JPWO2019065747A1 - 抗ckap4モノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
項1. 下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する、抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。
項2. アイソタイプがIgGである、項1に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
項3. 完全ヒト抗体又はヒト化抗体である、項1又は2に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
項4. 項1〜3のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とする、抗腫瘍剤。
項5. 肺がん、膵がん、又は食道がんの治療に使用される、項4に記載の抗腫瘍剤。
項6. 下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の、抗腫瘍剤の製造のための使用:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。
項7. 腫瘍の治療に使用される、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。
項8. 腫瘍を罹患している患者に、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を投与する工程を含む、腫瘍の治療方法:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。
項9. 項1〜3のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いてCKAP4を測定する工程を含む、CKAP4の測定方法。
項10. ELISA法において、項1〜3のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に使用する、項9に記載のCKAP4の測定方法。
本発明は、抗CKAP4モノクローナル抗体及びその抗体断片であって、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識することを特徴とする:(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部、(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部、(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部、(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524の領域の少なくとも一部及び585〜590位の領域の少なくとも一部。(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。以下、本発明の抗体について詳述する。
本発明の抗腫瘍剤は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の抗腫瘍剤について詳述する。
本発明の抗腫瘍剤は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として使用する。
特許文献1に開示されているように、CKAP4は、がん細胞において発現し、がん細胞の増殖を亢進させているので、本発明の抗腫瘍剤では、CKAP4の発現又は機能を抑制することにより、がん細胞の増殖抑制が可能になっている。従って、本発明の抗腫瘍剤は、がんの治療の用途に使用できる。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となるがんとしては、特に制限されないが、具体的には、肺がん、膵がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、胃がん、直腸がん、肝がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頚がん、頭頚部がん、胆管がん、胆嚢がん、口腔がん、舌がん、咽頭がん、喉頭がん、脳腫瘍、神経膠腫(グリオーマ)、膠芽腫、多型性神経膠芽腫、腹膜播種等の固形がん;白血病、悪性リンパ腫等の血液がんが挙げられる。
本発明の抗腫瘍剤の投与形態については、抗腫瘍効果が得られることを限度として、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよい。本発明の抗腫瘍剤の投与形態として、具体的には、経口投与;注射投与(静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への局所注射等)、座薬投与等の非経口投与、好ましくは注射投与が挙げられる。
本発明の抗腫瘍剤は、投与形態に応じた製剤形態に調製される。本発明の抗腫瘍剤の製剤形態としては、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤等の液状製剤;錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤等の固形製剤等が挙げられる。
本発明のCKAP4の測定方法は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて、CKAP4を測定する工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の測定方法について詳述する。
CKAP4を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を腸骨リンパ節法又は脾臓法によって作製した。
得られた抗CKAP4モノクローナル抗体についてエピトープの同定を行った。具体的には、ヒトCKAP4の断片ペプチド(各ペプチドのアミノ酸残基は17個、隣接するペプチドは7個のアミノ酸残基でオーバーラッピングしている)をセルロースメンブレン上に固定したペプチドアレイ(PepSpot)を使用して、エピトープマッピング分析を行った。その結果、図1に示すように、抗体83-2C8は配列番号1の302〜310位の領域、抗体73-1C12は配列番号1の451〜455位の領域、抗体52-2G9は配列番号1の481〜485位の領域、抗体1G4-4A9は配列番号1の502〜510位の領域、をエピトープとして認識することが明らかとなった。一方、抗体3F11-2B10及び5A6-17A11では、エピトープマッピング分析では認識するエピトープを同定できなかった。即ち、抗体3F11-2B10及び5A6-17A11は、立体構造エピトープを認識していることが示唆された。
得られた抗CKAP4モノクローナル抗体について、ヒト、イヌ、及びマウス由来のCKAP4への交差性を検証した。具体的には、ヒト膵がん細胞(S2-CP8細胞)、マウス乳腺上皮細胞(Eph4細胞)、及びイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来(MDCK細胞)の溶解液(Input)を1 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又は抗CKAP4ポリクローナル抗体でイムノブロッティング(IB)を行った。
