CN104334581B - 抗‑c‑Met抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人c‑Met的胞外结构域的抗体或其抗原结合片段，包含此类c‑Met抗体或其抗原结合片段的组合物和试剂盒，和使用其用于检测人c‑Met的方法，所述方法帮助鉴定具有表达或过表达人c‑Met的肿瘤的患者和/或改善它们使用抗c‑Met治疗剂的治疗应答。

Description

抗-c-Met抗体
本发明涉及医药领域。更特别地，本发明涉及抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合人c-Met(也称为MET)以形成可检测的c-Met/抗-c-Met抗体复合物，所述复合物可用于需要标记、做记号、或鉴定人c-Met的诊断技术，诸如成像、预后或预测性应用，所述应用帮助鉴定具有表达或过表达人c-Met蛋白的肿瘤的患者和/或改善它们使用抗c-Met疗法的治疗应答。
蛋白c-Met是受体酪氨酸激酶超家族的成员，和肝细胞生长因子(HGF)的受体，也称为散射因子(SF)。成熟的人c-Met蛋白由完全胞外的α亚基、由胞外配体结合结构域、单跨膜结构域，和细胞质酪氨酸激酶结构域组成的β亚基构成。
已经显示人c-Met受HGF的激活增强与侵袭性细胞表型相关的特征：增殖、迁移、形态发生、存活和蛋白酶合成。人c-Met信号传递途径是人癌症中最频繁失调的途径之一，并在几乎所有类型的实体瘤中涉及。在许多类型的癌症中观察到人c-Met的刺激、过表达、或突变，包括结肠、乳房、卵巢、肺、前列腺、胰腺、胆管、脑、甲状腺、肾、胃癌以及黑素瘤和肉瘤。HGF/c-Met信号传递轴的这些生物化学和遗传学异常与癌症患者中差的临床结果和药物抗性相关。
由于人c-Met信号传递途径在调节肿瘤形成的初始步骤和随后疾病扩散中的作用，人c-Met被认为是使用处于研发中的HGF或c-Met的小分子和抗体拮抗剂的癌症疗法的有吸引力的靶。考虑到处于研发中的人c-Met的小分子和抗体拮抗剂，需要人c-Met的诊断抗体用于分析患者癌症。
PCT国际公开WO2009/029591公布了命名为MET4的单克隆抗体，报道所述抗体结合人c-Met的ECD，并且能够对福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织中的c-Met进行染色。
为了评价在使用人c-Met的小分子和抗体拮抗剂的治疗前，治疗期间，或治疗后，癌症患者的肿瘤细胞中的人c-Met的表达或过表达的水平，需要备选的人c-Met诊断抗体，所述抗体能够特异性结合膜定位的人c-Met的ECD。此外，为了评价接受使用治疗性抗c-Met活性剂的治疗的癌症患者的肿瘤细胞中的人c-Met的表达或过表达的水平，需要人c-Met诊断抗体，所述抗体当c-Met已经与治疗性抗c-Met活性剂结合时能够特异性结合人c-Met。
对于人c-Met诊断抗体，对人c-Met的特异性和选择性也是极为重要的。避免与c-Met的紧密相关的受体酪氨酸激酶家族成员，诸如人RON(也称为MST1R)的交叉反应性对于人c-Met诊断抗体是重要的。因此，也需要能够特异性和选择性地(例如，没有与人RON的显著的结合)结合膜定位的人c-Met的人c-Met诊断抗体。
因此，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1包含多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2包含多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3包含多肽CQHHYGTPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1包含多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2包含多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：5)或GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：6)，并且HCDR3包含多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1包含多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2包含多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3包含多肽CQHHYGTPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1包含多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2包含多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：5)，并且HCDR3包含多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1包含多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2包含多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3包含多肽CQHHYGTPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1包含多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2包含多肽GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：6)，并且HCDR3包含多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1是多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2是多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3是多肽CQHHYGTPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1是多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2是多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：5)或GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：6)，并且HCDR3是多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1是多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2是多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3是多肽CQHHYGTPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1是多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2是多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：5)，并且HCDR3是多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1是多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2是多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3是多肽CQHHYGTPFT(SEQ IDNO：3)，HCDR1是多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2是多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQID NO：5)，并且HCDR3是多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1是多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2是多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3是多肽CQHHYGTPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1是多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2是多肽GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：6)，并且HCDR3是多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1是多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1)，LCDR2是多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO：2)，LCDR3是多肽CQHHYGTPFT(SEQ IDNO：3)，HCDR1是多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO：4)，HCDR2是多肽GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQID NO：6)，并且HCDR3是多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO：8，并且HCVR是多肽SEQID NO：9或SEQ ID NO：10。