CN111133108A - 抗ckap4单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种阻碍DKK1与CKAP4的结合而发挥优异的抗肿瘤效果的抗CKAP4单克隆抗体。将序列号1所示的氨基酸序列(CKAP4的氨基酸序列)的451～455位的区域的至少一部分、481～485位的区域的至少一部分、502～510位的区域的至少一部分、503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或者、585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体有效阻碍DKK1与CKAP4的结合、S2‑CP8细胞的AKT的活化、S2‑CP8细胞的增殖能力或S2‑CP8细胞的转移能力，而发挥优异的抗肿瘤效果。此外，通过开发使用这些抗CKAP4单克隆抗体的ELISA法，例如，可测定胰腺癌患者的血清CKAP4，因此也有助于伴随诊断试剂的开发。

Description

抗CKAP4单克隆抗体
技术领域
本发明涉及阻碍DKK1与CKAP4的结合而发挥优异的抗肿瘤效果的抗CKAP4单克隆抗体。另外，本发明涉及利用该抗CKAP4单克隆抗体的抗肿瘤剂。此外，本发明涉及利用该抗CKAP4单克隆抗体的CKAP4的测定方法。
背景技术
报告了分泌蛋白质Dikkopf 1(DKK 1)已知作为Wnt信号抑制因子，其是在胎儿期使形态形成适当化的细胞增殖因子，在出生后，DKK 1抑制大肠癌细胞的增殖。另一方面，DKK 1在多发性骨髓瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤、前列腺癌、肾癌(ウィムス腫瘍)、乳腺癌、食道癌、肺癌等中过量表达，推测DKK1具有促进癌细胞的增殖的功能，但其机理尚不明确。
在这样的状况下，本发明人等对通过DKK1使细胞的增殖亢进的信号通路进行阐明(非专利文献1和专利文献1)。具体而言，由发明人等进行存在于细胞膜的DKK1结合蛋白质的全面解析，其结果确定细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)作为DKK1的新型受体。此外，本发明人等阐明以下情况等(非专利文献1和专利文献1)：(1)通过DKK1与CKAP4结合，PI3K-AKT通路被活化，促进癌细胞的增殖；(2)DKK1和CKAP4这两个蛋白质在胰腺癌、肺癌和食道癌中以高频率在肿瘤部特异性过量表达，这两个蛋白质高表达的胰腺癌、肺癌和食道癌预后不良；(3)通过DKK1或CKAP4的表达抑制，DKK1和CKAP4这两个蛋白质高表达的胰腺癌细胞株、肺癌细胞株和食道癌细胞株中抑制AKT的活化，抑制小鼠皮下的肿瘤形成。此外，还报道了通过抗CKAP4多克隆抗体，可阻碍DKK1与CKAP4的结合而抑制小鼠皮下的胰腺癌细胞株、肺癌细胞株和食道癌细胞株的肿瘤形成(非专利文献1和专利文献1)。
如此，阐明CKAP4与癌细胞的增殖有关，并且以CKAP4为靶的分子靶向药物作为新的抗肿瘤剂受到关注。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Hirokazu Kimura et al.,J.Clin.Invest.,2016,126(7),p.2689-2705
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/136372号
发明内容
(发明要解决的课题)
可阻碍DKK1与CKAP4的结合的抗CKAP4单克隆抗体作为以CKAP4为靶的分子靶向药物是有用的。另外，作为以CKAP4为靶的分子靶向药物使用的抗CKAP4单克隆抗体中，不仅与CKAP4结合，而且阻碍DKK1与CKAP4的结合，有效抑制癌细胞的增殖是重要的。然而，在现有技术中，为了阻碍DKK1与CKAP4的结合而有效抑制癌细胞的增殖，对于可与CKAP4的哪个区域结合的单克隆抗体是有效的尚不明确。
另外，为了进行以CKAP4为靶的分子靶向药物的开发、研究，癌症的发病机理的阐明、诊断等，还需要确立CKAP4的测定方法。
因此，本发明的目的之一在于提供一种阻碍DKK1与CKAP4的结合而发挥优异的抗肿瘤效果的抗CKAP4单克隆抗体。另外，本发明的另一目的在于提供CKAP4的测定方法。
(用于解决课题的技术方案)
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：将序列号1所示的氨基酸序列(CKAP4的氨基酸序列)的451～455位的区域的至少一部分、481～485位的区域的至少一部分、502～510位的区域的至少一部分、503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体有效阻碍DKK1与CKAP4的结合而发挥优异的抗肿瘤效果。特别是发现：将序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体抑制DKK1-CKAP4信号的作用特别高，显著地发挥优异的抗肿瘤效果。应予说明，将序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分、503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体在以人CKAP4或其片段作为免疫原对通常的小鼠进行免疫的方法中无法制作，其是利用对敲除CKAP4的小鼠以人CKAP4或其片段作为免疫原进行免疫的新方法而首次制作的，是在现有技术中无法容易地制作的新型单克隆抗体。
另外，本发明人等发现通过使用上述抗CKAP4单克隆抗体的免疫测定法，可对人CKAP4进行定量。
本发明是基于这些见解并通过进一步重复研究而完成的。即，本发明提供以下记载的方式的发明。
方案1.一种抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分。
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分。
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分。
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分。
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
方案2.根据方案1记载的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其中，
上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的同型为IgG。
方案3.根据方案1或2记载的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其中，
上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段为完全人抗体或人源化抗体。
方案4.一种抗肿瘤剂，其以方案1～3中任一项记载的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段为有效成分。
方案5.根据方案4记载的抗肿瘤剂，其中，上述抗肿瘤剂用于肺癌、胰腺癌或食道癌的治疗。
方案6.抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段在制造抗肿瘤剂中的用途，上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分。
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分。
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分。
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分。
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
方案7.一种抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其用于肿瘤的治疗，并将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分。
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分。
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分。
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分。
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
方案8.一种肿瘤的治疗方法，其包括以下工序：
对患有肿瘤的患者给药抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的工序，上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分。
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分。
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分。
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分。
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
方案9.一种CKAP4的测定方法，其包括以下工序：
使用方案1～3中任一项记载的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段CKAP4单克隆抗体或其抗体片段测定CKAP4的工序。
方案10.根据方案9记载的CKAP4的测定方法，其中，在ELISA法中，将方案1～3中任一项记载的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段用于捕获抗体和检测抗体中的至少一者。
(发明效果)
本发明的抗CKAP4单克隆抗体可有效地阻碍DKK1与CKAP4的结合而发挥优异的抗肿瘤效果，因此可适当地用作抗肿瘤剂等以CKAP4为靶的分子靶向药物。此外，通过使用本发明的抗CKAP4单克隆抗体，能够定量或定性测定CKAP4。此外，本发明的抗CKAP4单克隆抗体具有优异的免疫沉淀能力，可用于CKAP4的结合蛋白质的全面解析，可成为CKAP4的功能分析、CKAP4的结合蛋白质的探索、功能分析等基础研究中的重要工具。
附图说明
图1是表示对于抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9和1G4-4A9通过表位定位分析来确定表位的结果的图。
