JP2020156486A - Mcm5に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
(ii)a.配列番号9の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
b.配列番号11の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
c.配列番号13の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
d.配列番号3の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
e.配列番号5の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、
f.配列番号7の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3、
g.配列番号21の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
h.配列番号23の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、及び
i.配列番号25の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
j.配列番号15の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
k.配列番号17の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、
l.配列番号19の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含み、
(iii)配列番号29又は33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、
(iv)配列番号27又は31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含み、又は
(v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の抗体と競合する
抗体が提供される。
(i)本発明のハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞を増殖させるステップ、及び
(ii)ハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞から抗体を単離するステップ
を含む、抗体を作製する方法が提供される。
(i)本発明の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)Mcm5に結合する第2の抗体を含む組成物
を含むキットが提供される。
(i)本発明の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)本発明の第2の抗体を含む組成物
を含むキットが提供される。
(i)固体支持体に固定化された本発明の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
(ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
(iii)標識にコンジュゲートさせた本発明の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
(iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
(v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
を含む方法が提供される。
本発明は抗体を提供する。「抗体」という語は、天然に存在する形態、又は一本鎖抗体、キメラ抗体若しくはヒト化抗体などの組換え抗体を指すことができる。「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」という語は、Mcm5などのMcmタンパク質などの標的タンパク質に結合しうる抗体フラグメントも包含すると考えられる。このようなフラグメントには、Fab'2、F'(ab)2、Fv、一本鎖抗体又はダイアボディ(diabody)が含まれうる。好ましい実施形態において、本発明の抗体は天然に存在する全長抗体(フラグメントではなく)である。好ましい実施形態において、抗体はマウス抗体(すなわちマウス脾細胞由来)である。
好ましくは、抗体はMcm5に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体は配列番号1又は配列番号2のうち少なくとも1つに結合する。任意選択で、抗体は配列番号1又は配列番号2のうち少なくとも1つに特異的に結合する。
本発明の抗体は、好ましくは抗体12A7又は4B4のCDR、すなわち:
a.配列番号9の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
b.配列番号11の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
c.配列番号13の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
d.配列番号3の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
e.配列番号5の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、
f.配列番号7の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3、
g.配列番号21の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
h.配列番号23の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、
i.配列番号25の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
j.配列番号15の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
k.配列番号17の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、及び
l.配列番号19の配列、又は1、2若しくは3アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3
からなる群から選択されるCDRのうち少なくとも1つを含む。
1)アラニン、グリシン、
2)アスパラギン酸、グルタミン酸、
3)アスパラギン、グルタミン、
4)アルギニン、リジン、
5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、
6)フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、
7)セリン、スレオニン、及び
8)システイン、メチオニン。
本発明の抗体は、好ましくは、配列番号29若しくは33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する重鎖可変領域、及び/又は配列番号27若しくは31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含む。このような抗体は、本明細書で「本発明の変異体抗体」と呼ばれる。