S2-CP8細胞の表面(Non-permeabilized)を抗体3F11-2B10(赤色)と抗ファロイジン抗体(緑色)で免疫染色し、その核をDRAQ5 DNA Dye(青色)で染色した。結果を図5に示す。この結果から、抗体3F11-2B10を使用することにより、細胞表面に存在するCKAP4を検出できることが確認された。
(検体溶液の調製)
ビオチン標識した抗CKAP4モノクローナル抗体(抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11)を、1%BSAを含むPBSで希釈し、0.125、0.25、0.5、1、2.5、及び5 nMの濃度の検体溶液を作製した。
CKAP4の細胞外ドメイン(ECD)(配列番号1に示すアミノ酸配列の128〜602位)のN末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を連結させたポリペプチド(GST-CKAP4-ECD)(細胞内ドメインが欠失している改変体)を準備した。96ウェルプレート(9018, Corning)の各ウェルに、1 nMのGST-CKAP4-ECD又はGSTを含む溶液100 μLを添加し、室温で終夜インキュベートした。次いで、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄した後に、ブロッキング溶液(1% BSAを含むPBS)を各ウェルに入れて、室温で1時間インキュベートした。その後、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄し、検体溶液50 μLを各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにHRP(horseradish peroxidas)-streptavidin (DY998, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)溶液50μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。次いで、各ウェルに基質溶液(DY999, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を添加して、10分間反応させた。反応停止溶液(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)50 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm及び540 nmの吸光度を測定した。
結果を図6に示す。なお、図6の縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値であり、3回の測定結果の平均値である。この結果、抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、濃度依存的にCKAP4の細胞外ドメイン(ECD)に結合することが確認された。また、抗体1G4-4A9はCKAP4に対する結合能が最も高く、抗体83-2C8はCKAP4に対する結合能が最も低かった。
CKAP4の細胞外ドメイン(ECD)(配列番号1に示すアミノ酸配列の128〜602位)のN末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を連結させたポリペプチド(GST-CKAP4-ECD)(細胞内ドメインが欠失している改変体)を準備した。NP40バッファー500μL中で、2 nMのGST-CKAP4-ECDと0.75〜3.0 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、 コードNo.140-09511)を混合した後に、2 nMのDKK1-FLAG(ヒトDKK1にFLAGタグを付加した融合タンパク質)を添加して4℃で2時間反応させた。次いで、グルタチオンを担持させたアガロースを用いてタンパク質を回収し、抗DKK1抗体を用いてDKK1の検出を行った。その結果を図7のAに示す。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11では、抗体83-2C8よりもCKAP4の細胞外ドメインとDKK1の結合阻害能が高いことが確認された。
DKK1をノックアウトしたS2-CP8細胞(S2-CP8/DKK1 KO細胞)を調製した。S2-CP8/DKK1 KO細胞を3μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体、コントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、 コードNo.140-09511)又はDKK1-FLAG(ヒトDKK1にFLAGタグを付加した融合タンパク質)を添加して1時間培養した。培養後の細胞の細胞膜(PM)のタンパク質をビオチン化し、ニュートラアビジンビーズを用いて沈降させた。得られた沈降物(PM)と細胞溶解液(lysates)に対して、抗CKAP4ポリクローナル抗体を用いてCKAP4の検出を行った。結果を図8のAに示す。この結果から、抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、S2-CP8/DKK1 KO細胞におけるCKAP4のインターナリゼーションを誘導しないことが確認された。
S2-CP8細胞(東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから購入)の溶解液(Input)を1 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG 140-09511)で免疫沈降させた。次いで、免疫沈降物(IP)に対して、抗CKAP4ポリクローナル抗体を用いてCKAP4の検出を行った。その結果を図7のBに示す。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11では、抗体83-2C8よりも、S2-CP8細胞の内因性CKAP4を効率的に免疫沈降できており、特に抗体1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11では、S2-CP8細胞の内因性CKAP4を免疫沈降させる作用が高いことが確認された。
S2-CP8細胞を、50 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体、又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG 140-09511)の存在下で1時間培養した。その後、細胞を回収して細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、抗pAKT(リン酸化AKT)抗体、抗AKT抗体、及び抗クラスリン抗体を用いて、pAKT、AKT及びクラスリンの検出を行った。その結果を図7のCに示す。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、S2-CP8細胞のAKTの活性化を抑制できていることが確認された。また、抗体83-2C8には、AKTの活性化に対する阻害能が認められなかった。
