CN102105791A - 新人乳头状瘤病毒单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明实施案例，提供方法、单克隆抗体、多克隆抗体、试验和试剂盒，侦测人乳头状瘤病毒感染和人乳头状瘤病毒相关癌症诊断，包括各式人乳头状瘤病毒病毒型之感染及早期或晚期人乳头状瘤病毒相关性或特异性之癌症。获得各种单克隆抗体，针对特异之人乳头状瘤病毒蛋白或病毒型，辨识其特殊抗原表位。所获得的单克隆抗体，可作为临床人乳头状瘤病毒感染早期侦测、人乳头状瘤病毒相关疾病一般侦测、非侵袭性子宫颈癌特殊侦测、其他人乳头状瘤病毒相关癌症侦测、早期癌前病灶和晚期癌症进程等侦测工具。
Description
本项发明应用相关参照
此专利应用范围受利于美国临时专利申请序号61/131,991，2008年6月13号提交，和美国临时专利申请序号61/192,912，2008年9月22日提交。每一上述相关之专利申请，在此以提及方式纳入。
本项发明背景
因某些特定上皮细胞感染人乳头状瘤病毒(HPV)而引起的上皮组织增生，在子宫颈癌的致癌机转上扮演了重要角色。在已经被诊断确定的子宫颈癌病例里，约99％的病例发现同时伴随有人乳头状瘤病毒的感染，并且患有组织切片确认的鳞状上皮内病变(SIL)或子宫颈上皮内赘瘤(CIN)。在所有受感染族群中，大约有1％的人有外生殖器病疣，4％的女性有不等程度之低度鳞状上皮内病变(LSIL)至高度鳞状上皮内病变(HSIL)，及意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)等子宫颈癌前期发展徵兆。一般认为，持续感染人乳头状瘤病毒将导致癌前表皮病变。感染高危险型人乳头状瘤病毒且伴随低度鳞状上皮内病变之女性，亦有可能发展成为高度鳞状上皮内病变；而实际上，大部分病人在低度病变之鳞状表皮部分转为高度病变时，病情获得减缓。虽然99.7％的子宫颈癌呈人乳头状瘤病毒阳性反应，将病毒基因体插入寄主细胞基因体中，可促进必需基因表现，发展为高度鳞状上皮内病变或癌症生成。长时期持续性的感染人乳头状瘤病毒的女性中，仅十分之一可能形成更高度之子宫颈上皮内赘瘤病变，如第二级子宫颈上皮内赘瘤和第三级子宫颈上皮内赘瘤，而部分病灶最终将发展成为子宫颈癌。
早期子宫颈癌筛检方式为传统细胞学检测，例如藉细胞染色之子宫颈抹片检查(papanicolaou smear)，若有异常抹片再进一步由阴道镜或合并组织学切片做检查。但碍于主观上的判定标准，使得子宫颈抹片筛检方法存在不少缺失，诸如：检体获得不易、检测者本身与不同检测者间观测信度低、伪阴性及伪阳性比例偏高、需要高度专业训练的人员与研究设备，以及无法有效检测出多数的人乳头状瘤病毒感染者。有鉴于此，发展更具再现性之检测方式成为首要课题，不仅可避免不必要之医疗介入，且可降低受感染女性病人之心理压力。
人乳头状瘤病毒感染之核酸检测方式，如具高敏感侦测度之″脱氧核醣核酸杂交捕获″，但由于价格昂贵、检测过程繁复，耗费检测设备、仪器以及高度专业训练之检测人员等限制，使得此检测方法无法臻至完善，且其对子宫颈上皮内赘瘤检体之阳性预测值偏低。另一检测方法，PreTect HPV-ProoferR被证实对E6/E7信使RNA(mRNA)具敏感性，且比杂交捕获方法具有更高之阳性预测值；然而，此方式却无法直接原位侦测E6/E7原至癌基因蛋白。此外，脱氧核醣核酸(DNA)检测无法分辨及诊断人乳头状瘤病毒感染后之病况和不同程度之细胞病灶(例如，无法辨别低度鳞状上皮内病变至高度鳞状上皮内病变之程度，亦无法侦测潜伏性或缓解性之病毒感染)。因此，有必要发展价格低廉、操作方法简单、具高敏感度及专一性，且可容易实行于一般临床检测实验室知检测方法，并协助医师早期诊断不同程度之表皮病变(低度鳞状上皮内病变至高度鳞状上皮内病变)，或预测罹患子宫颈癌之风险评估。
现今已知的单克隆抗体制程方式，无法与感染患者细胞中所带之人乳头状瘤病毒病毒蛋白做有效反应，因此，不仅不适用于抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体的生产，且难以应用在一般大众个体之免疫细胞学诊断。临床上，人乳头状瘤病毒诊断方式面临以下三项困难：第一，临床检体中所含的人乳头状瘤病毒蛋白量非常稀少；其次，人乳头状瘤病毒病毒是多型性的，而临床检体中所出现的人乳头状瘤病毒病毒种类通常是未知的，或尚未确认其机转，因此缺乏有效的抗体；第三，人乳头状瘤病毒病毒无法在实验室中藉由标准组织培养技术培养。基于上述理由，我们无法大量纯化人乳头状瘤病毒蛋白以作为生产抗人乳头状瘤病毒抗体之免疫原，亦无法辨识临床人乳头状瘤病毒检测中，抗病毒抗体或病毒蛋白之存在。
在一百多种造型的人乳头状瘤病毒病毒中，仅感染其中约十五种类型人乳头状瘤病毒的患者将可能成为子宫颈上皮内赘瘤或子宫颈癌的高危险群，而其中七成的子宫颈癌病例与五成的第二级子宫颈上皮内赘瘤及第三级子宫颈上皮内赘瘤病例，主要是由人乳头状瘤病毒16与人乳头状瘤病毒18这两种病毒所引发。部份进行性子宫颈癌病例则是感染某些低风险性的人乳头状瘤病毒病毒所造成，在此情况下感染高危险性人乳头状瘤病毒病毒时，将不再转为子宫颈癌。事实上，肿瘤的生成或癌症的产生，与感染人乳头状瘤病毒16和人乳头状瘤病毒18这两种盛行的高危险性病毒并无直接关联，分清确认人乳头状瘤病毒患者本身所表现之特定原致癌蛋白才是首要之务。
因此，发展临床检体中人乳头状瘤病毒相关原致癌蛋白之检测方法，作为子宫颈癌之生物标记，将有助于预测及筛选出高度细胞病或子宫颈癌相关疾病之高危险群。此外，抗人乳头状瘤病毒抗体的研发，以及发展针对侵袭性子宫颈癌或子宫颈癌相关原致癌蛋白的免疫侦测方法，皆有助于预测上皮细胞病灶恶性转型为子宫颈癌。
本项发明摘要
本项发明针对人类乳突瘤感染，研究各式不同的有效侦测方法、试剂盒、多克隆或单克隆抗人类乳突瘤抗体、多肽类、重组蛋白和核酸等，用以检验一般性人类乳突瘤感染、不同基因型、高风险型或低风险型人类乳突瘤。提供各式的新颖单克隆抗体，可作为生物标记侦测人乳头状瘤病毒蛋白、原致癌蛋白，早期筛检子宫颈癌及早期诊断子宫颈上皮内赘瘤、细胞异生和侵袭性子宫颈癌等。此发明可做为人类乳突瘤感染之早期临床侦测工具、子宫颈癌和其他癌症之一般诊断、侵袭性子宫颈癌专一性侦测、其他人类乳突瘤相关性癌症、早期癌前病灶，甚至是癌症晚期进程之侦测。
本专利提供单克隆抗体之制程，可辨识多种人乳头状瘤病毒蛋白或不同类型人乳头状瘤病毒之抗原表位(如泛抗人乳头状瘤病毒抗体，pan-HPV antib可見光譜ies)，其中某些单克隆抗体对特定人乳头状瘤病毒类型具有专一性，部分则为非专一性抗体；藉由非人乳头状瘤病毒型专一性泛抗体，辨识临床检体中最常见之人乳头状瘤病毒蛋白并与之键结。在另一方面，这些泛单克隆抗体的键结能力佳，利用单一简便之检测方式便可同时侦测多个临床人乳头状瘤病毒感染检体；除了可应用于其他免疫检测试验外，抗人乳头状瘤病毒抗体亦保有对单一人乳头状瘤病毒蛋白(特定单一人乳头状瘤病毒型上的特定单一人乳头状瘤病毒蛋白)之专一性。
本专利发明在一实施方案中，单克隆抗体由产生抗体之融合瘤细胞产生，其产生抗体之融合瘤细胞由一个或多个纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白筛选而来。筛选步骤包括，选择出对两种以上人乳头状瘤病毒重组蛋白具有阳性反应性，且对非人乳头状瘤病毒蛋白不具有反应性之产生抗体之融合瘤细胞，因此，融合瘤细胞所产生之单克隆抗体对两种以上之人乳头状瘤病毒病毒，便具有专一键结能力。各式不同的人乳头状瘤病毒相关抗体包含多克隆或单克隆抗体，这类抗体对携带了一种以上人乳头状瘤病毒基因型的早期或晚期基因之人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性。此专利所描述之抗体可应用于免疫方法，侦测不同个案检体，并与正负控制组作比较。
在一实施方案中，单克隆抗体经由由第一型的人乳头状瘤病毒纯化出之第一种人乳头状瘤病毒重组蛋白以及由第二型的人乳头状瘤病毒纯化出之第二种人乳头状瘤病毒重组蛋白筛选出之产生抗体之融合瘤细胞产生的抗体、因此该单克隆抗体可辨识相同或不同型人乳头状瘤病毒蛋白上之共同抗原表位。在另一实施方案中，单克隆抗体经由由第一型的人乳头状瘤病毒纯化之出第一种人乳头状瘤病毒纯重组蛋白以及由第二型的人乳头状瘤病毒纯化之出第二种人乳头状瘤病毒重组蛋白筛选出之产生抗体之融合瘤细胞产生的抗体、因此该抗体可辨识仅存在于第一种或第二种纯化之人乳头状瘤病毒重组蛋白的专一性抗原表位，不会辨识其他纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白。
在另一实施方案中，藉由筛选两种或两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白获得之产生抗体之融合瘤细胞，生产出与来自相同人乳头状瘤病毒病毒型的一个或多个人乳头状瘤病毒病毒蛋白具有专一性键结能力的单克隆抗体；其两种或两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白可来自于相同或不同型之人乳头状瘤病毒病毒，因此产生抗体之融合瘤细胞可制造出对两种以上来自相同型的人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性键结能力之单克隆抗体。其两种或两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白亦可为纯化后之人乳头状瘤病毒早期重组蛋白，因此单克隆抗体可键结至两种以上与纯化后重组蛋白相关之人乳头状瘤病毒早期蛋白。其两种或两种以上纯化后的人乳头状瘤病毒重组蛋白，亦可包含了纯化后之人乳头状瘤病毒早期重组蛋白和晚期蛋白，此种单克隆抗体可键结至与纯化后人乳头状瘤病毒之早期和晚期重组蛋白相关的早期和晚期病毒蛋白。
在另一实施方案中，单克隆抗体可对来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之多种人乳头状瘤病毒病毒蛋白具有键结能力。此抗体藉由筛选两种或两种以上的纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得，筛选步骤包括选择对来自不同人乳头状瘤病毒型之两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白具有阳性反应性且对非人乳头状瘤病毒蛋白为负反应的产生抗体之融合瘤细胞；产生抗体之融合瘤细胞所制造出的单克隆抗体对两种以上之人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性键结能力。
在另一实施方案中，生产出能与不同人乳头状瘤病毒型之早期和晚期病毒蛋白键结的单克隆抗体。且在又一实施方案中，一单克隆抗体仅能与第一种人乳头状瘤病毒蛋白键结，而不与第二种人乳头状瘤病毒蛋白键结，该单克隆抗体是藉由筛选自对第一型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白具阳性反应，且对第二型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白具阴性反应的产生抗体之融合瘤细胞以获得抗体；其中第一种人乳头状瘤病毒的病毒蛋白，相当于第一型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白，而第二种人乳头状瘤病毒的病毒蛋白，相当于第二型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白。
图示概述
图1A说明一单克隆抗体可以和人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒16 E7重组蛋白(来自相同人乳头状瘤病毒病毒型之不同人乳头状瘤病毒蛋白)进行专一性反应，且能辨识来自相同人乳头状瘤病毒16型之人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒16 E7不同蛋白的共同抗原表位，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法(EIA)。
图1B说明另一单克隆抗体可与人乳头状瘤病毒16E6和人乳头状瘤病毒16E7重组蛋白进行专一性反应，且能辨识人乳头状瘤病毒16E6和人乳头状瘤病毒16E7重组蛋白之共同抗原表位，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图2A说明一单克隆抗体对人乳头状瘤病毒16E6、E7、L1和L1N端重组蛋白(来自相同人乳头状瘤病毒病毒型之不同人乳头状瘤病毒蛋白)进行专一性反应，且能辨识来自相同人乳头状瘤病毒16型之不同E6、E7、L1和L1N端蛋白上的共同抗原表位，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图2B说明来自使用图2A之单克隆抗体进行之免疫印迹分析法(Western Blot)的结果，确认此抗体可与所有的人乳头状瘤病毒16E6、E7和L1重组蛋白产生键结。
图2C说明来自使用图2A之单克隆抗体进行之免疫印迹分析法分析子宫颈癌细胞株的细胞溶解物的结果，确认此抗体可与所有在子宫颈癌细胞株中表现的人乳头状瘤病毒16 E6、E7和L1病毒蛋白产生键结。