在另外的实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含LCVR和HCVR，LCVR是多肽SEQ ID NO：8，并且HCVR是多肽SEQ ID NO：9。在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO：8，并且HCVR是多肽SEQ ID NO：10。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC是多肽SEQ ID NO：11，并且HC是多肽SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。在另外的实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC是多肽SEQ ID NO：11，并且HC是多肽SEQ ID NO：12。在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC是多肽SEQ ID NO：11，并且HC是多肽SEQ ID NO：13。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：12。在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：13。
本发明提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物，和可接受的运载体、稀释剂，或赋形剂。更特别地，本发明的组合物还包含一种或多种额外的诊断活性剂。
本发明提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含容器，所述容器包含特异性结合本发明的抗体的第二抗体。在另外的实施方案中，本发明的试剂盒还包含容器，所述容器包含特异性结合本发明的抗体的第二抗体。优选地，第二抗体是抗小鼠IgG抗体诸如抗小鼠IgG1抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了检测由人细胞表达或过表达的人c-Met的方法，包括：(a)在体外将细胞与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和(c)检测，并且任选地对与人c-Met的ECD(SEQID NO：24)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量。在另外的实施方案中，本发明提供了检测由人细胞表达或过表达的人c-Met的方法，包括(a)在体外将细胞与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和(c)检测，并且任选地对与人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量，其中人细胞是福尔马林固定石蜡包埋的。在另外的实施方案中，本发明提供了检测由人细胞表达或过表达的人c-Met的方法，包括(a)在体外将细胞与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和(c)检测，并且任选地对与人c-Met的ECD(SEQ ID NO：24)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量，并且其中检测是通过直接或间接免疫组织化学(IHC)进行的。
在一个实施方案中，本发明提供了测定或监控患者中对施用抗c-Met治疗剂的应答的方法，包括：(a)在施用抗c-Met治疗剂之前从患者分离的第一样品中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段测量人c-Met的量；(b)在施用抗c-Met治疗剂之后从患者分离的第二样品中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段测量人c-Met的量；(c)测定较之第一样品，第二样品中的人c-Met是否降低，其中人c-Met降低提示患者应答抗c-Met治疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供了测定或监控患者中对施用抗c-Met治疗剂的应答的方法，包括：(a)在施用抗c-Met治疗剂之前从患者分离的第一样品中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段测量人c-Met的量；(b)在施用抗c-Met治疗剂之后从患者分离的第二样品中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段测量人c-Met的量；(c)测定较之第一样品，第二样品中的人c-Met是否降低，其中人c-Met降低提示患者应答抗c-Met治疗剂，并且其中抗c-Met治疗剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成。
在一个实施方案中，本发明提供了测定或监控患者中对施用抗c-Met治疗剂的应答的方法，包括：(a)在施用抗c-Met治疗剂之前从患者分离的第一样品中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段测量人c-Met的量；(b)在施用抗c-Met治疗剂之后从患者分离的第二样品中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段测量人c-Met的量；(c)测定较之第一样品，第二样品中的人c-Met是否降低，其中人c-Met降低提示患者应答抗c-Met治疗剂，并且其中抗c-Met治疗剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于诊断、预后和/或预测使用抗c-Met治疗抗体或小分子c-Met治疗化合物的癌症治疗应答。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段的用途，其用于：
(a)检测，并且任选地定量人细胞中或上的人c-Met；
(b)检测，并且任选地定量患者中表达或过表达人c-Met的肿瘤细胞；
(c)检测，并且任选地定量患者的血液样品中表达或过表达人c-Met的循环肿瘤细胞；
(d)检测，并且任选地定量来自癌症患者的体液中表达或过表达人c-Met的肿瘤细胞；
(e)评价个体是否具有组织或器官的癌症，所述组织或器官中表达或过表达人c-Met；
(f)选择具有适于使用抗c-Met治疗剂的治疗的肿瘤的患者；或
(g)测定对使用抗c-Met治疗剂的治疗的应答。
在另外的实施方案中，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段的用途，其中通过IHC进行人c-Met的检测，和，任选地，定量。在另外的实施方案中，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段的用途，其中抗c-Met活性剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成，或其中抗c-Met活性剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。