图2A是表示使用抗HA抗体、抗体83-2C8、73-1C12和52-2G9对人CKAP4缺失突变体进行免疫印迹(IB)的结果的图。图2B是表示使用抗体52-2G9和1G4-4A9对人CKAP4缺失突变体进行免疫印迹的结果的图。图2C是表示使用抗体52-2G9、3F11-2B10和5A6-17A11对人CKAP4缺失突变体进行免疫印迹的结果的图。图2的D是表示使用的人CKAP4缺失突变体的氨基酸序列的图。
图3是示意性地表示抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11的表位的汇总图像图。
图4是表示使用抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、5A6-17A11和抗CKAP4多克隆抗体对来自人、狗和小鼠的CKAP4进行免疫印迹(IB)的结果的图。
图5是表示使用抗体3F11-2B10检测S2-CP8细胞的表面的CKAP4的结果的图。
图6是表示对于抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、5A6-17A11，测定与CKAP4的细胞外结构域(ECD)的结合能力的结果的图。
图7A是表示使用各抗CKAP4单克隆抗体评价CKAP4与DKK1的结合阻碍能力的结果的图。图7B是表示使用各抗CKAP4单克隆抗体评价免疫沉淀能力的结果的图。图7C是表示对于抗CKAP4单克隆抗体，评价人胰腺癌细胞(S2-CP8细胞)的AKT的活性阻碍能力的结果的图。图7D是表示使用各抗CKAP4单克隆抗体评价在三维培养下的S2-CP8细胞的增殖阻碍能力的结果的图。图7E是表示使用各抗CKAP4单克隆抗体评价S2-CP8细胞的转移阻碍能力的结果的图。
图8A是表示在敲除DKK1的S2-CP8细胞(S2-CP8/DKK1 KO细胞)中添加抗CKAP4单克隆抗体、对照IgG或DKK1-FLAG而培养规定时间后，检测细胞膜(PM)和细胞裂解液(lysates)的CKAP4的结果的图。图8B是表示将S2-CP8/DKK1 KO细胞在包含抗CKAP4单克隆抗体或对照IgG的培养基中培养，进一步添加DKK1-FLAG而培养规定时间后，检测细胞膜(PM)和细胞裂解液(lysates)的CKAP4的结果的图。
图9是表示对皮下注射S2-CP8细胞的裸鼠给药抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、5A6-17A11或对照IgG，进行异种肿瘤组织片的外观观察、以及体积和重量的测定的结果的图。
图10是表示对皮下注射S2-CP8细胞的裸鼠给药抗体83-2C8或对照IgG，进行异种肿瘤组织片的外观观察、以及体积和重量的测定的结果的图。
图11是表示对皮下注射S2-CP8细胞的裸鼠以低于图9的量给药抗体3F11-2B10或对照IgG，进行异种肿瘤组织片的外观观察、以及体积和重量的测定的结果的图。
图12是表示对皮下注射S2-CP8细胞的裸鼠给药抗体3F11-2B10或对照IgG，进行异种肿瘤组织片的体积和重量的测定的结果的图。
图13是表示对皮下注射S2-CP8细胞的裸鼠给药抗体3F11-2B10和/或吉西他滨，或对照IgG，进行异种肿瘤组织片的外观观察、以及体积和重量的测定的结果的图。
图14是表示对腹腔内注射S2-CP8细胞的裸鼠给药抗体3F11-2B10或对照IgG，测量生存天数的结果的图。
图15是表示对皮下注射人胰腺癌细胞(HPAF-II细胞)的裸鼠给药抗体3F11-2B10，进行异种肿瘤组织片的外观观察、以及体积和重量的测定的结果的图。
图16是表示对皮下注射人肺癌细胞(A549细胞)的裸鼠给药抗体3F11-2B、73-1C12或对照IgG，进行异种肿瘤组织片的外观观察、以及体积和重量的测定的结果的图。
图17是表示将抗体3F11-2B10作为捕获抗体，将抗体1G4-4A9作为检测抗体，通过夹心ELISA求出将重组人CKAP4进行梯度稀释而成的溶液的CKAP4浓度的结果的图。
图18是表示将抗体3F11-2B10作为捕获抗体，将抗体1G4-4A9作为检测抗体，通过夹心ELISA求出各种样本溶液的CKAP4浓度的结果的图。各样本的详细内容示于表2。
图19是表示将抗体5A6-17A11作为检测抗体，使用PS CaptureTM Exosome ELISA Kit，通过外泌体ELISA检测各样本中的外泌体中的CKAP4的结果的图。各样本的详细内容示于表3。
图20A是表示将抗体3F11-2B10作为捕获抗体，将抗体1G4-4A9作为检测抗体，在夹心ELISA中使用将重组人CKAP4进行梯度稀释而成的溶液制作的标准曲线的图。图20B是表示将抗体3F11-2B10作为捕获抗体，将抗体1G4-4A9作为检测抗体，通过夹心ELISA，测定人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4浓度的结果的图。图20C是表示将抗体5A6-17A11作为检测抗体，通过外泌体ELISA检测人胰导管腺癌患者的血清所包含的外泌体中的CKAP4的结果的图。左边的泳道是直接使用样本的情况，右边的泳道是将样本稀释10倍的情况。图20D是将每个患者血清中的CKAP4的测定结果和外泌体中的CKAP4的测定结果进行对比的图。图20E是表示通过夹心ELISA，对从健康人(HC)、免疫组织化学确认为CKAP4阴性的胰腺导管腺癌的患者(PDAC IHC(-))、以及免疫组织化学确认为CKAP4阳性的胰腺导管腺癌的患者(PDACIHC(+))得到的血清中的CKAP4进行测定而得到的结果的图。图20F是表示将抗体5A6-17A11作为检测抗体，通过外泌体ELISA，对从健康人(HC)、免疫组织化学确认为CKAP4阴性的胰腺导管腺癌的患者(PDAC IHC(-))、以及免疫组织化学确认为CKAP4阳性的胰腺导管腺癌的患者(PDAC IHC(+))得到的血清所包含的外泌体中的CKAP4进行测定而得到的结果的图。
具体实施方式
1.抗CKAP4单克隆抗体及其抗体片段
本发明是抗CKAP4单克隆抗体及其抗体片段，其特征在于，将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分、(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分、(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分、(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分。(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。以下、对本发明的抗体进行详细说明。
本发明的抗体是与人CKAP4结合的抗体。CKAP4作为膜贯通型蛋白质是公知的，人CKAP4的氨基酸序列如序列号1所示。人CKAP4中，序列号1的1～106位的区域形成细胞内结构域，107～127位的区域形成膜贯通结构域，128～602位的区域形成细胞外结构域(或内质网内结构域)。此外，人CKAP4中，序列号1的1～21位的区域形成内质网锚定结构域，24～101位的区域形成微管结合结构域，318～328位的区域形成酪氨酸硫酸化区域，468～503位的区域形成亮氨酸拉链区域，525～602位的区域形成α-螺旋区域。
本发明的抗体将(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位(LQGRL)的区域的至少一部分、(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位(VLYGD)的区域的至少一部分、(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位(SLQKVQEQV)的区域的至少一部分、(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位(LQKVQEQVHTLLSQDQAQAARL)的区域的至少一部分以及585～590位(RNDLDR)的区域的至少一部分、或(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域(RNDLDRLF)的区域的至少一部分作为表位识别。如此通过选择识别CKAP4的特定部位的抗CKAP4单克隆抗体，可有效阻碍DKK1与CKAP4的结合，能够发挥格外优异的抗肿瘤效果。
在本发明的抗体识别的表位内，(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分、(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分、以及(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分分别被识别为线状表位。在此，“线状表位”是指识别氨基酸的一级序列作为为抗原结合部位的表位。抗CKAP4单克隆抗体识别的线状表位可通过利用CKAP4的片段肽的表位定位解析来确定。
此外，在本发明的抗体识别的表位内，对于(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分，以及(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分，被识别为构象表位。在此，“构象表位”是指不识别氨基酸的一级序列作为抗原结合部位，而是在构成CKAP4原有的立体结构的情况下通过抗体能够识别的表位。
在本发明的抗体中，将(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分作为表位识别是指将由序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分和585～590位的区域的至少一部分这两者形成的立体结构部位作为表位识别。即，对于缺失了序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域或585～590位的区域中的任一者的CKAP4突变体，该抗体的结合能力缺乏或者丧失。对于识别序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分及585～590位的区域的至少一部分作为构象表位，可通过确认以下情形来确定：(1)未与由序列号1所示的氨基酸序列的503～590位内包含的CKAP4的17个氨基酸构成的片段肽结合；(2)相对于与缺失序列号1所示的氨基酸序列的590～602位的区域的CKAP4突变体的结合能力，与缺失585～602的区域的CKAP4突变体的结合能力缺乏；(3)与缺失序列号1所示的氨基酸序列的585～602位的区域的CKAP4突变体的结合能力和与缺失525～602位的区域的CKAP4突变体的结合能力为同等程度；(4)未与缺失503～602位的区域的CKAP4突变体结合；以及(5)与具有原本的立体结构的CKAP4结合。
