEDWNFGLQPPPGGTLE

3 0 GGTLEDTYRFVTQAIACQKH

31 ACQKHTPPAPKEDDPLKKYT

3 2 LKXYTFWEVNLKEKFSADLD

3 3 SADLDQFPLGRKFLLQAGLK

34 QAGLKAKPKFTLGKRKATPT

3 5 KATPTTSSTSTTAKRKKRKL

3 6 RHKRSAKRTKRASATQLYKT

37 QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV

38 IIPKVEGKTIAEQILQYGSM

39 QYGSMGVFFGGLGIGTGSGT

40 TGSGTGGRTGYIPLGTRPPT

Claims

97426

1. Menetelmä ihmisen papilloomaviruksen (HPV) vasta-aineiden toteamiseksi kehon nesteestä tai kudok-5 sesta, HPV-assosioidun neoplasian diagnosoimiseksi, tunnettu siitä, että toteaminen suoritetaan määrittämällä IgA-vasta-aineiden esiintyminen kehon nesteissä tai kudoksissa immunoanalyysillä, jotka vasta-aineet on kohdistettu L2-koodatulle n. 64 kDa papil-10 loomavirusproteiinille, LI-koodatulle n. 54 kDa papil- loomavirusproteiinille sekä määrittämällä minkä tahansa tyyppisen vasta-aineen esiintyminen, joka vasta-aine on kohdistettu n. 28 kDa papilloomaviruksen virioniprote-iinille, n. 14 kDa papilloomaviruksen virioniprote-15 iinille tai peptidille, jolla on jonkin seuraavista kaavoista mukainen aminohapposekvenssi: QVTFIYILVITCYENDVNVY PSEATVYLPPVPVSKWSTD 20 WSTDEYVARTNIYYHAGTS HAGTSRLLAVGHPYFPIKKP PIKKPNNNKILVPKVSGLQY SGLQYRVFRIHLPDPNKFGF NKFGFPDTSFYNPDTQRLVW 25 QRLVWACVGVEVGRGQPLGV VDNRECISMDYKQTQLCLIG LCLIGCKPPIGEHWGKGSPC KGS PCTNVAVNPGDC P PLEL PPLELINTVIQDGDMVHTGF 30 VHTGFGAMDFTTLQANKSEV NKSEVPLDICTSICKYPDYI YPDYIKMVSEPYGDSLFFYL YIKGSGSTANLASSNYFPTP YFPTPSGSMVTSDAQIFNKP 35 IFNHPYWLQRAQGHNNGICW NGICWGNQLFVTWDTTRS T TTRSTNMSLCAAISTSETTY 97426 S ETTYKNTNFKEYLRHGEEY ITLTADVMTYIHSMNSTILE GGTLEDTYRF VTQ AIACQ KH ACQKHTPPAPKEDDPLKKYT 5 LKKYTFWEVNLKEKFSADLD SADLDQFPLGRKFLLQAGLK QAGLKAKPKFTLGKRKATPT Q L YKTC KQAGTC P P D11P K V IIPKVEGKTIAEQILQYGSM 10 PMDTFIVSTNPNTVTSSTPI GKSIGAKVHYYYDLS TID P A NNGLYDIYADDFITDTSTTP tai jonkin mainitussa ryhmässä esitetyn peptidin modifikaatiolle, joka on oleellisesti immunoreaktiivinen 15 alkuperäisen peptidin vastaisten vasta-aineiden kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään ELISA-menetelmällä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään im- munoblotting-menetelmällä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään eritteestä .

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun eritteestä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun 30 neoplasian diagnosoimiseksi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, : tunnettu siitä, että erite otetaan pumpuliti kulla, harjalla tai lastalla, ja se pestään ko. otti-mesta nestemäiseen laimennosaineeseen.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään seerumista . 97426

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toteaminen suoritetaan määrittämällä IgG-vasta-aineiden esiintyminen kehon nesteissä tai kudoksessa immunoanalyysillä, jotka vas-5 ta-aineet on kohdistettu n. 28 kDa papilloomaviruksen virioniproteiinille, n. 14 kDa virionipapilloomavi-rusproteiinille tai peptidille, jolla on jonkin seuraa-vista kaavoista mukainen aminohapposekvenssi: PSEATVYLPPVPVSKWSTD 10 VDNRECISMDYKQTQLCLIG KGSPCTNVAVNPGDCPFLEL YPDYIKMVSEPYGDSLFFYL YIKGSGSTANLASSNYFPTP NGICWGNQLFVTWDTTRST TTRSTNMSLCAAISTSETTY SADLDQFPLGRKFLLQAGLK QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV IIPKVEGKTIAEQILQYGSM PMDTFIVSTNPNTVTSSTPI 20 NNGLYDIYADDFITDTSTTP tai jonkin mainitussa ryhmässä esitetyn peptidin modifikaatiolle, joka on immunoreaktiivinen alkuperäisen 25 peptidin vastaisten vasta-aineiden kanssa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään ELISA-menetelmällä.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään immunoblotting-menetelmällä.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään eritteestä .

