CN103865883A - 抗高危型人乳头瘤病毒蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗高危型人乳头瘤病毒HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白的单抗及分泌该单抗的杂交瘤细胞株及其应用，其可以特异检测HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白。这2个抗体可以被标记胶体金或彩色乳胶颗粒，制备成为快速检测HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白的免疫层析试纸条。该方法用于检测HPV16E6蛋白、HPV18E7蛋白的特点是快速（在10分钟内出结果）、简单、特异、灵敏、成本低，易于推广。

Description

抗高危型人乳头瘤病毒蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白和HPV18型E7蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

HPV是一组无包膜、环状双链结构的DNA病毒，外形呈20多面体对称型。HPV属乳多空病毒科乳头瘤病毒属A亚群72个衣壳体，直径约45nm～55nm，分子量5×10⁶道尔顿。HPV基因组含7800～7900碱基对(bp)，包含4个部分：即早期转录区、晚期转录区、上游调控区和一个小的高度变异的位于E5和L2之间的非编码区，编码为9个开放读码框架。早期转录区又称为E区，由4500个碱基对组成，分别编码为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8等8个早期蛋白（一些HPV不含E3，E8），具有参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能。E1与E2一起涉及病毒DNA复制与生活周期的完成，在病毒开始复制中起关键作用。E2全长蛋白可以作为转录激活因子，与上游调控区的DNA结合增加早期区的转录，E2小蛋白抑制早期区的转录。E3功能不清。E4与病毒复制突变有关，当病毒装配时表达在感染的晚期。E5与细胞表面受体比如EGF和PDGF相互作用，可能刺激感染细胞的增殖。E6与P53结合引起P53蛋白的降解，在病毒复制、宿主细胞不死性和转化中起重要作用。E7与宿主细胞中的Rb蛋白结合并导致刺激宿主细胞转录的E2F-Rb复合物的解离，在病毒复制、宿主细胞不死性和转录中起关键作用。晚期转录区又称为L区，由2500个碱基对组成，编码2个衣壳蛋白即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，组成病毒的衣壳，且与病毒的增殖有关。非转录区又称为上游调节区、非编码区或长调控区，由1000个碱基对组成，位于E8和L1之间。该区含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的调控元件，以调控病毒的转录与复制。

为了不受宿主免疫系统的障碍完成生活周期，HPV用聪明的持久的策略来逃脱免疫监视。HPV必须通过破损的皮肤进入宿主，到达鳞状细胞的基层，鳞状细胞是HPV唯一进入宿主的细胞，一旦HPV病毒颗粒在鳞状上皮的基底层细胞感染，病毒DNA就会暴露和转运到宿主，病毒就建立了与宿主细胞严格捆绑在一起的基因表达模式，当感染还在基底层细胞时，就有了复制的元件但基底层细胞还没有分化，所以只有少部分基因表达，包括E5、E6、E7基因的表达相应的蛋白，这些蛋白会以加快的速度刺激宿主细胞的复制。

尽管HPV阻碍宿主的免疫反应，但大多数的生殖器HPV感染仍有成功的免疫反应。

HPV16感染的妇女血清抗体出现晚而且不是在所有HPV16感染的妇女中都能检测到抗体(针对L1)。Ho于2004年发现HPV16抗体IgG出现的平均时间在感染后8.3月。感染后12月以内，56.7%的HPV16感染妇女有抗体，16月以后67.1%的人出现，几年以后L1抗体消失。

2011年，KS Anderson研究发现在于HPV16型相关的头颈癌病人的血清中可以检测抗HPV16的E1、E2、E4、E6、E7和L1蛋白的抗体，但没有检测到E5和L2蛋白的抗体，其中E1、E7蛋白的抗体效价最高在1:1000以上，其他的在1：640。而且，L1抗体表示过去感染，HPV16的E6、E7抗体出现在侵蚀性癌症中，同时可以检测到HPV的DNA。

因为HPV很难在体外或动物模型中培养，因此缺乏很多关于药物治疗的信息，没有抗HPV病毒的药物，HPV损伤的治疗仍然主要依靠外科手术切除感染区的细胞，即使手术后仍然有可能向恶性方向发展，所以HPV感染的预防显得非常重要。

宫颈癌与高危型HPV感染关系密切，其自然病程有一个从宫颈上皮内瘤变（CIN）到原位癌再到浸润癌的一个连续发生、发展过程，大约8-10年。因宫颈癌有较长的癌前病变阶段，所以做好癌前筛查是防治宫颈癌的关键所在。HPV检测是筛查宫颈癌的有效辅助方法，所以大力开展HPV检测、尤其高危型HPV检测对宫颈癌的早期筛查、防治及在预测CIN的自然转归、治疗后的随诊上都有重要的作用。

研究表明，宫颈的高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）持续感染是引起宫颈癌及癌前病变的直接病因。Mattheus等报道，在99.7％的浸润性宫颈癌中可以检测到13种高危型HPV，其中HPV16（50-60%）、HPV18（18%）等高危型的感染是引起宫颈癌变的首要因素。

高危型HPV16和HPV18型的基因整合到人的基因中，其中的E6和E7致癌基因可在宫颈癌组织中持续表达E6、E7蛋白，所以检查宫颈脱落细胞或宫颈癌组织中的E6、E7蛋白可作为筛查宫颈癌的一个辅助方法。

目前HPV感染的检测方法有3类：

（1）传统的形态学方法检测HPV

包括巴氏涂片细胞病理学检测、阴道镜检查、宫颈活检组织病理学检查、电镜技术（直接观察病毒颗粒）、宫颈摄像检查和宫颈荧光检查等。宫颈细胞学筛查作为第二级预防已经有40年，系统的筛查能减少宫颈癌的死亡率70%，但花费很高。80%的宫颈发生在发展中国家,细胞学筛查执行的不是很好，而且细胞出现并病变前已经有HPV的感染，所以必须结合其他方法。