此外，同样地，在本发明的抗体在将(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的情况下，有可能在一级结构上存在于远离该区域的位置的氨基酸残基也与该区域一起构成表位。对于识别序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分作为构象表位，可通过确认以下情形来确定：(1)不与包含序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的CKAP4的片段肽(例如，由序列号1所示的氨基酸序列的578～594位的区域构成的片段肽)结合；(2)相对于与缺失序列号1所示的氨基酸序列的592～602位的区域的CKAP4突变体的结合能力相比，与缺失590～602位的区域的CKAP4突变体的结合能力缺乏；(3)不与缺失序列号1所示的氨基酸序列的585～602位的区域的CKAP4突变体结合；以及(4)与具有原本的立体结构的CKAP4结合。
在本发明的抗体中，特别是将序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体的抑制DKK1-CKAP4信号的作用格外高，发挥显著优异的抗肿瘤效果，因此可以说在本发明的抗体中特别优选。
此外，CKAP4具有即使种类不同序列保守性也高的特征，例如，来自人和来自小鼠的氨基酸序列的同一性高至约8成。由于这样的序列保守性，即使利用人CKAP4(序列号1)对通常的小鼠进行免疫，也难以得到将序列号1的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体。因此，为了得到该抗CKAP4抗体，使用敲除CKAP4的非人动物(小鼠等)进行免疫是重要的。即，将序列号1的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体是利用通常的抗体制作方法无法得到的特有的抗体，实际上可识别小鼠CKAP4和人CKAP4这两者。
本发明的抗体可以是对小鼠、大鼠等进行免疫而分离得到的小鼠抗体、大鼠抗体等，从减少人体内的抗原性的观点出发，可优选举出完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体，进一步优选为完全人抗体、人源化抗体，特别优选为完全人抗体。
在此，“完全人抗体”是可变区域和稳定区域的全部结构来自人的抗体。此外，“人源化抗体”是将来自小鼠等非人哺乳动物的抗体的互补性决定区域(CDR)序列移植到人抗体的框架序列上而得到的抗体，除CDR序列以外是来自人抗体的抗体。此外，“嵌合抗体”是可变区域序列来自人以外的哺乳动物、稳定区域序列来自人的抗体，例如，可举出可变区域序列来自小鼠抗体、稳定区域序列来自人抗体的小鼠－人嵌合抗体等。已经确立了完全人抗体、人源化抗体及嵌合抗体的制作方法，这些抗体可利用公知方法制作。
对于本发明的抗体的同种型没有特别限制，例如可以为IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(IgA1和IgA2)、IgM、IgD和IgE等中的任一者，优选可举出IgG。
此外，作为本发明的抗体片段，只要至少具有用于识别并结合上述表位的CDR即可，可举出Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、scFv-Fc等。
本发明的抗体及其抗体片段可按照公知的抗体制作方法而得到。具体而言，本发明的抗体可按照单克隆抗体的制作方法而得到，上述单克隆抗体的制作方法包括以下工序：使用CKAP4、CKAP4的细胞外结构域(或内质网内结构域)(序列号1所示的氨基酸序列的128～602位)、或包含上述表位的肽，对小鼠等非人动物进行免疫的工序。应予说明，由于CKAP4的氨基酸序列的小鼠与人的同源性高，因此即使利用通常的小鼠进行免疫，也难以得到以序列号1的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分作为表位的抗CKAP4抗体。因此，为了得到以序列号1的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分、或序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分为表位的抗CKAP4抗体，例如，可以对敲除CKAP4的小鼠免疫CKAP4或CKAP4的细胞外结构域。对于得到的抗体识别的表位，可以利用上述方法确认抗原结合部位。此外，对于完全人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体，也可以利用公知的制作方法得到。
2.抗肿瘤剂
本发明的抗肿瘤剂的特征在于，将上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段作为有效成分。以下，对本发明的抗肿瘤剂进行详细说明。
(有效成分)
本发明的抗肿瘤剂使用上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段作为有效成分。
(用途)
如专利文献1公开所示，CKAP4在癌细胞中表达，使癌细胞的增殖亢进，因此在本发明的抗肿瘤剂中，通过抑制CKAP4的表达或功能，可抑制癌细胞的增殖。因此，本发明的抗肿瘤剂可以用于癌症治疗的用途。作为成为本发明的抗肿瘤剂的适用对象的癌症，没有特别限制，具体而言，可举出肺癌、胰腺癌、食道癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、口腔癌、舌癌、咽癌，喉癌、脑肿瘤、神经胶质瘤(glioma)、胶质母细胞瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、腹膜转移癌(腹膜播種)等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。
另外，如专利文献1公开所示，抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段对于表达CKAP4的癌细胞，特别是表达CKAP4和DKK1这两者的癌细胞，有效地发挥癌细胞的增殖抑制效果，因此可以说在本发明的抗肿瘤剂中，表达CKAP4的癌，尤其是表达CKAP4和DKK1这两者的癌是优选的适用对象。在癌症中，肺癌、胰腺癌和食道癌以高频率高表达CKAP4和DKK1，特别适合作为成为本发明的抗肿瘤剂的适用对象的癌。
关于癌中的CKAP4的表达，可以通过对提取的癌组织进行组织免疫来确认。具体而言，对于提取的癌组织，使用抗CKAP4抗体进行免疫染色，在肿瘤区域中观察到CKAP4的表达的区域存在5％以上的情况下，判断为CKAP4表达。作为成为本发明的抗肿瘤剂的适用对象的癌症的优选例，可举出在肿瘤区域中存在5％以上的CKAP4的表达区域的癌，进一步优选在肿瘤区域中存在20％以上的CKAP4的表达区域的癌，特别优选在肿瘤区域中存在50％以上的CKAP4的表达区域的癌。
另外，关于癌中的CKAP4的表达，也可从提取的癌组织中回收RNA，通过定量PCR进行测定。在该情况下，对有无CKAP4的表达的判定只要将同一病例的非癌组织作为指标进行即可。具体而言，在癌组织的细胞裂解液中的CKAP4量多于同一病例的非癌组织的细胞裂解液中的CKAP4量的情况下，判断为在该癌中高表达CKAP4。
另外，关于癌中的DKK1的表达的确认，也与CKAP4的情况相同，可通过对提取的癌组织进行组织免疫的方法、从所提取的癌组织中回收RNA并通过定量PCR进行测定的方法等来确认。
具体而言，在使用抗DKK1抗体对提取的癌组织进行免疫染色的情况下，在肿瘤区域中存在5％以上的观察到DKK1的表达的区域的情况下，判断为DKK1表达。作为成为本发明的抗肿瘤剂的适用对象的癌的优选例，可举出在肿瘤区域中存在5％以上的DKK1的表达区域的癌，进一步优选在肿瘤区域中存在20％以上的DKK1的表达区域的癌，特别优选在肿瘤区域中存在50％以上的DKK1的表达区域的癌。
另外，在从提取的癌组织中回收RNA并测定DKK1的情况下，在癌组织的细胞裂解液中的DKK1量多于同一病例的非癌组织的细胞裂解液中的DKK1量的情况下，判断为在该癌中表达DKK1。
(给药方式)
关于本发明的抗肿瘤剂的给药方式，只要得到抗肿瘤效果，可以是口服给药或非口服给药中的任一种。作为本发明的抗肿瘤剂的给药方式，具体而言，可举出口服给药；注射给药(静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、对患部的局部注射等)、栓剂给药等非口服给药，优选举出注射给药。
对于本发明的抗肿瘤剂的给药量，可根据给药方式、作为适用对象的癌的种类、患者的症状的程度等适当设定。例如，如果是使用核酸分子作为有效成分的情况，则以核酸分子的一次量计，通常可以给药0.01μg～1000mg/kg体重左右，优选给药0.1～100μg/kg体重左右。另外，例如，以抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的一次量计，通常可以按每1～3周为1次左右的频率给药0.1mg～20mg/kg体重左右。
本发明的抗肿瘤剂可以单独使用，也可以与1种或2种以上的具有抗肿瘤作用的其它药剂和/或放射线疗法并用。作为与本发明的抗肿瘤剂并用的其它药剂的一例，可举出在化学疗法中使用的抗肿瘤剂。作为这样的抗肿瘤剂，具体而言，可举出抗代谢剂、烷化剂、微管作用药、抗癌抗生素、拓扑异构酶抑制剂、铂制剂等。具体而言，可举出吉西他滨、5－氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、去氧氟尿苷、替加氟、6－巯基嘌呤、阿糖胞苷等抗代谢剂；环磷酰胺(クロホスファミド)、异环磷酰胺、噻替哌、卡波醌、盐酸尼莫司汀等烷化剂；多西他赛、紫杉醇、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等微管作用药；盐酸阿霉素、丝裂霉素、盐酸氨柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸阿柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸博来霉素、硫酸培洛霉素等抗癌抗生素；伊立替康、盐酸拓扑替康等拓扑异构酶抑制剂；顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂等铂制剂等。其中，通过抗代谢剂(特别是吉西他滨)与本发明的抗肿瘤剂的并用可以使抗肿瘤效果显著提高，故优选。
(制剂形态)
本发明的抗肿瘤剂可制备成与给药方式相应的制剂形态。作为本发明的抗肿瘤剂的制剂形态，例如可举出液剂、悬浮剂、乳剂、注射剂等液状制剂；片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、栓剂等固体制剂等。