在一个实施方案中，本发明提供了选择具有其中表达或过表达人c-Met的肿瘤的患者的方法，用于使用抗c-Met治疗抗体或小分子c-Met治疗化合物的治疗，所述方法包括：(a)将肿瘤样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和(c)检测，并且任选地对与人c-Met的ECD特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量，其中存在与人c-Met的ECD特异性结合的抗体或其抗原结合片段将患者鉴定为适于使用抗c-Met治疗抗体或小分子c-Met治疗化合物的治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了预测患者对施用抗c-Met治疗抗体或小分子c-Met治疗化合物的应答的方法，包括：(a)将来自患者的肿瘤样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和(c)检测，并且任选地对与人c-Met的ECD特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量，其中存在与人c-Met的ECD特异性结合的抗体或其抗原结合片段提示患者将很可能应答施用抗c-Met治疗抗体或小分子c-Met治疗化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，包括：(a)选择需要其治疗的患者，其中患者具有其中表达或过表达人c-Met的肿瘤，如通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测人c-Met测定的；和(b)使用抗c-Met治疗剂治疗患者，其中抗c-Met治疗剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成，或其中抗c-Met活性剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。在本发明的方法的多种实施方案中，受治疗的癌症是胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胆管癌、头颈癌，或肾癌。在本发明的方法的多种实施方案中，使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：12，或使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：13。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者中的癌症的方法，包括测试来自患者的生物样品中人c-Met的存在并且如果测试样品是人c-Met是阳性的，如使用本发明的抗体或其抗原结合片段的检测所测定的，则对患者施用治疗有效量的抗c-Met治疗剂，并且其中抗c-Met治疗剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成，或其中抗c-Met活性剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。在本发明的方法的多种实施方案中，受治疗的癌症是胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胆管癌、头颈癌，或肾癌。在本发明的方法的多种实施方案中，使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：12，或使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：13。在本发明的方法的多种实施方案中，生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者中的癌症的方法，包括对患者施用治疗有效量的抗c-Met治疗剂，条件是如果测试来自患者的生物学样品是人c-Met阳性的，如使用本发明的抗体或其抗原结合片段的检测所测定的，则选择用于治疗的患者，并且其中抗c-Met治疗剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成，或者其中抗c-Met活性剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。在本发明的方法的多种实施方案中，受治疗的癌症是胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胆管癌、头颈癌，或肾癌。在本发明的方法的多种实施方案中，使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：12，或使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：13。在本发明的方法的多种实施方案中，生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的。
在一个实施方案中，本发明提供了抗c-Met治疗剂，其用于治疗癌症，包括(a)选择需要其治疗的患者，其中患者具有其中表达或过表达人c-Met的肿瘤，所述表达或过表达如通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测人c-Met测定的；和(b)使用抗c-Met治疗剂治疗患者，其中抗c-Met治疗剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成，或其中抗c-Met治疗剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。在用于治疗癌症的本发明的多种实施方案中，癌症是胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胆管癌、头颈癌，或肾癌。在用于治疗癌症的本发明的多种实施方案中，使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ IDNO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：12，或使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：13。
在一个实施方案中，本发明提供了抗c-Met治疗剂，其用于治疗癌症，包括使用来自患者的生物样品进行体外测定法，通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段的检测测定人c-Met的存在，并且如果存在人c-Met对患者施用治疗有效量的抗c-Met治疗剂，其中抗c-Met治疗剂是包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成，或其中抗c-Met治疗剂是N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺或6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪。在用于治疗癌症的本发明的多种实施方案中，癌症是胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胆管癌、头颈癌，或肾癌。在用于治疗癌症的本发明的多种实施方案中，使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：12，或使用包含两条轻链和两条重链的抗体检测人c-Met，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO：11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO：13。
在本发明的方法的多种实施方案中，通过免疫测定技术，诸如IHC、流式细胞术、western印迹，或ELISA进行本发明的抗体或其抗原结合片段与人c-Met的ECD的结合的检测。更优选地，通过IHC进行本发明的抗体或其抗原结合片段与人c-Met的ECD的结合的检测。
在本发明此方面的另外的实施方案中，人细胞可以是福尔马林固定石蜡包埋的，并且检测可以通过直接或间接IHC进行。间接IHC可以包括使用结合c-Met的第二、酶缀合的单克隆抗体或其抗原结合片段或竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段，并且c-Met可以通过使用酶的生色底物检测。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于检测循环肿瘤细胞(CTC)。CTC是从肿瘤流出的肿瘤细胞，在转运过程中在血流内存活并在远处的位点处开始新生长。检测CTC是有用的因为CTC可以在检测到肿瘤之前在患者中发现。CTC也可见于显著比例的肿瘤复发时的患者中，并且在移除原发肿瘤后CTC在一些患者中持续。有证据提示CTC源自原发肿瘤以及转移肿瘤中的克隆并且其在肿瘤进展的全部阶段反映肿瘤负荷。因此，除了在早期诊断和预后中的潜在作用之外，CTC可在表征随肿瘤进展的基因和表型改变中起主要作用，从而帮助引导靶向疗法。更特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于捕获、鉴定，和/或定量CTC的测定法中，诸如，例如，CTC测试(Veridex LLC，SanDiego，CA)、磁激活的细胞分选系统(Miltenyi Biotec GmbH，德国)、DynalMagnetic(Invitrogen)、(Stem Cell Technologies，Vancouver加拿大)、CTC芯片(on-Q-ity，Waltham，MA)，或本领域中已知用于分离和检测CTC的任何其他测试诸如在Sleijfer，等人.Circulating tumour cell detection on its wayto routinediagnostic implementation？Eur J Cancer，43(18)：2645-50(2007)；Lacroix M.，Significance，detection and markers of disseminated breast cancer cells.EndocrRelat Cancer.