图3A说明单克隆抗体不仅可与所有人乳头状瘤病毒16 E6、E7及L1N端重组蛋白，及与人乳头状瘤病毒18 E6及E7蛋白(来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之人乳头状瘤病毒蛋白)产生专一性键结，并能辨识来自人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18的E6、E7及L1 N端蛋白之共同抗原表位，做为另专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图3B说明来自使用图3A之单克隆抗体进行之免疫印迹分析法的结果，确认此抗体可键结至不同重组蛋白，且辨识来自两种不同人乳头状瘤病毒病毒型人乳头状瘤病毒16和人乳头状瘤病毒18之不同E6、E7及L1N端蛋白上的共同抗原表位。
图3C说明来自使用图3A之单克隆抗体进行之免疫印迹分析法分析子宫颈癌细胞株的细胞溶解物的结果，确认此抗体可与在子宫颈癌细胞株中表现的人乳头状瘤病毒16 E6、E7和L1病毒蛋白及人乳头状瘤病毒18 E6、E7和L1病毒蛋白产生键结。
图4A说明一单克隆抗体与两种E6重组蛋白(人乳头状瘤病毒16E6及人乳头状瘤病毒18 E6，来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之E6蛋白)具专一性键结，且辨识此两种不同病毒型之E6蛋白的共同抗原表位，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图4B说明来自使用图4A之单克隆抗体进行之免疫印迹分析法分析子宫颈癌细胞株的细胞溶解物的结果，确认此抗体可与在子宫颈癌细胞株中表现的人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒18 E6病毒蛋白产生键结。
图5说明一单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 E7及人乳头状瘤病毒18E7两种重组蛋白(来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之E7蛋白)进行专一性反应，且辨识此两种不同病毒型之E7蛋白的共同抗原表位，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图6说明一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒16 E6重组蛋白进行专一性反应，且不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图7A说明一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白进行专一性反应，且不与任何其他人乳头状瘤病毒16或人乳头状瘤病毒18重组蛋白反应，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图7B说明来自使用图7A之单克隆抗体进行之免疫印迹分析法分析子宫颈癌细胞株的细胞溶解物的结果，确认此抗体可与在Hela癌细胞株中表现的人乳头状瘤病毒18 E6病毒蛋白而非人乳头状瘤病毒E7病毒蛋白产生键结。
图8说明一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒16 E7重组蛋白进行专一性反应，且不与任何其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图9说明一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白进行专一性反应，且不与任何其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应，做为专利一实施方案中之酶免疫分析方法。
图10A说明一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒16 L1 N端重组蛋白进行专一性反应，且不与任何其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应，做为另一专利实施方案中之酶免疫分析方法。
图10B说明另一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒16 L1 N端重组蛋白进行专一性反应，且不与任何其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应，做为酶免疫分析方法。
图11说明一单克隆抗体仅与人乳头状瘤病毒16 L1及L1 N端重组蛋白进行专一性反应，且不与任何其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应，做为另一专利实施方案中之酶免疫分析方法。
图12A说明以一抗E6单克隆抗体在第二级子宫颈上皮内赘瘤组织中结构不良细胞的代表性染色图，做为一专利实施方案中之免疫组织化学(IHC)之侦测方法。
图12B说明图12A中第二级子宫颈上皮内赘瘤组织中结构不良细胞的邻近上皮之代表性染色图，做为另一专利实施方案之侦测方法。
图12C说明以与图12A中之同一抗E6单克隆抗体在第三级子宫颈上皮内赘瘤组织中结构不良之上皮细胞的代表性染色图，依据另一专利实施方案，显示此抗E6单克隆抗体对结构不良细胞之细胞核和细胞质具专一性之免疫组织化学。
图12D说明以图12A中之同一抗E6单克隆抗体在另一第三级子宫颈上皮内赘瘤组织中结构不良之上皮细胞进行免疫组织化学的代表性染色图，
图13A说明以一抗E7单克隆抗体进行鳞状细胞癌(SCC)组织的组织阵列之免疫组织化学之代表性染色图，依据另一专利实施方案使用抗E7单克隆抗体作为免疫组织化学之侦测方法。
图13B说明图13A中邻近鳞状细胞癌组织之正常上皮(约与肿瘤组织相距15毫米)的代表性染色图。
图13C说明以与图13A中之同一抗E7单克隆抗体进行另一鳞状细胞癌，显示此抗E7单克隆抗体对肿瘤细胞具专一性之免疫组织化学染色。
图13D说明由图13C所放大之代表性染色图，显示肿瘤细胞之细胞质染色。
图14A说明以一老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体染色对第二级子宫颈上皮内赘瘤子宫颈抹片样本之子宫颈细胞进行免疫细胞化学(ICC)之代表性染色图，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7抗体染色，依据一专利实施方案，作为免疫细胞化学侦测方法。
图14A说明以一老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体染色对第三级子宫颈上皮内赘瘤子宫颈抹片样本之子宫颈细胞进行免疫细胞化学之代表性染色图，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6抗体染色，依据一专利实施方案，作为免疫细胞化学侦测方法
图14C说明以与图14B中之同一抗E6单克隆抗体对子宫颈抹片样本之子宫颈腺癌细胞进行免疫细胞化学之代表性染色图。
内容详述
本专利发明实施方案中，生产多种抗人乳头状瘤病毒蛋白之单克隆抗体，高风险或低风险性之人乳头状瘤病毒病毒型皆可被单一单克隆抗体所侦测。此发明亦产生人乳头状瘤病毒之特异性单克隆抗体，仅能侦测高危险性之人乳头状瘤病毒病毒型。此外，也生产出针对单一人乳头状瘤病毒蛋白具有高度特异性之单克隆抗体。
专利其中一分项发明单克隆抗体之制造方法，包括获得不同纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白，以及由两种以上纯化之人乳头状瘤病毒重组蛋白中筛选出产生抗体之融合瘤细胞，藉以获得对两种以上纯化后人乳头状瘤病毒蛋白抗原表位具有辨识力之单克隆抗体，或可辨识依生物和临床检体中两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白。
此外，利用对两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞具有阳性反应，以及对非人乳头状瘤病毒蛋白之产生抗体之融合瘤细胞无反应之筛选方法，生产出对两种以上人乳头状瘤病毒蛋白具有专一键结能力之单克隆抗体。举例来说，包括筛选两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，藉由选择对两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白具阳性反应性之产生抗体之融合瘤细胞，且对非人乳头状瘤病毒蛋白不具反应性，产生抗体之融合瘤细胞所产生之单克隆抗体对两种以上人乳头状瘤病毒蛋白具有专一键结能力。两种以上之纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白胞过人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 E6、人乳头状瘤病毒18 E7、人乳头状瘤病毒18 L1蛋白以及其重组蛋白。
另一发明方法包括筛选来自人乳头状瘤病毒第一型首次纯化，与来自人乳头状瘤病毒第二型第二次纯化后之重组蛋白的产生抗体之融合瘤细胞，以获得对两种以上不同人乳头状瘤病毒病毒型之共同抗原表位具有辨识力之单克隆抗体。另一发明方法，筛选第一来自人乳头状瘤病毒第一型首次纯化，与来自人乳头状瘤病毒第二型第二次纯化后之重组蛋白的产生抗体之融合瘤细胞，获得仅能辨识第一和第二型人乳头状瘤病毒病毒特殊抗原表位之单克隆抗体，且对其他纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白无辨识能力。
试举一例，可键结至来自相同人乳头状瘤病毒病毒型两种以上人乳头状瘤病毒蛋白之单克隆抗体，本发明藉由筛选来自相同或不同人乳头状瘤病毒病毒型纯化之重组蛋白的产生抗体之融合瘤细胞。在一案例中，两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白是其早期蛋白，故可产生单克隆抗体，且可依据这些纯化后早期人乳头状瘤病毒重组蛋白，使抗体能与两种以上人乳头状瘤病毒早期蛋白产生键结。在另一案例中，两种以上之纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白可能包含有纯化后人乳头状瘤病毒早期和晚期蛋白，因此可产生另一单克隆抗体，依据纯化后人乳头状瘤病毒早期和晚期重组蛋白，对早期和晚期病毒蛋白具有键结能力。
在所有获得的单克隆抗体中，包含一种可与人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒16 E7病毒蛋白键结的单克隆抗体；另一种单克隆抗体可与所有人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒16 L1病毒蛋白键结；还有一种单克隆抗体则可与人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7病毒蛋白产生键结。藉由专利发明的方法所产生之单克隆抗体，可与选择自高危险群人乳头状瘤病毒病毒型、低危险型病毒型、人乳头状瘤病毒16、人乳头状瘤病毒18、人乳头状瘤病毒31、人乳头状瘤病毒33、人乳头状瘤病毒35、人乳头状瘤病毒39、人乳头状瘤病毒45、人乳头状瘤病毒51、人乳头状瘤病毒52、人乳头状瘤病毒56、人乳头状瘤病毒58、人乳头状瘤病毒59、人乳头状瘤病毒68、人乳头状瘤病毒6、人乳头状瘤病毒11、人乳头状瘤病毒42、人乳头状瘤病毒43、人乳头状瘤病毒44、人乳头状瘤病毒53、人乳头状瘤病毒54、人乳头状瘤病毒55和人乳头状瘤病毒56，以及期结合型之相同人乳头状瘤病毒病毒型两种以上病毒蛋白产生键结。
这些单克隆抗体可应用至多种免疫侦测方法，侦测人乳头状瘤病毒感染、人乳头状瘤病毒相关性子宫颈癌和其他疾病。适合的免疫侦测方法包过酶联免疫吸附试验(酶联免疫吸附试验)、人乳头状瘤病毒蛋白抗原试验、抗人乳头状瘤病毒蛋白抗体试验、人乳头状瘤病毒免疫群试验、蛋白芯片试验、放射性免疫沉淀试验、细胞膜快速免疫层析、快速棒状免疫层析、组织及子宫颈细胞之免疫化学和流式细胞仪之免疫细胞学分析等。
专利发明之另一分项，生产可与来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之多种病毒蛋白产生键结的单克隆抗体之方法。藉由筛选来自多种人乳头状瘤病毒纯化后重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，选择对不同人乳头状瘤病毒病毒型纯化后结和蛋白具有阳性反应性，且对非人乳头状瘤病毒蛋白不具反应之融合瘤细胞，此产生抗体之融合瘤细胞可产生对多种人乳头状瘤病毒病毒蛋白具有专一键结能力之单克隆抗体。这些单克隆抗体，包括可与人乳头状瘤病毒16E7和人乳头状瘤病毒18E7蛋白键结的抗体；另一类抗体可与人乳头状瘤病毒16E6和人乳头状瘤病毒18E6蛋白键结；以及可与人乳头状瘤病毒16L1和人乳头状瘤病毒18L1键结的抗体，可应用于多种免疫分析方法。