另外，本发明的抗肿瘤剂可根据其制剂形态而添加药物学上可接受的载体或添加剂而制剂化。例如，如果在液状制剂的情况下，则可使用生理盐水、缓冲液等进行制剂化。另外，如果在固体制剂的情况下，则可使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等进行制剂化。
3.CKAP4的测定方法
本发明的CKAP4的测定方法的特征在于，包括使用上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段测定CKAP4的工序。以下，对本发明的测定方法进行详细说明。
在本发明的测定方法中，利用上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段与样本中的CKAP4的抗原抗体反应，对样本中的CKAP4进行免疫测定。
作为样本，只要是要求测定CKAP4的样本，则没有特别限制，例如可举出血液、血清、血浆、尿、脊髓液、腹水、各种组织、各种组织液、精制外泌体等来自生物体的样本、培养液。
本发明的测定方法可以采用夹心ELISA法、外泌体ELISA法、竞争法、凝聚法等任意的免疫测定。另外，本发明的测定方法也可用于生物体组织的免疫染色。
在夹心ELISA法中，使用捕获抗原的抗体和与结合于该捕获抗体的抗原结合的检测抗体。在本发明的测定方法中，在采用夹心法的情况下，在捕获抗体及检测抗体中的至少一者中可以使用上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段。特别是，从更高精度测定CKAP4的观点出发，优选在捕获抗体和检测抗体的至少一者中使用识别序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分作为表位的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段。
另外，在本发明的测定方法中，作为采用夹心ELISA法的情况的优选方式，可举出以下方式：将上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的中的一个用于捕获抗体且将上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的中的另一个(识别的表位与作为捕获抗体使用的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段不同的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段)作为检测抗体使用的方式；进一步优选将识别序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分作为表位的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段用于捕获抗体，且将识别序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分、481～485位的区域的至少一部分、或502～510位的区域的至少一部分作为表位的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段作为检测抗体使用的方式；特别优选将识别序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分作为表位的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段用于捕获抗体，且将识别序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分作为表位的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段作为检测抗体使用的方式。
外泌体ELISA是将存在于外泌体的表面的分子(例如，与磷脂酰丝氨酸等特异性结合的蛋白质)固相化的板上使外泌体反应而固定化之后，使用上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段中的一个作为检测抗体，从而进行外泌体中的CKAP4的测定的分析。作为外泌体ELISA中使用的检测抗体，特别优选举出将序列编号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分作为表位识别的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段。
另外，免疫测定根据标识的种类包括酶免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法、放射性同位素免疫测定法等，在本发明的测定方法中，可以使用它们中的任一种。从测定的简易性、迅速性的观点出发，优选举出酶免疫测定法。
利用捕获抗体反应的免疫测定本身是公知的，本发明的测定方法可通过与免疫测定的测定原理、标识的种类对应的公知的方法进行。
此外，已知通过将从受试者采取的外泌体中的CKAP4的有无作为指标，可诊断受试者是否患癌，因此使用本发明的CKAP4抗体或其片段的外泌体ELISA法出于检查癌的目的可用于从受试者采取的外泌体中的CKAP4的测定。对于成为检查对象的癌的种类，没有特别限制，具体而言，可举出肺癌、胰腺癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、脑肿瘤、神经胶质瘤(glioma)、胶质母细胞瘤、多形性神经胶质母细胞瘤等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。其中，优选举出肺癌、胰腺癌和食道癌。此外，对于用于癌的检查的外泌体的来源，没有特别限制，例如可举出血清、尿等体液。其中，优选举出血清。
此外，已知通过将从受试者采取的血液样本中的CKAP4的有无作为指标，可诊断受试者是否患癌，因此使用本发明的CKAP4抗体或其片段的夹心ELISA法出于检查癌的目的可用于从受试者采取的血液样本中的CKAP4的测定。对于成为检查对象的癌的种类，没有特别限制，具体而言，可举出肺癌、胰腺癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、脑肿瘤、神经胶质瘤(glioma)、胶质母细胞瘤、多形性神经胶质母细胞瘤等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。其中，优选举出肺癌、胰腺癌及食道癌。此外，作为用于癌的检查的血液样本，例如可举出血清、血浆等，优选举出血清。
此外，已知癌组织中的CKAP4的表达量与癌患者术后的预后有关，因此本发明的测定方法出于检查癌患者的术后的预后的目的可用于从癌患者提取的癌组织中的CKAP4的表达量的测定。对于成为预后的检查对象的癌的种类，没有特别限制、具体而言，可举出肺癌、胰腺癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、脑肿瘤、神经胶质瘤(glioma)、胶质母细胞瘤、多形性神经胶质母细胞瘤等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。其中，优选举出肺癌、胰腺癌及食道癌。
此外，本发明还提供上述测定方法中使用的测定试剂盒。本发明的测定试剂盒中包含上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段。
此外，本发明的测定试剂盒中除了上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段以外，还可以根据免疫测定的测定原理、标识的种类而包含其它试剂、器具。例如，在选择酶免疫测定法的情况下，除了上述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段以外，还可以包含测定板、底物溶液、反应终止液、清洗液、标准溶液等。此外，在采用夹心ELISA法的情况下，作为捕获抗体使用的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段也可以以固定于固相的状态提供。
本发明的测定试剂盒可作为癌的检查试剂盒或癌患者术后的预后的检查试剂盒使用。
实施例
以下，基于实验数据对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于它们。
1.抗CKAP4单克隆抗体的制备
通过髂骨淋巴结法或脾脏法制作特异识别CKAP4的小鼠单克隆抗体。
在髂骨淋巴结法中，将包含使谷胱甘肽S-转移酶(GST)与人CKAP4的细胞外结构域(由序列号1所示的氨基酸序列的128～602位的氨基酸残基构成的多肽)融合而成的融合蛋白质0.7mg/mL、以及弗氏完全佐剂的乳剂100μL注射到10周龄的雌小鼠(野生型)的尾根部进行免疫。进而，从第一次的免疫注射开始17天后，以包含上述融合蛋白质0.7mg/mL的乳剂100μL注射到尾根部进行追加免疫。从追加免疫开始4天后，从免疫的小鼠的髂骨淋巴结回收细胞，在50％聚乙二醇中使其与来自小鼠骨髓瘤的骨髓瘤Sp2/0-Ag14细胞融合，得到杂交瘤。
此外，在脾脏法中，将包含使谷胱甘肽S-转移酶(GST)与人CKAP4的细胞外结构域的C末端(由序列号1所示的氨基酸序列的468～602位的氨基酸残基构成的多肽)融合而成的融合蛋白质1mg/mL、以及弗氏完全佐剂的乳剂100μL注射到敲除CKAP4的8周龄的小鼠的腹腔内进行免疫。进而，从第一次免疫注射开始按每14天合计4次将包含上述融合蛋白质1mg/mL的乳剂100μL注射到腹腔内进行追加免疫。从最后的追加免疫开始14天后，从免疫后的小鼠的脾脏回收细胞，在50％聚乙二醇中使其与来自小鼠骨髓瘤的骨髓瘤Sp2/0-Ag14细胞融合，得到杂交瘤。
将得到的杂交瘤播种于96孔板，在HAT选择培养基中培养。接着，通过进行基于ELISA的测定、基于蛋白质印迹法的内源性CKAP4的检测、细胞表面的CKAP4的免疫染色、以及使用杂交瘤培养上清液的DKK1与CKAP4的结合阻碍能力的测定来确定产生抗CKAP4抗体的杂交瘤。
其结果，最终作为产生抗CKAP4单克隆抗体的杂交瘤克隆，通过髂骨淋巴结法得到3株，通过脾脏法得到3株。将由通过髂骨淋巴结法取得的杂交瘤克隆3株得到的抗CKAP4单克隆抗体分别命名为83-2C8、73-1C12和52-2G9。另外，将由通过脾脏法取得的杂交瘤克隆3株得到的抗CKAP4单克隆抗体分别命名为1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11。
关于得到的各抗CKAP4单克隆抗体的同型，使用小鼠分型试剂盒进行确定，其结果，可确认抗体83-2C8、73-1C12、1G4-4A9和3F11-2B10为IgG2b(k)，抗体52-2G9和5A6-17A11为IgG2a(k)。
2.抗CKAP4单克隆抗体的表位的鉴定
