CN111333719B - 抗hpv16e7蛋白单抗69a6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

抗hpv16e7蛋白单抗69a6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗HPV16E7蛋白单抗69A6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用，该杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201720，该杂交瘤细胞能够分泌效价高的单克隆抗体，获得抗体能够与HPV16阳性的细胞株CaSki和HPV16阳性宫颈癌鳞癌石蜡组织切片反应，具有很好的特异性；可以作为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒或免疫荧光试剂盒。

Description

抗HPV16E7蛋白单抗69A6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞，还涉及由该细胞分泌的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
宫颈癌是全球妇女癌症中居第四位的癌症，每年新增530，000病例和死亡275，000例，这些病例中大约85％来源于发展中国家。在中国，宫颈癌发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus，HR-HPV)的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的直接病因，其中HPV16型最高，占53％。HPVE7蛋白是HPV致癌的关键分子，E7致癌蛋白选择性表达在肿瘤细胞中，不在正常细胞中表达，随着宫颈上皮内瘤变CIN从低级别向高级别(从CIN1经历CIN2再到CIN3)进展，E7致癌蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高，最终致癌蛋白E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。HR-HPVDNA检测联合细胞学检查(如TCT)，可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3的检出率并减少宫颈癌的发生，共同检测方法也可增加宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。对30～65岁女性进行细胞学和HPVDNA共同检测，不可避免会出现少部分细胞学检查结果阴性但HR-HPVDNA检测阳性者。美国最新的宫颈癌筛查指南提供了2种方案：(1)在12个月时重复细胞学和HR-HPVDNA共同检测。如果重复共同检测时HPVDNA阳性或细胞学检查结果为LSIL或更严重者，则应行阴道镜检查；(2)立即行HPV基因分型检测(HPVl6或HPVl8)。新的筛查指南对HR-HPVDNA检测结果阳性者缺乏肯定、一致的处理方案，而且阴道镜检查是有创伤的检查，也增加患者心理负担和经济负担，主要因为HR-HPV的DNA检测阳性不能预测哪些患者最终发展为宫颈内瘤变CIN1、CIN2、CIN3和宫颈浸润癌，但如果补充检测HR-HPV的E7致癌蛋白比如HPV16E7、HPV18E7致癌蛋白等，就可以间接提示宫颈有癌细胞的存在，很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在，最终达到早期预警、早期诊断和早期治疗宫颈癌的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供抗HPV16E7蛋白单抗69A6；本发明的目的之二在于提供分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞；本发明的目的之三在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6在制备检测抗体中的应用；本发明的目的之五在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6制备检测HPV16E7蛋白的试剂盒中的应用；本发明的目的之六在于提供含有所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、抗HPV16E7蛋白单抗69A6，所述单抗69A6包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6的第50-54位、第69～85位、第118～127位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.8的第46～55位、第71～77位和第110～118位所示。
优选的，单抗重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；单抗轻链氨基酸序列如SEQID NO.8所示。
优选的，单抗重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；单抗轻链核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
更优选的，所述单抗69A6由杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6分泌，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201720。
2、分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201720。
3、所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的制备方法，包括如下步骤：以HPV16E7蛋白为抗原免疫小鼠，用杂交瘤技术将SP2/0与免疫BALB/c小鼠的脾细胞或淋巴结细胞融合，筛选稳定性好、高效价的抗HPV16E7蛋白的杂交瘤细胞株，制备单抗腹水，经纯化获得抗HPV16E7蛋白单抗69A6。
4、所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6在制备检测抗体中的应用。