专利发明之又一分项，生产可与来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之早期和晚期病毒蛋白产生键结的单克隆抗体。藉由筛选一种人乳头状瘤病毒病毒型纯化后人乳头状瘤病毒早期重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，和来自另一人乳头状瘤病毒病毒型纯化后人乳头状瘤病毒晚期重组蛋白；筛选步骤包括选择对纯化后人乳头状瘤病毒早期及晚期重组蛋白具正反应性之融合瘤细胞，且对非人乳头状瘤病毒蛋白不具反应，融合瘤细胞所产生之单克隆抗体对来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之早期和晚期病毒蛋白具有键结能力。纯化后人乳头状瘤病毒早期重组蛋白包括人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒18 E6、人乳头状瘤病毒18 E7蛋白，以及其重组蛋白；纯化后人乳头状瘤病毒晚期重组蛋白则包括人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 L1蛋白及其重组蛋白。产生的单克隆抗体包括可与所有人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白产生键结；另一种单克隆抗体可与人乳头状瘤病毒16E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 E6、人乳头状瘤病毒18 E7和人乳头状瘤病毒18 L1蛋白产生键结。这些由专利发明所产生的抗体可于多种免疫分析试验中侦测任何范围内之病毒蛋白。
专利发明之又一分项，生产仅对人乳头状瘤病毒第一型病毒具专一性键结的人乳头状瘤病毒病毒型特异性单克隆抗体，且不对第一型病毒的第二病毒蛋白有键结能力。此抗体藉由筛选来自人乳头状瘤病毒第一型病毒对纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白具阳性反应之产生抗体之融合瘤细胞，且对来自第二型病毒纯化后第二重组蛋白不具反应，第一和第二病毒蛋白则依第一和第二病毒型之纯化后重组蛋白而定。人乳头状瘤病毒病毒型特异性单克隆抗体仅对第一型病毒蛋白具有键结能力，这些蛋白来自同一人乳头状瘤病毒病毒型，如高危险型人乳头状瘤病毒、低危险型人乳头状瘤病毒、人乳头状瘤病毒16、人乳头状瘤病毒18、人乳头状瘤病毒31、人乳头状瘤病毒33、人乳头状瘤病毒35、人乳头状瘤病毒39、人乳头状瘤病毒45、人乳头状瘤病毒51、人乳头状瘤病毒52、人乳头状瘤病毒56、人乳头状瘤病毒58、人乳头状瘤病毒59、人乳头状瘤病毒68，和人乳头状瘤病毒6、人乳头状瘤病毒11、人乳头状瘤病毒42、人乳头状瘤病毒43、人乳头状瘤病毒44、人乳头状瘤病毒53、人乳头状瘤病毒54、人乳头状瘤病毒55、人乳头状瘤病毒56以及其结合。产生的单克隆抗体，仅能辨识选择自人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16E7、人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 E6、人乳头状瘤病毒18 E7和人乳头状瘤病毒18 L1蛋白中仅一种病毒蛋白，这类抗体的产生方法可在多种免疫分析试验中侦测特异性病毒蛋白的存在。
在一实施方案中，由表现人乳头状瘤病毒重组蛋白的细胞裂解后可溶解部分纯化出多种人乳头状瘤病毒重组蛋白，为可溶解之纯化后重组蛋白。举例来说，重组蛋白可在溶液中被纯化成自然摺叠型态，或以与重组蛋白等电点相近之缓冲液酸硷值、中性酸硷值或磷酸盐缓冲液缓冲液来纯化重组蛋白。举例来说，多种人乳头状瘤病毒重组蛋白可被纯化成自然摺叠型态，藉由以下方式：在中性酸硷值之为缓冲溶液或磷酸盐缓冲液溶液中透析，和利用厚缩期或旋转管柱家以厚缩等，藉以维持蛋白之溶解度和获得较高之厚度。另一人乳头状瘤病毒重组蛋白的纯化方法描述在合作待批之美国专利No.11/559,366，2006年11月13号，标题为″Detection Meth可見光譜for Human Papillomavirus(HPV)And Its Application In Cervical Cancer″，在此引用为相关文献。
制造单克隆抗体的人乳头状瘤病毒蛋白来源没有特殊限制，可来自各种不同人乳头状瘤病毒病毒型之病毒基因。专利中的人乳头状瘤病毒病毒蛋白或原至癌蛋白包括人乳头状瘤病毒E6、人乳头状瘤病毒E7、人乳头状瘤病毒L1、人乳头状瘤病毒E2、人乳头状瘤病毒E3、人乳头状瘤病毒E4、人乳头状瘤病毒E5和人乳头状瘤病毒L2蛋白，但不受限于这些蛋白。
人乳头状瘤病毒病毒型种类亦不受限制，人乳头状瘤病毒被分为以下三种类：(1)高风险型，包括α型人乳头状瘤病毒16、人乳头状瘤病毒18、人乳头状瘤病毒31、人乳头状瘤病毒33、人乳头状瘤病毒45、人乳头状瘤病毒35、人乳头状瘤病毒52和人乳头状瘤病毒58等，这些为子宫颈癌或其他癌症之原至癌基因；(2)低风险型，包括α型人乳头状瘤病毒6、人乳头状瘤病毒11、人乳头状瘤病毒13、人乳头状瘤病毒34、人乳头状瘤病毒44、人乳头状瘤病毒55、人乳头状瘤病毒73、人乳头状瘤病毒27、俾格米黑猩猩乳头状瘤病毒1型、人乳头状瘤病毒2a和人乳头状瘤病毒57等，这类病毒发展成为子宫颈癌和其他癌症之风险性较低；(3)其他非原至癌α型，包括人乳头状瘤病毒66、人乳头状瘤病毒68、人乳头状瘤病毒53、人乳头状瘤病毒51、人乳头状瘤病毒59、人乳头状瘤病毒30、人乳头状瘤病毒26、人乳头状瘤病毒10、人乳头状瘤病毒28、人乳头状瘤病毒32、人乳头状瘤病毒39、人乳头状瘤病毒3、人乳头状瘤病毒29和人乳头状瘤病毒70等。单一病人若感染多重人乳头状瘤病毒病毒，病毒可能源自这三种人乳头状瘤病毒病毒型。
人乳头状瘤病毒临床诊断尚无有效之抗体，存在两个问题，第一是因临床检体中的人乳头状瘤病毒蛋白含量稀少，第二是临床检体中的人乳头状瘤病毒病毒型是未知的。因此，技术上的困难，以及无法生产大量的人乳头状瘤病毒抗体来辨识各种临床人乳头状瘤病毒病毒型，此长期的需求问题应有所解决方法。要成功将抗体利用于诊断试验，抗体不仅必须能辨识免疫原上的抗原表位，也要能辨识分析试验中表现在样本上的抗决定位(即任何经超低温保存、切片和固定等前处理后的组织)。因此，筛选大量融合瘤细胞上清液的方法，着重于选择能有效诊断之抗体。人乳头状瘤病毒重组蛋白的纯化和获得已经历许多失败，由其中产生抗用以侦测人乳头状瘤病毒感染更是迫切仍待解决之问题。本专利发明生产纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白并筛选其产生抗体之融合瘤细胞，产生抗人乳头状瘤病毒抗体应用于临床检体。
本专利提供抗人乳头状瘤病毒蛋白之单克隆抗体生产方法以获得多种单克隆抗体，每种单克隆抗体可辨识各种不同人乳头状瘤病毒蛋白和病毒型的一般或特殊抗原表位。此外，某些获得的单克隆抗体具病毒型特异性，而某些为非病毒型特异性；非病毒型特异性的抗体有助于临床检体中人乳头状瘤病毒盛行病毒型之侦测，这些单克隆抗体可应用于多个临床检体上人乳头状瘤病毒感染之侦测方法。这些非人乳头状瘤病毒病毒型特异性抗体的抗原表位图谱可辨识并指出人乳头状瘤病毒特殊蛋白共同抗原表位之所在，使其得以和单克隆抗体结合。
在一实施方案中，藉由筛选多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，获得可辨识多种人乳头状瘤病毒病毒蛋白上共同抗原表位的单克隆抗体。多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白包括任何合适的人乳头状瘤病毒蛋白，如人乳头状瘤病毒16E6、人乳头状瘤病毒16E7、人乳头状瘤病毒16L1、人乳头状瘤病毒18E6和人乳头状瘤病毒18L1，及其组合蛋白。
在另一实施方案中，两种以上的人乳头状瘤病毒蛋白对应于两种以上之纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白。例如，当两种以上人乳头状瘤病毒蛋白为E6和E7早期蛋白，藉由筛选来自人乳头状瘤病毒16、人乳头状瘤病毒18或其他病毒型之两种以上E6和E7重组蛋白，可获得单克隆抗体可辨识E6及E7重组蛋白上的共同抗原表位。在另一实施方案中，两种以上的纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白是人乳头状瘤病毒早期重组蛋白，该单克隆抗体可依据两种以上的纯化后人乳头状瘤病毒早期结合，辨识人乳头状瘤病毒早期蛋白的共同抗原表位。
在一案例中，藉由筛选纯化后人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒16 E7重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，产生单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒16 E7上的共同抗原表位。另一发明中，藉由纯化后人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，产生可辨识人乳头状瘤病毒18 E6及人乳头状瘤病毒18 E7早期蛋白上之一般常见的抗原表位的单克隆抗体。
在另一实施案例中，两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白，包括纯化后的人乳头状瘤病毒早期重组蛋白和晚期重组蛋白，此单克隆抗体可依纯化后早期和晚期人乳头状瘤病毒重组蛋白，辨识早期和晚期病毒蛋白之共同抗原表位。纯化后早期人乳头状瘤病毒重组蛋白可来自任何人乳头状瘤病毒病毒型的蛋白，如人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白，以及其重组蛋白纯化后人乳头状瘤病毒晚期重组蛋白可以是任何人乳头状瘤病毒晚期蛋白，如人乳头状瘤病毒16 L1和人乳头状瘤病毒18 L1蛋白，以及其结合。单克隆抗体是藉由筛选人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白所获得，因此可辨识这些蛋白之一般常见的抗原表位。
在另一实施案例中，两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白，是来自至少两种不同人乳头状瘤病毒病毒型之两种以上人乳头状瘤病毒重组蛋白。例如，单克隆抗体藉由筛选人乳头状瘤病毒第一病毒型第一纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白，和第二病毒型第二纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得；人乳头状瘤病毒病毒可为任何病毒型，诸如高风险型、低风险型、人乳头状瘤病毒16、人乳头状瘤病毒18、人乳头状瘤病毒31、人乳头状瘤病毒33、人乳头状瘤病毒35、人乳头状瘤病毒39、人乳头状瘤病毒45、人乳头状瘤病毒51、人乳头状瘤病毒52、人乳头状瘤病毒56、人乳头状瘤病毒58、人乳头状瘤病毒59，和人乳头状瘤病毒68、人乳头状瘤病毒6、人乳头状瘤病毒11、人乳头状瘤病毒42、人乳头状瘤病毒43、人乳头状瘤病毒44、人乳头状瘤病毒53、人乳头状瘤病毒54、人乳头状瘤病毒55以及人乳头状瘤病毒56。第一和第二纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白可能为人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒16 L1人乳头状瘤病毒18 E6、人乳头状瘤病毒18 E7和人乳头状瘤病毒18 L1重组蛋白，以及及重组蛋白。
一案例中的单克隆抗体可辨识来自两种不同人乳头状瘤病毒病毒型之E6蛋白上的共同抗原表位，人乳头状瘤病毒16和人乳头状瘤病毒18藉由筛选纯化后人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞获得。另一案例获得可辨识人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒18 E蛋白之共同抗原表位的单克隆抗体。还有另一案例之单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E6、人乳头状瘤病毒16 E7、人乳头状瘤病毒16 L1、人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白之一般常见的抗原表位。
另一实施案例中，单克隆抗体可辨识仅一种人乳头状瘤病毒蛋白之特殊抗原表位，藉由筛选来自第一型人乳头状瘤病毒病毒第一纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白，与，和第二型人乳头状瘤病毒病毒第二次纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得，其中病毒蛋白与人乳头状瘤病毒第一及第二型病毒之第一和第二纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白相对应。
一案例发明中，单克隆抗体藉由筛选来自纯化后人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得，此单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E6蛋白之特殊抗原表位，不会辨识人乳头状瘤病毒18 E6蛋白。另一案例发明中，单克隆抗体藉由筛选纯化后人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得，此单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒18 E6蛋白之特殊抗原表位，而不会辨识人乳头状瘤病毒16 E6蛋白或与之反应。