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun eritteestä. 97426

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun neoplasian diagnosoimiseksi.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että erite otetaan pumpulitikulla, harjalla tai lastalla, ja se pestään ko. otti-mesta nestemäiseen laimennosaineeseen.

16. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään seerumis- 10 ta.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toteaminen suoritetaan määrittämällä igM-vasta-aineiden esiintyminen kehon nesteissä tai kudoksessa immunoanalyysillä, jotka vas- 15 ta-aineet ovat vasta-aineita peptidille, jolla on jonkin seuraavista kaavoista mukainen aminohapposekvenssi: HAGTSRLLAVGHPYFPIKKP PIKKPMNNKILVPKVSGLQY SGLQYRVFRIHLPDPNKFGF

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään ELISA-menetelmällä.

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään im- 10 munoblotting-menetelmällä.

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään eritteestä .

20 NKFGFPDTSFYNPDTQRLVW QRLVWACVGVEVGRGQPLGV VDNRECISMDYKQTQLCLIG LCLIGCKPPIGEHWGKGSPC KGSPCTNVAVNPGDCPPLEL

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun eritteestä.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun neoplasian diagnosoimiseksi.

23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erite otetaan pumpulitikulla, harjalla tai lastalla, ja se pestään ko. otti-mesta nestemäiseen laimennosaineeseen.

24. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että määritys tehdään seerumista .

25. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toteaminen suoritetaan määrittämällä IgA-vasta-aineiden esiintyminen kehon 30 nesteessä tai kudoksessa immunoanalyysillä, jotka vasta-aineet on kohdistettu n. 28 kDa papilloomaviruksen virioniproteiinille, n. 14 kDa papilloomaviruksen vi-rioniproteiinille tai peptidille, jolla on jonkin seu-raavista kaavoista mukainen aminohapposekvenssi: 35 QVTFIYILVITCYENDVNVY PSEATVYLPPVPVSKWSTD WS TDEYVARTNIYYHAGTS 97426 HAGTS RLLAVGHPYFPIKKP SGLQYRVFRIHLPDPNKFGF NKFGFPDTSFYNPDTQRLVW QRLVWACVGVEVGRGQPLGV 5 VDNRECISMDYKQTQLCLIG LCLIGCKPPIGEHWGKGSPC KGSPCTNVAVNPGDCPPLEL PPLELINTVIQDGDMVHTGF VHTGFGAMDFTTLQANKSEV 10 NKSEVPLDICTSICKYPDYI YPDYIKMVSEPYGDSLFFYL YIKGSGSTANLASSNYFPTP YFPTPSGSMVTSDAQIFNKP NGICWGNQLFVTWDTTRST 1 5 S ETTYKNTNF KEYLRHGEEY ACQKHTPPAPKEDDPLKKYT LKKYTFWEVNLKEKFSADLD QAGLKAKPKFTLGKRKATPT QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV 20 IIPKVEGKTIAEQILQYGSM PMDTFIVSTNPNTVTSSTPI GKSIGAKVHYYYDLSTIDPA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 tai jonkin mainitussa ryhmässä esitetyn peptidin modi 2 fikaatiolle, joka on oleellisesti immunoreaktiivinen 3 alkuperäisen peptidin vastaisten vasta-aineiden kanssa. 4

25 NKSEVPLDICTSICKYPDYI YPDYIKMVSEPYGDSLFFYL YIKGSGSTANLASSNYFPTP IFNHPYWLQRAQGHNNGICW TTRSTNMSLCAAISTSETTY 30 SETTYKNTNFKEYLRHGEEY ITLTADVMTYIHSMNSTILE GGTLEDTYRFVTQAIACQKH ACQKHTPPAPKEDDPLKKYT LKKYTFWEVNLKEKFSADLD 35 97426 tai jonkin mainitussa ryhmässä esitetyn peptidin modifikaatiolle, joka on immunoreaktiivinen alkuperäisen peptidin vastaisten vasta-aineiden kanssa.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään 6 ELISA-menetelmällä. 7

27. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, 8 . tunnettu siitä, että immunoanalyysi tehdään 9 immunoblotting-menetelmällä. 10

28. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, 11 tunnettu siitä, että määritys tehdään eritteestä .

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, 97426 tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun eritteestä.

30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään kohdun 5 neoplasian diagnosoimiseksi.

31. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erite otetaan pumpulitikulla, harjalla tai lastalla, ja se pestään ko. otti-mesta nestemäisellä laimennusaineella.

32. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään seerumista . 97426