对得到的抗CKAP4单克隆抗体进行表位的确定。具体而言，使用将人CKAP4的片段肽(各肽的氨基酸残基为17个，相邻的肽以7个氨基酸残基重叠)固定在纤维素膜上而成的肽阵列(PepSpot)，进行表位定位分析。其结果，如图1所示，可知抗体83-2C8将序列号1的302～310位的区域作为表位识别，抗体73-1C12将序列号1的451～455位的区域作为表位识别，抗体52-2G9将序列号1的481～485位的区域作为表位识别，抗体1G4-4A9将序列号1的502～510位的区域作为表位识别。另一方面，在抗体3F11-2B10和5A6-17A11中，在表位定位分析中无法确定识别的表位。即，提示抗体3F11-2B10及5A6-17A11识别构象表位。
制作瞬时表达以下多肽的来自胎儿的正常肾细胞(X293T细胞)，上述多肽为使图2D所示的野生型人CKAP4(序列号1、WT)和野生型人CKAP4的缺失突变体(Δ2-106、Δ2-106/Δ592-602、Δ2-106/Δ587-602、Δ2-106/582-602、Δ525-602、Δ503-602、Δ468-602、Δ318-602和Δ221-602)与HA标签融合而成的多肽。对该X293T细胞的细胞裂解液使用抗CKAP4单克隆抗体和抗HA抗体进行免疫印迹。将结果示于图2A～C。该结果为(i)抗体83-2C8可检测Δ318-602，无法检测Δ221-602；(ii)抗体73-1C12可检测Δ468-602，无法检测Δ318-602；(iii)抗体52-2G9可检测Δ503-602，无法检测Δ468-602；(iv)抗体1G4-4A9可检测Δ525-602，无法检测Δ503-602等，上述结果表明，这些抗体与各CKAP4缺失突变体的结合特性如由上述确定的表位的结果预想所示。另一方面，由于抗体3F11-2B10在Δ587-602中检测能力降低，在Δ585-602中与Δ587-602相比检测能力进一步降低；在Δ580-602、Δ570-602和Δ525-602中显示与Δ585-602相同程度的检测能力，因此可认为识别包含序列号1的585～590位的区域内作为构象表位。但是，抗体3F11-2B10虽然在Δ525-602中低但可检测，但无法检测Δ503-602。这些结果显示抗体3F11-2B10也识别包含序列号1的503～524位的区域内作为构象表位。因此，可确认抗体3F11-2B10识别包含序列号1的503～524位、以及585～590位的区域内作为构象表位。抗体5A6-17A11在Δ590-602中检测能力降低，在Δ585-602中无法检测，因此可确认识别包含序列号1的585～592位的区域内作为构象表位。
根据以上结果，将示意性地表示各抗CKAP4单克隆抗体的表位的汇总图像图示于图3。在图3所示的CKAP4的序列示意图中，E是内质网锚定结构域，MB是微管结合结构域，M是膜贯通结构域，T是酪氨酸硫酸化区域，LZ是亮氨酸拉链区域，α是α-螺旋区域。
3.抗CKAP4单克隆抗体与来自人以外的CKAP4的交叉性的验证
对于得到的抗CKAP4单克隆抗体，验证与来自人、狗和小鼠的CKAP4的交叉性。具体而言，利用1μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体或抗CKAP4多克隆抗体对来自人胰腺癌细胞(S2-CP8细胞)、小鼠乳腺上皮细胞(Eph4细胞)和狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞)的裂解液(Input)进行免疫印迹(IB)。
将得到的结果示于图4。抗体83-2C8、73-1C12和52-2G9仅与人CKAP4结合，不与狗和小鼠CKAP4结合。抗体1G4-4A9与人CKAP4和狗CKAP4结合，不与小鼠CKAP4结合。抗体3F11-2B10和5A6-17A11与人、狗和小鼠的全部的CKAP4结合。
4.使用抗CKAP4单克隆抗体的细胞表面的CKAP4的检测
利用抗体3F11-2B10(红色)和抗鬼笔环肽抗体(绿色)对S2-CP8细胞的表面(Non-permeabilized)进行免疫染色，利用DRAQ5 DNA染料(青色)对其细胞核进行染色。将结果示于图5。由该结果可确认通过使用抗体3F11-2B10，可检测到存在于细胞表面的CKAP4。
5.抗CKAP4抗体与CKAP4的结合能力的测定
(样本溶液的制备)
利用包含1％BSA的PBS将生物素标识的抗CKAP4单克隆抗体(抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11)稀释，制作0.125、0.25、0.5、1、2.5和5nM的浓度的样本溶液。
(基于ELISA的测定)
准备使谷胱甘肽S-转移酶(GST)与CKAP4的细胞外结构域(ECD)(序列号1所示的氨基酸序列的128～602位)的N末端连结而成的多肽(GST-CKAP4-ECD)(细胞内结构域缺失的突变体)。在96孔板(9018,Corning)的各孔中添加包含1nM的GST-CKAP4-ECD或GST的溶液100μL，在室温孵育一夜。接着，利用包含0.05％Tween 20的PBS进行清洗后，将封闭溶液(包含1％BSA的PBS)加入各孔，在室温孵育1小时。其后，利用包含0.05％Tween 20的PBS进行清洗，将样本溶液50μL添加到各孔，在室温孵育1小时。清洗后，在各孔中添加HRP(辣根过氧化物酶，horseradish peroxidas)-链霉亲和素(DY998,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)溶液50μL，在室温孵育20分钟。接着，在各孔中添加底物溶液(DY999,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)，反应10分钟。在各孔中添加反应终止溶液(Cell SignalingTechnology,Beverly,MA)50μL使反应停止，利用酶标仪测定波长450nm和540nm的吸光度。
(结果)
将结果示于图6。应予说明，图6的纵轴是从波长450nm的吸光度减去540nm的吸光度而得到的值，其是3次测定结果的平均值。该结果可确认抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11与CKAP4的细胞外结构域(ECD)浓度依赖性地结合。另外，抗体1G4-4A9与CKAP4的结合能力最高，抗体83-2C8与CKAP4的结合能力最低。
6.CKAP4与DKK1的结合阻碍能力的评价
准备使谷胱甘肽S-转移酶(GST)与CKAP4的细胞外结构域(ECD)(序列号1所示的氨基酸序列的128～602位)的N末端连结而成的多肽(GST-CKAP4-ECD)(细胞内结构域缺失的突变体)。在NP40缓冲液500μL中，将2nM的GST-CKAP4-ECD和0.75～3.0μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)混合后，添加2nM的DKK1-FLAG(在人DKK1中添加FLAG标签而成的融合蛋白质)，在4℃使其反应2小时。接着，使用担载谷胱甘肽的琼脂糖回收蛋白质，使用抗DKK1抗体进行DKK1的检测。将其结果示于图7A。根据该结果，可确认抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11与抗体83-2C8相比，CKAP4的细胞外结构域与DKK1的结合阻碍能力高。
7.抗CKAP4抗体对CKAP4的内化带来的效果的验证
制备敲除DKK1的S2-CP8细胞(S2-CP8/DKK1 KO细胞)。对S2-CP8/DKK1 KO细胞添加3μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体、对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)或DKK1-FLAG(在人DKK1中添加FLAG标签而成的融合蛋白质)培养1小时。使培养后的细胞的细胞膜(PM)的蛋白质生物素化，使用中性亲和素珠使其沉淀。对得到的沉淀物(PM)和细胞裂解液(lysates)使用抗CKAP4多克隆抗体进行CKAP4的检测。将结果示于图8A。根据该结果，可确认抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11不诱导S2-CP8/DKK1 KO细胞中的CKAP4的内化。
此外，对S2-CP8/DKK1 KO细胞添加3μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体或对照IgG培养1小时后，添加4nM的DKK1-FLAG培养15、30和60分钟。使培养后的细胞的细胞膜(PM)的蛋白质生物素化，使用中性亲和素珠使其沉淀。对得到的沉淀物(IP)和细胞裂解液(lysates)使用抗CKAP4多克隆抗体进行CKAP4的检测。将结果示于图8B。根据该结果，抗体52-2G9、73-1C12、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11阻碍DKK1存在下的CKAP4的内化，但在抗体83-2C8中未观察到阻碍该内化。
8.免疫沉淀能力的评价
利用1μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG 140-09511)使S2-CP8细胞(从东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心购入)的裂解液(Input)免疫沉淀。接着，对免疫沉淀物(IP)使用抗CKAP4多克隆抗体进行CKAP4的检测。将其结果示于图7B。根据该结果，可确认抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11与抗体83-2C8相比可高效免疫沉淀S2-CP8细胞的内源性CKAP4，特别是抗体1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11使S2-CP8细胞的内源性CKAP4免疫沉淀的作用高。
9.AKT的活性抑制能力的评价
将S2-CP8细胞在50μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体、或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG 140-09511)的存在下培养1小时。其后，回收细胞而制作细胞的裂解液，对该裂解液使用抗pAKT(磷酸化AKT)抗体、抗AKT抗体和抗网格蛋白抗体，进行pAKT、AKT和网格蛋白的检测。将其结果示于图7C。根据该结果，可确认抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11可抑制S2-CP8细胞的AKT的活化。此外，未观察到抗体83-2C8对于AKT的活化的阻碍能力。
10.癌细胞的增殖抑制能力的评价