另一发明案例中，单克隆抗体藉由筛选纯化后人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得，此单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E7之特殊抗原表位，不会辨识人乳头状瘤病毒18 E7蛋白。另一发明案例中，单克隆抗体藉由筛选纯化后人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞而获得，此单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒18 E7蛋白上之特殊抗原表位，不会辨识人乳头状瘤病毒16 E7蛋白或与之反应。
在另一实施案例中，生产各种抗人乳头状瘤病毒蛋白E6、E7或L1之单克隆抗体(抗人乳头状瘤病毒E6、抗人乳头状瘤病毒E7和抗人乳头状瘤病毒L1)，这些抗体根据其产生之免疫原对侦测人乳头状瘤病毒病毒型具有专一性，亦获得其他非人乳头状瘤病毒病毒型特异性之单克隆抗体。发明获得之抗体包括抗-E6、抗-E7和抗-L1抗体，但不仅限于这些抗体，可应用于各种免疫侦测方法。例如，单克隆抗体可用于侦测各种生物性检体、细胞株，或不同子宫颈癌之不同程度表皮细胞病灶(第二级子宫颈上皮内赘瘤、第三级子宫颈上皮内赘瘤、低度鳞状上皮内病变、高度鳞状上皮内病变和意义不明的不典型鳞状细胞)之临床检体、鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(ADC)。
在一实施案例中，提供一筛选人体感染人乳头状瘤病毒之方法，包括由临床人体中获得之检体，运用各种人乳头状瘤病毒重组蛋白和实验试产生之人乳头状瘤病毒蛋白特异性抗体进行多种免疫分析检测，藉由人体中人乳头状瘤病毒抗体和蛋白的存在与否，侦测和筛选出是否感染人乳头状瘤病毒。在另一实施案例中，利用人乳头状瘤病毒重组蛋白产生之抗体侦测人体中的人乳头状瘤病毒蛋白，包括但不仅限于各种抗人乳头状瘤病毒早期和晚期蛋白之多克隆及单克隆抗体。
此专利所发展之抗体为高质量且适度纯化之重组蛋白，携带人乳头状瘤病毒早期和晚期基因，适用于免疫分析，对人乳头状瘤病毒感染和子宫颈癌之侦测具高度敏感性和专一性。此单克隆抗体可应用于多种免疫分析方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、人乳头状瘤病毒蛋白抗原分析、人乳头状瘤病毒免疫复合体分析、蛋白芯片分析、放射免疫沈殿分析、细胞膜快速免疫层析、快速棒状免疫层析、组织及子宫颈细胞之免疫化学和流式细胞仪之免疫细胞学分析等。在一实施案例中，一种或多种以上的免疫分析方法可为非侵入式的，或不需额外的仪器辅助。
基本免疫分析技术可参考″抗体：实验室手册″Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.1989；″分子选殖″实验室手册Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，以及其他书籍手册。相关之免疫学试验分析，组织及子宫颈细胞之免疫化学和流式细胞仪之免疫细胞学分析，可参考美国专利申请中请中序号11/559,366，提交于2006年11月，标题为″人乳头状瘤病毒侦测方法及其在子宫颈癌上的应用″；序号12/082,740，提交于2008年5月14日，标题为″蛋白芯片应用于人乳头状瘤病毒侦测″；序号61/131,991，提交于2008年7月13日，标题为″人乳头状瘤病毒侦测之抗体和分析方法″；序号61/192,912，提交于2008年9月22日，标题为″新颖抗人乳头状瘤病毒蛋白单克隆抗体，适用于人乳头状瘤病毒相关子宫颈癌之早期和晚期侦测、筛选和诊断″；序号NE可見光譜/0005.01，与此专利同时提交，标题为″人乳头状瘤病毒感染之早期和晚期原位侦测″；序号NE可見光譜/0005.02，与此专利同时提交，标题为″人乳头状瘤病毒感染之早期和晚期原位侦测″；序号NE可見光譜/0005.03，与此专利同时提交，，标题为″人乳头状瘤病毒感染之早期和晚期原位侦测″。以上所有参考专利皆纳入本专利之参考应用。
在一实施案例中，本发明提供各式方法，包括侦测试验、试剂、单克隆及多克隆抗体、多胜肽类、重组蛋白和核酸，有助于侦测一般人乳头状瘤病毒感染，或各式人乳头状瘤病毒病毒型感染、高风险性极低风险性人乳头状瘤病毒病毒感染。此外，侦测人乳头状瘤病毒蛋白存在之检测方式或检体造型不受限制，适用于子宫颈组织、子宫颈细胞、子宫颈抹片、血清和体液等。适合的侦测及诊断方式有免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞仪、抗体偶合微粒、快速试验、蛋白芯片、点墨分析、slots，以及传统的酶联免疫吸附试验分析法。表现于表皮组织的人乳头状瘤病毒蛋白，藉由免疫组织化学染色且经病理分析证实后，可被发明的抗体所被侦测到。
本发明所描述之抗体提供侦测各式来源生物检体之人乳头状瘤病毒蛋白的侦测工具。例如，此抗体可做为包被在培养盘上之捕捉抗体，或用于酶联免疫吸附试验分析。根据人乳头状瘤病毒蛋白及病毒型之检测，抗体可选用本专利描述之特异性单克隆抗体，针对人乳头状瘤病毒蛋白或病毒型以及其重组蛋白进行辨识。选择之特异性单克隆抗体可与生物素、硷性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光物质等进行结合做为标记物，藉由色度、化学冷光或萤光基质读取结果。侦测性抗体亦可由本专利描述之多克隆抗体选择，与生物素、硷性磷酸酶、辣根过氧化物酶或萤光物质等进行结合，做为二级抗体。结合多克隆和单克隆抗体作为夹心酶联免疫吸附试验分析之捕捉及侦测抗体，藉由二级抗体之结合，增加侦测及键结之讯号，以增加侦测之敏感度。酶免疫分析法中，受试的细胞、检体或培养之细胞被收集和溶解以产生细胞溶解物作为分析物。定量细胞溶解物中的蛋白含量并包被于培养盘，使用相同量的蛋白包被于培养格中的每一检体，接着利用此专利描述之特异性抗体进行侦测。
人乳头状瘤病毒去氧核醣核酸、基因体、早期病毒蛋白、晚期病毒蛋白、原至癌蛋白，以及来自各式人乳头状瘤病毒基因型之核衣蛋白，可经各式体内或体外试验方法产生，侦测方法依据″抗体：实验室手册″，Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.1989；″分子选殖″实验室手册Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，以及其他书籍手册等，皆有助于一般临床人乳头状瘤病毒感染之筛选。
此外，免疫分析方法中人乳头状瘤病毒抗体或原致癌蛋白之侦测，适用于一般临床人乳头状瘤病毒感染之筛选，以及子宫颈癌之早期诊断，且可应用于单一快速试验或多重试验。
危险阶段之人乳头状瘤病毒蛋白和宿主蛋白之侦测，可以本发明之抗体利用相同或不同免疫分析方法进行侦测。本抗体亦可用于诊断子宫颈人乳头状瘤病毒相关性癌症、上皮细胞不正常引起之人乳头状瘤病毒感染、潜在性及恶性人乳头状瘤病毒相关表皮细胞病灶、危险发展中人乳头状瘤病毒相关性子宫颈癌和腺癌。本专利描述之方法可独立使用或做为多重试验之辅助工具，如传统细胞学子宫颈抹片检查或病理检验，可结合两者结果做为病人之后续管理。
该抗体的发明可应用于免疫学试验侦测由人乳头状瘤病毒感染所引起之患病阶段。疾病阶段可能为，早期人乳头状瘤病毒感染、晚期人乳头状瘤病毒感染、早期子宫颈细胞病灶、晚期子宫颈细胞病灶、低度鳞状上皮内病变、高度鳞状上皮内病变、意义不明的不典型鳞状细胞、第一级，第二级及第三级子宫颈上皮内赘瘤、发展中的子宫颈癌、腺癌或鳞状细胞癌。
范例.
范例一：人乳头状瘤病毒重组蛋白的表现、纯化和制备，作为免疫原以产生抗血清和抗人乳头状瘤病毒抗体，并筛选单克隆抗体之融合瘤细胞株。
人乳头状瘤病毒重组蛋白可为任何种类之蛋白，人乳头状瘤病毒蛋白之早期或晚期基因，诸如但不仅限于E2，E6，E7，L1，L2，且可来自任何病毒型。E6，E7或L1胜肽序列全段，因蛋白纯化时产生聚集、蛋白之不稳定性、低度表现、低度免疫原表现，使得获得和纯化困难。例如，许多早期E6原致癌蛋白包含许多半胱氨酸，因而正确的E6原致癌蛋白拓图需要许多适切的双硫键之形成。此外，某些免疫学试验使用早期E6和E7蛋白之小分子胜肽，其侦测特异性和敏感度极低，且不适合作为临床活体诊断之工具。因此，本专利发明提供之重组蛋白，重组人乳头状瘤病毒原致癌蛋白之部分序列或全段续列，形成重组杂交蛋白。
1).带有人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒18 E6基因的重组蛋白之克隆和产生。一来自人乳头状瘤病毒范例病毒型人乳头状瘤病毒16之E6早期原致癌范例基因被克隆，此克隆基因具有474个硷基对(b.p.)之脱氧核醣核酸片段，包含全部人乳头状瘤病毒16 E6基因之157种胺基酸编码区，经聚合酶链反应(PCR)获得并加以扩增。分离出的脱氧核醣核酸片段之脱氧核醣核酸序列经由与基因银行资料库的比对进行确认。重组蛋白人乳头状瘤病毒18 E6亦可被获得。所有选殖步骤依据″分子克隆″，实验室手册，Sambrook，Fritsch andManiatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.一书所描述之方法。此外，人乳头状瘤病毒18 E6基因亦被克隆及确认脱氧核醣核酸序列。
2).带有人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒18 E7基因的重组蛋白之克隆和产生。一来自人乳头状瘤病毒范例病毒型人乳头状瘤病毒16之早期原致癌范例基因E7被克隆，此克隆基因具有294个硷基对(b.p.)之脱氧核醣核酸片段，包含全部人乳头状瘤病毒16 E7基因之99种胺基酸编码区，经聚合酶链反应获得并加以扩增。分离出的脱氧核醣核酸片段之脱氧核醣核酸序列经由与基因银行资料库的比对进行确认。人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白亦被获得。此外，来自不同人乳头状瘤病毒病毒型的E7脱氧核醣核酸片段，可由不同临床检体或来源被克隆。
3).带有人乳头状瘤病毒16 L1和人乳头状瘤病毒18 L1基因的重组蛋白之克隆和产生。一来自人乳头状瘤病毒范例病毒型人乳头状瘤病毒16之早期范例基因被选殖，1596个硷基对(b.p.)之脱氧核醣核酸片段，包含全部人乳头状瘤病毒16 L1基因之531种胺基酸编码区，经聚合酶链反应获得并加以扩增。分离出的脱氧核醣核酸片段之脱氧核醣核酸序列经由与基因银行资料库的比对进行确认。此外，来自不同人乳头状瘤病毒病毒型的L1脱氧核醣核酸片段，可由不同临床检体或来源被克隆。
由His-标记表现系统获得人乳头状瘤病毒16 L1蛋白之N端重组片段。人乳头状瘤病毒16 L1 N端重组蛋白之分子量约为34KD。L1C端片段亦可被获得。人乳头状瘤病毒18 L1重组蛋白也能被获得，做为免疫原产生抗血清、多克隆抗体和单克隆抗体。
此专利描述之多种重组蛋白可表现于各种合适之系统中，诸如细菌、病毒、酵母菌和哺乳类表现系统，如大肠杆菌、酵母菌、杆状病毒和哺乳类之细胞培养等。虽多胜肽可由其他方式获得，专利提供之实施案例中，多种重组蛋白大部分(或几乎)为其原始型式，此构型在免疫分析试验中，更有可能与来自人乳头状瘤病毒感染人体组织之抗体产生键结。例如，GST，MBP或His标志-人乳头状瘤病毒16-E6，人乳头状瘤病毒18 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒18 E7，人乳头状瘤病毒16 L1，和人乳头状瘤病毒18L1重组蛋白，利用IPTG驱动诱导，在E.coli BL21(DE3)中被表现。诱导蛋白表现后，标志-人乳头状瘤病毒重组蛋白经由培养细胞裂解后溶解部分被获得，并纯化至厚度约为0.1到1mg/ml或更高。人乳头状瘤病毒重组蛋白之纯度，经PAGE分析，预估大于90％。人乳头状瘤病毒重组蛋白可用以侦测临床检体中人乳头状瘤病毒抗体之存在与否，也可做为免疫原制造多克隆抗血清和单克隆抗体。
此专利描述之各式表现载体的细胞培养包含多种人乳头状瘤病毒重组蛋白，放大至1升，10升或100升甚至更高，以获得大量可溶的重组蛋白进行纯化。细胞裂解后可溶解部分，通过各式层析管柱，在适当的表现系统中与人乳头状瘤病毒重组蛋白之标记位置键结；标志-人乳头状瘤病毒重组蛋白在由管柱中被冲提出来，厚缩至100毫升，10毫升或1毫升。纯化后的水溶性人乳头状瘤病毒重组蛋白进一步以中性酸硷值缓冲液或磷酸盐缓冲液缓冲液厚缩和透析，作为抗原产生抗人乳头状瘤病毒蛋白之血清。由溶解部份纯化出的水溶性人乳头状瘤病毒重组蛋白，其结构与在活体状态下原始天然构象相似。
生产各种不同造型之单克隆抗体，获得高质量的纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白是很重要的，抗体能辨识一般或特殊的抗原表位，用以侦测人乳头状瘤病毒感染。纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白，经由测试确认与来自临床人乳头状瘤病毒感染检体之人乳头状瘤病毒抗体的键结能力。该纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白可作为抗原产生抗人乳头状瘤病毒蛋白之血清和抗体，辨识在活体状态下原始天然构象中之人乳头状瘤病毒蛋白。
范例二：生产抗人乳头状瘤病毒多克隆抗体
纯化大肠杆菌(E coli)中表达之人乳头状瘤病毒E6，E7或L1重组蛋白，以磷酸盐缓冲液厚缩透析后作为免疫原。免疫反应按照标准程序进行，以酶联免疫吸附试验分析每一获得之血清，接着程序性增加及出血。收集滴定度最佳之血液，产生之血清经由蛋白A管柱或亲合性管柱进行免疫球蛋白(Ig)之纯化；纯化后之免疫球蛋白G作为人乳头状瘤病毒免疫针测分析之抗人乳头状瘤病毒抗体。