5、所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6制备检测HPV16E7蛋白的试剂盒中的应用。
6、含有所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的试剂盒。
优选的，所述试剂盒为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或WesternBlot检测试剂盒；更优选的，所述ELISA试剂盒为双抗夹心ELISA试剂盒，以单抗79A11为捕获抗体时，单抗69A6为检测抗体检测抗原HPV16E7蛋白。
本发明的有益效果在于：本发明公开了分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能够分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6，可以用于HPV16E7蛋白的定量检测，并且具有特异性好、灵敏度高的优点，对宫颈癌早期诊断具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Western Blot检测纯化HPV16E7蛋白与组氨酸标签抗体反应结果。
图2为单抗69A6用Protein A纯化的10％SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1～6：纯化蛋白)。
图3为间接ELISA测定单抗69A6的最高效价图。
图4为4对可以配对单抗的单抗。
图5为单抗69A6与CaSki和HeLa的总蛋白的Western Blot反应图。
图6为单抗69A6与CaSki细胞的间接免疫荧光反应结果图(10×40)。
图7为单抗69A6与HeLa细胞的间接免疫荧光反应结果图(10×40)。
图8为单抗69A6与CaSki和HeLa细胞的免疫细胞化学反应(10*20)(单抗69A6从7.8125ng/片两倍增加到1μg/片共8个浓度时，分别与CaSki细胞反应都有棕黄色颗粒出现，分别与HeLa细胞反应都没有出现棕黄色颗粒)。
图9为69A6与HPV16阳性的宫颈癌鳞癌、HPV18阳性的宫颈癌腺癌的免疫组织化学(10*20)(单抗69A6与HPV16阳性的宫颈鳞癌组织反应后都有棕黄色颗粒的出现，而单抗69A6与HPV18阳性的宫颈腺癌组织反应后都没有棕黄色颗粒的出现)。
图10为单抗69A6的表位鉴定结果图(A：重叠肽的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69A6的优势线性B细胞表位；重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69A6的优势线性B细胞表位；C：单抗69A6的表位在HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图中的定位)。
保藏说明
将3株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株79A11、69A6和69E2送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为HPV16E7-79A11、HPV16E7-69A6、HPV16E7-69E2；HPV16E7-79A11保藏日为2017年4月10日，保藏号为CCTCC NO：C201718，分类命名为杂交瘤细胞株HPV16E7-79A11；HPV16E7-69A6保藏日为2017年4月10日，保藏号为CCTCC NO：C201720，分类命名为杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6；HPV16E7-69E2保藏日为2019年8月21日，保藏号为CCTCC NO：C2019181，分类命名为杂交瘤细胞株HPV16E7-69E2。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明用基因工程技术克隆和表达HPV16E7基因，以纯化的HPV16E7蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤技术融合SP2/0分别与免疫BALB/c小鼠的脾细胞和淋巴结细胞，筛选获得8个以上的稳定性好、高效价的抗HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备了单抗腹水，用盐析、亲和层析结合凝胶层析等综合方法纯化得到了8株纯度较高、效价较高的单抗，命名为79A11、69A6、69E2、54G5、54D5、54F4、74F3和72E6。
实施例1、制备HPV16E7蛋白
根据HPV16E7全长基因设计带有6个组氨酸标签的特异性引物，引物F和R的序列如下(下划线为核酸内切酶)：
F:5'-gcccatggaccatcaccatcaccatatgcatggagatacacctac-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5'-gcaagcttttatggtttctgygaacagatggggcacac-3’(SEQ ID NO.2)。
以CaSki细胞基因组总DNA为模板，PCR扩增HPV16E7全长基因，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，55℃～70℃30s和72℃60s 35个循环，72℃延伸7min。NcoⅠ和HindⅢ限制性酶酶切PCR产物HV16E7基因片段和质粒pET-28a(+)，将鉴定正确的重组质粒pET-28a(+)-HPV16E7转化感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS，将工程菌pET-28a(+)-HPV16E7-Rosetta(DE3)pLysS在LB培养基中1mM IPTG在37℃诱导4h，破菌液离心，12％SDS-PAGE电泳确定蛋白的表达量和表达形式，用镍柱亲和层析结合阴离子交换层析纯化HPV16E7蛋白，获得纯度大于95％的HPV16E7蛋白。Western Blot分析如图1所示，结果显示表达的HPV16E7蛋白的表达量较高，且呈可溶性表达，分子量大约在18kDa，HPV16E7蛋白的预测的理论分子量大约为11988.32Da，接近12kDa，PI＝4.59。但目前表达的HPV16E7蛋白的分子量在18kDa，大于HPV16E7蛋白的理论分子量12kDa，HPV16E7蛋白出现电泳异常行为现象，原因正如文献(Armstrong DJ and Roman A.Biochem Biophys Res Commun,1993)指出野生型的HPV16E7蛋白因为带有大量的负电荷，所以HPV16E7蛋白在电泳时会在14～21kDa迁移，本研究表达的HPV16E7蛋白表达的分子量大约在18kDa，正好与文献报道的HPV16E7蛋白在14～21kDa迁移相符合。