，13(4)：1033-67(2006)；和Pantel，等人，Detection，clinical relevanceand specific biological properties of disseminating tumour cells.Nat RevCancer，8(5)：329-40(2008))中描述的那些。目前，CTC是唯一由USFDA批准的作为检测和计数循环肿瘤细胞的自动化测试的诊断测试(Fed.Reg.69(91)：26036-38(2004)。测试的结果已经用于监控转移性前列腺癌(Danila，等人，Circulating tumorcell number and prognosis in progressive castration-resistant prostatecancer.Clin Cancer Res-，13(23)：7053-58(2007))、结肠直肠癌(Cohen，等人，Isolationand characterization of circulating tumor cells in patients with metastaticcolorectal cancer.Clin Colorectal Cancer 6(2)：125-32(2006))，和乳腺癌(Cristofanilli，等人.Circulating tumor cells，disease progression，and survivalin metastatic breast cancer.N Engl J Med.，351(8)：781-91(2004))中的疾病进展和疗法效力。本发明的抗体或其抗原结合片段，例如，本文描述的，和特别地下表1中描述的抗体I或II，可用于此类方法中，例如测试，并且在一些情况中在疗法开始以及c-Met介导的癌症的治疗过程中的任何时间进行。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段连同对于其他多肽特异性的抗体一起可用于此类方法中，所述多肽包括，但不限于，EPCAM、DAPI、CD45，和/或细胞角蛋白(包括，但不限于，细胞角蛋白7、8、18，和/或19)。通过允许，例如，监控疾病进程和疗法效力，从此类测试生成的信息对于其预后价值是有用的，并可以允许较早(以及进行中的)治疗决定。此外，通过允许可检测地标记的本发明的抗体或其抗原结合片段和治疗性抗c-Met抗体(诸如WO/2010/059654中公开的)的同时结合，使用治疗性抗c-Met抗体的治疗的间断，即，“洗出(washing out)”治疗抗体以允许诊断抗体结合c-Met，是不需要的。因此，必要时，本发明的抗体或其抗原结合片段允许伴有诊断监控的不间断的治疗性治疗。
如本文所用，“c-Met”或“人c-Met”指人c-Met；c-Met的结构示意性地描述为：
SEMA：Sema结构域
PSI：丛状蛋白，脑信号蛋白，和整联蛋白结构域
IPT：4个免疫球蛋白，丛状蛋白，和转录(IPT)因子结构域
TM：跨膜区
JM：近膜结构域
KD：激酶结构域
对于人c-Met ECD，成熟的蛋白质是多肽SEQ ID NO：24。SEMA结构域由在人c-Met的N端处的约500个氨基酸残基组成，并且含有α-链(SEQ ID NO：24的氨基酸残基1-283，即，(SEQ ID NO：25))和部分β-链(SEQ ID NO：24的氨基酸残基284-495，即，(SEQ ID NO：26))。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合人c-Met的ECD。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合IPT结构域。在另外的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合在成熟人c-Met ECD(SEQ ID NO：24)的氨基酸517-538(含端点)中。
“抗体”的一般结构在本领域是公知的。对于IgG型抗体，有经由链内和链间二硫键交联的4条氨基酸链(两条“重”链和两条“轻”链)。当在某些生物系统中表达时，具有未经修饰的人Fc序列的抗体在Fc区被糖基化。抗体也可以在其他位置被糖基化。本领域技术人员将理解本发明的抗体可以含有此类糖基化。抗体的亚基结构和三维构型也是本领域公知的。每条重链由N端重链可变区(“HCVR”)和重链恒定区(“HCCR”)组成。对于IgG、IgD，和IgA，重链恒定区由三个结构域(CHl、CH2，和CH3)组成；对于IgM和IgE，重链恒定区由4个结构域(CH1、CH2、CH3，和CH4)组成。每条轻链由轻链可变区(“LCVR”)和轻链恒定区(“LCCR”)组成。每条轻链/重链对的可变区形成抗体的结合位点。
可以使用本领域公知的技术生产本发明的抗体或其抗原结合片段，例如，重组技术、噬菌体展示技术、合成技术、或此类技术的组合或本领域公知的其他技术。生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域公知的并且可见于，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，第5-8和15章，ISBN 0-87969-314-2。
本发明的抗体或其抗原结合片段是经改造的抗体，所述抗体已经被设计为具有人源的框架、铰链区，和恒定区，它们与源自人基因组序列的框架和恒定区相同或基本相同(基本是人的)。完全的人框架、铰链区，和恒定区是那些人种系序列以及具有天然发生的体细胞突变的序列和/或具有经改造的突变的那些。本发明的抗体或其抗原结合片段可包含其中含有一个或多个氨基酸替换、缺失、或添加的源自完全的人框架、铰链，或恒定区的框架、铰链，或恒定区。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段在人中基本是非免疫原性的。
本发明的抗体或其抗原结合片段可用作诊断剂以帮助鉴定具有表达相对高水平的c-Met的肿瘤细胞的癌症患者。此外，此类抗体或其抗原结合片段，可用于监控并且，任选地优化使用c-Met靶向的治疗剂的癌症患者的治疗，所述治疗剂诸如WO2010/011538和美国专利申请号13/188496中描述的小分子c-Met治疗化合物，例如后文的结构1和2，以及抗c-Met治疗抗体，诸如WO2010/059654和WO2006/015371中描述的那些，包括，但不限于，C8-H241和MetMAb。更具体而言，本发明的抗体或其抗原结合片段，可用于监控并且，任选地优化使用抗c-Met治疗抗体C8-H241的癌症患者的治疗(Chemical Abstracts Service(CAS)#1365287-97-3)。抗c-Met抗体C8-H241包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链由多肽SEQID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：22组成。备选地，抗c-Met治疗抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO：20组成并且每条重链由多肽SEQ ID NO：21组成。更具体而言，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于监控，并且任选地优化使用抗c-Met治疗抗体MetMAb的癌症患者的治疗。如本文所用，“MetMAb”旨在意为人源化的一条臂的5D5(OA-5D5；onartuzumab，CAS#1133766-06-9)抗体，其具有如SEQ ID NO：27中显示的轻链和如SEQ ID NO：28中显示的重链。MetMAb可以在哺乳动物细胞或大肠杆菌中生产；哺乳动物细胞可包括HEK 293 EBNA细胞。更具体而言，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于监控，并且任选地优化使用如下文结构1和结构2中所示的小分子c-Met治疗化合物，或其可药用的盐的癌症患者的治疗。
结构1：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-甲酰胺
结构2：6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基硫基)-[1，2，4]三唑并[4，3-b]哒嗪
如本文所用，关于c-Met抗体或其抗原结合片段对于人c-Met的ECD的亲和力的词语“特异性结合”旨在意为，除非另外指出，少于约1x10-8M的KD，优选地，少于约1x10-9M的KD，这是通过本领域已知的通常方法所确定的，包括通过在25℃基本如本文所述使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器。本文所用的关于本发明的抗体或其抗原结合片段的术语“选择性的”指这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段以比所述抗体或其抗原结合片段结合包括但不限于人RON的人酪氨酸激酶家族中的至少一个成员低约1000、500、200、100、50、10、或约5倍的KD，结合人c-Met的ECD，如通过表面等离振子共振在25℃测量的。额外地或备选地，当通过下文实施例3-7中描述的免疫测定方法进行测定时，c-Met选择性的本发明的抗体或其抗原结合片段结合人c-Met的ECD但不结合或仅最少地结合包括但不限于人RON的人酪氨酸激酶家族中的至少一个成员。