此专利发明描述的单克隆抗体、多克隆抗体和血清之获得、纯化和试验，无论致病原因、细胞病灶、发炎反应或癌症之发展情况，可用以侦测人乳头状瘤病毒感染。其他研究者尝试发展抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体却未得成果，因未能得到足够之人乳头状瘤病毒蛋白来产生单克隆抗体；无法产生高度专一性之单克隆抗体，因抗原不具免疫抗原性；或产生之抗体无法辨识临床检体早期人乳头状瘤病毒感染之人乳头状瘤病毒原始天然构象中之人乳头状瘤病毒蛋白。一些突变胜肽产生之抗突变胜肽之抗体，仅能辨识晚期子宫颈癌，但不确定其抗体辨识原始天然构象中之人乳头状瘤病毒蛋白或任何早期人乳头状瘤病毒感染。此外，晚期人乳头状瘤病毒之侦测对疾病介入和治疗已太迟。
此专利发明所描述之临床抗体应用，可藉适当之临床检体经人乳头状瘤病毒免疫侦测分析被证实，如酶联免疫吸附试验试验、免疫细胞化学试验、免疫组织化学试验。本发明之新型单克隆抗体和抗血清获得方法，可与具有早期细胞病灶，如子宫颈上皮内赘瘤和晚期人乳头状瘤病毒相关之子宫颈癌，之临床检体的人乳头状瘤病毒病毒蛋白反应并产生键结。此单克隆抗体和抗血清，为人乳头状瘤病毒相关致病原和早期晚期子宫颈癌发展之侦测和筛选，提供了强而有利的侦测工具，因此提供疾病发展之介入和早期治疗之渠道。
范例三：发展抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体
纯化大肠杆菌(E coli)中表达之人乳头状瘤病毒E6，E7或L1重组蛋白，以磷酸盐缓冲液厚缩和透析后作为抗原。小鼠之免疫反应测试按照标准程序进行，以酶联免疫吸附试验分析滴定每一获得之血清，接着程序性增加及出血。当小鼠之血清达最佳化时，以标准步骤融合小鼠之脾细胞和肿瘤细胞。克隆融合细胞，如融合瘤细胞，并进一步进行培养。
1).融合瘤细胞筛选：为获得本专利所描述之对各种人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性键结能力之人乳头状瘤病毒产生抗体之融合瘤细胞，藉由筛选各种原始抗原和其他人乳头状瘤病毒蛋白作为正向筛选，非相关性的蛋白则作为负向筛选，以进行融合瘤细胞克隆。例如，用两种以上人乳头状瘤病毒重组蛋白筛选每一融合瘤细胞之克隆，并用以测试和了解所获得的每一产生抗体之融合瘤细胞株之专一性。
融合瘤细胞筛选之一范例，藉由两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白筛选之产生抗体之融合瘤细胞，此单克隆抗体能与两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白进行反应。两种以上之纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白，诸如但不仅限于人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒16 L1，人乳头状瘤病毒18 E6，人乳头状瘤病毒18 E7，人乳头状瘤病毒18 L1蛋白，和其他来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之人乳头状瘤病毒早期及晚期蛋白。
筛选对两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白具阳性反应之产生抗体之融合瘤细胞，且对非人乳头状瘤病毒蛋白，如BSA、组织胺6标志、股胱甘肽-S-转移脢(GST)、麦芽糖-结合蛋白(MBP)或其他结合蛋白之标志及蛋白，具阴性反应。由此融合瘤细胞克隆产生之单克隆抗体可与两种以上之人乳头状瘤病毒病毒蛋白(如临床检体中之人乳头状瘤病毒病毒蛋白)产生键结，且与两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白相关。
两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白为人乳头状瘤病毒早期蛋白，该单克隆抗体可与两种以上人乳头状瘤病毒早期蛋白进行反应。例如，筛选获得之融合瘤细胞株可产生一单克隆抗体，该抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒16 E7蛋白上之共同抗原表位；另一筛选获得之融合瘤细胞株则可产生能辨识人乳头状瘤病毒18 E6和人乳头状瘤病毒18 E7上共同抗原表位之单克隆抗体。
另一例子中，两种以上纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白包括一种人乳头状瘤病毒早期重组蛋白和一种人乳头状瘤病毒晚期重组蛋白，所产生之单克隆抗体可与纯化后之人乳头状瘤病毒早期和晚期之重组蛋白上之共同抗原表位进行反应。纯化后之人乳头状瘤病毒早期重组蛋白，可为人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒18 E6，人乳头状瘤病毒18 E7蛋白，和其他人乳头状瘤病毒早期重组蛋白；纯化后之人乳头状瘤病毒晚期重组蛋白，可为人乳头状瘤病毒16 L1，人乳头状瘤病毒18 L1蛋白，和其他人乳头状瘤病毒晚期重组蛋白。例如，筛选获得之融合瘤细胞株可产生单克隆抗体，该抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒18 E6蛋白上之共同抗原表位；或单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白上之共同抗原表位；或单克隆抗体可辨识人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒16 L1，人乳头状瘤病毒18 E6，和人乳头状瘤病毒18 E7蛋白上之共同抗原表位，更多的范例在此专利发明中被描述。
藉由筛选来自人乳头状瘤病毒第一型病毒之第一纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，以及来自人乳头状瘤病毒第二型病毒之第二纯化人乳头状瘤病毒重组蛋白之产生抗体之融合瘤细胞，产生之单克隆抗体可与来自两种以上不同人乳头状瘤病毒病毒型之人乳头状瘤病毒蛋白上的共同抗原表位进行反应。人乳头状瘤病毒第一和第二病毒型，可为人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，和其他人乳头状瘤病毒病毒型。两种以上的不同人乳头状瘤病毒病毒型，可为高风险性人乳头状瘤病毒型、低风险性人乳头状瘤病毒型，人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，人乳头状瘤病毒31，人乳头状瘤病毒33，人乳头状瘤病毒35，人乳头状瘤病毒39，人乳头状瘤病毒45，人乳头状瘤病毒51，人乳头状瘤病毒52，人乳头状瘤病毒56，人乳头状瘤病毒58，人乳头状瘤病毒59和人乳头状瘤病毒68，人乳头状瘤病毒6，人乳头状瘤病毒11，人乳头状瘤病毒42，人乳头状瘤病毒43，人乳头状瘤病毒44，人乳头状瘤病毒53，人乳头状瘤病毒54，人乳头状瘤病毒55，及人乳头状瘤病毒56。例如，第一和第二纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白，可以是人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒16 L1，人乳头状瘤病毒18 E6，人乳头状瘤病毒18 E7以及人乳头状瘤病毒18 L1重组蛋白。
另一融合瘤细胞筛选范例中，筛选对多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白具阳性反应，且对多种人乳头状瘤病毒重组蛋白或非人乳头状瘤病毒蛋白具阴性反应之产生抗体之融合瘤细胞。该融合瘤细胞所产生之单克隆抗体可与某些人乳头状瘤病毒病毒蛋白产生键结，且不与其他人乳头状瘤病毒病毒蛋白反应。
例如，筛选来自人乳头状瘤病毒第一病毒型之第一纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白胜体产生性融合瘤细胞，以及来自人乳头状瘤病毒第二病毒型之第二纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白胜体产生性融合瘤细胞，所获得之单克隆抗体仅对第一和第二纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白上其中一种抗原表位具有专一性，不能辨识其他纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白。特异性单克隆抗体的获得，包括仅对人乳头状瘤病毒16 E6蛋白具专一性之单克隆抗体、仅对人乳头状瘤病毒16 E7蛋白具专一性之单克隆抗体、仅对人乳头状瘤病毒16 L1蛋白具专一性之单克隆抗体、仅对人乳头状瘤病毒18 E6蛋白具专一性之单克隆抗体，以及仅对人乳头状瘤病毒18 E7蛋白具专一性之单克隆抗体。
2).融合瘤细胞株库：以免疫分析方法(如酶联免疫吸附试验，酶免疫分析方法和其他试验)克隆所希望之阳性反应及阴性反应之融合瘤细胞，并克隆至单一细胞。每一单一细胞经细胞培养而生长，当细胞数达每毫升含一百万个细胞时，将细胞冷冻保纯在-80℃或液态氮中，作为细胞库之存贮。
3).腹水之产生：每一融合瘤细胞株在组织培养中生长，并注射至小鼠体中以产生腹水。产生并收集之腹水做为以G蛋白管柱纯化之免疫球蛋白，每一融合瘤细胞株纯化出之免疫球蛋白是同型的，可应用于人乳头状瘤病毒免疫分析。
范例四：抗人乳头状瘤病毒抗体之专一性
多种免疫分析方法可用来测试藉由筛选多种人乳头状瘤病毒重组蛋白之融合瘤细胞株所产生之单克隆抗体的专一性，酶免疫试验或免疫印迹分析法都可用来作为本描述中人乳头状瘤病毒抗体专一性检测之试验。多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白含有原始的筛选蛋白，可获得抗人乳头状瘤病毒抗体；而其他非筛选之蛋白，可用来包被在微孔盘上，在酶免疫分析方法试验中作为获得的抗人乳头状瘤病毒抗体专一性之测试。来自子宫颈癌细胞株(有人乳头状瘤病毒感染或未感染)之细胞裂解物中的蛋白，也能藉由免疫印迹分析法用来作为抗人乳头状瘤病毒抗体专一性之测试。为确认来自人乳头状瘤病毒感染细胞株的人乳头状瘤病毒抗体之键结力与专一性，免疫印迹分析法是非常有效之方式，可藉由人乳头状瘤病毒感染细胞株所表现之蛋白，显示出特异性蛋白纹。这些免疫印迹分析法显示之蛋白纹，可藉由SDS-PAGE胶体电泳之预期分子量位置与人乳头状瘤病毒重组蛋白做比较。来自子宫颈癌细胞株之细胞裂解物，包括Hela细胞株(人乳头状瘤病毒18正反应)、SiHa细胞株(人乳头状瘤病毒18正反应)和C33A细胞株(无人乳头状瘤病毒感染)，藉由免疫印迹分析法，利用本专利发明之抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体，可用来侦测人乳头状瘤病毒E6，E7或L1蛋白。
各式的重组蛋白以其原始构形包被在微孔盘的底部，以进行酶免疫分析方法试验，测试本发明方法所产生之每一抗体的专一性。所获得的单克隆抗体可与来自相同人乳头状瘤病毒病毒型之两种以上人乳头状瘤病毒病毒蛋白产生键结，图1A和图1B显示两种不同的融合瘤细胞株，每种细胞株可产生单克隆抗体，辨识人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒16E7之共同抗原表位。图1A和图1B中，仅人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒16E7结合蛋白在酶免疫分析方法试验中呈阳性反应；人乳头状瘤病毒18 E6，人乳头状瘤病毒18 E7，人乳头状瘤病毒16 L1-N-端，人乳头状瘤病毒16 L1，和and 6x-组织胺蛋白则呈阴性反应或没有反应。这些结果表示该单克隆抗体对人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒16E7具专一性键结，对人乳头状瘤病毒16L1，人乳头状瘤病毒18 E6或人乳头状瘤病毒18 E7则不具键结能力。
所获得之单克隆抗体，可与来自相同人乳头状瘤病毒病毒型之人乳头状瘤病毒早期和晚期病毒蛋白产生键结。图2A说明单克隆抗体之专一性，在酶免疫分析方法试验中可与所有人乳头状瘤病毒E6，人乳头状瘤病毒E7及人乳头状瘤病毒L1蛋白产生键结，对人乳头状瘤病毒18 E6，人乳头状瘤病毒18 E7，及6x-组织胺但白呈阴性反应。这些结果表示该单克隆抗体对人乳头状瘤病毒16 E6及L1蛋白原始构型具有很强的反应，对人乳头状瘤病毒16 E7蛋白原始构型反应性较弱，且对人乳头状瘤病毒18 E6或人乳头状瘤病毒18 E7蛋白原始构型则不具反应性。研究结果显示该单克隆抗体包含有人乳头状瘤病毒16特异性之共同抗原表位，可辨识所有人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7以及人乳头状瘤病毒16 L1蛋白之原始构型。
