CN115838422B - 一种细胞快速融合技术制备的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞快速融合技术制备的单克隆抗体。本发明针对人钙网蛋白采用改进的快速单克隆抗体免疫及融合技术筛选获得了特异性的单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性，而且所述单抗还具有一定的肿瘤细胞增殖抑制效果，具有双重功效。并且通过包被抗体和酶标抗体的配对使用后，能够较好的用于检测钙网蛋白。

Description

一种细胞快速融合技术制备的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种细胞快速融合技术制备的单克隆抗体。

背景技术

钙网蛋白(CRT)是一种高度保守的内质网伴侣蛋白，参与各种细胞活动过程。1974年，CRT被分离出来，并被鉴定为钙离子结合蛋白。人类CRT基因位于第l9号染色体，由9个外显子和8内含子构成，其开放性阅读框架长度为1254bp，编码由417个氨基酸组成的酸性蛋白质。CRT主要定位于内质网，在内质网内外均具有多种功能。它由N末端可切割的信号序列和1个C末端内质网赖氨酸一天冬氨酸一谷氨酸一亮氨酸(KDEL)定位信号组成。CRT的结构预测表明，该蛋白质由3个结构域组成，即N结构域、P结构域(高亲和性、低容量)和C结构域(低亲和性、高容量)。富含脯氨酸的P结构域包含两组3个重复区域。这些重复的氨基酸序列形成凝集素样分子伴侣结构，该结构使得CRT具有蛋白质折叠功能。此外，CRT的P结构域也是一个高亲和力和低容量的钙离子结合区。

研究表明，CRT在肿瘤组织中的表达水平显著高于其在正常组织。有研究表明，在胃癌和乳腺癌中.CRT的表达水平与临床分期和淋巴结转移呈正相关。此外，CRT表达水平较高的胰腺癌和食管鳞状细胞癌患者生存率非常低。有研究结果显示，CRT表达水平在口腔癌、乳腺导管癌、结直肠癌中呈显著上调。此外，CRT的表达水平不仅在膀胱癌组织中增高，尿中的CRT也被证实可以作为检测膀胱尿路上皮癌的一种有用的生物标志物。钙网蛋白高表达在肿瘤进展中可能发挥着关键作用。另一方面，CRT在卵巢癌进展中的作用尚无定论。与原发肿瘤和实性器官转移相比。在伴恶性胸腔积液的高分化卵巢癌中，CRT的表达随着疾病的进展表达下降。另外，积液中CRT的表达水平可能与化疗更相关。且生存率与CRT的表达是不相关的。更进一步地说。在神经母细胞瘤中CRT的高表达被证明具有更好的预后和组织学分化类型。因此，CRT对肿瘤的形成和进展的影响取决于不同的细胞类型和临床分期。最近，在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中检测到了CRT基因的突变。这些CRT的突变，包括52bp缺失和插入5bp某些碱基对将导致移码突变。由突变的CRT基因所编码的蛋白缺乏C一末端KDEL域，因此其可能会影响正常钙离子的结合和细胞生长。

此前的研究表明，针对71例膀胱癌患者尿液标本，用免疫印记研究表明膀胱癌患者尿液中CRT的检测敏感性为73.5，特异性为86。此外也有报道检测组织钙网蛋白的表达用于前列腺癌的诊断，但用的方法为免疫组化法。钙网蛋白作为肿瘤标记物用于肿瘤的诊断研究才起步，目前报道的有关钙网蛋白检测主要是免疫印记法和免疫组化法，不利于临床推广使用。

因此，开发一种能够快速检测钙网蛋白的ELISA试剂盒从而实现钙网蛋白的快速检测是目前重要的研究方向。

发明内容

针对现有技术的试剂盒存在检测不精确、检测限高、检测时间长，而导致不能够敏感，本发明提供一种钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法，能够更精确的测试钙网蛋白，更精确、敏感性更高。

本发明改进了细胞快速融合技术，具体的，是在免疫环节，由于改良免疫法只需二次基础免疫而常规免疫法则需要2倍于改良法的免疫次数，所以改良法抗原用量明显少于常规法，从而大大减少了实验成本的消耗。

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性针对钙网蛋白的单克隆抗体。

更具体的，所述抗体是CRT11a-5或者CRT4b-7。

更具体的，CRT11a-5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTKQTWIFYKMKQLYWFLQRPGQSPQLLIYAKNNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCWNDLWCMIVFGSGTKLEIK

CRT11a-5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

VKPGGSLKLSCAASGKCGKECIMSWVRQTPDKRLEWVAIEKMDMYRSYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCDVHCSKKPMNAWGQGTTVTVS

CRT4b-7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTEEMAARHQPGLLYWFLQRPGQSPQLLIYAKWNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCPVFVLIVCDFGSGTKLEIK

CRT4b-7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

VKPGGSLKLSCAASYQIAEDNFMSWVRQTPDKRLEWVAINRIFLQAFYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCQGNAVVTSECNWGQGTTVTVS。

所述抗体为能够结合钙网蛋白的抗体变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少85％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：2至少85％相同。其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：3至少85％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：4至少85％相同。

所述抗体为能够结合钙网蛋白的抗体变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少80％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：2至少80％相同。其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：3至少80％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：4至少80％相同。

所述抗体为能够结合钙网蛋白的抗体变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少75％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：2至少75％相同。其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：3至少75％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：4至少75％相同。

所述抗体为能够结合钙网蛋白的抗体变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少70％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：2至少70％相同。其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：3至少70％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：4至少70％相同。

进一步的，本发明的单克隆抗体的可变区序列可以被保守取代。保守替代意指将属于特定物理-化学组的一个氨基酸用属于同一物理-化学组的氨基酸替换。物理-化学组如下定义：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸。具有不带电荷的极性侧链的氨基酸组包含天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、和胱氨酸。具有带正电荷的极性侧链的氨基酸的物理-化学组包含赖氨酸、精氨酸、和组氨酸。具有带负电荷的极性侧链的氨基酸的物理-化学组包含天冬氨酸和谷氨酸，其羧酸根阴离子又称为天冬氨酸根和谷氨酸根。

进一步的，抗体可与可检测标记物缀合；例如，一种可通过ELISA检测的可检测标记物，分光光度法，流式细胞术，显微镜或诊断成像技术(例如计算机断层摄影(CT)，计算机轴向断层摄影(CAT)扫描，磁共振成像(MRI)，核磁共振成像(NMRI)，磁共振断层摄影(MTR)，超声，纤维光学检查和腹腔镜检查)。可检测标记物的具体，非限制性例子包括荧光团，化学发光剂，酶键，放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，5-二甲基胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白，镧系磷光体等。生物发光标记也是有用的，例如荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可与可用于检测的酶缀合，例如辣根过氧化物酶，-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶偶联时，可通过加入酶用于产生可被识别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致有色反应产物，该有色反应产物在视觉上是可检测的。抗体或抗原结合片段也可与生物素缀合，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。应当注意，亲和素本身可以与酶或荧光标记缀合。

更进一步的，本发明提供钙网蛋白单克隆抗体在制备用于钙网蛋白检测的试剂盒中的用途。

更进一步的，本发明还提供了CRT11a-5作为包被抗体和CRT4b-7为酶标抗体制备的检测ELISA试剂盒。

更进一步的，本发明制备的钙网蛋白单克隆抗体还能够抑制HepG2细胞增殖能力，具有更广阔的应用前景。

更进一步的，本发明的ELISA检测试剂盒中包被抗体的浓度为1μg/mL；酶标抗体的浓度为0.5μg/mL。

更进一步的，本发明对所述检查板没有特殊限制，采用本领域所熟知的96孔板即可。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括所述样本稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。所述洗涤液还可以为含体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液，更优选为含体积浓度0.05％Tween-20的PBS溶液。所述底物显色液优选为单组分TMB底物显色液。终止液为2M的H₂SO₄溶液。

在本发明中，抗体为碱性磷酸酶标记，具体流程如下：取1mg碱性磷酸酶AP溶于200μL 0.3mol/L pH8.0的NaHCO₃缓冲液中；加1mL 0.06mol/L的过碘酸钠，室温下避光轻搅0.5h；加1mL 0.16mol/L的乙二醇，室温下轻搅lh，终止氧化；在0.01mol/L pH9.5的CB缓冲液中4℃透析过夜；于1mg醛化AP中加含0.5mg抗体的CB缓冲液1mL，室温避光轻搅3h；加入5mgNaHB₄，放4℃过夜；在0.01mol/L，pH7.2 PBS中4℃透析24h；4℃，4000rpm离心30min，除去沉淀即得到标记的单抗。