当测定人细胞、CTC，或肿瘤组织样品的人c-Met的量显著大于正常人细胞或非肿瘤人组织中的人c-Met的量时，人c-Met在人细胞、CTC、或肿瘤组织样品中或上是过表达的。
本文公开的抗体或其抗原结合片段用于检测在细胞中或上，或在组织、器官、体液等中的细胞中或上存在的人c-Met的表达、过表达，或水平，以及用于诊断、预后，和/或患者监控过程中。术语“体液”指源自正常或患病对象的身体的任何液体或其他材料，诸如血液、血清、血浆、淋巴、骨髓、尿、唾液、泪、脑脊髓液、乳、羊水、胆汁、尿、支气管液、腹水流体、脓，和任何其他生物学产物。此术语的含义也包括器官或组织提取物，和培养液在内，其中已经孵育了来自对象的任何细胞或组织制品。
本领域中存在本领域技术人员可以使用的用于形成稳定的、可检测的抗原-抗体复合物的公知方法(参见，例如，Antibodies，A Laboratory Manual，Harlow和Lane(当前版本)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，对于允许形成可检测的抗原/抗体复合物的条件而言)。特别地，WO 2010/059654描述了可以允许包括但不限于本文称为抗体I和抗体II的抗体的本发明的抗体或其抗原结合片段结合的示例性的条件。也可以使用本文教导的方法或本领域通常已知的方法，包括但不限于Harlow和Lane，如上，或WO 2010/059654中公开的此类方法，检测、标记和/或鉴定包含与人c-Met的ECD结合的本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物。
可以通过多种免疫测定方法测量特别的蛋白质诸如人c-Met，所述方法包括，例如，并非限制，竞争性和非竞争性测定法系统，其使用诸如，例如，并非限制，western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集反应测定法、补体结合测定法、免疫放射分析、荧光免疫测定法，和蛋白A免疫测定法的技术。免疫学和免疫测定流程的一般综述参见Stites和Terr(编)(1991)Basic and Clinical Immunology(第7版)。此外，本发明的免疫测定可以以多种形式实施，在Maggio(编)(1980)Enzyme Immunoassay CRC Press，Boca Raton，Florida；Gosling J P 2000 Immunoassays：A Practical Approach(Practical Approach Series)Oxford Univ Press；Diamandis&Christopoulus，1996Immunoassay Academic Press，San Diego，CA；Tijan(1985)″Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays，″Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Wild，D.(编)，2001 The Immunoassay Handbook(第2版)Nature Pub Group；James T.Wu，2000 Quantitative Immunoassay：A Practical Guide for Assay Establishment，Troubleshooting，and Clinical Application，Amer Assn for Clinical Chemistry，Brousseau&Beaudet(编)Manual of Immunological Methods CRC Press Boca Raton，Florida；和Harlow和LaneAntibodies，A Laboratory Manual，见上文中广泛综述。也参见Chan(编)(1987)Immunoassay：A Practical Guide Academic Press，Orlando，FL；Price和Newman(编)(1991)Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press，NY；和Ngo(编)(1988)Non-isotopic Immunoassays Plenum Press，NY。
可以通过多种本领域已知的方法实施免疫测定法。简而言之，测量人c-Met ECD的免疫测定法可以是竞争性或非竞争性结合测定法。在竞争性结合测定法中，待分析的样品与经标记的分析物竞争结合在固体表面的捕获剂上的特异性结合位点。优选地，捕获剂是与如本文所述的人c-Met ECD特异性反应的抗体。与捕获剂结合的经标记的分析物的浓度与样品中存在的游离分析物的量成反比例。
在竞争性结合免疫测定法中，样品中存在的靶蛋白(即，人c-Met ECD)与经标记的蛋白质竞争结合本发明的抗体。本发明的抗体可与固体表面结合以实现分离结合的经标记的蛋白质与未结合的经标记的蛋白质。备选地，可以在液相中进行竞争性结合测定法并且可以使用本领域中已知的多种技术以分离结合的经标记的蛋白质与未结合的经标记的蛋白质。在分离后，测定结合的经标记的蛋白质的量。在样品中存在的蛋白质的量与经标记的蛋白质结合的量成反比例。
备选地，可以实施均质免疫测定法，其中不需要分离步骤。在这些免疫测定法中，通过蛋白质与其特异性结合组合物的结合改变蛋白质上的标签。经标记的蛋白质中的这一改变导致由标签发射的信号降低或增加，从而在免疫测定法末尾的标签测量允许检测或定量蛋白质。
竞争性测定法也是特别有用的，其中用经标记的抗体和测试样品接触并且孵育细胞，所述抗体对蛋白质具有已知的结合亲和力，诸如125I-标记的抗体，所述测试样品对结合组合物的结合亲和力被测量。然后分离结合的和游离的经标记的结合组合物以评价蛋白质结合程度。结合的测试化合物的量与结合已知源的经标记的结合伙伴的量成反比例。可以使用众多技术中的任何一种以分离结合的和游离的蛋白质从而评价蛋白质结合程度。此分离步骤通常可以涉及这样的流程，诸如附着于过滤器之后洗涤，附着于塑料之后洗涤，或细胞膜离心。也可以使用活细胞以筛选药物对人c-Met介导的功能的作用(例如，第二信使水平，诸如，例如，细胞增殖；肌醇磷酸池改变，使用荧光素酶类型测定法的转录；以及其它)。一些检测方法允许去除分离步骤，例如，临近敏感检测系统(proximity-sensitivedetection system)。
也可以通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段的多种非竞争性免疫测定法方法测定人c-Met的定性或定量分析。例如，可以使用两位点、固相夹心免疫测定法。在此类测定法中，抗体附着于固体支持物。标记第二蛋白结合-组合物，所述组合物也可以是抗体，并且在不同位点特异性结合蛋白质。在蛋白质上的两个位点已经结合后，移除未结合的-经标记的结合组合物并且测量结合至固相的经标记的结合组合物的量。结合的经标记的结合组合物的量与样品中蛋白质的量成正比。
实施例1：抗体表达和纯化
重链和轻链的可变区的多肽，抗体I和II的完整重链和轻链氨基酸序列，和编码其的核苷酸序列在下文标题为“氨基酸和核苷酸序列”的部分中列出。此外，轻链和重链CDR多肽在表1中示出。
使用标准转染流程，包括但不限于抗体I和II的本发明的抗体或其抗原结合片段可在HEK293 EBNA细胞(Edge BioSystems，#90500130)中瞬时表达。在转染后，于37℃在含有遗传霉素(G418)和妥布霉素的标准无血清培养基中培养经转染的细胞48至120小时。通过遵循公知的流程和/或生产商的说明，抗体可以在60 ml rProtein A Sepharose柱(Amersham Biosciences；#17-1279-04)上纯化，并通过使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH 7.4作为流动相的大小排阻层析(XK50/60 Superdex200，Pharmacia)进一步浓缩和纯化。之后，可以使用Millex-GV，PVDF膜，0.22μm，33mm，(Millipore；#SLGV033RS)过滤抗体制品并贮存于4至8℃。
表1：SEQ ID NO
实施例2：抗体I和II的结合动力学和亲和力
根据本领域已知的方法，可以通过使用表面等离振子共振生物传感器诸如2000，3000，或T100(GE Health Care，Piscataway，NJ)，测定本发明的抗体或其抗原结合片段与人c-Met ECD的结合动力学和亲和力。除非另有注明，全部试剂和材料购自GE Healthcare，并且测量可在25℃进行。可以使用HBS-EP+运行缓冲液(10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)pH 7.4，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05％表面活性剂P20；#BR-1006-69)填装仪器并且将分析温度设为25℃。可使用CM5芯片以采用捕获方法，所述芯片在全部四个流动室上含有经固定的山羊抗小鼠Fc抗体(使用标准NHS-EDC胺偶联生成的)。可以通过在HBS-EP+运行缓冲液中稀释制备5微克/mL的本发明的抗体或其抗原结合片段。可以从CHO细胞表达具有Fc和Flis标签的c-Met-ECD(c-Met-ECD-Fc-Flis)并将其纯化用于此分析(SEQ ID NO：23)。可以通过在HBS-EP+运行缓冲液中稀释制备终浓度范围从200nM至1.56nM(2倍稀释)的人c-Met-ECD-Fc-Flis。每个分析循环可由以下组成(1)在流动室2、3，和4上捕获本发明的抗体或其抗原结合片段的样品，(2)以50微升/min在全部流动室上注射250微升(300 sec)人c-Met-ECD，(3)回到HBS-EP+运行缓冲液流20min以监控解离相，(4)通过注射30微升(36 sec)甘氨酸，pH 1.5再生芯片表面，(5)通过注射50微升(60sec)HBS-EP+运行缓冲液平衡芯片表面。使用标准双参照处理数据并且使用2000评价软件，版本4.1拟合至1：1结合模型，以测定缔合速率(kon，M- 1s-1单位)、解离速率(koff，s-1单位)，和Rmax(RU单位)。平衡解离常数(KD)可以从关系KD＝koff/kon来计算，并且单位为摩尔。