（2）HPVDNA的检测

以上已经提到高危型HPV的持续感染时宫颈癌的直接病因，在细胞学筛查正常前，HPVDNA的检测很重要。目前应用最多的是PCR，其次是杂交捕获技术。PCR很灵敏，可以同时诊断多个亚型，但会出现假阳性，杂交捕获技术没有假阳性，但需要专业设备、专业人才，目前不能推广使之受到限制。

（3）血清学方法和免疫学方法

主要是检测患者血清中的L1抗体或是用抗体检测抗原。但L1抗体在HPV清除后几个月到1年后都有较高的效价，所以血清中的L1抗体的检测不能知道是现在感染或是过去感染。用ELISA检测血清中的HPVE6、E7特异性抗体，目前在HPV16阳性的口腔癌患者血清中可以检测到E6、E7特异性抗体，在其他HPV相关癌症中没有研究过。用抗体检测抗原的方法主要指免疫组化法，因为该方法的时间很长，操作繁琐。所以血清学和免疫学方法检测的应用受到限制。

以上检测HPV的方法在宫颈癌及癌前病变筛查和癌前预报中发挥了重要作用。但以上检测HPV的方法有一个共同的局限性：耗费时间长、需要专业的仪器设备和技术人员、操作程序复杂、成本高，不易推广。因此建立简单高效特异快速的诊断方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供抗高危型人乳头瘤病毒HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白的单抗。

具体地，本发明提供一种分泌抗高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为：CCTCC C201401（保藏单位：中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学邮编：430072；保藏日期：2014年1月20日，其培养物名称：杂交瘤细胞株2F10）

本发明提供一种分泌抗高危型人乳头瘤病毒HPV18型E7蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为：CCTCC:CCTCC C201402。（保藏单位：中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学邮编：430072；保藏日期：2014年1月20日，其培养物名称：杂交瘤细胞株2D4）

本发明还提供上述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明还提供表达高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白或/和HPV18型E7蛋白的表达载体。

本发明还提供一种宿主菌，其含有上述的表达载体。

本发明所述的抗体能够用于制备检测高危型人乳头瘤病毒的制剂。

本发明所述的抗体能够用于制备检测人宫颈癌脱落细胞中的HPV16E6蛋白和/或HPV18E7蛋白的制剂。

本发明还提供一种免疫层析试纸条，其含有上述的抗体。

本发明所述的免疫胶体金试纸条能够用于检测高危型人乳头瘤病毒。

本发明所述的免疫层析试纸条能够用于检测人宫颈癌脱落细胞中的HPV16E6蛋白和/或HPV18E7蛋白。

本发明研制的抗高危型人乳头瘤病毒HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白的单抗，可以特异检测HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白。这2个抗体可以被标记胶体金或乳胶颗粒，制备成为快速检测HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白的免疫层析试纸条。该方法用于检测HPV16E6蛋白、HPV18E7蛋白的特点是快速（在10分钟内出结果）、简单、特异、灵敏、成本低，易于推广。将以上2个单抗应用于免疫层析试纸条中建立的快速诊断方法，可以快速大规模筛查感染高危型人乳头瘤病毒16型和18型的高危妇女人群，并用该试纸条追踪检查高危型人乳头瘤病毒16型和18型和结合其他方法达到早期筛查，早期诊断和早期治疗宫颈癌的目的。该方法适用于各种级别的医院对宫颈癌的早期筛查，特别是医疗条件差的基层医院。

本发明的单抗至少有以下3个优点：第一点，因为制备的抗原是接近天然构象的HPV16E6蛋白、HPV18E7蛋白，从而使制备的单抗更易与宫颈脱落细胞或宫颈癌组织中的的HPV16E6蛋白、HPV18E7蛋白结合，提高检测率；第二点，本发明的单抗的特异性较强。免疫荧光检测显示，抗HPV16E6蛋白的单抗只与整合有HPV16型的CaSki细胞反应，而不与整合有HPV18型的HeLa细胞反应；抗HPV18E7蛋白的单抗在免疫荧光检测中显示不与整合有HPV16型的CaSki细胞反应，只与整合有HPV18型的HeLa细胞反应。第三点，制备的单抗有很多潜在的用途，比如用于免疫组化、免疫荧光、免疫层析试纸条、甚至可以将获得的鼠源单抗改构成基因工程抗体成为生物导弹治疗宫颈癌，或用于宫颈癌治疗性疫苗的研制。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是抗HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白的单抗的研制和应用技术路线图。

图2是HPV16E6的梯度PCR，泳道1-10的退火温度为：55.1、56.3、57.7、59.4、61.4、63.3、65.3、67.6、69.0、69.7℃；M：DL2000DNA Marker。

图3是HPV18E7的梯度PCR，泳道1-10的退火温度为55.1、56.3、57.7、59.4、61.4、63.3、65.3、67.6、69.0、69.7℃；M：DL2000DNA Marker。

图4是pET-28a(+)-HPV16E6的3个阳性质粒与CaSki和SiHa中的HPV16E6的DNA比对图。

图5是pET-28a(+)-HPV16-1的测序图谱。

图6是pET-28a(+)-HPV16-2的测序图谱。

图7是pET-28a(+)-HPV16-4的测序图谱。

图8是pET-28a(+)-HPV18E7与HeLa中的HPV18E7的DNA比对图。

图9是pET-28a(+)-HPV18E7-1的测序图谱。

图10是pET-28a(+)-HPV18E7-2的测序图谱。

图11是pET-28a(+)-HPV18E7-3的测序图谱。

图12是ZYM-5052和IPTG诱导pET-28a(+)-HPV18E7-2-BL21star-DE3plysS-1的表达，泳道1：ZYM-5052表达18h；泳道2、3、4：IPTG诱导4h的破菌液、上清和沉淀；M：中分子蛋白Marker。

图13是ZYM-5052和IPTG诱导pET-28a(+)-HPV16E6-1-BL21star-DE3plysS-1的表达，泳道1-5：ZYM-5052诱导18h破菌、沉淀、上清、诱导前和空载体；泳道6-9：IPTG诱导4h沉淀、上清、破菌液和诱导前；M：中分子蛋白Marker。

图14是杂交瘤细胞融合前SP2/0细胞。

图15是细胞融合后的杂交瘤细胞图。

图16是克隆化培养的单克隆杂交瘤细胞图.