更优先的，本发明的洗板液含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4PBS。

更优选的，本发明的封闭液5％BSA的0.05M pH9.6CB。

进一步的，本发明的显色剂为反应底物对硝基苯磷酸盐pNPP，其是将pNPP以10mmol/L的浓度溶于含1mmol/LMgCl₂的0.1mol/L二乙醇胺缓冲液(pH 9.8)制备而得。

更进一步的，本发明的ELISA试剂盒可以用于癌症的诊断。

有益效果

本发明针对人钙网蛋白采用改进的快速单克隆抗体免疫及融合技术筛选获得了特异性的单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性，而且所述单抗还具有一定的肿瘤细胞增殖抑制效果，具有双重功效。并且通过包被抗体和酶标抗体的配对使用后，能够较好的用于检测钙网蛋白。

附图说明

图1抗体对HepG2细胞增殖能力的结果图

图2抗体亚型鉴定结果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1钙网蛋白单克隆抗体的制备

钙网蛋白(上海禾午生物科技有限公司，货号：A01791)免疫用抗原分装：60μg/每只小鼠x5只＝300μg/L个分装管，作为首次免疫用。60μg/每只小鼠x5只＝300μg/L个分装管，作为加强免疫使用。分装若干含有抗原100μg EP管，作为融合前加强免疫及检测用抗原使用。

钙网蛋白60μg以PBS稀释至60ul，取50μl福氏完全佐剂混合，充分乳化后注入8～12周龄Balb/c小鼠腹腔完成初次免疫，2周后用60μg抗原(60μl)与等量ISA720佐剂混匀后腹腔注射。2周后，将小鼠尾部放入37-40℃水中预热5min左右，减去1cm左右尾尖部分，用手顺着小鼠尾部挤压血液至EP管中。将血液室温放置1h，再4℃过夜。次日，ELISA检测小鼠血清效价。通过对免疫小鼠采血获得血清进行间接ELISA测定效价，ELISA实验操作方法如下：包被缓冲液稀释抗原。96孔板中每孔100ul，4℃过夜；次日，弃板内液体。洗涤缓冲液洗涤3次，5min/次。加入血清100μl，37℃孵育1小时。洗涤方法同上，设置空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔。加入钙网蛋白抗体(上海恪敏生物科技有限公司，货号：BY-5913R)100μl，37℃孵育1h。洗涤缓冲液洗涤2次，5min/次，ddH₂O洗涤一次，吸去孔内全部液体。加入TMB底物溶液100μl。37℃孵育10-30min。于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml H₂SO₄。OD450nm处测量各孔吸光度值。其结果如下表1所示。

表1各小鼠吸光度值

从表1的结果可以看出，实验选取的5个小鼠中全部5只都免疫成功，说明本发明改进的免疫融合技术具有更好的效果。通过间接法ELISA结果可以看到，多克隆抗体的效价都达到1:20000。

融合前3d作腹腔注射(用100μg抗原(100μl)与等量ISA720佐剂混匀后腹腔注射)加强免疫。间接ELISA选出效价合格的小鼠。取脾脏与NS-1融合。采血清作为多克隆抗体，用于ELISA检测用。

在融合实验前，要将PEG4000融化，制成50％浓度。小鼠NS-1细胞：脾细胞＝1:5，按照这个比例轻轻混匀，1000rpm，离心5min。弃去管中全部上清液(保证PEG4000的浓度)，并置于37℃水浴锅中。于37℃水浴锅中，先将1ml50％PEG4000加入到50ml离1心管中，缓慢搅动1分钟。1min内加入1ml 37℃1640培养基。2min内加入10ml1640培养基，800rpm，离心5min，弃去上清液。细胞重悬于HAT培养基，细胞铺96孔培养板，加入饲养细胞，CO₂培养箱中培养。

融合后5天，换半液HAT培养基，10天HT全部替换HAT培养基。此后用1640完全培养基培养。当杂交瘤细胞长至皿底1/8以上时，用间接ELISA法检测细胞上清效价，确定阳性孔43个。将效价合格的阳性孔，又进行第二次杂交瘤细胞的亚克隆筛选和第三次杂交瘤细胞的亚克隆筛选，最终，筛选获得3株阳性反应最高的分泌钙网蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为CRT11a-5、CRT4b-7和CRT7d-3。将三株杂交瘤细胞扩大皿培养并及时冻存细胞。

