CN105087496A - Nok/styk1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NOK/STYK1单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可以特异的识别NOK/STYK1蛋白。本发明公开的一株杂交瘤细胞7G9，其保藏编号为CGMCC？No.8163。本发明公开的单克隆抗体为深入研究NOK/STYK1蛋白在肿瘤发生、发展中的作用及机理提供依据并奠定基础。

Description

NOK/STYK1单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗体及其应用；特别涉及一种NOK/STYK1单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

NOK基因是有明确功能的一个新的酪氨酸蛋白激酶(RTKs)家族成员(GeneBank登录号：AY563053)，这与Ye等人报道的因为富含丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸残基而命名的STYK1是同一个基因。NOK/STYK1基因全长2.79kb，位于染色体12q13.2，cDNA全长为1269bp，编码422个氨基酸的蛋白质，分子量约47.6kD，同源性分析表明该蛋白属于受体型酪氨酸蛋白激酶家族的一员。

酪氨酸蛋白激酶(RTKs)受体介导着重要的信号通路，它能激活大多数的信号通路，引起细胞的增殖、分化、迁移和代谢的改变等，在胚胎发育，代谢以及免疫系统中起着非常重要的作用。目前研究表明，在超过一半的遗传性和散发肿瘤病例中，RTKs过量表达或者是突变的形式与恶性肿瘤相关。

NOK/STYK1(NovelOncogenewithKinase—domain/alsoknownasSTYK1(aputativeserine/threonineandtyrosinereceptorproteinkinase))作为一个新的受体蛋白激酶家族的成员，研究发现它能够转化NIH3T3细胞和小鼠前B细胞BaF3，并且在裸鼠中注射表达NOK的BaF3细胞能够引起肿瘤的发生和迁移现象。在对一些细胞系的检测中，也发现NOK在一些肿瘤细胞中高表达，如人子宫颈癌Hela细胞，人卵巢癌H08910细胞以及人慢性髓性白细胞瘤K562细胞等。而在一些肿瘤细胞如人的表皮癌A431细胞中却检测不到NOK的表达，提示NOK可能在某些肿瘤的发生中具有重要作用。研究发现，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌的恶性肿瘤标本中，NOK表达具有较高水平，说明NOK可能可以作为恶性肿瘤早期诊断的一个标志。

因此需要合适的单克隆抗体来研究复杂的NOK/STYK1活性，以便进一步帮助我们理解其在肿瘤发生、发展中的作用及机理，为新的治疗策略提供设计，比如在肿瘤信号转导中阻断NOK/STYK1信号通路，以此来控制及治疗肿瘤，或将NOK/STYK1作为新的靶标，预防或判断疾病预后。

发明内容

本发明的目的是提供一种NOK/STYK1单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可以特异的识别NOK/STYK1蛋白。

一株杂交瘤细胞7G9，其保藏编号为CGMCCNo.8163。

由所述的杂交瘤细胞制备的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

上述抗体在制备检测NOK或STYK1蛋白的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

所述产品具体为抗体。

上述抗体在制备阻断NOK或STYK1信号通路的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述癌为结肠癌、胃癌或乳腺癌；

所述癌的癌细胞中高表达NOK或STYK1蛋白。

本发明提供的单克隆抗体为深入研究NOK/STYK1蛋白在肿瘤发生、发展中的作用及机理提供依据并奠定基础。

附图说明

图1为Westernblot检测NOK/STYK1(7G9)单抗与内源NOK/STYK1蛋白以及外源NOK/STYK1蛋白的特异性结合。

图2为NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在不同肿瘤细胞中的表达。

图3为NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在乳腺癌变组织和乳腺癌旁组织中的表达差异。

图4为NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在结肠癌变组织和结肠癌旁组织中的表达。

图5为NOK/STYK1(7G9)单抗检测内源NOK/STYK1蛋白在不同细胞系中的定位及表达。

图6为NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在乳腺癌变组织中的定位及表达。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

8-12周龄的雌性Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

骨髓瘤细胞(SP2/0)购自Abmart。

HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自JacksonImmunoResearch公司。

人肾胚上皮细胞293T细胞购自ATCC。

MCF7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为TCHu74。

MDA-MB-231购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为TCHu104。

SW480购自ATCC，产品目录号为CCL-228^TM。

SW620购自ATCC，产品目录号为CCL-227^TM。

HT-29购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为TCHu103。

HCT116购自ATCC，产品目录号为CCL-247^TM。

DLD1购自ATCC，产品目录号为CCL-221^TM。

胃癌细胞803购自上海生博生物医药科技有限公司，产品目录号为pSC1038。

pcDNA3.1-NOK/Flag质粒在文献“Ying-HuaLi,Yin-YinWang,ShanZhong,Zhi-LiRong,Yong-MingRen,Zhi-YongLi,Shu-PingZhang,Zhi-JieChang,andLiLiu.Transmembranehelixofnoveloncogenewithkinase-domain(NOK)influencesitsoligomerizationandlimitstheactivationofRAS/MAPKsignaling.MoleculesandCells.27:39-45,2009.”中公开过，公众可从清华大学获得。