图17是HPV16E6、HPV18E7单抗纯化后的电泳图，其中泳道1-2道：HPV16E6、HPV18E7单抗；M：蛋白质Marker。

图18是抗HPV16E6单抗与CaSki和HeLa细胞的免疫荧光图。

图19是抗HPV18E7单抗与HeLa和CaSki细胞的免疫荧光图。

图20是HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的技术路线图。

图21是检测HPV16E6和HPV18E7抗原的免疫层析试纸条的结构示意图。

图22是HPV16E6试纸条的检测结果。

图23是单个亚型HPV18E7试纸条的检测结果。

图24是HPV16E6与HPV18E7试纸条的检测结果。

具体实施方式

本发明所使用的各种试剂如下：

菌株与试剂:

大肠杆菌DH5a购于上海榕柏生物技术有限公司;

BL21（DE3)plysS购于上海北诺生物科技有限公司;

组织/细胞DNA(小量)抽提试剂盒购于上海华舜生物技术有限公司;

质粒(小量)抽提试剂盒(50次)购于OMEGA公司;

胶回收（小量）试剂盒（100次）)购于OMEGA公司;

质粒pET-28a（+）购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司;

HPV16E6引物由大连TaKaRa公司合成;

HPV18E7引物由大连TaKaRa公司合成;

购于大连TaKaRa公司；

限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ购于大连TaKaRa公司；

T4DNA连接酶购于大连TaKaRa公司；

DNA Maker DL-2000购于大连TaKaRa公司；

中分子量标准蛋白购于大连TaKaRa公司；

溶菌酶购于上海生工生物技术有限公司；

丙烯酰胺购于Japan公司；

甲双丙烯酰胺购于Amresco公司；

Tris购于上海生工生物技术有限公司；

L-甘基酸购于上海生工生物技术有限公司；

Ammonium Persulfate购于Promega公司；

TEMED为Sigma产品；

SDS购于上海生工生物技术有限公司；

溴酚蓝购于上海生工生物技术有限公司；

考马斯亮蓝R25O购于上海生工生物技术有限公司；

考马斯亮蓝G25O购于上海生工生物技术有限公司；

羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP购于中衫金桥；

DAB购于南京生工生物工程公司产品；

牛血清白蛋白购于中国医药集团上海化学试剂公司；

咪唑购于Bio Basic Incorporation；

硫酸镍购于Bio Basic Incorporation；

Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质购于美国GE公司；

Dnase购于上海生工生物技术有限公司；

尿素购于上海生工生物技术服务有限公司；

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购于Sigma；

TMB购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；

家兔和BALB/c纯系小鼠，昆明鼠购于重庆医科大学实验动物中心；

SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系购于上海华研科技有限公司；

DMEM和RPMI-1640培养基粉购于GIBCO公司；

HAT为美国Sigma公司产品；

HT为美国Sigma公司产品；

50%PEG-1500为Roche公司产品；

新生小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；

8-氮鸟嘌呤为美国Sigma公司产品；

TMB购于美国Sigma公司；

馿抗小鼠IgG的免疫荧光抗体购于美国Sigma公司;

乳胶颗粒为德国默克公司产品;

亲和素为美国Sigma公司产品;

生物素为美国Sigma公司产品;

PVA购于美国Sigma公司;

PVP购于美国Sigma公司;

BSA购于美国Roche公司;

柠檬酸三钠购于美国Sigma;

其他化学试剂均为市售的化学纯或分析纯试

试剂配方:

核酸电泳缓冲液TAE（50×贮存液/L）：242gTris，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)；

1×TAE电泳缓冲液：取49份水，加1份50×TAE配制而成；

LB：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，去离子水溶解，5N的NaOH调pH至7.0；

30%丙烯酰胺混合液：丙烯酰胺29g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1g，温热的蒸馏水100ml,放于暗色瓶中，放置数月；

4×SDS电泳样品缓冲液：Tris0.8g,SDS0.8g,β-巯基乙醇1.0ml,溴酚蓝2mg,浓盐酸0.189ml，去离子水定容至10ml;

5×Tris甘氨酸SDS电泳缓冲液：Tris7.55g，甘氨酸47g，SDS2.5g，去离子水定容至500ml，用前去离子水稀释至1×Tris甘氨酸SDS电泳缓冲液；

考马斯亮蓝R250染色液：0.125g考马斯亮蓝R250，甲醇30ml,冰醋酸10ml,加去离子水至100ml；

脱色液：甲醇30ml,冰醋酸10ml,加水至100ml；

底物显色液（用前配制）：DAB（3.3-二氨基联苯胺四盐酸盐）15mg,甲醇5ml,30%H₂O₂15ul,溶于25ml的TTBS缓冲液或柠檬酸底物缓冲液中。

细菌裂解缓冲液：50mmol/LTris-HCL(pH8.0)，300mmol/LNaCl,，200ug/ml溶菌酶（pH大于8.0）；

包涵体洗涤液Ⅰ：5%乙酸、1%Triton X-100；

包涵体洗涤液Ⅱ：2mol/L尿素、25mmol/L Tris、5mmol/L EDTA；

包涵体洗涤液Ⅲ:20mmol/LpB、0.5mol/L NaCL、50%乙醇；

包涵体溶解液Ⅰ：2mol/L尿素、10mmol/L乙醇胺、1‰β-ME(β-巯基乙醇)；

包涵体溶解液Ⅱ：8M尿素、10mM乙醇胺、1‰β-ME；

透析袋处理液：10mmol/LNaHCO₃,1mmol/LEDTA；

0.01mol/L,pH7.2的PBS：NaCl8g，KCl0.2g,KH2PO40.2g,Na2HPO41.15g,去离子水1L；

包被液（pH9.6）：Na₂CO₃0.17g，NaHCO₃0.28g，加蒸馏水至100ml，4℃保存；

洗涤液（PBST）：NaCl8g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，无水Na₂HPO₄1.15g，Tween-200.5ml,去离子水定容至1L；