其中PCR扩增产物序列如(SEQ ID NO.3)所示：
gcccatggaccatcaccatcaccatatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctactgttatgagcaattcaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttcacagaaaccataa
编码的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.4
MDHHHHHMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQFNDSSE
EEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
实施例2、抗HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备
用杂交瘤技术以HPV16E7蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的后腿腹股沟淋巴结B淋巴细胞和脾脏细胞分别与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合，培养筛选、多次克隆化获得抗HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，结果如表1和表2所示。
表1展示了脾脏来源的效价高的阳性多克隆杂交瘤细胞株，经过多次克隆化后筛选的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的名称、细胞上清液的抗体的OD450nm值和抗体亚型，其中效价高和亚型非常明确的单抗有79A11(IgM)、38E11(IgM)、74F3(IgG2a为主)和72E6(亚型不明确)。从中可以看出脾脏来源的单抗抗体的亚型主要是IgM。
表1、来源于脾细胞的阳性多克隆和单克隆杂交瘤细胞株
Figure GDA0003182945510000041
表2展示了腹股沟淋巴结来源的效价高的阳性多克隆杂交瘤细胞株，经过多次克隆化后筛选的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的名称、细胞上清液的抗体的OD450nm值和抗体亚型，其中效价高和亚型非常明确的单抗有69E2、69A6、69D10、69B11、54D5、54F4和54G5等，其中单抗69A6的亚型为IgM，其余的单抗69E2、69D10、69B11、54D5、54F4和54G5亚型都为IgG2a，说明淋巴结来源的单克隆抗体的亚型主要是IgG2a。
表2、来源于淋巴结细胞的阳性多克隆和单克隆杂交瘤细胞株
Figure GDA0003182945510000051
单抗亚型鉴定及制备单抗腹水，分别按IgM和IgG的纯化方案纯化单抗。
单克隆抗体的亚型鉴定：用单抗亚型鉴定试剂盒鉴定阳性单克隆抗体细胞上清液的亚型有两种：IgG2a和IgM。IgG2a亚型的阳性单克隆杂交瘤细胞株来源于淋巴结，如69E2、69D10、69B11、54D5、54F4、54G5；IgM亚型的阳性单克隆杂交瘤细胞株主要来源于脾脏，主要有79A11、56E4、38E11等，而脾脏来源的单抗74F3的亚型不明确，但以IgG2a为主，脾脏来源的单抗72E6的亚型也不明确；淋巴结来源的单抗69A6的亚型也是IgM。(表3)。
表3、单抗亚型鉴定的OD450nm值及其亚型结果
Figure GDA0003182945510000052
Figure GDA0003182945510000061
单抗腹水制备、收集和保存：
动物体内诱生法制备单抗腹水，结果显示实际注射BALB/c小鼠的杂交瘤细胞数量是：1.5*106-2.7*106/只，大部分的小鼠产生腹水的体积在3-5mL/只之间，小部分可以达到8-10mL/只，注射到2.0*106/只产生的腹水多于1.5*106/只。用9号针头在消毒腹部后进入腹腔抽取腹水，腹水收集后4℃离心，细胞可以加细胞冻存液冻存，这种细胞以后复苏后会生长得更好，上清液为腹水单抗，在56℃水浴锅里灭活45min后加入同体积的甘油放在-80℃保存。
以2μg/mL包被抗原HPV16E7蛋白，间接ELISA法一共检测了25株单抗腹水，抗体稀释度从1:5000开始倍比稀释到1:5120000，信噪比S/N值≥2.1为阳性判断阳性来最高效价，信噪比S/N＝待测样品的OD值/阴性对照的OD值，25株中的单抗腹水最高效价在1:128000以上的单抗腹水有11株：79A11、69E2、69A6、69A11、69B11、38E11、54D5、54F4、54G5、56E4和56E5(见表4)。
表4、效价≥1:128000的11株单抗腹水的最高效价
Figure GDA0003182945510000062
间接ELISA测定纯化后的单抗的效价：
间接ELISA法测定纯化后的8株纯度较高的单抗，以信噪比S/N≥2.1判断为阳性，单抗79A11、69A6、69E2、54G5、54D5、54F4、74F3和72E6的最高效价依次为6.25ng、0.78ng、0.19ng、1.56ng、0.39ng、1.56ng、6.25ng和6.25ng(表5)。
表5、纯化后的8株单抗的效价
Figure GDA0003182945510000063
用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗69E2的纯度高达95％以上，而且效价高大约0.19ng；用二步法-辛酸-硫酸铵+Protein A法纯化IgM亚型的单抗69A6的纯度高达95％以上，69A6的效价在0.78ng；用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层析加IgM柱加凝胶过滤层析纯化的IgM亚型单抗79A11的纯度高达95％以上，单抗79A11效价大约6.25ng。单抗的高纯度和高活性对于后续的单抗的表征分析和检测方法的建立很重要。