20 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体、又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo.140-09511)の存在下で、S2-CP8細胞(1×104 cells)をマトリゲル上で三次元的に5日間培養し、対物10倍で1視野当たりの細胞凝集塊の総面積を計測した。その結果を図7のDに示す。図7のDにおいて、左図は、5日間培養後のS2-CP8細胞の状態を観察した写真であり、右図は、抗体未添加の条件での1視野当たりの細胞凝集塊の総面積を1として、各条件での1視野当たりの細胞凝集塊の総面積の相対値を算出した結果(5視野、平均値±s.d.;*はP<0.05、**はP<0.01(Student's t test))である。この結果、図7のAにおいてCKAP4の細胞外ドメインとDKK1の結合阻害能が低い抗体83-2C8では細胞凝集塊数の形成を抑制できなかったが、当該結合阻害能の高い抗体では、細胞凝集塊数の形成を有意に抑制できることが確認された。即ち、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、S2-CP8細胞のin vitroにおける細胞増殖能を抑制し得ることが明らかとなった。抗体83-2C8には、S2-CP8細胞のin vitroにおける細胞増殖能に対する阻害能が認められなかった。
抗CKAP4抗体ががん細胞の遊走能に及ぼす影響を確認するために、modified Boyden chamber(tissue culture treated, 6.5 mm in diameter, 10-μm thick, 8-μm pores; Transwell, Costar, Cambridge, MA)を用いたトランスウェルアッセイを行った。具体的には、フィルターの下側表面を10 μg/mLのI型コラーゲンで2時間コートした。その後、0.1%の牛血清アルブミン(BSA)及び20 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)を含む無血清DMEM培地に1×105 cells /mLとなるようにS2-CP8細胞を懸濁し、この細胞懸濁液200μLを上側チャンバーに添加した。また、下側チャンバーには、前記と同組成の無血清培地を添加した。下側チャンバーの上に上側チャンバーをセットし、37℃で3時間インキュベートした。次いで、下側チャンバー側に移動した細胞を、4% (w/v)のパラフォルムアルデヒドを含むPBSで固定し、DNA染色試(DRAQ5 DNA dye)で細胞を染色して細胞数を計測した。その結果を図7のEに示す。図7のEにおいて、左図は、下側チャンバー側に移動した細胞を観察した写真であり、右図は、抗体未添加の条件で下側チャンバー側に移動した細胞数を1として、各条件で下側チャンバー側に移動した細胞数の相対値を算出した結果(n=3、平均値±s.d.;**はP<0.01(Student's t test))である。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11には、S2-CP8細胞の遊走を有意に抑制できることが確認された。抗体83-2C8には、S2-CP8細胞の遊走能に対する阻害能が認められなかった。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞(3×106 cells)を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に7つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(73-1C12(n=6)、52-2G9(n=4)、1G4-4A9(n=9)、3F11-2B10(n=6)、5A6-17A11(n=5)、83-2C8(n=3))又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)(n=8)を1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に投与した。1回当たりの投与量は、抗体52-2G9及び83-2C8の場合は1 mg/body、それ以外の場合は200 μg/bodyに設定した。抗体投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞(3×106 cells)を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に2つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10(n=3))又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)(n=3)を50 μg/bodyで1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。抗体投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞(3×106 cells)を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に4つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)を25、50、又は200 μg/body、或はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)を200 μg/bodyで1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。抗体投与開始から21日後に異種腫瘍組織片の体積及び重量を測定した。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞(3×106 cells)を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に以下の表1に示す6つのグループに分けて、各投与検体を1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。投与検体の投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の腹腔内に、麻酔下でS2-CP8細胞(3×106 cells)を注入した。S2-CP8細胞の注入から2日後に、ヌードマウスを無作為に3つのグループに分け、抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)(n=10)又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)(n=10)を50 μg/bodyで1週間に2回の頻度で腹腔内に投与し、ヌードマウスの生存日数を計測した。なお、腹腔内にS2-CP8細胞を注入した前記免疫不全ヌードマウスは、腹膜播種が生じ、腹膜播種モデルとして利用できることが確認されている。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の背部に、麻酔下でHPAF-II細胞(3×106 cells)を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に2つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10(n=6))又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)(n=7)を200 μg/bodyで1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。抗体投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。