(i)12A7 CDRH1、12A7 CDRH2及び12A7 CDRH3、
(ii)配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域、
(iii)12A7 CDRL1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3、並びに
(iv)配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域
を含む。
(i)4B4 CDRH1、4B4 CDRH2及び4B4 CDRH3、
(ii)配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域、
(iii)4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3、並びに
(iv)配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域
を含む。
ペアワイズアラインメントパラメータ -方法:accurate、マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、ギャップ伸長ペナルティ:0.10、
マルチプルアラインメントパラメータ -マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、遅延についての同一性%(%identity for delay):30、ペナライズエンドギャップ(Penalize end gaps):on、ギャップ分離距離(Gap separation distance):0、ネガティブマトリックス:no、ギャップ伸長ペナルティ:0.20、残基特異的ギャップペナルティ(Residue-specific gap penalties):on、親水性ギャップペナルティ(Hydrophilic gap penalties):on、親水性残基:GPSNDQEKR。
本発明は、本発明の抗体と競合する抗体をさらに提供する。例えば、本発明は:
(i)配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
(ii)12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、12A7 CDRL3、4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2、及び4B4 CDRL3からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含み、
(iii)配列番号29又は33に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、又は
(iv)配列番号27又は31に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含む
抗体と競合する抗体を提供する。
本発明の抗体を、標識(例えばユーロピウム3+又は西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートさせることができる。標識は直接付着させても、リンカー(アジピン酸ジヒドラジド(ADH)など)を介して付着させてもよい。
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体を含む組成物が提供される。このような組成物は、溶液中で抗体を安定化させることができる適切な安定化剤をさらに含んでいてよい。例えば、組成物は、TAPS(3-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸)、ビシン(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン)、トリシン(N-トリス(ヒドロキシメチル(メチルグリシン)))、TAPSO(3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、HEPES(4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、リン酸緩衝生理食塩水及びMOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)からなる群から選択される緩衝液を含んでいてよい。好ましい実施形態において、組成物はpH7.6のリン酸緩衝生理食塩水を含む。さらに好ましい実施形態において、組成物は、0.01%〜0.09%の間のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水を含む。好ましくは、組成物は、本発明の抗体を室温又は15℃、10℃、7℃、5℃、0℃、-10℃、若しくは-25℃以下の温度で保存するのに適した薬剤を含む。好ましい実施形態において、組成物は、本発明の抗体を2℃〜8℃の間の温度で保存するのに適した薬剤を含む。さらなる実施形態において、組成物は、糖、例えばラクトース又はトレハロース、などの安定化剤を含む。
本発明は、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドにも関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の抗体をコードする核酸配列を含んでいてよい。「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換可能に使用され、ヌクレオチドの任意の長さの高分子形態、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらのアナログを指す。
本発明は、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株をさらに提供する。このようなハイブリドーマ細胞株は、適切な培養状態で維持されると、本発明の抗体を産生する。
本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。このような宿主細胞には、本発明の抗体を発現するように改変された細胞が含まれる。このような宿主細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞とすることができる。本発明のベクター又は核酸の挿入により改変されうる宿主細胞の特定の例には、哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、NS0及びCOS細胞が含まれる。あるいは、大腸菌(E.coli)などの細菌細胞が使用可能である。
本発明の抗体は任意の方法を使用して産生可能である。一実施形態において、抗体はハイブリドーマ細胞株から直接産生される。本発明のさらなる実施形態において、抗体は組換えにより産生される。
本発明の抗体は、キットの一部として使用可能である。例えば、抗体を試料、例えばヒト由来の試料中のMcm5濃度を検出するのに使用するためのキットの一部とすることができ、これにより、試料が採取された対象におけるがんの検出が可能になる。
(i)固体支持体に固定化された本発明の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
(ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
(iii)標識にコンジュゲートさせた本発明の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
(iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
(v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
を含む。
「含む(comprises)」という用語は、「含む(includes)」を意味する。したがって、「含む(comprises)」という用語、並びに「含む(comprise)」、及び「含む(comprising)」などの変化形は、明記される化合物又は組成物又はステップ、又は化合物若しくはステップの群を含むことを含意するが、任意のその他の化合物、組成物、ステップ又はそれらの群を除外することは含意しないことが理解されるものである。
ステージI:クローニング戦略
1. DNAの648bpフラグメントを増幅するため、ヒトMCM5 cDNAを含む検証済みIMAGEクローンを得て、PCR鋳型として使用した。フォワードPCRプライマーは、n開始コドン及び特許を受けていない改変ポリヒスチジンタグ(HQ)4をコードしていた。
3. 高収量の発現タンパク質を確実にするため、Mcm5フラグメントを含む組換えプラスミドをBL21大腸菌(非λDE3)に形質転換した。
5. 特定された、高レベルの組換えタンパク質を有するクローンを0.5L規模で培養し、IPTGで誘導した。細胞をペレットにし、-70℃で保存した。Stoeber et al. J Natl Cancer Inst 2002 94 1071-9により記載される変性溶解緩衝液中で細胞を崩壊させた。
MAbスクリーニングELISA
Welcome/CRUK Institute for Cancer and Developmental Biologyから、プロテインAで精製されたMAbを得た。これらの抗体を、Mcm5に結合する能力についてスクリーニングした。
プロテインAで精製されたMAbの相対的親和性を、Ab濃度の正規化、及びAg制限条件下での比色分析スクリーニングアッセイへのMAbの適用により決定した。Ni-NTA His-Sorbマイクロタイタープレートウェル全体でのMcm5のリニアタイトレーション(linear titration)により、Ag制限条件を決定した。Agが制限されない場合、得られる最大Abs 450読取り値が4.000となるため、観察される最大Abs 450nm 3.000未満がAg制限条件を示す。ウサギMcm5 PAb(101)及びヤギ抗ウサギHRPを使用してAgタイトレーションを実施し、ELISA応答を測定した。各Ni-NTAウェルに対する結合に利用可能であるMcm5 25ngをもたらした濃度は、PAbのELISA Abs 450応答に制限的であった。全て揃ったMcm5エピトープがPAbにより結合されるため、マウスMabの研究のためのAg制限条件を決定するためにウサギPAbを選択した。これにより、エピトープ競合の程度を決定するための、組合せインキュベーション研究において、MAbを調べることができることが確実となった。
抗体のエピトープ競合
2部位免疫測定法のため、別個のエピトープを標的とする2種類のMAbが必要である。Ag制限条件においては、同じエピトープについて競合する一対のMAbにより、より大きい相対的親和性のAbの、競合するMAb非存在下でインキュベートされた場合のAbs 450nmシグナルに等しいELISA Abs 450nm測定値がもたらされる。しかし、別個のエピトープを標的とする一対のMAbをインキュベートすると、立体障害が存在しないという条件で、利用可能な制限されたAgに対するMAbの個々のAbs 450nm応答両方の合計に等しいAbs 450測定値がもたらされる。最大相対的親和性のMAb 12A7の、20ng/ウェルという50%最大結合濃度に対し、MAb 12A7及び4B4を正規化した。25ng/ウェルMcm5 Ag制限Ni-NTAプレートで、個々の及び一対のAbインキュベーション両方を使用するELISAを、正規化された濃度のMAbで行った。一対のMAbの組合せインキュベーションから測定される最も大きいAbs 450nmシグナルは、2部位IFMAにおいて使用するのに最も適したMAbを示す。
Ab Agエピトープ競合ELISA研究結果(表4)は、MAb 4B4が、12A7との2部位結合に適合する別個のエピトープを標的とすることを示している。4B4をその他のMAbと並行してインキュベートすると、制限的なAgに対する両MAbの結合の合計に等しいAbs 450応答により、4B4が標的とする別個のエピトープが実証される。
エピトープマッピング
使用した物品:
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)Mcm5に特異的に結合する抗体であって、
(i)配列番号2又は1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
(ii)
a.配列番号21の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
b.配列番号23の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、
c.配列番号25の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
d.配列番号15の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
e.配列番号17の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、
f.配列番号19の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3、
g.配列番号9の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
h.配列番号11の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
i.配列番号13の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
j.配列番号3の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
k.配列番号5の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、及び
l.配列番号7の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3
から成る群から選択される少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(iii)配列番号33又は29に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、
(iv)配列番号31又は27に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含み、又は
(v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の抗体と競合する、前記抗体。
(2)1〜10nMの範囲のMcm5に対する親和性を有する、(1)記載の抗体。
(3)Fab' 2 、F'(ab) 2 、Fv、一本鎖抗体又はダイアボディである、(1)又は(2)記載の抗体。
(4)配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、(1)〜(3)のいずれか1記載の抗体。