将稳定分泌抗体79A11、69A6、69E2的杂交瘤细胞株送中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为HPV16E7-79A11、HPV16E7-69A6、HPV16E7-69E2；HPV16E7-79A11保藏日为2017年4月10日，保藏号为CCTCC NO：C201718，分类命名为杂交瘤细胞株HPV16E7-79A11；HPV16E7-69A6保藏日为2017年4月10日，保藏号为CCTCC NO：C201720，分类命名为杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6；HPV16E7-69E2保藏日为2019年8月21日，保藏号为CCTCC NO：C2019181，分类命名为杂交瘤细胞株HPV16E7-69E2。
实施例3、单抗的制备及鉴定
采用体内诱生法制备抗HPV16E7蛋白的单抗腹水，先用辛酸-饱和硫酸铵法初步纯化单抗69A6的腹水，再进一步用Protein A纯化单抗69A6，可以发现在分子量大约68kDa和25kDa处分别出现两条带，正好与IgM抗体的重链和轻链的分子量一致，没有发现其他杂带(见图2)。说明用辛酸-饱和硫酸铵法结合Protein A纯化单抗69A6的纯度较高，可以用于单抗的鉴定和检测。
将单克隆抗体杂交瘤细胞株69A6送到南京金斯瑞生物技术有限公司，该公司测定单抗69A6的核苷酸序列，再用单抗69A6的核苷酸序列预测单抗69A6的氨基酸序列，结果如下：
重链核酸序列如SEQ ID NO.5(1782bp)所示，结构为Leadersequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon：具体核酸序列如下，黑体为CDR序列：
Figure GDA0003182945510000071
编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6(593aa)所示，结构为Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon，具体序列如下，，黑体为CDR序列：
Figure GDA0003182945510000081
轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.7(708bp)所示，Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon，具体序列如下，黑体为CDR序列：
Figure GDA0003182945510000082
轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8(235aa)所示，结构为Light chain:Amino acidssequence，具体序列如下，黑体为CDR序列：
Figure GDA0003182945510000083
实施例4、单抗69A6检测
1、用间接ELISA法检测单抗69A6的最高效价
包被抗原HPV16E7全蛋白2μg/ml，单抗69A6从4μg/ml倍比稀释至0.1953μg/ml，100μl/well，12个浓度的单抗69A6分别与抗原HPV16E7全蛋白反应，单抗69A6在0.7813ng时的S/N在2.313，大于2.1，单抗69A6在0.7813ng以上时S/N都大于3.4，所以单抗69A6的最高效价为0.7813ng，见表6和图3。
表6、间接ELISA法测定单抗69A6的最高效价结果
Figure GDA0003182945510000091
2、单抗69A6与其他单抗配对
单抗69A6不标记辣根过氧化物酶HRP作为捕获抗体，与其他7株标记了HRP的抗HPV16E7蛋白的单抗(79A11-HRP、69E2-HRP、54D5-HRP、54G5-HRP、54F4-HRP、74F3-HRP、72E6-HRP)作为检测抗体配对，进行双抗夹心ELISA实验；单抗69A6标记辣根过氧化物酶HRP作为检测抗体，与其他7株没有标记了HRP的抗HPV16E7蛋白的单抗(79A11、69E2、54D5、54G5、54F4、74F3、65B4)作为捕获抗体配对，进行双抗夹心ELISA实验。
结果：56对配对单抗中，有4对单抗可以配对：79A11与69E2-HRP、79A11与74F3-HRP、79A11与69A6-HRP、79A11与54D5-HRP(见图4)。对于单抗69A6来说，只有当单抗79A11为捕获抗体时，单抗69A6-HRP为检测抗体配对检测抗原HPV16E7蛋白时，有比较强的阳性信号；单抗69A6为捕获抗体时与其他7株单抗配对没有阳性信号。说明单抗69A6在双抗夹心ELISA中不适合做捕获抗体，适合作为检测抗体。
3、抗HPV16E7蛋白单抗69A6的有效性和特异性鉴定
用Western Blot、间接免疫荧光、免疫细胞化学和免疫组织化学验证抗HPV16E7蛋白单抗69A6的有效性和特异性。
A.用Western Blot验证抗HPV16E7蛋白单抗69A6的有效性和特异性
培养和收集CaSki和HeLa细胞，用RIPA提取CaSki和HeLa细胞中的总蛋白，CaSki细胞总蛋白中含有HPV16E7蛋白，HeLa细胞中的总蛋白中含有HPV18E7蛋白，先用12％SDS-PAGE电泳分离CaSki和HeLa细胞中的总蛋白以及一个带有组氨酸标签的其他蛋白c-myc(his-tag-c-myc，分子量62kDa)，再将胶转印到NC膜上，然后再用5％脱脂乳封闭NC膜，再将一抗69A6用PBS配置成1μg/ml，分别与NC膜上的蛋白反应，加二抗羊抗鼠IgG-HRP，加ECL发光液曝光后拍照。Western Blot结果显示单抗69A6与一个带有组氨酸标签的其他蛋白c-myc(his-tag-c-myc)反应后没有曝光的条带出现，提示单抗69A6与组氨酸标签不发生反应；当单抗69A6与CaSki细胞总蛋白反应大约在18kDa处出现一条强的曝光条带，而与HeLa细胞总蛋白反应都没有出现曝光条带(图5)，验证了单抗在Western Blot中检测HPV16E7蛋白的有效性和特异性，提示单抗69A6在Western Blot中检测HPV16E7蛋白具有潜在应用价值。
B.间接免疫荧光