图2B说明免疫印迹分析法分析结果，单克隆抗体可与人乳头状瘤病毒E6，人乳头状瘤病毒E7及人乳头状瘤病毒L1重组蛋白产生反应。本专利方法描述之抗体，可由免疫印迹分析法侦测到人乳头状瘤病毒E6(约18-20kDa)和人乳头状瘤病毒L1(约55kDa)重组蛋白。每一重组蛋白之蛋白纹表现出其预期分子量，显示本专利描述之抗体与变性的人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒18 E6蛋白具有很强之反应性，对人乳头状瘤病毒L1蛋白反应性弱，且对人乳头状瘤病毒16 E7及人乳头状瘤病毒18 E7蛋白不具反应性。比较图2A和图2B，结果显示此抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体含有人乳头状瘤病毒共同抗原表位，可藉由人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7和人乳头状瘤病毒16 L1蛋白原始构型被辨识，亦可辨识人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白之变性构型。
图2C说明来自各式子宫颈癌细胞株之细胞裂解物的免疫印迹分析法结果，与图2B所使用之单克隆抗体相同。比较每一细胞株之子宫颈癌细胞裂解物和变性构型之重组蛋白。该单克隆抗体对人乳头状瘤病毒E6，人乳头状瘤病毒E7及人乳头状瘤病毒L1蛋白具有专一性，且可辨识人乳头状瘤病毒感染之癌细胞株所表现的人乳头状瘤病毒病毒蛋白，但不会辨识没有人乳头状瘤病毒感染的细胞株。单克隆抗体在标准分子量标记物17kDa位置所显示的双纹，表示侦测到来自HeLa(人乳头状瘤病毒18型感染)及SiHa(人乳头状瘤病毒16型感染)细胞株中的子宫颈癌细胞株人乳头状瘤病毒E6蛋白(约18kDa)及人乳头状瘤病毒E7蛋白(约15kDa)，而非C33A(非人乳头状瘤病毒感染型)细胞株。重组蛋白栏中所显示的蛋白纹表现其预期分子量，显示单克隆抗体与变性的人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白具强反应性，与变性之人乳头状瘤病毒L1重组蛋白反应性弱，且对人乳头状瘤病毒16 E7或人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白不具键结能力。
获得之单克隆抗体可与来自不同人乳头状瘤病毒病毒型的人乳头状瘤病毒早期和晚期病毒蛋白产生键结。图3A说明，酶免疫分析方法试验结果显示，单克隆抗体对来自人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18病毒型的E6，E7及L1重组蛋白具特异性键结能力。这些结果说明该单克隆抗体对所有的人乳头状瘤病毒16 E6，E7及L1蛋白具专一性反应，不与组织胺-标记胜肽(甚或将重组蛋白融合至6x-组织胺加以表现和纯化)产生反应。这些结果显示该抗体辨识不同人乳头状瘤病毒病毒型人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18所共有的共同抗原表位，证据来自其与所有人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒16 L1，人乳头状瘤病毒18 E6，及人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白之键结能力。
图3B说明图3A所使用之单克隆抗体的免疫印迹分析法结果。该单克隆抗体对人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18蛋白的E6，E7及L1重组蛋白具阳性反应，表示抗体可辨识E6(约18kDa)，E7(约15kDa)及L1(约55kDa)蛋白。西方点墨分析法中，每一重组蛋白栏所表现的蛋白纹说明预期分子量位置，且说明该单克隆抗体与来自人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18之E6和E7蛋白具强反应性，对L1变性蛋白反应性弱。图3A和图3B的结果说明该单克隆抗体辨识人乳头状瘤病毒共同抗原表位，且能与人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒16 E7，人乳头状瘤病毒16 L1，人乳头状瘤病毒18 E7及人乳头状瘤病毒18 E6蛋白之原始和变性构型产生反应。
图3C说明免疫印迹分析法之结果，利用来自不同子宫颈癌细胞株的细胞裂解物，与图3A和图3B中所使用的单克隆抗体进行反应，细胞裂解物和变性构型之重组蛋白在此被测试。单克隆抗体侦测到的蛋白双纹，约为分子量标准标记物17kDa，表示侦测到来自HeLa(人乳头状瘤病毒18)及SiHa(人乳头状瘤病毒16)细胞中的子宫颈癌细胞株里的人乳头状瘤病毒E6蛋白(约18kDa)和人乳头状瘤病毒E7蛋白(约15kDa)，而非C33A(非人乳头状瘤病毒感染型)细胞株。重组蛋白栏上产生的蛋白纹分子量说明，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 E6，人乳头状瘤病毒18 E6及人乳头状瘤病毒18 E7重组变性蛋白具强反应性，与人乳头状瘤病毒L1重组变性蛋白反应性弱，且在免疫印迹分析法中，未侦侧到对人乳头状瘤病毒16 E7重组蛋白之键结能力。
获得之单克隆抗体可与来自不同人乳头状瘤病毒病毒型之两种以上人乳头状瘤病毒病毒蛋白产生键结；例如，单克隆抗体可与获得的人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18之E6重组蛋白产生反应。图4A说明单克隆抗体在酶免疫分析方法试验中之专一性，可辨识人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白之共同抗原表位并与之产生反应，重组蛋白呈原始构型被包被在微孔盘的底部。这些结果显示单克隆抗体对人乳头状瘤病毒16 E6及人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白原始构型具有强反应性，对人乳头状瘤病毒E7及人乳头状瘤病毒L1重组蛋白原始构型则不具反应性，表示该单克隆抗体可辨识任何人乳头状瘤病毒病毒型之人乳头状瘤病毒E6共同抗原表位。
图4B说明免疫印迹分析法结果，利用来自各种子宫颈癌细胞株的细胞裂解物，与图4A所使用的单克隆抗体进行反应，该抗体对人乳头状瘤病毒感染癌细胞株所表现的人乳头状瘤病毒16及人乳头状瘤病毒18 E6病毒蛋白具有专一性键结能力。单克隆抗体侦测到的蛋白单纹，约为分子量标准标记物17kDa，表示侦测到HeLa(人乳头状瘤病毒18)子宫颈癌细胞株里的人乳头状瘤病毒E6蛋白(约18kDa)，而非C33A(非人乳头状瘤病毒感染型)细胞株。重组蛋白栏上产生的蛋白纹分子量说明，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒18E6重组变性蛋白具强反应性。
另一种单克隆抗体，可与来自不同人乳头状瘤病毒之多种病毒蛋白产生键结，是一种对人乳头状瘤病毒16 E7及人乳头状瘤病毒18 E7蛋白具专一性键结之单克隆抗体。图5说明该单克隆抗体在酶免疫分析方法试验分析中的专一性，结果显示该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 E7及人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白原始构型具有强反应性，但对人乳头状瘤病毒E6及人乳头状瘤病毒L1重组蛋白不具反应性，表示该抗体仅能辨识任何人乳头状瘤病毒病毒型上E7蛋白的抗原表位。
获得之单克隆抗体仅能与第一人乳头状瘤病毒病毒蛋白键结，但不与来自第一人乳头状瘤病毒病毒型的第二病毒蛋白产生键结。图6说明单克隆抗体之专一性，在酶免疫分析方法试验中，与人乳头状瘤病毒16 E6重组蛋白产生反应，但不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应。该单克隆抗体包含特殊之抗原表位，仅能人乳头状瘤病毒16 E6反应，而不与人乳头状瘤病毒18 E6或其他重组蛋白产生连结反应。这些结果显示该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 E6重组蛋白原始构型具有强反应性，但对人乳头状瘤病毒E7或L1重组蛋白原始构型不具反应性；同时，也表示该抗体仅能辨识人乳头状瘤病毒16 E6特异性抗原表位，与人乳头状瘤病毒16 E6蛋白产生反应。
另一范例中，图7说明单克隆抗体之专一性，在酶免疫分析方法试验中，与人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白产生反应，但不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应。该单克隆抗体仅对人乳头状瘤病毒18 E6具有专一性，而不与人乳头状瘤病毒16 E6或其他重组蛋白产生连结反应，表示该抗体仅能辨识人乳头状瘤病毒18 E6特异性抗原表位，与人乳头状瘤病毒18 E6蛋白产生反应。
图7B说明免疫印迹分析法结果，利用来自各种子宫颈癌细胞株的细胞裂解物，与图7A所使用的单克隆抗体进行反应。单克隆抗体侦测到的蛋白单纹，约为分子量标准标记物17kDa，表示侦测到HeLa(人乳头状瘤病毒18)子宫颈癌细胞株里的人乳头状瘤病毒E6蛋白(约18kDa)，而非C33A(非人乳头状瘤病毒感染型)细胞株。重组蛋白栏上产生的蛋白纹分子量说明，该单克隆抗体也能与人乳头状瘤病毒18 E6重组变性蛋白具强反应性。
另一范例中，图8说明酶免疫分析方法试验中单克隆抗体之专一性，仅与人乳头状瘤病毒16 E7重组蛋白反应，而不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白产生反应；人乳头状瘤病毒18 E7或其他人乳头状瘤病毒重组蛋白不具连结反应性。这些结果显示该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 E7重组蛋白原始构型具有强反应性，但对人乳头状瘤病毒E6或L1重组蛋白原始构型未侦测到键结反应，表示该抗体仅能与人乳头状瘤病毒16 E7蛋白产生反应，辨识人乳头状瘤病毒16 E7特异性抗原表位。
另一范例说明单克隆抗体仅对人乳头状瘤病毒第一型病毒蛋白之专一性键结，对来自不同人乳头状瘤病毒第一型病毒蛋白之第二人乳头状瘤病毒病毒蛋白则不具键结力。图9说明单克隆抗体之专一性，在酶免疫分析方法试验中，与人乳头状瘤病毒18E7重组蛋白产生反应，而不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应。这些结果显示该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白原始构型具有强反应性，但对人乳头状瘤病毒E6或L1重组蛋白原始构型不具反应性，表示该抗体仅能与人乳头状瘤病毒18 E7蛋白产生反应，辨识人乳头状瘤病毒18 E7特异性抗原表位。
另一范例中，图10A和图10B说明两种选殖的单克隆抗体之专一性，在酶免疫分析方法试验中，仅与人乳头状瘤病毒16 L1-N端重组蛋白反应，而不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应；在酶免疫分析方法试验中，抗体与人乳头状瘤病毒16 L1或其他重组蛋白无连结反应。这些结果显示该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 L1-N端重组蛋白原始构型具有强反应性，但对人乳头状瘤病毒E6或人乳头状瘤病毒E7重组蛋白原始构型不具反应性，表示此单克隆抗体仅能与人乳头状瘤病毒16 L1 N端蛋白反应，辨识其人乳头状瘤病毒16 L1 N端蛋白特异性之抗原表位。
另一范例中，图11说明单克隆抗体之特异性，在酶免疫分析方法试验中，可与人乳头状瘤病毒16 L1重组蛋白及人乳头状瘤病毒16L1-N端蛋白反应，但不与其他人乳头状瘤病毒重组蛋白反应。该单克隆抗体辨识人乳头状瘤病毒16 L1及人乳头状瘤病毒16 L1 N端蛋白之特殊抗原表位，且未发现对其他人乳头状瘤病毒早期蛋白之反应性。这些结果显示，此描述之单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16 L1及人乳头状瘤病毒16 L1-N端重组蛋白具有强反应性，但对来自人乳头状瘤病毒16或18之E6或E7重组蛋白不具反应性，表示此抗体能与人乳头状瘤病毒16 L1和人乳头状瘤病毒16 L1 N端蛋白反应，辨识其人乳头状瘤病毒16 L1 N端蛋白特异性之抗原表位。
本专利发明所描述之单克隆抗体可应用于各种免疫分析方法中。夹心酶联免疫吸附试验试验就是其中一种免疫分析方法，首先，将一次抗人乳头状瘤病毒抗体包被于微孔盘；再将含有人乳头状瘤病毒病毒蛋白或待测之重组蛋白的测试样本加入微孔盘的每一孔洞中，与一次抗人乳头状瘤病毒抗体反应，捕捉微孔盘底部表面之人乳头状瘤病毒蛋白；最后，加入与第二种抗人乳头状瘤病毒抗体结合之辣根过氧化酶或其他侦测试剂。抗体-蛋白复合物常以所加入侦测试剂之呈色液进行侦测，如辣根过氧化物酶的四甲基联苯铵(TMB)呈色液，藉由仪器(如酶免疫微盘分析仪)用来显示伴随侦测试剂的抗体-蛋白复合物标记之表现(呈现抗人乳头状瘤病毒抗体与人乳头状瘤病毒蛋白之键结能力)。夹心酶联免疫吸附试验试验以一次和二次抗人乳头状瘤病毒抗体，产生人乳头状瘤病毒蛋白之专一性键结，确认并证实此两种抗人乳头状瘤病毒抗体之专一性。本专利发明描述之各种抗体可作为包被抗体和侦测抗体，用以侦测抗体之专一性。
表一：夹心酶联免疫吸附试验试验侦测人乳头状瘤病毒E6蛋白