6週齢の免疫不全ヌードマウス(雄、BALB/cAnNCrj-nu)の背部に、麻酔下でヒト肺胞基底上皮腺癌細胞(A549細胞)(5×106 cells)を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に3つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(73-1C12(n=6)、3F11-2B(n=6))又はコントロールIgG(富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511)(n=6)を200 μg/bodyで1週間に2回の頻度で4週間(at days 0, 3, 8, 10,14, 17, 21, 24) 腹腔内に投与した。1回当たりの投与量は、抗体73-1C12及びコントロールIgGの場合は200 μg/body、抗体3F11-2Bの場合は50 μg/bodyに設定した。抗体投与開始から28日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。
(検体溶液の調製)
組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した検体溶液を作製した。
96ウェルプレート(9018, Corning)の各ウェルに、1 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)溶液100 μLを添加し、室温で終夜インキュベートした。次いで、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄した後に、ブロッキング溶液(1% BSAを含むPBS)を各ウェルに入れて、室温で1時間インキュベートした。その後、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄し、検体溶液50 μLを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、2 μg/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(1G4-4A9)溶液50 μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにHRP(horseradish peroxidas)-streptavidin (DY998, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)溶液50μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。次いで、各ウェルに基質溶液(DY999, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を添加して、10分間反応させた。反応停止溶液(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)50 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm及び540 nmの吸光度を測定した。
結果を図17に示す。なお、図17の縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値である。この結果から、抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体として使用したサンドイッチELISAによって、1 ng/mL以上のCKAP4を定量できることが確認された。
表2に示す検体を準備し、前記「19.サンドイッチELISAによるCKAP4の測定(1)」と同様の方法でサンドイッチELISAを行い、CKAP4の測定を行った。なお、表2に示す血清検体は抗凝固剤フリーの真空採血管にて採取して遠心分離することにより調製した。また、表2に示血漿検体はEDTA添加の真空採血管にて採取し、遠心分離することにより調製した。血清検体及び血漿検体は、使用まで-80℃で保存し、解凍後速やかに試験に用いた。検体の希釈はいずれも1%BSAを含むPBSで行った。また、表2に示す検体Cは採血時にがんに対する治療歴のない症例である。
表3に示す検体を準備し、PS CaptureTM Exosome ELISA Kitを使用して、検体に含まれるエクソソーム中のCKAP4の測定を行った。Kit付属のExosome Capture 96 Well Plateの各ウェルを反応/洗浄液で洗浄後、検体溶液100 μLを添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、6.25 ng/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(5A6-17A11)溶液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにPoly-HRP Streptavidin 反応液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルに基質溶液を添加して、30分間反応させた。反応停止溶液100 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm、及び620 nmの吸光度を測定した。抗CKAP4モノクローナル抗体以外はKit付属のものである。
(検体の準備)
ヒト膵管腺癌患者(47症例)から得られた血清、及び当該血清を10倍稀釈した希釈液を検体溶液として準備した。
サンドイッチELISAにより、以下の方法でヒト膵管腺癌患者の血清中CKAP4の測定を行った。96ウェルプレート(9018, Corning)の各ウェルに、2 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)溶液100μLを添加し、室温で終夜インキュベートした。次いで、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄した後に、ブロッキング溶液(1% BSAを含むPBS)を各ウェルに入れて、室温で1時間インキュベートした。その後、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄し、検体溶液(血清及びその10倍希釈液)50 μLを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、1 μg/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(1G4-4A9)溶液100 μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにHRP(horseradish peroxidas)-streptavidin (DY998, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)溶液50 μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。