在基本如此实施例2所述进行的实验中，抗体I和II以非常高的结合亲和力(KD)结合人c-Met-ECD(见表2)。较之抗体I，抗体II以高5x结合亲和力结合c-Met-ECD。
表2：抗体I和II与人c-Met-ECD-Fc-Flis的结合动力学和亲和力
实施例3：抗体I和II与C8-H241同时结合人c-Met的ECD
表面等离振子共振
为了测定本发明的抗体或其抗原结合片段是否可以与抗c-Met治疗抗体(诸如，例如，C8-H241，在WO/2010/059654中公开)同时结合人c-Met的ECD，可以根据本领域已知的方法使用表面等离振子共振生物传感器诸如2000，3000，或T100(GE Health Care，Piscataway，NJ)进行结合实验。除非另有注明，全部试剂和材料可购自可以从CHO细胞表达具有Fc和Flis标签的c-Met-ECD(c-Met-ECD-Fc-Flis)并将其纯化用于此分析(SEQ ID NO：23)。全部测量可在25℃进行。HBS-EP+缓冲液(10 mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20；#BR-1006-69)可用作运行缓冲液和样品缓冲液。使用胺偶联试剂盒，可以以7000应答单位(Ru)的水平将小鼠IgG1抗多组氨酸抗体(R&D systems，Mab050)固定在CM5传感器芯片的流动室1至4上以捕获人c-Met-ECD-Fc-Flis。人c-Met-ECD-Fc-Flis可以首先注射至流动室2。可以初始以50nM注射本发明的抗体或其抗原结合片段以完全饱和芯片表面上的c-Met-ECD-Fc-Flis。然后可立即注射C8-H241。可以使用结合应答单位计算结合化学计量。为了显示同时结合不依赖于两种抗体的添加顺序，可以在实验过程中颠倒或改变结合顺序若干次。
在本质上如此实施例3中描述地进行的实验中，每个c-Met-ECD-Fc-Flis结合1.1的抗体I和0.8的C8-H241(人IgG4亚型)抗c-Met抗体。对于抗体II，每个c-Met-ECD-Fc-Flis结合1.5的抗体II和0.9的C8-H241(CAS#1365287-97-3)抗c-Met抗体。添加顺序的全部组合显示抗体I和II能够在C8-H241的存在下结合cMet-ECD-Fc-Flis。这些数据显示抗体I和II和mAb C8-H241(人IgG4亚型)能够同时结合人c-Met-ECD-Fc-Flis，提示当进行使用C8-H241的治疗时，抗体I和抗体II可以用来检测患者样品中的c-Met水平，无需洗出时期。
FACS
可以进行设计用于测量细胞表面c-Met受体的体外测定法以测定当C8-H241也结合时，本发明的抗体是否能够对细胞表面的人c-Met染色。可以使用荧光激活的细胞分选(FACS)分析以证实c-Met抗体C8-H241和本发明的抗体同时结合细胞表面c-Met。
可以用Alexa Fluor 488单克隆抗体标记试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR，#A-20181)标记C8-H241 c-Met抗体。人胃肿瘤MKN45细胞(Japan Health SciencesFoundation，Health Science Research Resource Bank，#JCRB0254)可以在RPMI-1640(Invitrogen，#11835)，10％(v/v)FBS(Invitrogen，#10082)；2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)；100U/500mL青霉素G，和100微克/500mL链霉素(Invitrogen，#15140)中培养。来自T75瓶的MKN45细胞可以用5mL无酶细胞解离溶液(Chemicon，#S-014-B)解离。在室温孵育5分钟后，可以将细胞收集到离心管中，并在培养基中洗涤一次，然后在结合缓冲液(具有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)叠氮化钠的Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(DPBS))中再洗涤一次。将100微升含有5微克/mL的本发明的抗c-Met抗体或其抗原结合片段的结合缓冲液添加至细胞。可孵育细胞30分钟然后用1mL结合缓冲液洗涤。然后可添加100微升含有5微克/mL的Alexa Fluor 647(Invitrogen，#A21236)标记的抗mIgG的结合缓冲液并在冰上孵育30分钟。然后可对以上染色溶液添加10微升50微克/mL Alexa Fluor 488标记的C8-H241(终浓度5微克/mL)并在冰上孵育30分钟。然后用结合缓冲液洗涤细胞两次并在DPBS中重悬。可以通过对每个样品获取的20000个事件的FACS分析来分析结合细胞表面c-Met的抗体，。
在本质上如此实施例3描述地进行的FACS实验中，98.68％的MKN45细胞被C8-H241(CAS#1365287-97-3)和抗体I两者染色。98.64％的MKN45细胞被C8-H241和抗体II两者染色。这些结果提示当进行使用C8-H241的治疗时，抗体I和抗体II可以用来检测患者样品中的c-Met水平，无需洗出时期。
实施例4：抗体I和II与MetMAb同时结合人c-Met的ECD
为了测定本发明的抗体或其抗原结合片段是否可以与MetMAb同时结合人c-Met的ECD，可以根据本领域已知的方法使用表面等离振子共振生物传感器诸如2000，3000，或T100(GE Health Care，Piscataway，NJ)进行结合实验。除非另有注明，全部试剂和材料可购自可以从CHO细胞表达具有Fc和Flis标签的c-Met-ECD(c-Met-ECD-Fc-Flis)并将其纯化用于此分析。全部测量可在25℃进行。HBS-EP+缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20；#BR-1006-69)可用作运行缓冲液和样品缓冲液。使用胺偶联试剂盒，可以以6500应答单位(Ru)的水平将小鼠IgGl抗多组氨酸抗体(R&D systems，Mab050)固定在CM5传感器芯片的流动室1至4上以捕获人c-Met-ECD-Fc-Flis。人c-Met-ECD-Fc-Flis可以首先注射至流动室2。可以初始以500nM注射本发明的抗体或其抗原结合片段以完全饱和芯片表面上的c-Met-ECD-Fc-Flis。然后可立即注射MetMAb。可以使用结合应答单位计算结合化学计量。为了显示同时结合不依赖于两种抗体的添加顺序，可以在实验过程中颠倒或改变结合顺序若干次。
在基本如此实施例4中描述地进行的实验中，每个c-Met-ECD-Fc-Flis结合1.5的抗体I和1.3的MetMAb，其在HEK 293 EBNA中表达。对于抗体II，每个c-Met-ECD-Fc-Flis结合1.3的抗体II和1.4的MetMAb。添加顺序的全部组合显示抗体I和II可以在MetMAb的存在下结合cMet-ECD-Fc-Flis。这些数据显示抗体I、II，或MetMAb可以同时结合人c-Met-ECD-Fc-Flis。此外，数据提示这些抗c-Met抗体的表位不同。
实施例5：用于血液样品中循环肿瘤细胞的诊断测定法
可以通过使用系统，和CellTracks Analyzer 或分析仪测定本发明的抗体或其抗原结合片段与循环肿瘤细胞(CTC)的结合。可以使用分析仪的开放通道(第4通道)检测CTC中c-Met受体表达。开放通道允许使用激发/发射波长与FITC(荧光素)或PE(藻红蛋白)相似的荧光染料。除非另外指明，全部试剂可购自Veridex LLC(Raritan，NJ)。
R-藻红蛋白(R-PE)荧光染料和硫缀合化学试剂盒(Dojindo，#LK26)可用于与本发明的抗体或其抗原结合片段缀合。在用于对CTC中的c-Met染色之前，R-PE缀合的抗体可以使用用于IgG的蛋白G亲和柱进一步纯化。可以在CTC测定法中评估本发明的R-PE缀合的抗体或其抗原结合片段的最优浓度和PE通道获取时间。