作为一个范例，表一说明酶连结免疫吸附分析(酶联免疫吸附试验)之实验设计与结果，用以侦测人乳头状瘤病毒18 E6蛋白之存在(一抗原测试)。结果显示，当包被及侦测抗体能与人乳头状瘤病毒18 E6产生反应时，人乳头状瘤病毒18 E6蛋白可在分析方法中被侦测到；虽包被抗体能与人乳头状瘤病毒16 E6产生键结，但无法侦测到人乳头状瘤病毒16 E6重组蛋白，侦测抗体仅对人乳头状瘤病毒18 E6具反应专一性。使用抗人乳头状瘤病毒18 E6专一性蛋白做包被，侦测抗体与人乳头状瘤病毒16 E6和人乳头状瘤病毒18 E6键结，也能获得相似之结果。研究结果显示抗体之专一性，在夹心酶连结免疫吸附分析中，以人乳头状瘤病毒18 E6重组蛋白作为测试蛋白，可辨识人乳头状瘤病毒18 E6，且不会与作为抗原之人乳头状瘤病毒16 E6重组蛋白进行反应。在此描述之分析方式可用来侦测生物性检体中人乳头状瘤病毒18 E6蛋白的存在，包括但不仅限于来自子宫颈癌细胞株的细胞裂解物、子宫颈抹片、组织、体液和血清等。此专一性之夹心吸附试验提供了人乳头状瘤病毒18之专一性分析，且排除在分析方法中侦测到人乳头状瘤病毒16 E6之键结。
另一范例说明本发明中的抗体可用来侦测人乳头状瘤病毒E7蛋白，表2说明酶联免疫吸附试验分析之结果，使用一单克隆抗体抗人乳头状瘤病毒18 E7(辨识人乳头状瘤病毒18E7)作为包被及侦测抗体，以侦测人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白之存在。研究结果显示抗体之专一性，以人乳头状瘤病毒18 E7重组蛋白作为抗原辨识人乳头状瘤病毒18 E7，但以人乳头状瘤病毒16 E7作为抗原时，则不具反应性。所描述之夹心分析方法可用来生物性检体中人乳头状瘤病毒E7蛋白的存在，包含但不仅限于于来自子宫颈癌细胞株的细胞裂解物、子宫颈抹片、组织、体液和血清等。本分析方法提供人乳头状瘤病毒18之E7特异性检测，适用于人乳头状瘤病毒感染之筛选，以及侦测人乳头状瘤病毒E7原致癌蛋白。
表二：夹心酶联免疫吸附试验试验侦测人乳头状瘤病毒E6蛋白
范例五：抗人乳头状瘤病毒抗体之应用
本专利发明描述之人乳头状瘤病毒抗体可应用于各式免疫分析试验，侦测一般人乳头状瘤病毒感染及各种人乳头状瘤病毒特异基因型之感染，高风险性人乳头状瘤病毒和低风险性人乳头状瘤病毒。用来侦测人乳头状瘤病毒蛋白表现的样本，可以是但不仅限于子宫颈组织、细胞、抹片、血清、体意等。有效筛选或诊断子宫颈癌或人乳头状瘤病毒感染的免疫分析方法，包括免疫组织化学试验、免疫细胞化学试验、流式细胞仪分析、抗体偶合微粒、快速试验、蛋白芯片、点墨分析、slots，以及传统的酶联免疫吸附试验分析法。在筛选试验中，人乳头状瘤病毒抗体可原位侦测一般大众子宫颈抹片表皮细胞中的人乳头状瘤病毒蛋白，作为病理医师免疫组织化学染色和分级之依据。在确认试验中，人乳头状瘤病毒抗体也可用来原位侦测上皮组织中的人乳头状瘤病毒蛋白，作为病理医师免疫组织化学染色和分级之依据。
1).纯化后之人乳头状瘤病毒蛋白和生物检体中之抗人乳头状瘤病毒抗体之反应性。为了确认生物检体中伴随含有人乳头状瘤病毒之细胞裂解物或伴随人乳头状瘤病毒蛋白的人乳头状瘤病毒抗体和纯化后之人乳头状瘤病毒结合蛋白产生键结能力，可以酶联免疫吸附试验或直接酶免疫分析方法进行测试。生物检体包括但不仅限于细胞培养之细胞株，或来自临床的检体。
表三：子宫颈癌细胞株E6，E7，及L1蛋白之酶免疫分析方法侦测
一范例如表3所示，单克隆抗体对人乳头状瘤病毒E6，人乳头状瘤病毒E7或人乳头状瘤病毒L1蛋白具有专一性，在直接酶免疫分析方法试验方法中，以HEC-1A作为负控制组，抗体对来自各式子宫颈癌细胞株的细胞裂解物具有专一性反应。来自子宫颈癌细胞株的细胞裂解物包括Caski，Siha，Cxca，Hela和子宫内膜癌细胞株HEC-1A(非人乳头状瘤病毒感染)，被用来证实单克隆抗体对人乳头状瘤病毒E6，人乳头状瘤病毒E7和人乳头状瘤病毒L1具有专一性，可侦测到人乳头状瘤病毒E6，E7或L1蛋白。
本专利所描述和试验的培养细胞株，包括但不仅限于子宫颈癌细胞株Caski(人乳头状瘤病毒16阳性)，Siha(人乳头状瘤病毒16阳性)，Cxca，Hela(人乳头状瘤病毒18阳性)和子宫内膜癌细胞株HEC-1A(非人乳头状瘤病毒感染)。进行直接酶免疫分析方法试验，收集细胞加以离心、纯化和裂解，产生细胞溶解物作为分析物。定量细胞溶解物中的蛋白含量，包被于微孔盘，相同含量的蛋白亦包被在每一孔洞的样本上；密闭微孔盘，利用稍后提到与抗老鼠IgG单克隆抗体结合之辣根过氧化物酶作为侦测，最后加入四甲基联苯铵呈色液作为标准终止液，以酶联免疫吸附试验微量盘分析仪读取可見光譜吸收值(450nm)。
2).临床检体中抗人乳头状瘤病毒之抗体跟纯化后之人乳头状瘤病毒蛋白之反应。本专利发明所描述试验的临床检体，包括但不仅限于来自子宫颈抹片的细胞、体液或血清样本。获得之子宫颈抹片之临床检体也能利用酶免疫分析方法试验，侦测人乳头状瘤病毒E6，E7或L1蛋白。
各种样本所产生的细胞溶解物来源，包括水溶液中的子宫颈抹片细胞、培养基(用于人乳头状瘤病毒 脱氧核醣核酸测试样本)或子宫颈抹片样本，皆证实藉由酶免疫分析方法试验，利用本专利描述之多种人乳头状瘤病毒单克隆抗体，可由临床样本中侦测人乳头状瘤病毒E6，E7或L1蛋白。在此描述的酶免疫分析方法方法，检体处理、离心、纯化和裂解后，产生细胞裂解物作为分析物。定量细胞溶解物中的蛋白含量，包被于微孔盘，相同含量的蛋白亦包被在每一孔洞的样本上；密闭微孔盘，利用稍后提到与抗老鼠IgG单克隆抗体结合之辣根过氧化物酶作为侦测，最后加入四甲基联苯铵呈色液作为标准终止液，以酶联免疫吸附试验微量盘分析仪读取可見光譜吸收值(450nm)。
表四：子宫颈抹片样本中E6，E7及L1蛋白之酶免疫分析方法侦测
表4结果说明每一单克隆抗体可专一性侦测来自鳞状细胞癌样本中的人乳头状瘤病毒E6，E7及L1蛋白，以正常之抹片检体(人乳头状瘤病毒16阴性)作为负控制组。酶免疫分析方法试验，高度人乳头状瘤病毒去氧核醣核酸阳性的样本中，三分之一对E6，E7和L1呈阳性反应。结果显示来自鳞状细胞癌细胞裂解物的E6，E7和L1蛋白，可经酶免疫分析方法试验使用本专利描述之单克隆抗体加以侦测；高度人乳头状瘤病毒去氧核醣核酸阳性的样本(第一或第二级子宫颈上皮内赘瘤)可能含有或不含人乳头状瘤病毒E6，E7及L1蛋白。此处用来测试的高度人乳头状瘤病毒去氧核醣核酸为HC2，是唯一经美国食品和药物管理局认可之测试。人乳头状瘤病毒去氧核醣核酸阳性但为酶免疫分析方法阴性的样本，在人乳头状瘤病毒去氧核醣核酸试验中可能为伪阳性，或是阳性反应但不表现人乳头状瘤病毒原始致癌蛋白。研究结果显示，本专利描述之人乳头状瘤病毒酶免疫分析方法试验，可作为提供临床筛选子宫颈癌之另一依据。
3).免疫组织化学方法侦测人乳头状瘤病毒蛋白以抗纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白之抗体反应：将组织块蜡切片切割成4微米放在片子上，以摄氏60度烘烤隔夜；去蜡水合部分则不加以遮蔽，进行免疫组织化学染色步骤。本专利描述之抗纯化后之人乳头状瘤病毒蛋白之单克隆抗体，稀释后作为第一级抗体，以第二级抗体溶液进行染色和清洗步骤，最后加入适合的呈色试剂。当组织块发展后，以去离子水使片子浮起，以四溴荧光素进行复染、脱水并盖上盖拨片。
在一范例中，准备来自各种子宫颈上皮内赘瘤阶段的不同子宫颈组织，以兔子多克隆抗人乳头状瘤病毒E7抗体进行免疫组织化学试验。另一范例中，同时以免疫组织化学和组织微阵列方法组织芯片利用单克隆抗体侦测来自各种不同人乳头状瘤病毒病毒型(由人乳头状瘤病毒脱氧核醣核酸基因型确认)之人乳头状瘤病毒蛋白。利用单克隆抗体来抗人乳头状瘤病毒病毒蛋白或原致癌蛋白，此发明提供抗体用于单一或多重人乳头状瘤病毒感染之临床检体，侦测人乳头状瘤病毒L1病毒蛋白和E6，E7原致癌蛋白。此描述之单一抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体可侦测单一人乳头状瘤病毒感染，包括人乳头状瘤病毒6，人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，人乳头状瘤病毒31，人乳头状瘤病毒33，人乳头状瘤病毒52等癌症相关人乳头状瘤病毒病毒型(高风险或低风险之人乳头状瘤病毒病毒型)。单一抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体可侦测两种以上病毒型之人乳头状瘤病毒感染，例如人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，人乳头状瘤病毒52，人乳头状瘤病毒58，人乳头状瘤病毒44，人乳头状瘤病毒51，人乳头状瘤病毒39，人乳头状瘤病毒59等之结合型，包含高风险、低风险和非原致癌基因α-人乳头状瘤病毒。
一范例中，本专利发明描述之人乳头状瘤病毒抗体可应用于临床。免疫组织化学试验结果证实，利用老鼠单克隆抗人乳头状瘤病毒E7抗体，可原位侦测不同阶段子宫颈组织的人乳头状瘤病毒E7蛋白。另一范例中，本专利发明描述之抗体，利用各种子宫颈上皮内赘瘤不同阶段之子宫颈组织进行免疫细胞化学试验。又另一范例中，使用老鼠单克隆抗人乳头状瘤病毒E6抗体免疫组织化学染色的结果显示，可原位侦测各种子宫颈上皮内赘瘤阶段组织中所表现的人乳头状瘤病毒E6蛋白。这些结果说明人乳头状瘤病毒E6和人乳头状瘤病毒E7原致癌蛋白在结构不良细胞中过度表现利用特异性之人乳头状瘤病毒抗体经免疫组织化学染色可被专一性侦测。
一范例中，图12A-12D说明以老鼠单克隆抗人乳头状瘤病毒E6抗体进行子宫颈上皮内赘瘤组织的免疫组织化学染色。结果显示表现的E6原致癌蛋白可在第二级子宫颈上皮内赘瘤致癌前阶段被早期侦测；黑色直线箭头指出结构不良细胞中E6蛋白之特异性染色，空白键头则表示未被染色的正常细胞。放大图显示在早期结构不良细胞核中标表现的E6蛋白。
图12A说明第二级子宫颈上皮内赘瘤组织的结构不良细胞之代表性影像，以抗E6单克隆抗体进行免疫组织化学染色。图12B说明图12A的第二级子宫颈上皮内赘瘤样本结构不良组织中的邻近正常上皮之代表性影像。图12C-12D说明两种第三级子宫颈上皮内赘瘤样本的结构不良性上皮之代表性影像，以相同之抗E6单克隆抗体进行免疫组织化学染色。这些结果显示，以E6单克隆抗体进行免疫组织化学染色，对结构不良性细胞之细胞核与细胞质具有专一性。
在另一范例中，图13A-13D说明利用老鼠人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体对鳞状细胞癌进行免疫组织化学染色。结果显示，E7原致癌蛋白的表现可在鳞状细胞癌组织的肿瘤细胞中被侦测到；黑色直线箭头指出结构不良细胞中E7蛋白之特异性染色，空白键头则表示未被染色的正常细胞。放大图显示肿瘤细胞的细胞质中所表现的E7蛋白，但不存在于上皮细胞或基质细胞中。这些结果显示，以E7单克隆抗体进行免疫组织化学染色，对肿瘤细胞的细胞质具有专一性。图13A说明以抗E7单克隆抗体对来自组织微阵列之鳞状细胞癌组织进行免疫组织化学染色的代表性影像。图13B说明图13A中鳞状细胞癌正常上皮细胞(与肿瘤组织相距15mm)之代表性影像。图13C说明另一来自组织微阵列之鳞状细胞癌样本代表性影像，以相同抗E7单克隆抗体进行免疫组织化学染色。图13D说明图13C细胞质中的肿瘤细胞染色之代表性放大影像。
4).以免疫细胞化学方法原位侦测人乳头状瘤病毒蛋白之抗人乳头状瘤病毒之抗体专一性：
由液体溶液中所收集的子宫颈抹片，依制造说明步骤制备。细胞的准备分为两部分，一是传统之子宫颈抹片，一是免疫染色。片子上的单层子宫颈细胞由细胞离心机或薄层准备技术制成，依免疫染色步骤将细胞固定及染色，被染色的细胞可藉显微镜被观察到。
在一范例中，图14A-14C说明以抗人乳头状瘤病毒抗体进行免疫细胞化学分析。图14A说明来自第二级子宫颈上皮内赘瘤子宫颈抹片的子宫颈细胞之代表性影像，以薄层制备并以老鼠抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行免疫细胞化学染色。图14B说明来自第三级子宫颈上皮内赘瘤子宫颈抹片的子宫颈细胞之代表性影像，以薄层制备并以老鼠抗E6抗体进行免疫细胞化学染色。图14C说明来自腺癌子宫颈抹片的子宫颈细胞之代表性影像，以薄层制备并以图14B所示之老鼠抗人乳头状瘤病毒E6抗体进行免疫细胞化学染色。
多种免疫试验分析所用之抗体和纯化后之重组蛋白，是由人乳头状瘤病毒早期或晚期基因演化而来，作为人乳头状瘤病毒感染发生时的了解性指标。此外，人乳头状瘤病毒相关之恶性肿瘤或癌前期细胞转型皆可被试验。本发明最有用之一方面，便是诊断子宫颈癌、鳞状细胞癌和腺癌，以及任何与人乳头状瘤病毒原致癌基因相关之不正常性表皮细胞，包括空洞细胞、过度角化、上皮细胞变性或鳞状细胞病变之癌前期症状、高度增生不良症，以及侵入性或恶性癌症。
在高度子宫颈上皮内赘瘤病灶中，E6和E7在宿主基底表皮细胞中大量表现，且严重干扰这些有复制能力的宿主细胞之细胞周期。人乳头状瘤病毒原致癌蛋白的表现干扰宿主细胞G1-S-期的调控。人乳头状瘤病毒E6及E7蛋白标记过多的细胞交互反应，例如E7使pRB失活，E6可造成p53缺失。高度的人乳头状瘤病毒E7蛋白使pRB失活，导致中断E2F-Rb的键结，通常pRB键结至E2F，阻碍E2F驱动细胞周期之活化。在细胞复制中，E2F受RB磷酸化作用调节，RB磷酸化则是由细胞周期素依酶(CDK4，CDK6)中介，由许多激酶抑制剂(INKs)所控制。
Rb/E2F压制作用的丧失，游离的E2F产生很强的活化，宿主细胞蛋白p16INK4a便会过度表现。此外，因为p16INK4a中介的Cdk4/6压制作用对宿主细胞蛋白pRb无下游效应，故S-期的基因持续的被活化。E7-依赖的E2F之释放非经由pRb的磷酸化中介，反向调控p16INK4a之表现，对细胞周期之活化无影响性。在生理状态下，当细胞遇到基因性压力情况，如老化组织的端粒酶大量缩短，此时p16INK4a被表现。周期素的过度表现依赖激酶(CDK)抑制物p16INK4a，产生不再调控人乳头状瘤病毒原致癌基因表现的直接结果。