封闭液：在PBST中加入5%脱脂乳或1%BSA（W/V），现配现用；

底物缓冲液：柠檬酸0.51g，Na₂HPO₄.12H₂O1.84g，加蒸馏水至100ml;

底物反应液：预先配制TMB/DMSO：10mg的TMB加入5ml的DMSO中；

9.9ml的底物缓冲液加100ul的TMB/DMSO，加1.2ul的30%H₂O₂，现配现用。

50×HAT溶液：用DMEM10ml溶解一支Sigma的HAT粉剂，配制成了50×HAT溶液；

1×HAT溶液：取98ml的含20%小牛血清的DMEM,加入2ml的50×HAT溶液；

50×HT溶液：用DMEM10ml溶解一支Sigma的HT粉剂，配制成了50×HAT溶液；

1×HT溶液：取98ml的含20%小牛血清的DMEM,加入2ml的50×HT溶液；

1%枸橼酸三钠：取Sigma公司的枸橼酸三钠1g，加超纯水定容至100ml，4℃保存；

5%BSA：取0.5g的BSA，加超纯水，定容至10ml；

10%PEG20000：取1g的PEG20000,加超纯水，定容至10ml；

0.005mol/L的pH7.2PBS：取200mmol/L的Na₂HPO₄7.2mL和200mmol/L的NaH₂PO₄2.8ml混合后得200mmol//L的PBS,将后者稀释40倍得pH为7.2的0.005mol/L的PBS；

0.01mol/L的pH7.4PBS：取200mmol/L的Na₂HPO₄8.1mL和200mmol/L的NaH₂PO₄1.9ml混合后得200mmol//L的PBS,将后者稀释20倍得pH为7.2的0.01mol/L的PBS；

pH为8.2的0.005mol/L硼酸盐缓冲液：取50mmol/L的Na₂B₄O₇3.5ml和200mmol/L的H₃BO₃6.5ml混匀得pH为8.2的200mmol/L硼酸盐缓冲液，将后者稀释40倍得pH为8.2的0.005mol/L硼酸盐缓冲液；

pH为8.2的TBS：Tris2.4g,NaCl17g,纯乙酸调pH至8.2，超纯水定容至1000ml。

参照图1，本发明的技术方案综述如下：

1.设计和合成针对高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6基因和HPV18型E7基因的特异性引物，用基因工程技术构建含有HPV16型E6基因和HPV18型E7基因的表达载体，表达和纯化高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白和HPV18型E7蛋白。

2.用高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白和HPV18型E7蛋白分别多次免疫6-8周龄的雌性Balb/C小鼠，用间接ELISAFA检测血清抗体效价，当抗体效价升高后进行细胞融合。

3.用杂交瘤技术将免疫后抗体效价高的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，多次亚克隆培养筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株，再经多次传代和冻存获得稳定分泌抗体的单克隆细胞株。用体外培养法制备腹水型单抗，纯化腹水单抗，并用免疫组化法或免疫荧光法进行单抗的特异性鉴定。

4.将纯化后的单抗应用于免疫层析试纸条中。

实施例1 引物的设计

软件分析载体pET-28a（+）及HPV16E6基因和HPV18E7基因的序列后设计针对全长基因的引物，含有6个组氨酸标签以及NcoⅠ(碱基序列为ccatgg)和HindⅢ(碱基序列为aagctt)限制性酶切位点的，2对针对载体pET-28a(+)的HPV16E6基因和HPV18E7基因共2个基因的引物，它们的序列如下：

HPV16的E6基因引物：

上游引物P1(SEQ ID NO:1):5’-catg-ccatgg at cac cat cac cat cac atg caccaa aag aga act gca atgt-3’;

下游引物P2(SEQ ID NO:2):5’-ccg-ctcgag tta cag ctg ggt ttc tct acg tgtt-3’。

HPV18的E7基因引物：

上游引物P1(SEQ ID NO:3):5’-gc-ccatgg at cac cat cac cat cac atg catgga cct aag gca ac-3’;

下游引物P2(SEQ ID NO:4):5’-ccg-ctcgag tta ctg ctg gga tgc aca ccacgg-3’。

实施例2 重组子pET-28a(+)-HPV16E6，HPV18E7-BL21star-DE3plysS的构建

1.以提取CaSki和HeLa细胞的总DNA为模板PCR扩增目的基因HPV16E6、HPV18E7，2个基因片段都采用从55-70℃的退火温度首先做梯度PCR，反应条件如下：