在20μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体、或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制、正常小鼠IgG、编码No.140-09511)的存在下，将S2-CP8细胞(1×10 4细胞)在基质胶上立体培养5天，以物镜10倍测量每一个视野的细胞凝聚块的总面积。将其结果示于图7D。在图7D中，左图为对培养5天后的S2-CP8细胞的状态进行观察的照片，右图为将在未添加抗体的条件下的每一个视野的细胞凝聚块的总面积设为1，算出在各条件下的每一个视野的细胞凝聚块的总面积的相对值的结果(5个视野，平均值±s.d.；*为P<0.05，**为P<0.01(Student's ttest))。该结果确认在图7A中CKAP4的细胞外结构域与DKK1的结合阻碍能力低的抗体83-2C8无法抑制细胞凝聚块数的形成，但在该结合阻碍能力高的抗体中，可显著抑制细胞凝聚块数的形成。即，可知抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11可抑制S2-CP8细胞的体外的细胞增殖能力。未观察到抗体83-2C8对S2-CP8细胞的体外的细胞增殖能力的阻碍能力。
11.癌细胞的转移抑制能力的评价
为了确认抗CKAP4抗体对癌细胞的转移能力造成的影响，进行使用改良的伯夷顿小室(modified Boyden chamber)(组织培养处理,直径：6.5mm,厚度：10-μm,孔：8-μm；Transwell,Costar,Cambridge,MA)的细胞侵袭实验(Transwell assay)。具体而言，利用10μg/mL的I型胶原蛋白将过滤器的下侧表面涂布2小时。其后，在包含0.1％的牛血清白蛋白(BSA)以及20μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)的无血清DMEM培养基中以成为1×105细胞/mL的方式悬浮S2-CP8细胞，将该细胞悬浮液200μL添加到上侧腔室。此外，在下侧腔室中添加与上述相同组成的无血清培养基。在下侧腔室上安装上侧腔室，在37℃孵育3小时。接着，利用包含4％(w/v)的多聚甲醛的PBS固定移动到下侧腔室侧的细胞，利用DNA染色试剂(DRAQ5 DNA染料)对细胞进行染色而计量细胞数。将其结果示于图7E。在图7E中，左图是对移动到下侧腔室侧的细胞进行观察的照片，右图是将在未添加抗体的条件下移动到下侧腔室侧的细胞数设为1，算出在各条件下移动到下侧腔室侧的细胞数的相对值的结果(n＝3，平均值±s.d.；**为P<0.01(Student's t test))。根据该结果，可确认在抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10和5A6-17A11可显著抑制S2-CP8细胞的转移。未观察到抗体83-2C8对S2-CP8细胞的转移能力的阻碍能力。
12.对胰腺癌细胞的体内肿瘤形成的中和活性的评价(1)
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的背部，在麻醉下皮下注射S2-CP8细胞(3×106细胞)。在平均肿瘤尺寸达到100mm3的时刻，随机将裸鼠分成7组。以一周2次的频率在腹腔内给药抗CKAP4单克隆抗体(73-1C12(n＝6)、52-2G9(n＝4)、1G4-4A9(n＝9)、3F11-2B10(n＝6)、5A6-17A11(n＝5)、83-2C8(n＝3))或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)(n＝8)3周(0天,3天,7天,10天,15天,17天)。每一次的给药量在抗体52-2G9和83-2C8的情况下设定为1mg/只，在除此以外的情况下设定为200μg/只。从抗体给药开始21天后，对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。
将结果示于图9和10。在图9中，上图表示观察摘出的异种肿瘤组织片的结果，中图表示异种肿瘤组织片的体积的测定结果，下图表示异种肿瘤组织片的重量的测定结果。在图10中，左图表示观察摘出的异种肿瘤组织片的结果，中图表示异种肿瘤组织片的体积的测定结果，右图表示异种肿瘤组织片的重量的测定结果。在抗体83-2C8中，无法阻碍S2-CP8细胞到导致的肿瘤形成。另一方面，在抗体73-1C12、3F11-2B10、52-2G9、1G4-4A9和5A6-17A11中可阻碍S2-CP8细胞导致的肿瘤形成，特别是在抗体3F11-2B10中其作用高。
13.对胰腺癌细胞的肿瘤形成的中和活性的评价(2)
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的背部，在麻醉下皮下注射S2-CP8细胞(3×106细胞)。在平均肿瘤尺寸达到100mm3的时刻，随机将裸鼠分成2组。以一周2次的频率以50μg/只在腹腔内注射抗CKAP4单克隆抗体(3F11-2B10(n＝3))或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)(n＝3)3周(0天,3天,7天,10天,15天,17天)。从抗体给药开始21天后，对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。
将结果示于图11。在图11中，左图表示观察到摘出的异种肿瘤组织片的结果，中图表示异种肿瘤组织片的体积的测定结果，右图表示异种肿瘤组织片的重量的测定结果。根据该结果，可知抗体3F11-2B10即使在低用量的情况下也可阻碍S2-CP8细胞导致的肿瘤形成。
14.对胰腺癌细胞的肿瘤形成的中和活性的评价(3)
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的背部，在麻醉下皮下注射S2-CP8细胞(3×106细胞)。在平均肿瘤尺寸达到100mm3的时刻，随机将裸鼠分成4组。以一周2次的频率以25、50或200μg/只在腹腔内注入抗CKAP4单克隆抗体(3F11-2B10)或者，以200μg/只在腹腔内注入对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)3周(0天,3天,7天,10天,15天,17天)。从抗体给药开始起21天后，测定异种肿瘤组织片的体积和重量。
将结果示于图12。根据该结果，可确认即使将抗体3F11-2B10的给药量减少至25μg/只或50μg/只，也可阻碍S2-CP8细胞导致的肿瘤形成。
15.对胰腺癌细胞的肿瘤形成的中和活性的评价(4)
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的背部，在麻醉下皮下注射S2-CP8细胞(3×106细胞)。在平均肿瘤尺寸达到100mm3的时刻，随机将裸鼠分成表1所示的6组，以一周2次的频率在腹腔内注入各给药样本3周(0天,3天,7天,10天,15天,17天)。从给药样本的给药开始21天后，对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。
[表1]
Figure BDA0002423313960000281
将结果示于图13。在图13中，上图表示观察所摘出的异种肿瘤组织片的结果，中图表示异种肿瘤组织片的体积的测定结果，下图表示异种肿瘤组织片的重量的测定结果。50μg/只的抗体3F11-2B10和400μg/只的吉西他滨的并用给药为与50μg/只的抗体3F11-2B10的单独给药相同的抗肿瘤效果，但在50μg/只的抗体3F11-2B10和1000μg/只的吉西他滨的并用给药中观察到显著优异的抗肿瘤效果。
16.对胰腺癌细胞的腹膜转移癌模型的预后延长能力的评价
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的腹腔内，在麻醉中注入S2-CP8细胞(3×106细胞)。从S2-CP8细胞的注入开始2天后，随机将裸鼠分成3组，以一周2次的频率以50μg/只在腹腔内给药抗CKAP4单克隆抗体(3F11-2B10)(n＝10)或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)(n＝10)，计量裸鼠的生存天数。应予说明，可确认在腹腔内注入S2-CP8细胞的上述免疫缺陷裸鼠产生腹膜转移癌，可作为腹膜转移癌模型利用。
将结果示于图14。其结果，可知抗体3F11-2B10和52-2G9具有对S2-CP8细胞的腹膜转移癌的预后延长能力。
17.对胰腺癌细胞的肿瘤形成的中和活性的评价(5)
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的背部，在麻醉下皮下注射HPAF-II细胞(3×106细胞)。在平均肿瘤尺寸达到100mm3的时刻，随机将裸鼠分成2组。以一周2次的频率以200μg/只在腹腔内注入抗CKAP4单克隆抗体(3F11-2B10(n＝6))或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)(n＝7)3周(0天,3天,7天,10天,15天,17天)。从抗体给药开始21天后，对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。
将结果示于图15。在图15中，上图表示观察摘出的异种肿瘤组织片的结果，下左图表示异种肿瘤组织片的体积的测定结果，下右图表示异种肿瘤组织片的重量的测定结果。根据该结果，可确认抗体3F11-2B10具有阻碍HPAF-II细胞导致的肿瘤形成的作用。
18.对肺癌细胞的肿瘤形成的中和活性的评价
在6周龄的免疫缺陷裸鼠(雄，BALB/cAnNCrj-nu)的背部，在麻醉下皮下注射人肺泡基底上皮腺癌细胞(A549细胞)(5×106细胞)。在平均肿瘤尺寸达到100mm3的时刻，随机将裸鼠分成3组。以一周2次的频率以200μg/只在腹腔内给药抗CKAP4单克隆抗体(73-1C12(n＝6)、3F11-2B(n＝6))或对照IgG(富士胶片和光纯药株式会社制，正常小鼠IgG，编码No.140-09511)(n＝6)4周(0天,3天,8天,10天,14天,17天,21天,24天)。每一次的给药量在抗体73-1C12和对照IgG的情况下设定为200μg/只，在抗体3F11-2B的情况下设定为50μg/只。从抗体给药开始28天后，对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。
将结果示于图16。在图16中，左图表示观察到摘出的异种肿瘤组织片的结果，中图表示异种肿瘤组织片的体积的测定结果，右图表示异种肿瘤组织片的重量的测定结果。根据该结果，在抗体3F11-2B和73-1C12中可观察到阻碍A549细胞导致的肿瘤形成的作用。特别是在抗体3F11-2B中可观察到显著优异的抗肿瘤效果。
19.基于夹心ELISA的CKAP4的测定(1)
(样本溶液的制备)
制作阶段性地稀释重组人CKAP4而成的样本溶液。
(基于夹心ELISA的测定)