(5)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、(1)〜(3)のいずれか1記載の抗体。
(6)12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3から成る群から選択される、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又は5つ以上のCDRを含む、(1)〜(4)のいずれか1記載の抗体。
(7)12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、及び12A7 CDRH3を含む、(6)記載の抗体。
(8)12A7 CDRL1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3を含む、(6)又は(7)記載の抗体。
(9)配列番号9の配列を有する12A7 CDRH1、配列番号11の配列を有する12A7 CDRH2、及び配列番号13の配列を有する12A7 CDRH3を含む、(6)〜(8)のいずれか1記載の抗体。
(10)配列番号3の配列を有する12A7 CDRL1、配列番号5の配列を有する12A7 CDRL2、及び配列番号7の配列を有する12A7 CDRL3を含む、(6)〜(9)のいずれか1記載の抗体。
(11)4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2、及び4B4 CDRL3から成る群から選択される、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又は5つ以上のCDRを含む、(1)〜(3)のいずれか1記載の抗体。
(12)4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、及び4B4 CDRH3を含む、(11)記載の抗体。
(13)4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3を含む、(11)又は(12)記載の抗体。
(14)配列番号21の配列を有する4B4 CDRH1、配列番号23の配列を有する4B4 CDRH2、及び配列番号25の配列を有する4B4 CDRH3を含む、(11)〜(13)のいずれか1記載の抗体。
(15)配列番号15の配列を有する4B4 CDRL1、配列番号17の配列を有する4B4 CDRL2、及び配列番号19の配列を有する4B4 CDRL3を含む、(11)〜(14)のいずれか1記載の抗体。
(16)配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(4)又は(6)〜(10)のいずれか1記載の抗体。
(17)配列番号29に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(4)、(6)〜(10)又は(16)のいずれか1記載の抗体。
(18)配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(4)、(6)〜(10)又は(16)〜(17)のいずれか1記載の抗体。
(19)配列番号27に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(4)、(6)〜(10)又は(16)〜(18)のいずれか1記載の抗体。
(20)配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(5)又は(11)〜(15)のいずれか1記載の抗体。
(21)配列番号33に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(5)、(11)〜(15)又は(20)のいずれか1記載の抗体。
(22)配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(5)、(11)〜(15)又は(20)〜(21)のいずれか1記載の抗体。
(23)配列番号31に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、(1)、(2)、(3)、(5)、(11)〜(15)又は(20)〜(22)のいずれか1記載の抗体。
(24)(1)〜(23)のいずれか1記載の抗体を含む組成物。
(25)(1)〜(23)のいずれか1記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
(26)抗体がモノクローナル抗体である、(1)〜(25)のいずれか1記載の抗体、組成物又はハイブリドーマ。
(27)抗体が放射標識で標識されている、(1)〜(26)のいずれか1記載の抗体、組成物又はハイブリドーマ。
(28)放射標識がユーロピウムである、(27)記載の抗体、組成物、又はハイブリドーマ。
(29)(1)〜(23)又は(26)のいずれか1記載の抗体の重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(30)(1)〜(23)又は(26)のいずれか1記載の抗体の軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(31)配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、又は100%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(32)配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(33)(29)〜(32)のいずれか1記載の核酸を含むベクター。
(34)(29)〜(32)のいずれか1記載の核酸又は(33)記載のベクターを含む宿主細胞。
(35)CHO細胞又は大腸菌細胞である、(34)記載の宿主細胞。
(36)(i)(25)記載のハイブリドーマ細胞株又は(34)若しくは(35)記載の宿主細胞を増殖させるステップ、及び
(ii)ハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞から抗体を単離するステップ
を含む、抗体を作製する方法。
(37)抗体を放射標識にコンジュゲートさせることにより抗体を標識するステップをさらに含む、(36)記載の方法。
(38)抗体を固体支持体に固定化するステップをさらに含む、(36)記載の方法。
(39)(i)(1)〜(23)のいずれか1記載の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)Mcm5に結合する第2の抗体を含む組成物
を含むキット。
(40)(i)(4)、(6)〜(10)又は(16)〜(19)のいずれか1記載の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)(5)、(11)〜(15)又は(20)〜(23)のいずれか1記載の第2の抗体を含む組成物
を含むキット。
(41)試料中のMcm5の濃度又は量を決定する方法であって、
(i)固体支持体に固定化された、(1)〜(23)又は(26)のいずれか1記載の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
(ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
(iii)標識にコンジュゲートさせた、(1)〜(23)又は(26)〜(28)のいずれか1記載の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
(iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
(v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
を含む、前記方法。
(42)第1の抗体及び第2の抗体がともにMcm5に結合するが、第1の抗体及び第2の抗体がMcm5の異なるエピトープに結合する、(39)若しくは(40)記載のキット又は(41)記載の方法。
(43)第1の抗体が配列番号1に結合する、(39)又は(41)〜(42)のいずれか1記載のキット又は方法。
(44)第1の抗体が配列番号2に結合する、(39)又は(41)〜(42)のいずれか1記載のキット又は方法。
(45)第2の抗体が配列番号1に結合する、(39)、(41)〜(42)又は(44)のいずれか1記載のキット又は方法。
(46)第2の抗体が配列番号2に結合する、(39)又は(41)〜(44)のいずれか1記載のキット又は方法。
(47)第1の抗体がELISAプレートに固定化されている、(39)〜(46)のいずれか1記載のキット又は方法。
(48)第2の抗体がELISAプレートに固定化されている、(39)〜(40)又は(42)〜(46)のいずれか1記載のキット。
(49)第2の抗体が放射性標識にコンジュゲートしている、(39)〜(47)のいずれか1記載のキット又は方法。
(50)第1の抗体が放射性標識にコンジュゲートしている、(39)〜(40)、(42)〜(46)又は(48)のいずれか1記載のキット。
(51)放射性標識がユーロピウム 3+ である、(49)又は(50)記載のキット又は方法。
(52)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップが、Eu 3+ の免疫蛍光検出を含む、(41)〜(51)のいずれか1記載の方法。
(53)(41)〜(47)又は(49)のいずれか1記載の方法の実施における、(39)〜(40)若しくは(42)〜(51)のいずれか1記載のキット又は(1)〜(23)若しくは(26)のいずれか1記載の抗体の使用。
Claims (53)
- Mcm5に特異的に結合する抗体であって、
(i)配列番号2又は1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、
(ii)
a.配列番号21の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号21と異なる配列を有する4B4 CDRH1、
b.配列番号23の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号23と異なる配列を有する4B4 CDRH2、
c.配列番号25の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号25と異なる配列を有する4B4 CDRH3、
d.配列番号15の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号15と異なる配列を有する4B4 CDRL1、
e.配列番号17の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号17と異なる配列を有する4B4 CDRL2、
f.配列番号19の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号19と異なる配列を有する4B4 CDRL3、
g.配列番号9の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号9と異なる配列を有する12A7 CDRH1、
h.配列番号11の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号11と異なる配列を有する12A7 CDRH2、
i.配列番号13の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号13と異なる配列を有する12A7 CDRH3、
j.配列番号3の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号3と異なる配列を有する12A7 CDRL1、
k.配列番号5の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号5と異なる配列を有する12A7 CDRL2、及び
l.配列番号7の配列、又は1アミノ酸置換により配列番号7と異なる配列を有する12A7 CDRL3
から成る群から選択される少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(iii)配列番号33又は29に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する重鎖可変領域を含み、
(iv)配列番号31又は27に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%又は100%同一である配列を有する軽鎖可変領域配列を含み、又は
(v)(i)、(ii)、(iii)又は(iv)の抗体と競合する、前記抗体。 - 1〜10nMの範囲のMcm5に対する親和性を有する、請求項1記載の抗体。
- Fab'2、F'(ab)2、Fv、一本鎖抗体又はダイアボディである、請求項1又は2記載の抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
- 12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、12A7 CDRH3、12A7 CDRL1、12A7 CDRL2、及び12A7 CDRL3から成る群から選択される、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又は5つ以上のCDRを含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体。
- 12A7 CDRH1、12A7 CDRH2、及び12A7 CDRH3を含む、請求項6記載の抗体。
- 12A7 CDRL1、12A7 CDRL2及び12A7 CDRL3を含む、請求項6又は7記載の抗体。
- 配列番号9の配列を有する12A7 CDRH1、配列番号11の配列を有する12A7 CDRH2、及び配列番号13の配列を有する12A7 CDRH3を含む、請求項6〜8のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号3の配列を有する12A7 CDRL1、配列番号5の配列を有する12A7 CDRL2、及び配列番号7の配列を有する12A7 CDRL3を含む、請求項6〜9のいずれか1項記載の抗体。
- 4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、4B4 CDRH3、4B4 CDRL1、4B4 CDRL2、及び4B4 CDRL3から成る群から選択される、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又は5つ以上のCDRを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
- 4B4 CDRH1、4B4 CDRH2、及び4B4 CDRH3を含む、請求項11記載の抗体。
- 4B4 CDRL1、4B4 CDRL2及び4B4 CDRL3を含む、請求項11又は12記載の抗体。