95℃预变性5分钟

72℃延伸7分钟

2个基因片段大量扩增时的PCR反应条件：

HPV16E6基因反应条件：

95℃预变性5分钟

72℃延伸7分钟

HPV18E7基因反应条件：

95℃预变性7分钟

72℃延伸7分钟

HPV16E6和HPV18E7共2个基因片段的10个退火温度（55.1、56.3、57.7、59.4、61.4、63.3、65.3、67.6、69.0、69.7℃）都出现有与目的片段分子量大小一致的条带。HPV16的E6和HPV18E7的10个温度扩增的目的条带都很亮，且无杂带，依次见图2、图3。

pET-28a(+)和HPV16E6和HPV18E7基因50ul的双酶切体系如下：

2.重组子pET-28a(+)-HPV16E6的测序结果

在NCBI中找到细胞株CaSki和SiHa中的HPV16E6序列（SEQ IDNO:5），然后在OMEGA软件中比对，发现pET-28a(+)-HPV16E6的3个阳性质粒（pET-28a(+)-HPV16-1，E6pET-28a(+)-HPV16E6-2，pET-28a(+)-HPV16E6-4）测序后的序列与细胞株CaSki和SiHa中的HPV16E6序列完全一致。3个基因的序列的比对结果请参照图4。

pET-28a(+)-HPV16-1，pET-28a(+)-HPV16E6-2，pET-28a(+)-HPV16E6-4的测序图谱分别参照图5、图6、图7。

3.重组子pET-28a(+)-HPV18E7的测序结果

pET-28a(+)-HPV18E7的3个阳性质粒（pET-28a(+)-HPV18E7-1，pET-28a(+)-HPV18E7-2，pET-28a(+)-HPV18E7-3）测序后的序列与细胞株HeLa中的HPV18E7序列（SEQ ID NO:6）完全一致，3个基因的序列的比对结果请参照图8。pET-28a(+)-HPV18E7-1，pET-28a(+)-HPV18E7-2，pET-28a(+)-HPV18E7-3的测序图谱分别参照图9、图10、图11。

实施例3 重组子pET-28a(+)-HPV16E6/HPV18E7-BL21star-DE3plysS的表达与纯化

把实施例2中制备的正确的重组质粒转化用于表达的感受态大肠杆菌BL21star-DE3plysS中表达目的蛋白，因表达的目的蛋白带有6个组氨酸标签，所以用镍柱亲和层析纯化得到较纯的目的蛋白。表达结果如下：

1.pET-28a(+)-HPV18E7-2-BL21star-DE3plysS-1的表达结果

请参照图12，泳道1为pET-28a(+)-HPV18E7-2-BL21star-DE3plysS-1在37℃中ZYM-5052表达18h破菌液，泳道2、3、4道分别0.5mmol/L IPTG表达4h破菌液、上清和沉淀。可以看出在大约13KDa处出现一条与HPV18E7蛋白分子量大小一致的条带，且出现在上清，不是沉淀中。以上结果显示用自诱导培养基ZYM-5052和IPTG诱导都可以表达HPV18E7蛋白，为可溶性表达，两种方法表达量无明显差异，但自诱导培养基ZYM-5052更易操作，成本更低，易于推广！用镍柱亲和层析纯化和透析后得到HPV18E7蛋白，作为抗原制备对应的单抗。

2.pET-28a(+)-HPV16E6-1-BL21star-DE3plysS-1的表达结果

请参照图13，显示的1-5道分别是ZYM-5052诱导表达18h的破菌液、沉淀、上清液、诱导前和空载体，6-9是IPTG诱导4h的沉淀、上清、破菌液和诱导前，可以看出ZYM-5052和IPTG诱导pET-28a(+)-HPV16E6-1-BL21star-DE3plysS-1表达18h后在19KDa处出现与目的蛋白HPV16E6分子量大小一致的条带，表达量较高，且在沉淀中，为包涵体表达。以上结果显示用自诱导培养基ZYM-5052和IPTG诱导都可以表达HPV16E6蛋白，但自诱导培养基ZYM-5052诱导表达量更高，更易操作，成本更低，易于推广！

3.HPV16E6蛋白的复性

HPV16E6蛋白为包涵体表达，所以变性条件下用镍柱亲和层析纯化后采用一步稀释法复性，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的10:1的比例加入复性液中，还原型谷胱甘肽的最终浓度为2mmol/L,氧化型谷胱甘肽的最终浓度为0.2mmol/L，后再用镍柱亲和层析浓缩复性后的HPV16E6蛋白，再透析得到纯化的复性的HPV16E6蛋白，作为抗原制备对应的单抗。

实施例4 抗HPV16型E6蛋白和HPV18型E7蛋白单抗的制备

1.小鼠的免疫

选择8-10周龄的雌性Balb/c小鼠抗原刺激小鼠产生抗体的剂量在10-100ug,初次免疫HPV16和18型的E6、E7蛋白的剂量50ug/只，加等体积的福氏完全佐剂皮下多点注射。一般一只Balb/C小鼠0.5ml/只，0.1-0.2ml／点，2周后进行第二次免疫，剂量75ug/只，加福氏不完全佐剂，皮下或肌肉注射，剂量不宜超过0.5ml/只，每2周进行第三次、四次、五次、六次免疫，剂量100ug/只，加福氏不完全佐剂，皮下或肌肉注射，最后一次免疫7～10天后采血分离血清检测抗体效价，检测免疫效果。免疫前3天冲击免疫，不加佐剂，抗原剂量50～500ug为宜，腹腔注射，3天后取脾融合。

2.小鼠腹腔巨噬细胞的制备

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／C小鼠6～10周龄，拉颈处死，浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入6～8ml培养液，按摩腹部，反复冲洗，吸出冲洗液，放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟，用含HAT的20％胎牛血清FCS的培养液混悬，调整细胞数1×10⁵／ml，加入96孔板，100ul／孔，放入37℃，用5%CO₂在CO₂孵箱培养。一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×10⁶腹腔巨噬细胞。每种蛋白的单抗制备取两只BaLb／c小鼠的腹腔巨噬细胞，一只BaLb／C小鼠的腹腔巨噬细胞刚好铺96孔板一块，每种单抗的制备使用两块96孔板。

3.骨髓瘤细胞的复苏和培养

髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量的单克隆抗体。本发明选用SP2／0骨髓瘤细胞系。在准备融合前的两周就开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，复苏稳定后，移种于含1%8-AG的DMEM培养基中，以防止细胞的突变，融合前1周换用无8-AG的培养液。当骨髓瘤细胞处于对数生长期、良好的形态、活细胞计数高于95％，进行细胞融合。也是决定细胞融合的关键。