此外，宿主细胞蛋白在增生和基因复制扮演重要脚色，当受人乳头状瘤病毒感染时便可能过度表现。这些宿主细胞蛋白包括ki67(MIB-1)，MYC细胞原致癌基因，周期素蛋白(周期素A，B，E)，CDKN2A/p16INK4a，端粒酶(TERC)，复制蛋白复合体(MCM5，CDC6，拓璞异构酶II(TOP2A)，MCM2，微小染色体维持蛋白2，4，5)。
本专利发明所提供之一种以上的免疫学试验方法，目标在提供操作者简便的步骤和仪器，或不需额外仪器便可在短时间内完成，与各式免疫学分析方法之结果进行比较分析，配合人体核酸杂交试验之细胞学和组织学结果，以及人口学信息，可作为证实人乳头状瘤病毒感染和子宫颈癌之准确及相关诊断。
另一范例为筛选人体感染人乳头状瘤病毒之方法，包括获得临床检体、进行核酸杂交试验、侦测人乳头状瘤病毒基因之表现、进行多项免疫学分析试验、侦测早期病毒蛋白之抗体表现，或以早期人乳头状瘤病毒蛋白之第一重组蛋白侦测早期人乳头状瘤病毒病毒蛋白之表现，侦测晚期人乳头状瘤病毒蛋白抗体表现，或以晚期人乳头状瘤病毒蛋白之第二重组蛋白侦测晚期人乳头状瘤病毒病毒蛋白之表现。
此专利发明描述之多种诊断性免疫学试验方法，包括获得多克隆抗体、单克隆抗体和抗血清，对获得之多种重组蛋白具专一性。一临床样本可能含有人乳头状瘤病毒相关蛋白或抗原，与所获得对多种重组蛋白具特异性之多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清反应，以适合之侦测系统分析任何抗原-抗体复合体之存在。适合的侦测系统可为各式比色计、化学发光指示剂、萤光物质等，对每一免疫分析方法的二次抗体具有专一性。
为了成功预防及治疗子宫颈癌，早期诊断人乳头状瘤病毒感染是很重要的。预防子宫颈癌之策略必须增进人乳头状瘤病毒测试/筛选，使能够扩及世界各地之人类，进一步追踪这些个案之过去或现在之人乳头状瘤病毒感染及癌前期病灶。重要的是，妇女感染人乳头状瘤病毒病毒12-15年便能发展成侵袭性子宫颈癌。此专利发明描述之人乳头状瘤病毒感染生物标记检测可早期对妇女进行预筛选，可早期治疗人乳头状瘤病毒感染并预防子宫颈癌之发展，而不需依赖化学治疗或放射治疗癌症恶化。
Claims (26)
1.一种生产对两种或两种以上人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性之单克隆抗体的方法，包括：
利用两种或两种以上的纯化后之人乳突瘤病毒重组蛋白筛选产生抗体之融合瘤细胞，筛选步骤包括选择对两种或两种以上的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白具有阳性反应，且对非乳突瘤病毒蛋白具阴性反应的产生抗体之融合瘤细胞；由该产生抗体之融合瘤细胞产生之单克隆抗体，对两种或两种以上的人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性键结能力。
2.根据申请专利范围第1项之方法，其两种或两种以上之纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白是由人乳头状瘤病毒16E6，人乳头状瘤病毒16E7，人乳头状瘤病毒16L1，人乳头状瘤病毒18E6，人乳头状瘤病毒18E7，人乳头状瘤病毒18L1蛋白及其组合群中选择出来。
3.藉由利用两种或两种以上之纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白筛选出的产生抗体之融合瘤细胞获得单克隆抗体，该单克隆抗体与来自不同人乳头状瘤病毒型之两种或两种以上的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白具有键结能力；筛选步骤包括选择对两种或两种以上来自不同人乳头状瘤病毒型之纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白具有阳性反应，且对非乳突瘤病毒蛋白具阴性反应的产生抗体之融合瘤细胞；由该产生抗体之融合瘤细胞产生之单克隆抗体，对两种或两种以上的人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性键结能力。
4.根据申请专利范围第3项之单克隆抗体，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16E7和人乳头状瘤病毒18E7蛋白具有键结能力。
5.根据申请专利范围第3项之单克隆抗体，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16E6和人乳头状瘤病毒18E6蛋白具有键结能力。
6.根据申请专利范围第3项之单克隆抗体，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16L1和人乳头状瘤病毒18L1蛋白具有键结能力。
7.根据申请专利范围第3项之单克隆抗体，该单克隆抗体由产生抗体之融合瘤细胞产生；而此产生抗体之融合瘤细胞经由利用一人乳头状瘤病毒型之早期的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白，及来自另一人乳头状瘤病毒型之晚期的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白筛选获得，并选择此产生抗体之融合瘤细胞对早期和晚期的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白具有阳性反应，且对非人类乳突瘤蛋白具阴性反应；由此产生抗体之融合瘤细胞获得之单克隆抗体，可与来自不同人乳头状瘤病毒型之早期和晚期病毒蛋白产生键结。
8.根据申请专利范围第7项之单克隆抗体，该单克隆抗体与所有人乳头状瘤病毒16E6，人乳头状瘤病毒16E7，人乳头状瘤病毒16L1，人乳头状瘤病毒18E6，和人乳头状瘤病毒18E7蛋白具有键结能力。
9.根据申请专利范围第7项之单克隆抗体，该单克隆抗体与所有人乳头状瘤病毒16E6，人乳头状瘤病毒16E7，人乳头状瘤病毒16L1，人乳头状瘤病毒18E6，人乳头状瘤病毒18E7，和人乳头状瘤病毒18L1蛋白具有键结能力。
10.根据申请专利范围第3项之单克隆抗体，该单克隆抗体可用于多种免疫试验分析，其中一种或多种免疫检验方法是由酶联免疫吸附试验、人乳头状瘤病毒蛋白抗原分析、抗人乳头状瘤病毒蛋白抗体分析、人乳头状瘤病毒免疫复合体分析、蛋白芯片分析、放射免疫沈殿分析、细胞膜快速免疫层析、快速棒状免疫层析、组织及子宫颈细胞之免疫化学和流式细胞仪之免疫细胞学分析等，及上述组合所构成群组中所选出。
11.一单克隆抗体与来自相同人乳头状瘤病毒型之两种或两种以上人乳头状瘤病毒蛋白具有键结能力。
12.根据申请专利范围第11项之单克隆抗体，该单克隆抗体藉由利用两种或两种以上之纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白筛选出的产生抗体之融合瘤细胞获得；筛选步骤包括选择对两种或两种以上之纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白具有阳性反应，且对非乳突瘤病毒蛋白具阴性反应的产生抗体之融合瘤细胞；由该产生抗体之融合瘤细胞产生之单克隆抗体，对两种或两种以上的人乳头状瘤病毒蛋白具有专一性键结能力。
13.根据申请专利范围第12项之单克隆抗体，其中两种或两种以上的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白，是来自相同的人乳头状瘤病毒型。
14.根据申请专利范围第12项之单克隆抗体，其中两种或两种以上的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白，是来自不同的人乳头状瘤病毒型。
15.根据申请专利范围第12项之单克隆抗体，其中两种或两种以上的任一纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白是从人乳头状瘤病毒16E6，人乳头状瘤病毒16E7，人乳头状瘤病毒16L1，人乳头状瘤病毒18E6，人乳头状瘤病毒18E7，人乳头状瘤病毒18L1蛋白及其组合群中选出。
16.根据申请专利范围第12项之单克隆抗体，其中两种或两种以上的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白，来自两种或两种以上早期的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白，该单克隆抗体与两种或两种以上早期人乳头状瘤病毒蛋白具有键结能力。
17.根据申请专利范围第12项之单克隆抗体，其中两种或两种以上之纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白包括早期和晚期的纯化后之乳突瘤病毒重组蛋白；该单克隆抗体与一种早期人乳头状瘤病毒蛋白及一种晚期人乳头状瘤病毒蛋白具有键结能力。
18.根据申请专利范围第11项之单克隆抗体，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒16E6和人乳头状瘤病毒16E7病毒蛋白具有键结能力。
19.根据申请专利范围第11项之单克隆抗体，该单克隆抗体与所有人乳头状瘤病毒16E6，人乳头状瘤病毒16E7，和人乳头状瘤病毒16L1病毒蛋白具有键结能力。
20.根据申请专利范围第11项之单克隆抗体，该单克隆抗体与人乳头状瘤病毒18E6和人乳头状瘤病毒18E7病毒蛋白具有键结能力。
21.根据申请专利范围第11项之单克隆抗体，该单克隆抗体与两种或两种以上来自相同人乳头状瘤病毒型的人乳头状瘤病毒蛋白具有键结能力，其中相同的人乳头状瘤病毒型是从高危险型人乳头状瘤病毒、低危险型人乳头状瘤病毒，人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，人乳头状瘤病毒31，人乳头状瘤病毒33，人乳头状瘤病毒35，人乳头状瘤病毒39，人乳头状瘤病毒45，人乳头状瘤病毒51，人乳头状瘤病毒52，人乳头状瘤病毒56，人乳头状瘤病毒58，人乳头状瘤病毒59，以及人乳头状瘤病毒68，人乳头状瘤病毒6，人乳头状瘤病毒11，人乳头状瘤病毒42，人乳头状瘤病毒43，人乳头状瘤病毒44，人乳头状瘤病毒53，人乳头状瘤病毒54，人乳头状瘤病毒55和人乳头状瘤病毒56，及上述组成的构成群组中选出。
22.根据申请专利范围第11项之单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于多种免疫试验分析，其中一种或多种免疫检验方法是由EILSA(酶连结免疫分析)、人类乳突瘤蛋白抗原分析、抗人类乳突瘤病蛋白抗体分析、人类乳突瘤免疫复合体分析、蛋白芯片分析、放射免疫沈殿分析、细胞膜快速免疫层析、快速棒状免疫层析、组织及子宫颈细胞之免疫化学和流式细胞仪之免疫细胞学分析等，及上述组合所构成群组中所选出。
23.一单克隆抗体仅能与第一种人乳头状瘤病毒蛋白键结，而不与第二种人乳头状瘤病毒蛋白键结；该单克隆抗体是藉由筛选自对第一型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白具阳性反应，且对第二型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白具阴性反应的产生抗体之融合瘤细胞以获得抗体；其中第一种人乳头状瘤病毒病毒蛋白，相当于第一型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白，而第二种人乳头状瘤病毒病毒蛋白，相当于第二型的人乳头状瘤病毒之纯化后之重组蛋白。
24.根据申请专利范围第23项之单克隆抗体，其中第一型人乳头状瘤病毒蛋白是从人乳头状瘤病毒16E6，人乳头状瘤病毒16E7，人乳头状瘤病毒16L1，人乳头状瘤病毒18E6，人乳头状瘤病毒18E7，人乳头状瘤病毒18L1蛋白，及上述组成的构成群组中选出。
25.根据申请专利范围第23项之单克隆抗体，该单克隆抗体与第一型人乳头状瘤病毒蛋白病毒蛋白具有键结能力，其中人乳头状瘤病毒蛋白病毒型是从高危险型、低危险型、人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，人乳头状瘤病毒31，人乳头状瘤病毒33，人乳头状瘤病毒35，人乳头状瘤病毒39，人乳头状瘤病毒45，人乳头状瘤病毒51，人乳头状瘤病毒52，人乳头状瘤病毒56，人乳头状瘤病毒58，人乳头状瘤病毒59，以及人乳头状瘤病毒68，人乳头状瘤病毒6，人乳头状瘤病毒11，人乳头状瘤病毒42，人乳头状瘤病毒43，人乳头状瘤病毒44，人乳头状瘤病毒53，人乳头状瘤病毒54，人乳头状瘤病毒55和人乳头状瘤病毒56，及上述组成的构成群组中选出。
26.根据申请专利范围第23项之单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于多种免疫试验分析，其中一种或多种免疫检验方法是由酶联免疫吸附试验、人乳头状瘤病毒蛋白抗原分析、抗人乳头状瘤病毒蛋白抗体分析、人乳头状瘤病毒免疫复合体分析、蛋白芯片分析、放射免疫沈殿分析、细胞膜快速免疫层析、快速棒状免疫层析、组织及子宫颈细胞之免疫化学和流式细胞仪之免疫细胞学分析等，及上述组合所构成群组中所选出。
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