- 配列番号21の配列を有する4B4 CDRH1、配列番号23の配列を有する4B4 CDRH2、及び配列番号25の配列を有する4B4 CDRH3を含む、請求項11〜13のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号15の配列を有する4B4 CDRL1、配列番号17の配列を有する4B4 CDRL2、及び配列番号19の配列を有する4B4 CDRL3を含む、請求項11〜14のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号29に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、4又は6〜10のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号29に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、4、6〜10又は16のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号27に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、4、6〜10又は16〜17のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号27に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、4、6〜10又は16〜18のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号33に対し少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、5又は11〜15のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号33に対し少なくとも98%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、5、11〜15又は20のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号31に対し少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、5、11〜15又は20〜21のいずれか1項記載の抗体。
- 配列番号31に対し少なくとも98%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1、2、3、5、11〜15又は20〜22のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項1〜23のいずれか1項記載の抗体を含む組成物。
- 請求項1〜23のいずれか1項記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜25のいずれか1項記載の抗体、組成物又はハイブリドーマ。
- 抗体が放射標識で標識されている、請求項1〜26のいずれか1項記載の抗体、組成物又はハイブリドーマ。
- 放射標識がユーロピウムである、請求項27記載の抗体、組成物、又はハイブリドーマ。
- 請求項1〜23又は26のいずれか1項記載の抗体の重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1〜23又は26のいずれか1項記載の抗体の軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34に対し少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、又は100%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32又は34の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項29〜32のいずれか1項記載の核酸を含むベクター。
- 請求項29〜32のいずれか1項記載の核酸又は請求項33記載のベクターを含む宿主細胞。
- CHO細胞又は大腸菌細胞である、請求項34記載の宿主細胞。
- (i)請求項25記載のハイブリドーマ細胞株又は請求項34若しくは35記載の宿主細胞を増殖させるステップ、及び
(ii)ハイブリドーマ細胞株又は宿主細胞から抗体を単離するステップ
を含む、抗体を作製する方法。 - 抗体を放射標識にコンジュゲートさせることにより抗体を標識するステップをさらに含む、請求項36記載の方法。
- 抗体を固体支持体に固定化するステップをさらに含む、請求項36記載の方法。
- (i)請求項1〜23のいずれか1項記載の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)Mcm5に結合する第2の抗体を含む組成物
を含むキット。 - (i)請求項4、6〜10又は16〜19のいずれか1項記載の第1の抗体を含む組成物、及び
(ii)請求項5、11〜15又は20〜23のいずれか1項記載の第2の抗体を含む組成物
を含むキット。 - 試料中のMcm5の濃度又は量を決定する方法であって、
(i)固体支持体に固定化された、請求項1〜23又は26のいずれか1項記載の抗体である、固定化された第1の抗体を用意するステップ、
(ii)固定化された第1の抗体に試料中のMcm5が結合できるように、固定化された第1の抗体に試料を曝露して、固定化されたMcm5を用意するステップ、
(iii)標識にコンジュゲートさせた、請求項1〜23又は26〜28のいずれか1項記載の抗体である、標識された第2の抗体を用意するステップ、
(iv)標識された第2の抗体がMcm5に結合できるように、標識された第2の抗体に固定化されたMcm5を曝露するステップ、及び
(v)標識された第2の抗体の濃度を検出するステップ
を含む、前記方法。 - 第1の抗体及び第2の抗体がともにMcm5に結合するが、第1の抗体及び第2の抗体がMcm5の異なるエピトープに結合する、請求項39若しくは40記載のキット又は請求項41記載の方法。
- 第1の抗体が配列番号1に結合する、請求項39又は41〜42のいずれか1項記載のキット又は方法。
- 第1の抗体が配列番号2に結合する、請求項39又は41〜42のいずれか1項記載のキット又は方法。
- 第2の抗体が配列番号1に結合する、請求項39、41〜42又は44のいずれか1項記載のキット又は方法。
- 第2の抗体が配列番号2に結合する、請求項39又は41〜44のいずれか1項記載のキット又は方法。
- 第1の抗体がELISAプレートに固定化されている、請求項39〜46のいずれか1項記載のキット又は方法。
- 第2の抗体がELISAプレートに固定化されている、請求項39〜40又は42〜46のいずれか1項記載のキット。
- 第2の抗体が放射性標識にコンジュゲートしている、請求項39〜47のいずれか1項記載のキット又は方法。
- 第1の抗体が放射性標識にコンジュゲートしている、請求項39〜40、42〜46又は48のいずれか1項記載のキット。
- 放射性標識がユーロピウム3+である、請求項49又は50記載のキット又は方法。
- 標識された第2の抗体の濃度を検出するステップが、Eu3+の免疫蛍光検出を含む、請求項41〜51のいずれか1項記載の方法。
- 請求項41〜47又は49のいずれか1項記載の方法の実施における、請求項39〜40若しくは42〜51のいずれか1項記載のキット又は請求項1〜23若しくは26のいずれか1項記載の抗体の使用。
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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