4.免疫脾细胞悬液的制备

免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞的浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成脾细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中300目的不锈钢筛网上，用弯镊尖部刺破脾脏，用弯镊弯部研磨脾脏成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×10⁸脾脏左右。

实施例5 筛选抗HPV16E6和HPV18E7蛋白阳性克隆方法的建立

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。在杂交瘤细胞布满孔底1/4-1/2时，吸取细胞上清，用间接ELISA方法检测细胞上清抗体效价，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

用方阵滴定法确定最佳的抗原包被工作浓度，操作步骤如下：

1.用包被液将抗原HPV16E6和HPV18E7蛋白作一系列稀释：8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml，分别进行包被，37℃温育1h后转入4℃温育过夜，PBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。

2.将鼠抗HPV16E6和HPV18E7蛋白免疫血清用0.01mol/l的PBS做一系列稀释：1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000、1：512000，将阴性血清稀释1：1000，设置PBS作为空白对照，每个抗体稀释度均做复孔，100ul/孔，37℃温育2小时，PBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。

3.将HRP标记的羊抗鼠IgG以1:10000稀释，除空白对照不加以外，100ul/孔，37℃温育1小时，PBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。

4.加底物显色，测A450值：每孔加入底物反应液100ul，37℃温育0.5小时。

5.加入2mol/L的硫酸终止反应，100ul/孔。

6.测A450值。

7.结果判定：选择待检血清A450值为1.0左右作为最适宜抗原包被浓度和最佳抗体稀释度。

实施例6 细胞融合和阳性杂交瘤细胞的筛选

1.细胞融合的操作步骤

（1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

（2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10的比例混合在一起，在无菌的50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1500rpm,5分钟。

（4）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

（5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

（6）在室温下融合:

①在45秒内加入预热至37℃的1ml50％PEG1500,边加边搅拌,作用90秒钟.若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

②加预热的不完全培养液，终止PEG作用，在90秒钟以内加入35ml的不完全DMEM,前中后30秒分别加入2ml，8ml和25ml的DMEM。室温离心，1500rpm，5分钟。

（7）弃上清，先用4ml左右不含HAT的20％小牛血清RPMI-1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。再补加不含HAT的20％小牛血清RPMI-1640至20ml,分装至两个灭菌的青霉素瓶中，每瓶10ml。

（8）将每10ml含融合后的细胞悬液加至含饲养细胞的一块96孔板中，100ul/孔，每个单抗都铺板2块，37℃，5%CO₂培养。

2.HAT选择杂交瘤

细胞融合后第1、2、3、5天每孔用选择HAT选择培养液半换液，培养到第7天后，改用HT培养液，维持培养到10-14天后，每孔100ul的上清液吸取进行阳性克隆的筛选。

3.间接ELISA筛选阳性克隆

当杂交瘤细胞生长至孔底的1/2时，用间接ELISA筛选阳性克隆。

4.杂交瘤的克隆化培养和冻存

A、第一次克隆化培养

克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。本发明采有限稀释法进行克隆化。

有限稀释法的程序：

（1）制备饲养细胞悬液同融合前准备。

（2）阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10³／ml。

（3）取100个细胞放入20ml含饲养细胞HT培养液，即5个细胞／ml，1个/200ul,以200μl／孔加入96孔版中，每孔1个细胞。每种蛋白的单抗制备时先克隆化3个阳性克隆孔的细胞，每孔细胞一块板，共克隆化培养3板细胞。

（4）培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，更换HT培养液100μl／孔。

（5）第8～10天时，对在倒置显微镜下看到的单克隆孔进行标记，吸取细胞上清100ul/孔，用间接ELISA检测细胞上清抗体效价。

B、第二次克隆化培养

选取效价高的单克隆孔分别冻存，同时进行第二次克隆化，其他操作不变，传代培养。针对每种蛋白都选择多次传代培养能稳定分泌高效价抗体的细胞株进行第二次克隆化培养，取30个阳性单克隆细胞放入含饲养细胞的HT培养液20ml中轻轻混匀,以每孔200ul转入96孔细胞培养板中，培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，更换HT培养液100μl／孔。第8～9天时，对在倒置显微镜下看到有单克隆细胞克隆孔进行标记，吸取细胞上清100ul/孔用间接ELISA进行单克隆抗体检测。扩大培养能稳定分泌抗体的单克隆细胞株进行冻存。结果是所有单克隆孔上清液抗体检测为阳性，且A450值接近。

5.单克隆杂交瘤细胞株建立的结果

细胞融合前SP2/0细胞都处于对数生长期，数量足够，活细胞在95%以上，结果见图14。

细胞融合后经过HAT培养基的筛选，没有融合的SP2/0和脾细胞逐渐死亡，只有融合成功的杂交瘤细胞才存活下来，融合后3-5天可以在倒置显微镜下观察到克隆的生长，平均每块96孔中有90-93孔有细胞克隆生长，且生长状态良好，所以细胞融合率约为93%-96%，融合后的杂交瘤细胞克隆见图15。

第一次用有限稀释法亚克隆阳性多克隆杂交瘤细胞后，在倒置显微镜下观察到有的孔无细胞生长，有的孔有2-5个克隆，有的孔为1个克隆，1块96孔板中有13-30个单克隆，当细胞生长到孔底的1/2时进行间接ELISA检测有克隆的细胞上清液的抗体效价，结果显示2个克隆孔的效价接近或高于阳性血清的效价，单克隆孔的抗体效价较低。所以即使再将第一次克隆化培养得到的高效价多克隆杂交瘤细胞进行第二次克隆化培养，方法与第一次。显微镜下观察到的克隆情况同第一次，再次筛选结果显示有3-5株效价高于阳性血清的单克隆细胞株，经过扩大培养和反复冻存复苏再培养再筛选，筛选出稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，下述实施例8至实施例10中的的免疫荧光发现HPV16E6的2F10和HPV18E7的2D4杂交瘤细胞株长生的单抗效果好，所以已经进行了保藏，具体分别为上述的CCTCC:C201401和CCTCC:C201402。将这些单克隆杂交瘤细胞株再次以0.3个细胞/孔进行克隆化培养时，间接ELISA筛选的单克隆细胞株的抗体效价A450值很接近，随后扩大培养这些单克隆细胞株，部分冻存，部分注射到小鼠腹腔生产腹水单抗。单克隆杂交瘤细胞图见图16。