在96孔板(9018,Corning)的各孔中添加1μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体(3F11-2B10)溶液100μL，在室温孵育一夜。接着，利用包含0.05％Tween 20的PBS进行清洗后，将封闭溶液(包含1％BSA的PBS)加入各孔，在室温孵育1小时。其后，利用包含0.05％Tween 20的PBS进行清洗，将样本溶液50μL添加到各孔中，在室温孵育2小时。清洗后，添加2μg/mL的生物素标识抗CKAP4单克隆抗体(1G4-4A9)溶液50μL，在室温孵育1小时。清洗后，在各孔中添加HRP(horseradish peroxidas)-链霉亲和素(DY998,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)溶液50μL，在室温孵育20分钟。接着，在各孔中添加底物溶液(DY999,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)，使其反应10分钟。在各孔中添加反应终止溶液(Cell SignalingTechnology,Beverly,MA)50μL而停止反应，利用酶标仪测定波长450nm和540nm的吸光度。
(结果)
将结果示于图17。应予说明，图17的纵轴是由波长450nm的吸光度减去540nm的吸光度而得到的值。根据该结果，可确认通过使用抗体3F11-2B10作为捕获抗体，使用抗体1G4-4A9作为检测抗体的夹心ELISA，可定量1ng/mL以上的CKAP4。
20.基于夹心ELISA测定CKAP4(2)
准备表2所示的样本，通过与上述“19.基于夹心ELISA的CKAP4的测定(1)”相同的方法进行夹心ELISA，进行CKAP4的测定。应予说明，表2所示的血清样本是通过利用无抗凝固剂的真空采血管采取并离心分离而制备的。另外，表2所示的血浆样本是通过利用添加EDTA的真空采血管采取并离心分离而制备的。血清样本和血浆样本在-80℃保存至使用，在解冻后迅速地用于试验。样本的稀释均利用包含1％BSA的PBS进行。此外，表2所示的样本C是在采血时没有针对癌的治疗历史的病例。
[表2]
Figure BDA0002423313960000311
将结果示于图18。根据该结果，可确认通过使用抗体3F11-2B10作为捕获抗体，使用抗体1G4-4A9作为检测抗体的夹心ELISA，可定量CKAP4。
21.基于外泌体ELISA的血清外泌体中的CKAP4的测定(利用PS CaptureTMExosome ELISA Kit的测定)
准备表3所示的样本，使用PS Capture TM Exosome ELISA Kit进行样本所包含的外泌体中的CKAP4的测定。利用反应/清洗液清洗试剂盒附带的Exosome Capture 96Well Plate的各孔后，添加样本溶液100μL，在室温下孵育孵育2小时。清洗后，添加6.25ng/mL的生物素标识抗CKAP4单克隆抗体(5A6-17A11)溶液100μL，在室温孵育1小时。清洗后，在各孔添加多HRP-链霉亲和素反应液100μL，在室温孵育1小时。清洗后，在各孔中添加底物溶液，使其反应30分钟。在各孔中添加反应终止溶液100μL而停止反应，利用酶标仪测定波长450nm和620nm的吸光度。除抗CKAP4单克隆抗体以外，均为试剂盒附带的物质。
[表3]
Figure BDA0002423313960000321
将结果示于图19。应予说明，图19的纵轴是由波长450nm的吸光度减去620nm的吸光度而得到的值。根据该结果，可确认通过使用抗体5A6-17A11作为检测抗体，可使用PSCapture TM Exosome ELISA Kit检测样品所包含的外泌体中的CKAP4。
22.人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4的测定
(样本的准备)
准备由人胰导管腺癌患者(47个病例)得到的血清、及将该血清稀释10倍而成的稀释液作为样本溶液。
(基于夹心ELISA的血清中CKAP4的测定)
通过夹心ELISA，利用以下方法进行人胰导管腺癌患者的血清中CKAP4的测定。在96孔板(9018,Corning)的各孔中添加2μg/mL的抗CKAP4单克隆抗体(3F11-2B10)溶液100μL，在室温下孵育一夜。接着，利用包含0.05％Tween 20的PBS进行清洗后，将封闭溶液(包含1％BSA的PBS)加入各孔，在室温下孵育1小时。其后，利用包含0.05％Tween 20的PBS进行清洗，在各孔中添加样本溶液(血清及其10倍稀释液)50μL，在室温下孵育2小时。清洗后，添加1μg/mL的生物素标识抗CKAP4单克隆抗体(1G4-4A9)溶液100μL，在室温下孵育1小时。清洗后，在各孔中添加HRP(horseradish peroxidas)-链霉亲和素(DY998,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)溶液50μL，在室温孵育20分钟。接着，在各孔中添加底物溶液(DY999,R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)，使其反应10分钟。在各孔中添加反应终止溶液(CellSignaling Technology,Beverly,MA)50μL而停止反应，利用酶标仪测定波长450nm和540nm的吸光度。此外，使用梯度稀释重组人CKAP4而成的溶液同样进行测定，制作标准曲线。应予说明，在CKAP4的浓度小于1ng/mL(标准曲线的下限值)的情况下，浓度为0ng/mL。
(基于外泌体ELISA的血清外泌体中CKAP4的测定)
使用PS Capture TM Exosome ELISA Kit，利用以下方法进行血清所包含的外泌体中的CKAP4的测定。利用反应/清洗液清洗试剂盒附带的Exosome Capture 96Well Plate的各孔后，添加样本溶液(血清)100μL，在室温下孵育2小时。清洗后，添加100ng/mL的生物素标识抗CKAP4单克隆抗体(5A6-17A11)溶液100μL，在室温下孵育1小时。清洗后，在各孔中添加聚HRP-链霉亲和素反应液100μL，在室温孵育1小时。清洗后，在各孔中添加底物溶液，使其反应30分钟。在各孔中添加反应终止溶液100μL而停止反应，利用酶标仪测定波长450nm和620nm的吸光度。除抗CKAP4单克隆抗体以外，均为试剂盒附带的物质。
(结果)
将使用梯度稀释重组人CKAP4而成的溶液制作的标准曲线示于图20A。应予说明，图20A的纵轴是由波长450nm的吸光度减去540nm的吸光度而得到的值。由图20A可知，可确认在上述条件的夹心ELISA中，可定量1～25ng/mL的浓度范围内的CKAP4。
将利用夹心ELISA测定人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4的结果示于图20B。根据该结果，可确认通过使用抗体3F11-2B10作为捕获抗体，使用抗体1G4-4A9作为检测抗体的夹心ELISA，可测定人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4。
此外，将利用外泌体ELISA测定人胰导管腺癌患者的血清所包含的外泌体中的CKAP4的结果示于图20C。图20C的纵轴是由波长450nm的吸光度减去620nm的吸光度而得到的值。该结果可确认通过使用抗体5A6-17A11作为检测抗体，可检测人胰导管腺癌患者的血清所包含的外泌体中的CKAP4。
另外，图20D示出对每个患者使用夹心ELISA的血清中的CKAP4的测定结果与使用外泌体ELISA的血清外泌体中的CKAP4的测定结果进行对比的图。由该结果可知，人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4的浓度与血清外泌体中的CKAP4的浓度具有相关性。
23.人胰导管腺癌患者和健康人的血清中的CKAP4的测定
(样本的准备)
准备由健康人(HC)(13个病例)、免疫组织化学确认为CKAP4阴性的胰腺导管腺癌的患者(PDAC IHC(-))(9个病例)、以及免疫组织化学确认为CKAP4阳性的胰腺导管腺癌的患者(PDAC IHC(+))(11个病例)得到的血清作为样本溶液。
(血清中CKAP4的测定)
按照上述“22.人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4的测定”的“基于夹心ELISA的血清中的CKAP4的测定”记载的方法进行血清的CKAP4浓度的测定。
(外泌体中CKAP4的测定)
按照上述“22.人胰导管腺癌患者的血清中的CKAP4的测定”的“基于外泌体ELISA的外泌体中CKAP4的测定”记载的方法进行血清外泌体中的CKAP4浓度的测定。
(结果)
将进行血清中CKAP4的测定的结果示于图20E，将进行血清外泌体中CKAP4的测定的结果示于图20F。应予说明，图20F的纵轴是由波长450nm的吸光度减去540nm的吸光度而得到的值。在来自CKAP4阳性的胰腺导管腺癌患者的血清中，与来自CKAP4阴性的胰腺导管腺癌患者和健康人的血清相比，可观察到显著高的CKAP4浓度。此外，在来自CKAP4阳性的胰腺导管腺癌患者的血清外泌体中，与来自CKAP4阴性的胰腺导管腺癌患者的外泌体相比，可观察到显著高的CKAP4浓度，此外，相对于来自健康人的外泌体，也观察到CKAP4浓度变高的趋势(p＝0.064)。
序列表
<110> 大阪大学
<120> CKAP4分子靶向抗肿瘤剂
<130> 18050WO
<150> JP2017-185090
<151> 2017-09-26
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 602
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Pro Ser Ala Lys Gln Arg Gly Ser Lys Gly Gly His Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Glu Lys Gly Ala His Pro Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val
20 25 30
Ala Lys Lys Pro Pro Pro Ala Pro Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Ala
35 40 45
Pro His Pro Gln Gln His Pro Gln Gln His Pro Gln Asn Gln Ala His
50 55 60
Gly Lys Gly Gly His Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Ser Ser
65 70 75 80
Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser
85 90 95