pcDNA3.1(+)购自DB。

RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司。

实施例1、抗原的设计与合成

一、抗原设计

首先设计15个短肽，短肽的序列如表1所示。

表1短肽序列

二、抗原的合成

人工合成表1所示的15种短肽，并将编号为2，3，1的短肽，编号为6，4，5的短肽，编号为7，8，9的短肽，编号为12，10，11的短肽，编号为14，15，13的短肽，分别按照从N端到C端的顺序连接，并在各短肽间用GSGS作为连接做成一个融合抗原蛋白，共形成1-5号共计5种混合肽段。

实施例2、动物免疫

将实施例1制备的5种混合肽段作为抗原分别免疫小鼠，其中每种混合肽段免疫一只小鼠，共计5只小鼠。具体步骤如下：

分别将抗原(混合肽段)用PBS稀释后与等体积弗氏完全佐剂乳化混匀(注射蛋白剂量为80μg/只)，对8-12周龄的雌性Balb/C小鼠进行腹腔注射。14天后，用PBS稀释相同的抗原并与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化混匀(注射蛋白剂量为40μg/只)后对小鼠皮下注射。随后，每隔7天对小鼠进行腹腔注射加强免疫1次(40μg抗原与弗氏不完全佐剂乳化混匀)。在共计第4次免疫后7d，通过眼眶采血对各小鼠采血20ul，通过ELISA方法鉴定免疫血清效价，取免疫效价较高的2号混合肽段免疫的小鼠的脾脏用于下述的杂交瘤细胞融合实验。

实施例3、融合和单抗的筛选

一、杂交瘤细胞的获得

将免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞平铺于半固体培养基上进行培养，10-14天后挑取融合后的单克隆移至96孔板进行培养，经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆，具体方法如下：

将有限稀释的细胞在96孔板中进行培养，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值较高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％，即认为此为单克隆,细胞株构建成功，最终获得12株阳性单克隆杂交瘤细胞。

将筛选得到的阳性单克隆杂交瘤细胞扩大培养，细胞数按1×10⁶-2×10⁶/管进行冻存。同时收集细胞进行下述的腹水抗体的制备。

二、腹水抗体的制备

采用动物体内生产单抗的方法。每只8-12周龄的雌性Balb/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml，7-14天后可以供腹腔注射步骤一得到的各单克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后观察小鼠腹水生产情况，如腹部明显膨大，即可抽取腹水。腹水采集后离心除去油脂和沉淀，并用ProteinG柱纯化得到各腹水抗体，同时收集ProteinG柱的流穿溶液。

三、腹水抗体效价的测定

采用间接ELISA法测定腹水抗体的效价，具体步骤如下：

(一)将实验用的抗原(2号混合肽段)按适当浓度溶解于包被液(50mMNa₂CO₃(pH9.6))中，加入到96孔ELISA板中，4℃孵育过夜。

(二)抛干液体并用300μL清洗液(含0.03％Tween-20的0.1MTris-HCl(pH7.5))洗涤三次。

(三)每个样品中加入300μL的封闭液(用清洗液配成的含有3％的BSA，％代表g/100ml)，室温封闭1h。

(四)每个样品孔中加稀释好的步骤二的腹水抗体100μl，并进行倍比稀释，37℃孵育1h。

(五)抛干液体，用清洗液洗涤三次。

(六)每个样品孔中加稀释好的HRP标记的二抗(购自Abmart，货号为M21001)100μl，37℃孵育1h。

(七)抛干液体，用清洗液洗涤三次。

(八)用300μL洗涤液浸泡5-10min,抛干残留液体。

(九)用清洗液洗涤5次后，抛干残存液体。

(十)每个样品孔中加100μl底物，显色，待最大的稀释度的孔有轻微着色之后加入终止反应液，用ELISA检测仪测定OD值，计算出各腹水抗体的ELISA效价，ELISA效价显示如表2。

四、抗原表位的判断

2号混合肽段为YTRGAISSTQGSGSQRSGPQGIAPGSGSAAIKTADDEA(从N端到C端)，采用步骤三的ELISA方法分别包被SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.63条多肽对产生的腹水抗体进行鉴定其对应的表位，发现其与AAIKTADDEA(SEQIDNo.5)呈阳性反应，据此判断该抗体针对的抗原表位为AAIKTADDEA(SEQIDNo.5)。