6.腹水单抗制备的结果

在10-12周的雌性Balb/C小鼠被腹腔注射无菌的液体石蜡油后1-2周0.5ml或弗氏不全佐剂0.3ml后3天，每只注射生长至对数生长期的单克隆杂交瘤细胞1-3×10⁶后4-5天，观察到小鼠腹部开始膨隆并逐渐长大，逐渐小鼠的食欲下降，活动力减弱，在7-11天时小鼠频临死亡，75%酒精消毒腹部皮肤后穿刺收集腹水，每只小鼠产生的腹水量不同，大约2-8ml不等，离心后加入等量甘油保存，待所有的腹水收集完毕后进行纯化和抗体效价的检测。

7.单抗的纯化结果

用饱和硫酸铵法纯化腹水单抗，12%SDS-PAGE还原电泳显示纯化后的HPV16E6/HPV18E7单抗在25KDa、50KDa、75KDa处出现条带，结果见图17。

实施例7 单抗的特异性鉴定

单抗的特异性决定试纸条的特异性，所以对得到的单抗进行特异性鉴定很有必要。本申请采用免疫荧光法鉴定。因为不易获得宫颈癌的组织切片，先用宫颈癌细胞株：CaSki细胞（宫颈癌鳞癌）和Hela细胞（宫颈癌腺癌）进行鉴定。

免疫荧光法的操作步骤如下：

（1）将泡酸灭菌的盖玻片放入无菌的6孔细胞板中，取培养至对数生长期的1*10⁵/ml的CaSki和Hela细胞200ul/片,室温作用10分钟，补加含10%FCS的DMEM值2ml/孔，37℃，5%CO2培养过夜。

（2）37℃的0.01mol/L的PBS（PH7.2）洗片3次，每次10分钟；

（3）用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10-20分钟，200ul/孔，PBS洗片3次，每次10分钟；

（4）1%Triton X-100在室温下打孔10分钟,200ul/孔，PBS洗片3次，每次10分钟；

（5）10%山羊血清封闭，200ul/孔，37℃作用1-2小时，PBS洗片3次，每次10分钟；

（6）加入一抗：将抗HPV16E6的单抗2F10、HPV18E7的单抗2D4以1：500稀释度分别加到生长有CaSki细胞和含Hela细胞的玻片上，200ul/片，同时每种细胞设置一张不加一抗只加二抗的阴性对照和一张只加PBS的空白对照。37℃作用1小时，PBS洗片3次，每次10分钟；

（7）加二抗：将荧光标记的驴抗小鼠IgG稀释1：2000，每片加200ul,室温下作用1小时，不洗片；

（8）加DAPI显色：每孔加DAPI原液50ul染色细胞核，避光，室温下作用20-30分钟，PBS洗片3次，每次10分钟；

（9）荧光显微镜下拍照，用软件photoshopcCS6和IllustratorCS6完成图片的处理。

实施例8 抗HPV16E6单克隆抗体的特异性鉴定结果

免疫荧光结果显示抗HPV16E6单抗2F10与宫颈癌鳞癌细胞株CaSki细胞反应，在细胞核出现红光，Merge后红光信号仍然存在（箭头所指处），与宫颈癌腺体细胞株HeLa细胞反应为出现任何信号，结果请参照图18。

实施例9 抗HPV18E7单抗的特异性鉴定结果

免疫荧光结果显示抗HPV18E7单抗2D4与宫颈癌腺癌细胞株HeLa细胞反应，在细胞核出现红光，Merge后红光信号仍然存在（箭头所指处），而与宫颈癌鳞癌细胞株细胞CaSki反应没有出现任何信号，结果请参照图19。

实施例10 检测HPV16E6和HPV18E7抗原的免疫层析试纸条的制备

下述结合图20至图24，详细说明宫颈脱落细胞HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的制备方法。其中图20，其是HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的技术路线图；图21，其是HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的结构示意图。

参见图21，检测HPV16E6和HPV18E7抗原的免疫层析试纸条，包括底板1，加样区2、乳胶标记区3、反应区4、吸水纸5。其中，底板采用塑料板，加样区和乳胶标记区采用玻纤材料制成，反应区采用NC膜（硝酸纤维素膜）制成，吸水区采用吸水性强的吸水纸制成。加样区、乳胶标记区、反应区、吸水区沿纵向依次排列粘接在底板上，其中反应区的一端位于底板的一个端面，另一端粘接覆盖在乳胶标记区的一个端面上；乳胶标记区的另一端粘接覆盖在反应区的一个端面上；吸水区的一端粘接覆盖在反应区的另一个端面，吸水区的另一端位于底板的另一个端面；反应区依次设置有用于检测宫颈脱落细胞中HPV18E7的第一检测线T1、用于检测宫颈脱落细胞中HPV16E6蛋白的第二检测线T2和质控线C，所述第一、二检测线分别固定有HPV16E6和HPV18E7多抗，所述质控线内固定有生物素-BSA联结物。

质控线和第一、二检测线沿底板纵向排列，质控线和检测线之间不相连，其中第一、二检测线、质控线分别等距离排列，第一检测线T1与第二检测线T2之间的距离为3-5mm，第二检测线T2与质控线C相距3-5mm，质控线位于第二检测线T2的一侧与吸水区相邻，第一检测线的一侧与乳胶标记区相邻，另一侧与第二检测线相邻。