SPF级BALB/C小鼠，首先在小鼠腹部接种弗氏不完全佐剂，每只0.2-0.3ml。10天后，收集将对数生长期杂交瘤细胞CRT11a-5、CRT4b-7和CRT7d-3，分别制成浓度为10^6个/ml细胞悬液。分别腹腔注射杂交瘤细胞，0.3ml/只。7天后观察腹水生长情况。如腹部膨大，可抽取小鼠腹水。腹水2000rpm，离心5min。取上清，采用饱和硫酸铵初步盐析沉淀，经S-300HR层析柱纯化，0.05M pH8.0 Tris-HCl洗脱即为纯化后的三株单克隆抗体。采用Lowry法检测蛋白浓度，结果如表2所示，将纯化抗体分装-80℃保存。

表2蛋白浓度结果

抗体名称	蛋白浓度
		CRT11a-5	9.83mg/mL
CRT4b-7	10.03mg/mL
		CRT7d-3	11.42mg/mL

按照简易过碘酸钠法标记HRP，并按照ELISA双抗体夹心法测抗原的基本实验程序，采用棋盘滴定实验，将3种纯化的抗体分别稀释后包被酶标板，冰浴钙网蛋白免疫原反应后，分别与包被包被抗体不同的3种HRP酶标抗体进行反应，根据TMB显色测定A450值，确定了包被抗体和酶标抗体的最佳搭配和工作浓度结果如表3所示。

表3最佳搭配组合

包被抗体	酶标抗体	A450
			CRT11a-5	CRT4b-7	2.65
	CRT7d-3	1.84
			CRT4b-7	CRT11a-5	1.73
	CRT7d-3	1.68
			CRT7d-3	CRT11a-5	1.59
	CRT4b-7	2.72
			空白对照孔		0.024

从表3的结果可以看出，当采用CRT11a-5包被抗体CRT4b-7为酶标抗体时以及CRT7d-3为包被抗体CRT4b-7为酶标抗体时能够取得最佳搭配的效果。并且，包被抗体的浓度均确定为1ug/mL，酶标抗体的浓度为0.5ug/mL即可。

采用间接ELISA法，以免疫原、人膀胱癌细胞株5637裂解液、人皮肤上皮细胞裂解液、鼠皮肤上皮细胞裂解液、大肠杆菌裂解液、BSA、为包被抗原对抗体进行特异性检测。结果如表4所示。

表4单抗特异性鉴定结果

从表4的结果可以看出，本发明制备的三株单克隆抗体均具有较好的特异性。

同时检测3种抗体对HepG2细胞增殖能力的影响：取对数生长期的细胞接种于96孔板。每孔加入100ul共1000个细胞。细胞贴壁后分别加入添加有终浓度为100ug/ml单抗的10％太牛血清的DMEM培养基,培育48h。每孔加入l0ul CCK-8溶液，继续孵育48h后，应用自动酶标仪测450nm处吸光度(A)值。抑制率(％)＝(1-实验组A值/对照组A值)X100％，以不加单抗的培养基为阴性对照组。以钙网蛋白抗体(上海恪敏生物科技有限公司，货号：BY-5913R)作为阳性对照。结果如图1所示。

从图1结果显示，与阴性对照组相比较，实验组处理48h生长抑制显著(P<0.05),三种单抗均具有大于70％的增殖抑制率，对照抗体的增殖抑制率没有本发明三种抗体高，这也充分的说明，本发明制备的三种单抗，除了能够特异性的结合钙网蛋白之外，还能够通过抑制钙网蛋白的活性而抑制HepG2的细胞增殖。

实施例2 CRT11a-5包被抗体和CRT4b-7为酶标抗体的特性分析

(1)、抗体亚型测定

单抗亚类鉴定按鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒说明书进行操作。通过鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒对2个单抗进行检测，结果如图2所示，所检测的2株抗体均为IgG2a，轻链为κ型。

(2)、亲和力鉴定

采用AffinitySensors公司生产的生物传感器IAsysPlus对单克隆抗体的亲和常数进行测定。羧甲基葡聚糖(carboxymethyldextran,CMD)预处理样品池，在样品池中加入不同浓度的免疫原蛋白,5min后用乙醇胺封闭空余羧基3min。然后用1mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。将包被好免疫原的样品池放入生物传感器,平衡10min。基线(baseline):加入pH7.2,0.01mol/L PBS 50μl,等待5min,作一平稳基线。结合(asso-ciation):吸去PBS,加入45μl PBS和5μl单抗,待单抗结合至饱和时吸去单抗液。解离(dissociation):换50μlPBS,待单抗结合与解离达到平衡。再生(regeneration):换20mmol/LHCl 50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗。回复基线:换PBS,再次回到基线,即可开始下1个循环。将每种单抗用PBS稀释为5个不同浓度,依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率,并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。结果如表5所示。