先制备宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的细胞爬片，再把单抗69A6配制成不同的浓度分别与CaSki和HeLa的细胞反应(按1μg/孔，0.5μg/孔，0.25μg/孔，0.125μg/孔，0.0625μg/孔，0.03125μg/孔，0.015625μg/孔，0.0078125μg/孔)，加二抗羊抗鼠IgG-绿色荧光。间接免疫荧光的结果如图6和图7所示。间接免疫荧光结果显示，当单抗69A6的用量从7.8125ng/孔两倍逐渐增加到1μg/孔时，在CaSki细胞的细胞核出现逐渐增强的绿色荧光，即反应灵敏度至少为7.8125ng/孔；单抗69A6在上述多个同样的浓度时与HPV18阳性的HeLa细胞反应，均无绿色荧光(图6和图7)。基于HPV16E7单克隆抗体69A6的性质，初步建立了HPV16E7蛋白免疫荧光试剂盒，灵敏度至少为7.8125ng/孔。
C.单抗69A6在免疫细胞化学中的应用
使用一抗为69A6的单抗，使用量分别为1μg/孔，0.5μg/孔，0.25μg/孔，0.125μg/孔，0.0625μg/孔，0.03125μg/孔，0.015625μg/孔，0.0078125μg/孔，与含HPV16型的CaSki细胞进行反应，当一抗在很低含量即7.8125ng/孔时，均仍然有浅浅的棕黄色的颗粒出现，即反应灵敏度至少为7.8125ng/孔，说明69A6单抗可以检测到HPV16型的CaSki细胞的HPV16E7蛋白，初步验证69A6单抗在免疫细胞化学中检测HPV16E7蛋白的有效性；在使用同样浓度的一抗与二抗用量时，与HPV18型的HeLa细胞反应，都没有出现棕黄色的颗粒，说明69A6单抗都不与含HPV18型的HeLa细胞的HPV18E7蛋白发生反应，验证了69A6单抗免疫细胞化学中的特异性。单抗69A6为代表展示免疫细胞化学的反应图(见图8)。说明69A6单抗在免疫细胞化学中检测天然的HPV16E7蛋白具有潜在应用价值。
D.单抗69A6在免疫组织化学中的应用
单抗69A6用于免疫组织化学中，单抗69A6的用量为1.84μg/片分别与HPV16阳性的宫颈鳞癌组织反应后都主要在细胞核中出现典型的棕黄色颗粒，而与宫颈腺癌组织反应后没有出现棕黄色颗粒，阴性对照和空白都没有出现棕黄色颗粒(见图9)。根据抗体与抗原发生特异性反应的知识，单抗69A6可以与HPV16阳性的宫颈鳞癌组织反应后出现棕黄色颗粒的结果，说明单抗69A6可以检测到HPV16阳性的宫颈癌鳞癌中的天然的HPV16E7蛋白，而单抗69A6与HPV18阳性的宫颈腺癌组织反应后都没有出现棕黄色颗粒的结果，说明这单抗69A6不能检测到HPV18阳性的宫颈癌鳞癌中的HPV18E7蛋白，验证了单抗69A6检测HPV16E7蛋白的特异性和有效性，提示单抗69A6在免疫组织化学方法中检测HPV16E7蛋白具有潜在的应用价值。
实施例5、单抗69A6的表位鉴定
(1)HPV16E7步移重叠18肽的合成
明确HPV16E7氨基酸序列：在NCBI网站中查到CaSki細胞株里面的的HPV16 E7蛋白序列(Seguence ID:NC-001526.2)。HPV16 E7蛋白全长98个氨基酸，具体氨基酸序列如下：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO.9)。
短肽合成：从1号氨基酸开始一次步移6个氨基酸，设计含18个氨基酸的重叠肽，委托上海强耀公司合成，共15条，纯度大于95％，用DMSO溶解合成的重叠肽至1mg/ml的储存浓度，分装后于-80℃保存。
(2)重叠肽的间接ELISA法筛选抗HPV16E7单抗69A6的优势线性B细胞表位
A、间接ELISA的棋盘实验
(1)包被抗原：HPV16E7全蛋白，将HPV16E7全蛋白配置成4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，每个浓度包被12孔，100μl/孔，4℃过夜，第二日用PBST洗板4次，每次3分钟；
(2)封闭：用PBST配制1.5％BSA，250μl/孔，37℃2h，用PBST洗板3次，每次3分钟；
(3)加一抗：将单抗69A6分别配制第一个梯度为4μg/ml，依次倍比稀释8个梯度，分别加入含4个浓度的抗原孔，100μl/孔，第9、10、11、12列依次为HPV16E7的阳性血清、阴性血清、二抗对照和空白对照，100μl/孔，37℃1h，用PBST洗板4次，每次3分钟；
(4)加二抗：将CST公司的货号7076S的Anti-mouse IgG-HRP以1:3000稀释，100μl/孔，37℃45分钟，用PBST洗板4次，每次3分钟；
(5)加TMB显色液：将北京索莱宝PR1210的TMB双组份的显色试剂盒中的A液和B液以1:1稀释，100μl/孔，37℃5-8分钟；
(6)终止反应：加2MH2SO4，50μl/孔；
(7)测定OD450nm及数据分析。
B、重叠肽在1μmol/L时的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69A6的优势线性B细胞表位
(1)包被抗原HPV16E7全蛋白：选择棋盘实验中OD450nm在0.7-0.8的抗原和抗体比例包被HPV16E7全蛋白。对于单抗79A11的抗原包被浓度为1μg/ml，对应的单抗79A11与重叠肽反应的浓度为1μg/ml；对于单抗69E2的抗原包被浓度为0.25μg/ml，对应的单抗69E2与重叠肽反应的浓度为0.125μg/ml，100μl/孔，4℃过夜第二日用PBST洗板4次，每次3分钟；
(2)封闭：用PBST配制1.0％BSA，250μl/孔，37℃2h，用PBST洗板3次，每次3分钟；
(3)加一抗和重叠肽反应的混合物：将单抗69A6分别配制2μg/ml，把15个重叠肽配成2μmol/L，同时将BSA配成2mg/ml，将单抗分别与重叠肽、BSA、PBST以1:1比例混合，25℃震荡反应30分钟后加入板中，100μl/孔，37℃1h，用PBST洗板4次，每次3分钟；
(4)加二抗：将CST公司的货号7076S的Anti-mouse IgG-HRP以1:3000稀释，100μl/孔，37℃45分钟，用PBST洗板4次，每次3分钟；
(5)加TMB显色液：将北京索莱宝PR1210的TMB双组份的显色试剂盒中的A液和B液以1:1稀释，100μl/孔，37℃5-8分钟；
(6)终止反应：加2M H2SO4，50μl/孔；
(7)测定OD450nm及数据分析。
结果如图10中A所示：重叠肽的间接ELISA法显示单抗69A6与重叠肽HPV16E749-66的反应信号最强(P<0.01)，与重叠肽HPV16E749-66的前后重叠肽HPV16E743-60和HPV16E755-72、HPV16E761-78都有反应，符合重叠肽反应的规律。