次いで、各ウェルに基質溶液(DY999, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を添加して、10分間反応させた。反応停止溶液(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)50 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm及び540 nmの吸光度を測定した。また、組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した溶液を使用して同様に測定を行い、標準曲線を作製した。なお、CKAP4の濃度が1 ng/mL(標準曲線の下限値)未満である場合には、濃度は0 ng/mLとした。
PS CaptureTM Exosome ELISA Kitを使用して、以下の方法で血清に含まれるエクソソーム中のCKAP4の測定を行った。Kit付属のExosome Capture 96 Well Plateの各ウェルを反応/洗浄液で洗浄後、検体溶液(血清)100 μLを添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、100 ng/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(5A6-17A11)溶液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにPoly-HRP Streptavidin 反応液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルに基質溶液を添加して、30分間反応させた。反応停止溶液100 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm、及び620 nmの吸光度を測定した。抗CKAP4モノクローナル抗体以外はKit付属のものである。
組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した溶液を使用して作製した標準曲線を図20のAに示す。なお、図20のAの縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値である。図20のAから分かるように、前記条件のサンドイッチELISAでは、1〜25ng/mL濃度範囲内のCKAP4を定量できることが確認された。
(検体の準備)
健常者(HC)(13症例)、免疫組織化学的にCKAP4陰性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(-))(9症例)、及び免疫組織化学的にCKAP4陽性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(+))(11症例)から得られた血清を検体溶液として準備した。
前記「22.ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4の測定」の「サンドイッチELISAによる血清中CKAP4の測定」に記載の方法に従って、血清のCKAP4濃度の測定を行った。
前記「22.ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4の測定」の「エクソソームELISAによるエクソソーム中CKAP4の測定」に記載の方法に従って、血清エクソソーム中のCKAP4濃度の測定を行った。
血清中CKAP4の測定を行った結果を図20のEに示し、血清エクソソーム中CKAP4の測定を行った結果を図20のFに示す。なお、図20のFの縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値である。CKAP4陽性の膵管腺癌患者由来の血清では、CKAP4陰性の膵管腺癌患者及び健常者由来の血清に比べて、有意に高いCKAP4濃度が認められた。また、CKAP4陽性の膵管腺癌患者由来の血清エクソソームでは、CKAP4陰性の膵管腺癌患者由来のエクソソームに比べて、有意に高いCKAP4濃度が認められ、更に健常者由来のエクソソームに対しても、CKAP4濃度が高くなる傾向を認めた(p=0.064)。
Claims (10)
- 下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する、抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。 - アイソタイプがIgGである、請求項1に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
- 完全ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1又は2に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とする、抗腫瘍剤。
- 肺がん、膵がん、又は食道がんの治療に使用される、請求項4に記載の抗腫瘍剤。
- 下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の、抗腫瘍剤の製造のための使用:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。 - 腫瘍の治療に使用される、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。 - 腫瘍を罹患している患者に、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を投与する工程を含む、腫瘍の治療方法:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列の451〜455位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列の481〜485位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列の502〜510位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号1に示すアミノ酸配列の503〜524位の領域の少なくとも一部、及び585〜590位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号1に示すアミノ酸配列の585〜592位の領域の少なくとも一部。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いてCKAP4を測定する工程を含む、CKAP4の測定方法。
- ELISA法において、請求項1〜3のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に使用する、請求項9に記載のCKAP4の測定方法。
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