纯化得到的腹水抗体的抗原表位以及ELISA效价如表2所示。表2中，抗体标注号表示获取抗体的单克隆杂交瘤细胞株的编号。抗原表位表示所制备的抗体能够识别的抗原肽段，ELISA效价表示ELISA实验时抗体的稀释倍数。

表2腹水抗体的抗原表位的判断以及ELISA效价测定

抗体标注号	抗原表位	ELISA效价
			7131-1-1M12/2K9_120307	AAIKTADDEA	128K
7131-1-1M12/2D2_120305	AAIKTADDEA	128K
			7131-1-1M12/7E4_120307	AAIKTADDEA	128K
7131-1-1M12/6I8_120307	AAIKTADDEA	128K
			7131-1-1M12/7O5_120307	AAIKTADDEA	128K
7131-1-1M12/5P16_120307	AAIKTADDEA	128K
			7131-1-1M12/7A14_120307	AAIKTADDEA	128K
7131-1-1M12/7G9_120307	AAIKTADDEA	128K
			7131-1-1M12/8F12_120307	AAIKTADDEA	128K
7131-1-1M12/5P16_120307	AAIKTADDEA	128K
			7131-1-1M12/7O5_120307	AAIKTADDEA	128K
7131-1-1M12/6D14_120307	AAIKTADDEA	128K

五、为最终确定能够识别NOK/STYK1的特异性抗体的阳性细胞株，进一步将12个腹水抗体进行westernblotting检测，二抗为GoatantiMouse-HRP(购自Abmart公司，货号M21001)。

Westernblotting检测抗体的特异性结果为有3个腹水抗体能识别细胞裂解液中的NOK/STYK1蛋白，其中7131-1-1M12/7G9_120307号杂交瘤细胞产生的抗体识别特异性和亲和力最高。

六、将步骤二收集的7131-1-1M12/7G9_120307号杂交瘤细胞株的腹水、ProteinG柱纯化后的抗体(NOK/STYK1单抗)以及流穿溶液按照步骤三的间接ELISA法精确测定各样品的效价，结果如表3所示。

表3ELISA检测数据

表3中，K表示1000；PC表示正对照(positivecontrol)；NC表示负对照(negativecontrol)。

表3表明，纯化后大部分抗体被保留下来并且维持了抗体活性。

七、单抗浓度测定

紫外分光光度法测定7131-1-1M12/7G9_120307(以下简称7G9)在280nm和260nm处的吸光度值A280和A260。

蛋白含量按照下列公式计算：蛋白质含量(g/L)＝1.45×A280-0.74×A260。

NOK/STYK1单抗的浓度为3mg/mL。

产NOK/STYK1单抗的杂交瘤细胞7G9已于2013年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.8163。

下述实施例中将杂交瘤细胞7G9产生的单克隆抗体记作NOK/STYK1(7G9)单抗。

实施例4、NOK/STYK1单抗的检测

一、Westernblot检测NOK/STYK1(7G9)单抗与内源NOK/STYK1蛋白以及外源NOK/STYK1蛋白的特异性结合

分别将插入NOK/STYK1基因的pcDNA3.1-NOK/Flag质粒和pcDNA3.1(+)转染人肾胚上皮细胞293T细胞，得到转NOK/STYK1-Flag基因和转空载体的细胞，转染后24小时，将转NOK/STYK1基因和转空载体的细胞用RIPA细胞裂解液裂解，得到细胞裂解液，离心，得上清。同时用RIPA细胞裂解液裂解MCF7细胞和MDA-MB-231细胞，离心，得上清。

分别将得到的以上四种上清进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上；用TBST稀释制备的5g/100ml脱脂奶粉室温封闭2小时，加入用上述5g/100ml脱脂奶粉按体积比1：1000稀释的实施例1中ProteinG柱纯化得到的NOK/STYK1(7G9)单抗，4℃过夜孵育；TBST清洗膜3次，每次5min；再加入用TBST按1：10000稀释制备的HRP标记的山羊抗小鼠IgG后，室温孵育2小时；TBST清洗膜5次，每次5min；在暗室进行底物(SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate，购自赛默飞世尔公司，产品目录号为1856136)显色曝光，检测结果如图1所示。