C.重叠肽在10μmol/L的间接竞争ELISA法初步筛选单抗的优势线性B细胞表位
因为包被重叠肽的间接ELISA中单抗只能筛选到疏水性强的氨基酸的肽段，但会漏掉亲水性抢的氨基酸肽段，所以用间接竞争ELISA筛选含亲水性强的氨基酸肽段。由于重叠肽在1μmol/L时，单抗69A6抑制重叠肽时的OD450nm没有到达二抗对照的OD450nm，所以需要提高重叠肽的浓度到10μmol/L。当重叠肽在1μmol/L时，被单抗69A6抑制的重叠肽有4个：HPV16E749-66、HPV16E767-84、HPV16E773-90和HPV16E785-98，它们的抑制率依次为15.57％、47.29％、56.2％和48.59％，抑制率≥50％为阳性，小于50％为阴性。抑制率大部分达不到要求，所以提高重叠肽的浓度。
在方法上与重叠肽在1μmol/L的间接竞争ELISA法的一个不同点是加一抗和重叠肽反应的混合物：将单抗69A6配制成2μg/ml，选择重叠肽在1μmol/L时被单抗抑制的几个重叠肽段和1-2个没有被单抗抑制的重叠肽段为阴性对照，BSA为阳性对照。把几个重叠肽配成20μmol/L，同时将BSA配成20mg/ml，将单抗分别与重叠肽、BSA、PBST以1:1比例混合，25℃震荡反应30分钟后加入板中，其余步骤同1μmol/L。
结果如图10中.B所示：重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA法显示单抗69A6可以抑制肽段HPV16E749-66、HPV16E767-84、HPV16E773-90和HPV16E785-98的抑制率依次为16.28％、91.58％、93.45％和92.01％，其中HPV16E767-84、HPV16E773-90和HPV16E785-98的抑制率大于50％，为阳性，与阴性对照相比具有极显著差异(P<0.01)；但是肽段HPV16E749-66的抑制率为16.28％，抑制率小于50％，原因不清楚。
综合间接ELISA和间接竞争ELISA结果，可以发现单抗69A6与4个重叠肽段HPV16E767-84、HPV16E773-90和HPV16E785-98、HPV16E749-66都有特异结合，但是具体的表位是哪些氨基酸不是很清楚。目前虽然没有检索到HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图，HPV16E7蛋白的氨基酸序列与HPV45E7蛋白的氨基酸序列同源性较高46％，HPV45E7蛋白有晶体结构。利用SWISS-MODEL同源建模，获得以HPV45蛋白为模型的HPV16E7蛋白的第46-97位氨基酸的三维晶体结构建模图。用PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System 2.2.0)呈现HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图，目前只解析了HPV16E7蛋白的第46-97aa的结构，两个HPV16E7蛋白单体可以通过锌结合结构域连成二聚体，呈二重旋转对称轴，二级结构主要为α螺旋。用圆二色谱测定获得的HPV16E7蛋白的二级结构的确为α螺旋。将间接ELISA中单抗有反应的肽和间接竞争ELISA显示有阳性抑制率的肽标示在HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图中，标示为绿色的肽段是单抗69A6有特异性结合的肽段部分；标示为蓝色的是单抗79A11的有特异结合的肽段部分(图10中C)。结合单抗69A6与单抗79A11可以配对的结果可以推断单抗69A6与单抗79A11分别与HPV16E7蛋白的两个单体的表位反应，这样才能配对而不发生冲突。
因此，本发明制得的单抗69A6可以用于制备检测HPV16E7蛋白双抗夹心ELISA试剂盒包括化学发光免疫分析法、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒，还可以制备免疫层析试纸、磁珠试剂盒等。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 抗HPV16E7蛋白单抗69A6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccatggac catcaccatc accatatgca tggagataca cctac 45
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaagctttt atggtttctg ygaacagatg gggcacac 38
<210> 3
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccatggac catcaccatc accatatgca tggagataca cctacattgc atgaatatat 60
gttagatttg caaccagaga caactgatct ctactgttat gagcaattca atgacagctc 120
agaggaggag gatgaaatag atggtccagc tggacaagca gaaccggaca gagcccatta 180
caatattgta accttttgtt gcaagtgtga ctctacgctt cggttgtgcg tacaaagcac 240
acacgtagac attcgtactt tggaagacct gttaatgggc acactaggaa ttgtgtgccc 300
catctgttca cagaaaccat aa 322
<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asp His His His His His Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His
1 5 10 15
Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr
20 25 30
Glu Gln Phe Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
35 40 45
Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
50 55 60