1.HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的制备方法

（1）彩色乳胶颗粒标记HPV16E6和HPV18E7单抗以及亲和素

用0.01M PH7.4的PBS把红色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入HPV16E6和HPV18E7的单抗使单抗的终浓度为0.1mg/ml，用0.01M PH7.4的PBS把蓝色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入亲和素使亲和素的终浓度为0.1mg/ml；4℃反应过夜；加入终浓度为1%的BSA封闭1h。离心，去上清，沉淀用含0.1%BSA的0，01M PH7.4的PBS复溶置于4℃备用。

（2）点乳胶

用含0.1%BSA的0，01M PH7.4的PBS将（1）步中标记好的乳胶抗体和亲和素结合物稀释至合适浓度，喷涂在试纸条上的乳胶标记区，37℃烘干2小时，置于室温备用。

（3）点膜

按照试纸条结构示意图所示，用0.01M PH7.4的PBS分别将兔抗HPV18E7多抗和兔抗HPV16E6多抗稀释至合适的浓度点在硝酸纤维素膜的反应区，分别为检测线T1和T2，检测线T1与T2相距3-5mm。用0.01MPH7.4的PBS将生物素-BSA稀释至合适的浓度点在硝酸纤维素膜上，为质控线C，检测线T2与质控线C相距3-5mm。37℃烘干2小时，置于室温备用。

（4）组装：按照图21的试纸条结构示意图所示，将玻璃纤维、点好的乳胶、点好的膜和吸水纸分别按顺序粘贴在PVC底板上，切成相应宽度装入塑料卡中待用。

2.HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的检测原理

HPV16E6和HPV18E7抗原检测试剂盒（乳胶免疫层析法）采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析技术来定性检测标本中是否含有HPV16E6和HPV18E7抗原。

测试时，将处理过的标本滴入检测卡加样孔内,标本液体与乳胶结合垫中预先包被的用红色乳胶颗粒标记的HPV16E6和HPV18E7单抗及蓝色乳胶标记的亲和素混合。然后，混合物随之在毛细效应下向另一端层析。如果是阳性标本，红色乳胶标记的HPV16E6和HPV18E7单抗先与标本中的HPV16E6和HPV18E7抗原结合形成红色乳胶*抗体-抗原复合物，在层析过程中经过反应区时，复合物会被固定在反应区的另一个HPV16E6和HPV18E7多抗所捕获，形成红色乳胶*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物，在检测线T1或T2内会出现一条或两条红色条带。如果是阴性标本，由于没有HPV16E6和HPV18E7抗原，则检测线T1和T2内不能形成上述夹心复合物，将没有红色条带出现。膜上的质控线C内固定有生物素-BSA联结物，将捕获混合物中层析过来的蓝色乳胶颗粒标记的亲和素，在质控线C形成蓝色乳胶*亲和素-生物素-BSA（固定于膜上）的复合物。因此，无论HPV16E6和HPV18E7抗原是否存在于临床标本中，一条蓝色条带都会出现在质控线C内。质控线C内所显现的蓝色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

3.HPV16E6和HPV18E7抗原检测试纸条的检测结果

（1）单个亚型HPV16E6试纸条的检测结果

在加样孔处加入HPV16E6蛋白，试纸条的检测线上出现红线，质控线出现蓝线，加入PBS和HPV18E7蛋白时，检测线上无反应，质控线出现蓝线，说明无假阳性和无交叉反应，见图22。

（2）单个亚型HPV18E7试纸条的检测结果

在加样孔处加入HPV18E7蛋白，试纸条的检测线上出现红线，质控线出现蓝线，加入PBS和HPV16E6蛋白时，检测线上无反应，质控线出现蓝线，说明无假阳性和无交叉反应，见图23。

（3）HPV16E6与HPV18E7组装后的试纸条的检测结果

HPV16E6与HPV18E7组装的免疫层析试纸条，同时加入HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白，在检测线T1和T2上出现红线，在质控线C上出现蓝线。结果见图24。

上述结果表明：用制备的鼠抗HPV16E6蛋白单抗和鼠抗HPV18E7蛋白单抗去捕获样品中的HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白抗原。免疫组化和免疫荧光证明这两种单抗能够捕获宫颈癌组织中的HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白抗原。

将导致宫颈癌的两个主要高危型HPV16和18型（两者覆盖率大于70%）的检测融合在一张试纸条上，即在同一张试纸条上可以同时或单独检测HPV16E6蛋白和HPV18E7蛋白抗原。

所述试纸用于宫颈癌早期筛查的免疫层析的检测，其检测方法操作方便，结果易于判定，特异性好，灵敏度高，快捷迅速等优点，在检测样品时只需要5-10分钟即可判断结果，因此可达到快速诊断的目的，从而可以推广应用。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (10)

1.一种分泌抗高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为：CCTCC C201401。

2.一种分泌抗高危型人乳头瘤病毒HPV18型E7蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为：CCTCC C201402。

3.权利要求1或/和权利要求2所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

4.一种表达高危型人乳头瘤病毒HPV16型E6蛋白或/和HPV18型E7蛋白的表达载体。

5.一种宿主菌，其特征在于，含有权利要求4所述的表达载体。

6.权利要求3所述的抗体在制备检测高危型人乳头瘤病毒的制剂中的应用。

7.权利要求3所述的抗体在制备检测人宫颈癌的HPV16E6蛋白和/或HPV18E7蛋白的制剂中的应用。

8.一种免疫层析试纸条，其特征在于，含有权利要求3所述的抗体。

9.权利要求8所述的免疫层析试纸条在检测高危型人乳头瘤病毒中的应用。

10.权利要求8所述的免疫层析试纸条在检测人宫颈癌脱落细胞中的HPV16E6蛋白和/或HPV18E7蛋白的应用。

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