图1中，NOK–Flag代表转NOK/STYK1基因的细胞，pcDNA3.1代表转空载体的细胞。

图1表明，NOK/STYK1(7G9)单抗可以特异的检测到内源的NOK/STYK1(MCF7细胞产生的NOK/STYK1)以及外转的NOK/STYK1(转NOK/STYK1基因的细胞产生的NOK/STYK1)，而在转pcDNA3.1(+)的293T细胞(转空载体细胞)并未检测到目的条带，表明NOK/STYK1(7G9)能特异性的结合NOK/STYK1，在MDA-MB-231细胞中未能检测到目的蛋白条带，表明NOK/STYK1在该细胞中表达量相对较低。

二、NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在不同肿瘤细胞中的表达

取不同的结肠癌细胞系SW480、SW620、HT-29、HCT116和DLD1以及乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231，培养后裂解，得到全蛋白并定量一致后经SDS-PAGE电泳，采用步骤一的方法进行WesternBlot检测，同时以β-actin作为内参。

westernblotting检测结果如图2所示。

图2表明，NOK/STYK1蛋白在结肠癌和乳腺癌细胞系中均有表达，并且与结肠癌细胞系SW480、DLD1以及乳腺癌细胞系MDA-MB-231相比，NOK/STYK1蛋白在三种结肠癌细胞系SW620、HT-29和HCT116以及乳腺癌细胞MCF7中表达量明显较高。

三、NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达差异

取人体乳腺的乳腺癌变组织和乳腺癌旁组织细胞按照步骤一的方法，并调整不同稀释度的NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在乳腺癌变组织和乳腺癌旁组织中的表达差异。

westernblot检测结果如图3所示。

图3中，Normal为乳腺癌旁组织；Cancer为乳腺癌变组织。

图3表明，在NOK/STYK1(7G9)单抗分别以1:500、1:1000、1:5000以及1:10000比例进行稀释的条件下，可以检测到NOK/STYK1蛋白在乳腺癌变组织中的表达要显著高于乳腺癌旁组织。

四、NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在结肠癌组织中的表达

取6个样本(患有结肠癌病人)的结肠癌变组织和结肠癌旁组织按照步骤一的方法，用NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在结肠癌组织中的表达。

westernblot检测结果如图4所示。

图4中，Normal为结肠癌旁组织；Cancer为结肠癌变组织。

图4表明，与结肠癌旁组织相比，NOK/STYK1在一半的结肠癌变组织样本中表现为高表达，在另一半结肠癌变组织样本中表达未见显著差异。根据此结果可以初步判定NOK/STYK1高表达与结肠癌的发生存在相关性，可作为潜在的辅助诊断标志。如要进一步判断其在结肠癌中的诊断意义需进一步在大量样本中进行检测，然后根据临床分型，确定NOK/STYK1与结肠癌的关系，最终确定NOK/STYK1是否可以作为早期诊断的标志物的结肠癌的类型。

五、NOK/STYK1(7G9)单抗检测内源NOK/STYK1蛋白在不同细胞系中的定位及表达

免疫荧光标记检测NOK/STYK1蛋白在三种不同细胞系(结肠癌细胞HT-29、胃癌细胞803以及乳腺癌细胞MCF7)中的定位，结果如图5所示。

图5中，DAPI代表用DAPI染色细胞核，NOK/STYK1代表用TRITC红色荧光标记的NOK/STYK1蛋白。

图5表明，NOK/STYK1蛋白在这三种肿瘤细胞系中主要定位在细胞质基质，并且有一定的聚集颗粒形成。

六、利用NOK/STYK1(7G9)单抗检测NOK/STYK1蛋白在乳腺癌组织中的定位及表达

取患乳腺癌病人的乳腺癌变组织，进行石蜡包埋并制作组织切片。对组织切片进行免疫组化分析,具体方法参考PV-6000/PV-6001/PV-6002/PV-6004Polink-1HRPDABDetectionSystemOne-steppolymerdetectionsystemforMouse,RabbitandRatantibodies试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)的说明书，一抗同免疫荧光染色用的NOK/STYK1(7G9)，二抗为PV-6002。结果如图6所示。

图6中，蓝色表示细胞核，黄色表示内源NOK/STYK1。

图6表明，NOK/STYK1(7G9)单抗能够检测到内源NOK/STYK1蛋白在乳腺癌变组织中高表达。由此推测，NOK/STYK1蛋白和其它的酪氨酸激酶类似，对于肿瘤尤其是乳腺癌的发生可能有一定的影响。

Claims (6)

1.一株杂交瘤细胞7G9，其保藏编号为CGMCCNo.8163。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞制备的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的抗体在制备检测NOK或STYK1蛋白的产品中的应用。

4.权利要求2所述的抗体在制备阻断NOK或STYK1信号通路的产品中的应用。

5.权利要求2所述的抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌为结肠癌、胃癌或乳腺癌。