Ser Ala Ser Cys Ser Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Asn Phe Leu Phe
100 105 110
Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala Phe Ser Gly Trp Cys Val His
115 120 125
His Val Leu Glu Glu Val Gln Gln Val Arg Arg Ser His Gln Asp Phe
130 135 140
Ser Arg Gln Arg Glu Glu Leu Gly Gln Gly Leu Gln Gly Val Glu Gln
145 150 155 160
Lys Val Gln Ser Leu Gln Ala Thr Phe Gly Thr Phe Glu Ser Ile Leu
165 170 175
Arg Ser Ser Gln His Lys Gln Asp Leu Thr Glu Lys Ala Val Lys Gln
180 185 190
Gly Glu Ser Glu Val Ser Arg Ile Ser Glu Val Leu Gln Lys Leu Gln
195 200 205
Asn Glu Ile Leu Lys Asp Leu Ser Asp Gly Ile His Val Val Lys Asp
210 215 220
Ala Arg Glu Arg Asp Phe Thr Ser Leu Glu Asn Thr Val Glu Glu Arg
225 230 235 240
Leu Thr Glu Leu Thr Lys Ser Ile Asn Asp Asn Ile Ala Ile Phe Thr
245 250 255
Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Lys Glu Ile Asn Asp Met Lys Ala Lys
260 265 270
Val Ala Ser Leu Glu Glu Ser Glu Gly Asn Lys Gln Asp Leu Lys Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Ala Val Lys Glu Ile Gln Thr Ser Ala Lys Ser Arg Glu
290 295 300
Trp Asp Met Glu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Gln Thr Met Glu Ser Asp
305 310 315 320
Ile Tyr Thr Glu Val Arg Glu Leu Val Ser Leu Lys Gln Glu Gln Gln
325 330 335
Ala Phe Lys Glu Ala Ala Asp Thr Glu Arg Leu Ala Leu Gln Ala Leu
340 345 350
Thr Glu Lys Leu Leu Arg Ser Glu Glu Ser Val Ser Arg Leu Pro Glu
355 360 365
Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Gln Leu Lys Ser Asp Ser
370 375 380
His Gly Pro Lys Glu Asp Gly Gly Phe Arg His Ser Glu Ala Phe Glu
385 390 395 400
Ala Leu Gln Gln Lys Ser Gln Gly Leu Asp Ser Arg Leu Gln His Val
405 410 415
Glu Asp Gly Val Leu Ser Met Gln Val Ala Ser Ala Arg Gln Thr Glu
420 425 430
Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ser Lys Ser Gln Glu His Glu Gln Arg Leu
435 440 445
Ala Ala Leu Gln Gly Arg Leu Glu Gly Leu Gly Ser Ser Glu Ala Asp
450 455 460
Gln Asp Gly Leu Ala Ser Thr Val Arg Ser Leu Gly Glu Thr Gln Leu
465 470 475 480
Val Leu Tyr Gly Asp Val Glu Glu Leu Lys Arg Ser Val Gly Glu Leu
485 490 495
Pro Ser Thr Val Glu Ser Leu Gln Lys Val Gln Glu Gln Val His Thr
500 505 510
Leu Leu Ser Gln Asp Gln Ala Gln Ala Ala Arg Leu Pro Pro Gln Asp
515 520 525
Phe Leu Asp Arg Leu Ser Ser Leu Asp Asn Leu Lys Ala Ser Val Ser
530 535 540
Gln Val Glu Ala Asp Leu Lys Met Leu Arg Thr Ala Val Asp Ser Leu
545 550 555 560
Val Ala Tyr Ser Val Lys Ile Glu Thr Asn Glu Asn Asn Leu Glu Ser
565 570 575
Ala Lys Gly Leu Leu Asp Asp Leu Arg Asn Asp Leu Asp Arg Leu Phe
580 585 590
Val Lys Val Glu Lys Ile His Glu Lys Val
595 600

Claims (10)

1.一种抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其特征在于，
所述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分；
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分；
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分；
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分；
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
2.根据权利要求1所述的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其中，所述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的同型为IgG。
3.根据权利要求1或2所述的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其中，所述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段为完全人抗体或人源化抗体。
4.一种抗肿瘤剂，其特征在于，以权利要求1～3中任一项所述的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段为有效成分。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤剂，其中，所述抗肿瘤剂用于肺癌、胰腺癌或食道癌的治疗。
6.抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段在制造抗肿瘤剂中的用途，其特征在于，所述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分；
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分；
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分；
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分；
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
7.一种抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段，其特征在于，所述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段用于肿瘤的治疗，并将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分；
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分；
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分；
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分；
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
8.一种肿瘤的治疗方法，其特征在于，包括以下工序：
对患有肿瘤的患者给药抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段的工序，
所述抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段将以下(i)～(v)中任一者所示的部位作为表位识别：
(i)序列号1所示的氨基酸序列的451～455位的区域的至少一部分；
(ii)序列号1所示的氨基酸序列的481～485位的区域的至少一部分；
(iii)序列号1所示的氨基酸序列的502～510位的区域的至少一部分；
(iv)序列号1所示的氨基酸序列的503～524位的区域的至少一部分以及585～590位的区域的至少一部分；
(v)序列号1所示的氨基酸序列的585～592位的区域的至少一部分。
9.一种CKAP4的测定方法，其特征在于，包括以下工序：
使用权利要求1～3中任一项所述的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段CKAP4单克隆抗体或其抗体片段测定CKAP4的工序。
10.根据权利要求9所述的CKAP4的测定方法，其中，在ELISA法中，将权利要求1～3中任一项所述的抗CKAP4单克隆抗体或其抗体片段用于捕获抗体和检测抗体中的至少一者。
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