可以将CTC定义为EpCAM(上皮细胞黏附分子)，细胞角蛋白8、18、19阳性的以及具有核(DAPI染色)的以及对CD45(白细胞标志物)阴性的细胞。可以通过添加抗EpCAM抗体-免疫-磁珠从7.5ml患者血液样品富集CTC。在洗涤这些富集的CTC后，可以用针对细胞角蛋白、细胞核和CD45的抗体对这些细胞免疫荧光染色。本发明的R-PE缀合的抗体或其抗原结合片段可以添加至测定法流程中，作为细胞染色步骤的一部分。抗体可以添加至包括在VeridexCellSearchTM CXC试剂盒中的肿瘤表型分型试剂杯中，然后可以使用系统分析患者样品。备选地，使用Veridex Mouse/RatCellCaptureTM CTC试剂盒，使用者可以同时手动添加抗体与DAPI和FITC染色剂。可以用CellTracks Analyzer显现装置中的样品筒(sample cartridge)中含有的CTC，并且可以在计算机上捕获细胞图像，使用随此系统提供的软件。
为了证明CTC测定法针对不同水平的c-Met表达的敏感性，可以选择SKBR3、H441、SKOV3、MNK45，和SNU5细胞系。SKBR3细胞(乳腺癌细胞系)不表达可检测的水平的c-Met受体。H441细胞(肺癌细胞系)表达中等水平的c-Met受体。SKOV3细胞(卵巢癌细胞系)表达低水平的c-Met受体。均为胃癌细胞系的MNK45和SNU5表达高水平的c-Met受体。
在本质上如此实施例5描述地进行的实验中，发现抗c-Met抗体的最优浓度是0.1微克/测试，并且最优PE获取时间是0.005至0.007秒。抗体I和II能够检测表达中等和高水平的c-Met的细胞系中的c-Met表达，同时显示在c-Met阴性的细胞系中没有染色。
与C8-H241和MetMAb同时结合
如果待在用c-Met靶向的疗法治疗的患者中使用CTC测定法，重要的是测定治疗剂是否干扰诊断c-Met抗体。可以通过对掺入测试样品的培养的细胞添加治疗剂，然后使用本发明的R-PE缀合的抗体或其抗原结合片段对c-Met染色，评价抗c-Met治疗抗体MetMAb或C8-H241对诊断测试的性能的干扰，使用基本如此实施例5所述的CTC测定法。可以对在含有10％CellSave防腐剂的Veridex稀释缓冲液中稀释的培养的细胞添加MetMAb或C8-H241抗体(0、10、30和90μg/mL)。可以使用Veridex Mouse/Rat CellCaptureTM CTC试剂盒，遵循试剂盒中提供的说明书或本领域已知的流程，测定测试样品的CTC。简而言之，富集样品的EpCam阳性细胞，然后用FITC-抗细胞角蛋白8、18和19，DAPI，和0.1μgR-PE抗体I或II染色。可以将经染色的细胞置于放在装置内的样品筒中，并且可以在CellTracksAnalyzer上扫描该筒。可以捕获细胞图像，并且在PE通道中评价鉴定为CTC的细胞的c-Met染色。
C8-H241(CAS#1365287-97-3)不干扰抗体I或II(表3和4)。在HEK293EBNA细胞中表达的MetMAb可轻微干扰具有中等c-Met表达的细胞中的抗体I，但不干扰具有高水平的人c-Met的细胞中的抗体I。用PE缀合的抗体I染色的c-Met阳性H441细胞的％稍微降低，与MetMAb的增加剂量相关(表5)。这在高MET表达细胞系，MKN 45中未见到。MetMAb不干扰抗体II(见例如，表6)。视觉上，PE通道中的图像质量在具有或没有MetMAb时保持一致，并且高百分比的H441细胞在最高MetMAb剂量时保持c-Met阳性。
结果支持本发明的抗体或其抗原结合片段在CTC测定法中作为临床研究中的患者选择和作为受MetMAb或C8-H241治疗的患者中的用于治疗应答的诊断抗体的用途。
表3
在用C8-H241孵育细胞后CellTracks AnalyzerPE通道中用R-PE抗体I阳性染色的细胞的百分比
表4
在用C8-H241孵育细胞后CellTracks AnalyzerPE通道中用R-PE抗体II阳性染色的细胞的百分比
表5
在用MetMAb孵育细胞后CellTracks AnalyzerPE通道中用R-PE抗体I阳性染色的细胞的百分比
表6
在用MetMAb孵育细胞后CellTracks AnalyzerPE通道中用R-PE抗体II阳性染色的细胞的百分比
实施例6：人c-Met的免疫组织化学(IHC)测定法
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于检测福尔马林固定石蜡包埋的正常或瘤形成人组织中的人c-Met。
简言之，可以通过在60℃烘烤至少1小时或至多16小时，然后在线性染色器(Autostainer XL ST5010，Leica Microsystems)上的一系列的二甲苯、乙醇和水处理中再水合并且脱石蜡化来制备人组织或癌细胞的载玻片。使用Diva柠檬酸抗原恢复缓冲液(retrieval buffer)(DV2004G1，Biocare Medical)在高压decloaking室中达到125℃30秒，可以恢复细胞或组织中的抗体II的细胞外结构域表位。
在Leica Bond III自动化载玻片染色器上使用Leica Bond Refine Polymer试剂盒(DS9800，Leica Microsystems)，可以检测c-Met信号。简而言之，载玻片可以用过氧化物阻断物(3-4％过氧化氢，DS9800，Leica Microsystems的组分)处理5分钟，PowerVision超级阻断物(PV6122，Leica Microsystems)处理10分钟，抗体II处理15分钟，Post-Primary(兔抗小鼠IgG，DS9800，Leica Microsystems的组分)处理8分钟，聚合物(抗兔聚-HRP-IgG，DS9800，Leica Microsystems的组分)处理8分钟，DAB色原(来自DS9800，LeicaMicrosystems的组分)处理10分钟，和苏木精复染剂(DS9800，Lecia Microsystems的组分)处理5分钟。在IHC方案过程中，可以使用浓度为2微克/mL的抗体II。可以在线性染色器(Autostainer XL ST5010，Leica Microsystems)上从水到乙醇到二甲苯对载玻片脱水，然后按照常规流程盖片。
为了测定本发明的抗体或其抗原结合片段对人c-Met的ECD的选择性是否高于对人RON的ECD的选择性，可以进行预吸附/阻断实验。可以在旋转器上在4℃用200x摩尔过量的c-Met-ECD-Fc-Flis(SEQ ID NO：23)或人RON的ECD(R&D Systems，#1947-MS-050)过夜孵育2微克/mL的本发明的抗体或其抗原结合片段。在过夜孵育后，可以如实施例6以上所述针对人组织或癌细胞系的载玻片测试本发明的抗体或其抗原结合片段。
在基本如此实施例6所述地进行的实验中，人c-Met的ECD阻断了抗体II的免疫反应性，而人RON的ECD没有阻断抗体II的免疫反应性染色。这些发现支持抗体II对人c-Met的选择性高于对人RON的选择性。
为了对人肿瘤细胞系染色，收获6千万个细胞，福尔马林固定，并处理到histogel中。Histogel细胞沉淀可以包埋到石蜡块中，去芯，并设计到细胞微阵列中，所述细胞微阵列可以再被包埋到石蜡块中然后薄片切片机处理到载玻片上。可以如上文实施例6中所述使用IHC测定法方案对这些载玻片免疫组织化学染色和复染。MKN45细胞(人胃癌)和H441细胞(人肺腺癌)可以用作高c-MET表达体；U87MG细胞(人成胶质细胞瘤-星形细胞瘤)、H1299(人非小细胞肺癌)，和Colo205细胞(人结肠腺癌)可用作c-MET的中等表达体；而SKBR3(人乳腺癌)和c-MET转染的NIH 3T3细胞(转染了人c-Met重组蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞)可用作c-MET的低表达体。RON转染的NIH 3T3细胞和Mock NIH 3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)用作非c-MET表达阴性对照。
在基本如此实施例6描述地进行的实验中，抗体II在多种细胞系中表现出不同水平的免疫染色；100％的MKN45和H441细胞具有强细胞质和膜染色，大多数是阴性的细胞核；100％的U87MG、H1299，和Colo205细胞具有中等至强细胞质和膜染色，大多数是阴性的细胞核；以及50％的SKBR3和90％的c-MET转染的NIH 3T3细胞具有低至中等细胞质和膜染色，大多数是阴性的细胞核。mock和RON转染的NIH 3T3细胞的c-Met染色仅显示一些微弱的细胞质红色并被认为是阴性的。
为了对人肿瘤组织和正常人组织染色，可以将来自组织微阵列的切片封固在带电的玻璃载玻片上并如上文实施例6中所述地用IHC方案染色。用抗体II的免疫染色的结果可以由病理学家评分。在基本如此实施例6中所述地实施的实验中，针对非小细胞肺癌(n＝300)、胃癌(n＝61)、胆管癌(n＝58)、卵巢癌(n＝15)、前列腺癌(n＝256)以及肾的肾细胞癌(n＝140)测试抗体II。从一种肿瘤类型到另一种并且也在相同肿瘤组织的不同区内观察到多种免疫组织化学染色图式(弥散的、局灶的和可变的)。总体而言，抗体II混合对肿瘤细胞膜染色和细胞质的可变组分染色。肿瘤细胞核一致染色为阴性，同时摄取苏木精复染。与瘤形成组织相似，正常人组织(结肠、肾、子宫、肝和肺)中的整体c-MET的模式在用抗体II测试后的免疫反应性是细胞质的和细胞膜的，而细胞核一致为阴性。
实施例7：人c-Met的第二免疫组织化学(IHC)测定法
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于检测组织微阵列(TMA)形式的商业获得的福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)人生物样本材料和FFPE人生物样本材料的完整切片中的人c-Met。