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
65 70 75 80
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
85 90 95
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
100 105
<210> 5
<211> 1782
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gacaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240
gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acataattac 360
tacggtagtt cgtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagagagt 420
cagtccttcc caaatgtctt ccccctcgtc tcctgcgaga gccccctgtc tgataagaat 480
ctggtggcca tgggctgcct ggcccgggac ttcctgccca gcaccatttc cttcacctgg 540
aactaccaga acaacactga agtcatccag ggtatcagaa ccttcccaac actgaggaca 600
gggggcaagt acctagccac ctcgcaggtg ttgctgtctc ccaagagcat ccttgaaggt 660
tcagatgaat acctggtatg caaaatccac tacggaggca aaaacagaga tctgcatgtg 720
cccattccag ctgtcgcaga gatgaacccc aatgtaaatg tgttcgtccc accacgggat 780
ggcttctctg gccctgcacc acgcaagtct aaactcatct gcgaggccac gaacttcact 840
ccaaaaccga tcacagtatc ctggctaaag gatgggaagc tcgtggaatc tggcttcacc 900
acagatccgg tgaccatcga gaacaaagga tccacacccc aaacctacaa ggtcataagc 960
acacttacca tctctgaaat cgactggctg aacctgaatg tgtacacctg ccgtgtggat 1020
cacaggggtc tcaccttctt gaagaacgtg tcctccacat gtgctgccag tccctccaca 1080
gacatcctaa ccttcaccat ccccccctcc tttgccgaca tcttcctcag caagtccgct 1140
aacctgacct gtctggtctc aaacctggca acctatgaaa ccctgaatat ctcctgggct 1200
tctcaaagtg gtgaaccact ggaaaccaaa attaaaatca tggaaagcca tcccaatggc 1260
accttcagtg ctaagggtgt ggctagtgtt tgtgtggaag actggaataa caggaaggaa 1320
tttgtgtgta ctgtgactca cagggatctg ccttcaccac agaagaaatt catctcaaaa 1380
cccaatgagg tgcacaaaca tccacctgct gtgtacctgc tgccaccagc tcgtgagcaa 1440
ctgaacctga gggagtcagc cacagtcacc tgcctggtga agggcttctc tcctgcagac 1500
atcagtgtgc agtggcttca gagagggcaa ctcttgcccc aagagaagta tgtgaccagt 1560
gccccgatgc cagagcctgg ggccccaggc ttctacttta cccacagcat cctgactgtg 1620
acagaggagg aatggaactc cggagagacc tatacctgtg ttgtaggcca cgaggccctg 1680
ccacacctgg tgaccgagag gaccgtggac aagtccactg gtaaacccac actgtacaat 1740
gtctccctga tcatgtctga cacaggcggc acctgctatt ga 1782
<210> 6
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Glu Ser Gln Ser Phe Pro
130 135 140
Asn Val Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn
145 150 155 160
Leu Val Ala Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile
165 170 175
Ser Phe Thr Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile
180 185 190
Arg Thr Phe Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser
195 200 205
Gln Val Leu Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr
210 215 220
Leu Val Cys Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val
225 230 235 240
Pro Ile Pro Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val
245 250 255
Pro Pro Arg Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu
260 265 270
Ile Cys Glu Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp
275 280 285
Leu Lys Asp Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val
290 295 300
Thr Ile Glu Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser
305 310 315 320
Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr
325 330 335
Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser
340 345 350
Thr Cys Ala Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro
355 360 365
Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Ser Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala
385 390 395 400
Ser Gln Ser Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser
405 410 415
His Pro Asn Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val
420 425 430
Glu Asp Trp Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg
435 440 445
Asp Leu Pro Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val
450 455 460
His Lys His Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln
465 470 475 480
Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
485 490 495
Ser Pro Ala Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu
500 505 510
Pro Gln Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala
515 520 525
Pro Gly Phe Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu
530 535 540
Trp Asn Ser Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu
545 550 555 560
Pro His Leu Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro
565 570 575
Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys
580 585 590
Tyr
<210> 7
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180
ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc 360
tcggggacaa agttggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480
taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540
ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600
acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660
acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708
<210> 8
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
165 170 175
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
195 200 205
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
210 215 220
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 9
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro

Claims (6)

1.抗HPV16 E7 蛋白的单抗69A6，其特征在于：单抗重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；单抗轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8 所示。
2.分泌权利要求1 所述抗HPV16E7 蛋白的单抗69A6 的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201720。
3.权利要求1 所述抗HPV16E7 蛋白的单抗69A6 在制备检测HPV16E7 蛋白的抗体中的应用。
4.权利要求1 所述抗HPV16E7 蛋白的单抗69A6 在制备检测HPV16E7 蛋白的试剂盒中的应用。
5.含有权利要求1 所述抗HPV16E7 蛋白的单抗69A6 的试剂盒。
6.根据权利要求5 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为ELISA 试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或Western Blot 检测试剂盒。
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