表5抗体的亲和常数

抗体名称	亲和常数(nM)
		CRT11a-5单克隆抗体	0.97±0.03
CRT4b-7单克隆抗体	2.59±0.05

从表5的结果可以看出，CRT11a-5和CRT4b-7这两个单克隆抗体具有较好的亲和能力，结合能力较好.

采用试剂盒提取2个杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，其中：

CRT11a-5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

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CRT11a-5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

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CRT4b-7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTEEMAARHQPGLLYWFLQRPGQSPQLLIYAKWNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCPVFVLIVCDFGSGTKLEIK

CRT4b-7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

VKPGGSLKLSCAASYQIAEDNFMSWVRQTPDKRLEWVAINRIFLQAFYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCQGNAVVTSECNWGQGTTVTVS。

实施例3CRT11a-5包被抗体和CRT4b-7为酶标抗体制备检测ELISA试剂盒

碱性磷酸酶标记CRT4b-7抗体，具体流程如下：取1mg碱性磷酸酶AP溶于200μL0.3mol/L pH8.0的NaHCO₃缓冲液中；加1mL 0.06mol/L的过碘酸钠，室温下避光轻搅0.5h；加1mL 0.16mol/L的乙二醇，室温下轻搅lh，终止氧化；在0.01mol/L pH9.5的CB缓冲液中4℃透析过夜；于1mg醛化AP中加含0.5mg抗体的CB缓冲液1mL，室温避光轻搅3h；加入5mgNaHB₄，放4℃过夜；在0.01mol/L，pH7.2 PBS中4℃透析24h；4℃，4000rpm离心30min，除去沉淀即得到标记的CRT4b-7单抗。

ELISA板的包被和封闭：用0.05M pH9.6CB包被液稀释CRT11a-5单克隆抗体，每孔加入50μL浓度为1μg/mL的CRT11a-5单克隆抗体，4℃静置过夜，弃去包被液，用洗板液含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4PBS洗涤3次，排干后加入封闭液5％BSA的0.05M pH9.6CB，37℃静置2h，弃去封闭液，晾干代用。

ELISA检测：每个孔分别加入钙网蛋白标准品不同的梯度浓度，室温静置1h，用洗板液洗涤4次。再加入优化后的100μL的酶标CRT4b-7单克隆抗体(0.5μg/mL)，室温静置1h，用洗板液洗涤4次。每孔加入反应底物对硝基苯磷酸盐pNPP 150μL(将pNPP以10mmol/L的浓度溶于含1mmol/LMgCl₂的0.1mol/L二乙醇胺缓冲液(pH 9.8))，室温避光反应15min，每孔加入50μL终止液(0.5mol/L碳酸钠)终止反应，在5min内用酶标仪测定405nm的吸光值。以P/N≥2.1判定为阳性,确定可检测的最低抗原浓度，结果如表6所示。

表6试剂盒的敏感性

从表6的结果可以看出，本发明的ELISA试剂盒检测钙网蛋白的最低浓度为1μg/L，具有较低的检测效果。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。

Claims (5)

1.一种钙网蛋白单克隆抗体，其特征在于所述抗体为CRT11a-5单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的钙网蛋白单克隆抗体在制备检测钙网蛋白的试剂中的用途。

3.如权利要求1所述的钙网蛋白单克隆抗体在制备用于检测钙网蛋白的试剂盒中的用途，其中，所述试剂盒中CRT11a-5单克隆抗体作为包被抗体和CRT4b-7单克隆抗体为酶标抗体；

CRT11a-5单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

CRT11a-5单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

CRT4b-7单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

CRT4b-7单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于包被抗体的浓度为1μg/mL；酶标抗体的浓度为0.5μg/mL。

5.一种用于检测钙网蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中CRT11a-5单克隆抗体作为包被抗体和CRT4b-7单克隆抗体为酶标抗体；

CRT11a-5单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

CRT11a-5单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

CRT4b-7单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

CRT4b-7单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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