简而言之，可通过在60℃烘烤至少30分钟或至多2小时以完全去除任何残留的水来制备人组织或癌细胞的载玻片。可以使用EnVisionTMFLEX靶恢复溶液，低pH(K8005，Dako)在Dako PT Link单元中达到97℃20分钟，脱石蜡化并且在细胞或组织中恢复抗体II的胞外结构域表位。
可以在Dako Autostainer Link 48自动化载玻片染色仪上使用DakoEnVisionTMFLEX+小鼠(K8002，Dako)可视化系统检测c-Met信号。简而言之，载玻片可以用过氧化物酶阻断剂(K8002的组分，Dako)处理5分钟，抗体II处理15分钟，小鼠(LINKER)试剂(信号放大剂，K8002的组分，Dako)处理15分钟，HRP聚合物试剂(K8002的组分，Dako)处理20分钟，DAB色原/底物工作溶液(来自K8002的组分，Dako)处理10分钟，和苏木精复染剂(K8008，Dako)处理5分钟。在IHC方案过程中，可以使用浓度为2μg/mL的抗体II。遵循常规流程，可以从水、95％乙醇、100％乙醇、二甲苯对载玻片脱水然后盖片。
为了对人肿瘤细胞系染色，收获6千万个细胞，福尔马林固定，并处理到histogel中。Histogel细胞沉淀可以包埋到石蜡块中，去芯，并设计为细胞微阵列，所述细胞微阵列可以被再包埋到石蜡块中然后薄片切片机处理到载玻片上。可以如上文实施例7中所述使用IHC测定法方案对这些载玻片免疫组织化学染色并复染。RON转染的NIH 3T3细胞和mockNIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)用作非c-MET表达阴性对照。
在基本如此实施例7中描述地进行的实验中，抗体II表现出的选择性高于对RON。在通过显微镜的定性分析中，mock和RON转染的NIH 3T3细胞均表现出缺乏抗体II对RON的染色并且被认为是阴性的，而通过数字图像分析的定量分析，抗体II针对RON是选择性的，如比较mock和RON转染的NIH 3T3细胞的像素计数所示(表7和表8)。
表7：使用明视野显微镜的人工解释
表8：使用Aperio阳性像素计数算法的数字图像分析
在基本如此实施例7中描述地进行的实验中，抗体II对肿瘤细胞膜染色，混合细胞质染色可变组分。肿瘤细胞核一致染色为阴性，同时摄取苏木精复染剂。与瘤形成组织相似，在用抗体II测试后正常人组织中的c-MET免疫反应性的整体图式是细胞质的和细胞膜的，而细胞核一致为阴性。可以用抗体II染色的存档的、非瘤形成人FFPE生物样本包括，但不限于，II型肺细胞(子集)、血管内皮、前列腺和子宫腺的基细胞、生殖中心B细胞(成中心细胞(centrablast))、基底层细胞(cells of the stratum basle)、集合小管细胞(局灶的)、肝细胞，和子宫内膜、胃肠道、呼吸道，和卵巢的局灶腺上皮。未被抗体II染色的存档的、非瘤形成FFPE人生物样本包括，但不限于神经纤维网、休眠T细胞、棘层的最表层、前列腺上皮的腔细胞，和小脑皮层的分子层。

Claims (23)

1.特异性结合人c-Met的胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO:24)的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2，和LCDR3，并且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2，和HCDR3，其中LCDR1是多肽RASENIYSYLA(SEQ ID NO:1)，LCDR2是多肽VYNAKPLAE(SEQ ID NO:2)，LCDR3是多肽CQHHYGTPFT(SEQ IDNO:3)，HCDR1是多肽KASGYSFTSYWMY(SEQ ID NO:4)，HCDR2是多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQID NO:5)或GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQ ID NO:6)，并且HCDR3是多肽TRGYYYDGSFTY(SEQ IDNO:7)。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中HCDR2是多肽GFHPGNSGTNYNQKFKG(SEQ IDNO:5)。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中HCDR2是多肽GFHPRNSGTNYNQKFKG(SEQ IDNO:6)。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO:8，并且HCVR是多肽SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中LCVR是多肽SEQ ID NO:8，并且HCVR是多肽SEQ ID NO:9。
6.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中LCVR是多肽SEQ ID NO:8，并且HCVR是多肽SEQ ID NO:10。
7.权利要求1或4的抗体或其抗原结合片段，包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC是多肽SEQ ID NO:11，并且HC是多肽SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
8.权利要求7的抗体或其抗原结合片段，其中LC是多肽SEQ ID NO:11，并且HC是多肽SEQ ID NO:12。
9.权利要求7的抗体或其抗原结合片段，其中LC是多肽SEQ ID NO:11，并且HC是多肽SEQ ID NO:13。
10.权利要求1或4的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO:11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO:12。
11.权利要求7的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO:11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO:12。
12.权利要求1或4的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO:11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO:13。
13.权利要求7的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO:11，并且每条重链是多肽SEQ ID NO:13。
14.组合物，其包含权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及可接受的载体、稀释剂，或赋形剂。
15.权利要求14的组合物，其还包含一种或多种额外的诊断剂。
16.试剂盒，其包含权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段。
17.权利要求16的试剂盒，其还包含含有与抗体结合的第二抗体的容器。
18.根据权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段在检测由人细胞表达或过表达的人c-Met中的非诊断用途，其中所述检测包括：
(a)在体外将细胞与权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段接触；
(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和
(c)检测并且任选地，对与人c-Met的ECD(SEQ ID NO:24)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量。
19.权利要求18的非诊断用途，其中人细胞是福尔马林固定石蜡包埋的。
20.权利要求18或19的非诊断用途，其中检测是通过直接或间接免疫组织化学进行的。
21.根据权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测由人细胞表达或过表达的人c-Met的试剂盒中的用途，其中所述检测包括：
(a)在体外将细胞与权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段接触；
(b)移除任何未结合的或非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和
(c)检测并且任选地，对与人c-Met的ECD(SEQ ID NO:24)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量进行定量。
22.权利要求21的用途，其中人细胞是福尔马林固定石蜡包埋的。
23.权利要求22的用途，其中检测是通过直接或间接免疫组织化学进行的。
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