JP7363007B2 - 食道癌の検出および治療のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
は、食道癌のイン・ビトロ診断方法、ならびに、食道癌の予防または治療のための方法お
よび組成物に関する。この発明による組成物は、プロガストリン結合分子、特に抗hPG
抗体を含み、一方この発明による方法は、プロガストリン結合分子、特に抗hPG抗体の
使用を含む。
い癌であるといわれており、女性よりも男性への影響が大きく、その割合は国によって大
きく異なる。
またいくつか知られている。扁平上皮癌は食道の上皮細胞から生じ、一方、腺癌は食道の
下方部に存在する腺細胞から生じる。
、特に診断の遅れに起因し、特に初期の兆候および症状がないことに起因する。これまで
、食道癌の広範な臨床行為に置き換えられるような分子バイオマーカーはなかった(Kaz
et al, Cancer Letters, 2014)。治療は、癌の進行に左右されるが、小さい局所的な腫
瘍については、外科手術、または、ことによっては放射線療法と組み合わせた化学療法を
通常含む。
るように、素早く、信頼でき、費用対効果の高い食道癌の診断を可能にする方法が未だ要
望されている。
は対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの検出を含む。好ましくは、前記サ
ンプル中におけるプロガストリンの量を決定することで、プロガストリンの定量を可能に
する。本発明はまた、食道癌の予防または治療用組成物であって、プロガストリンに結合
する抗体を含む前記組成物と、プロガストリンに結合する抗体を含む組成物の、単独での
使用または食道癌に対するその他の公知の予防法もしくは治療法と組み合わせての使用を
含む、食道癌の予防または治療の方法とを提供する。
ス:AAB19304.1)は、ガストリン遺伝子の一次翻訳産物である。プロガストリ
ンは、プレプロガストリンからはじめの21のアミノ酸(シグナルペプチド)を切断する
ことによって形成される。プロガストリンの80アミノ酸鎖は、切断および修飾酵素によ
って、いくつかの生物活性ガストリンホルモン形態である、プロガストリンの38~71
のアミノ酸を含むガストリン34(G34)およびグリシン伸長ガストリン34(G34
-Gly)、プロガストリンの55~71のアミノ酸を含むガストリン17(G17)お
よびグリシン伸長ガストリン17(G17-Gly)となるように、さらにプロセシング
される。
らの用途は、以下の文献に記載されている:結腸直腸癌に関して国際公開第2011/0
83088号、乳癌に関して国際公開第2011/083090号、膵癌に関して国際公
開第2011/083091号、結腸直腸癌および消化器癌に関して国際公開第2011
/116954号、ならびに、肝臓病変に関して国際公開第2012/013609号お
よび国際公開第2011/083089号。
うになるが、それらは説明の目的のためのみに与えられるものであって、この発明の意図
した範囲を限定するものではない。
の方法に関するものであって、前記方法は対象からの生物サンプル中におけるプロガスト
リンを検出する工程を含む。サンプル中におけるプロガストリンの存在が、食道癌の存在
の危険性があることを示唆するものである。
イン・ビトロ評価方法に関するものであって、前記方法は、
a)前記対象からの生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触さ
せる工程と、
b)前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を
検出する工程とを含み、前記結合は食道癌の存在の危険性を示唆するものである。
って検出することができる。該アッセイを実施する任意の好適な手段は、この発明の範囲
に含まれるものであるが、特にFACS、ELISA、RIA、ウエスタンブロットおよ
びIHCを挙げることが可能である。
めのこの発明による方法は、
a)前記生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と
、
b)前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を決定する工程とを含み、前記
生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも10pMであることは食道癌
の存在の危険性の示唆である。
ルの濃度と比較することが可能であり、該対照のサンプルは試験サンプルと同様の手法で
取得されるが、食道癌に罹患していないことがわかっている個人から取得されるものとす
る。試験サンプル中においてプロガストリンの濃度が有意に高いほど、そのサンプルが得
られた対象は食道癌を有する尤度が高いということが結論付けられ得る。
c)参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
d)前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの
濃度と比較する工程と、
e)工程d)での比較から、食道癌の存在の危険性を評価する工程とである、さらなる
工程を含む。
って、前記方法は、
a)前記対象からの生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触さ
せる工程と、
b)前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を
検出する工程とを含み、前記結合は前記対象における食道癌の存在を示唆するものである
。
って、
a)前記生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と
、
b)前記生物サンプル中におけるプロガストリンのレベルまたは濃度を決定する工程と
を含み、前記生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも10pMである
ことは、前記対象における食道癌の存在の示唆である。
ガストリンの濃度が少なくとも10pM、少なくとも20pM、少なくとも30pMであ
ることは、前記対象における食道癌の存在の示唆である。
c)参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
d)前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの
レベルまたは濃度と比較する工程と、
e)工程d)での比較から、食道癌の存在を診断する工程とである、さらなる工程を含
む。
方法であって、前記方法は、
a)前記対象からの生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触さ
せる工程と、
b)前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を
検出する工程とを含み、前記結合は前記対象における転移した食道癌の存在を示唆するも
のである。
移した食道癌のイン・ビトロ診断方法であって、
a)前記生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と
、
b)前記生物サンプルにおけるプロガストリンのレベルまたは濃度を生化学アッセイに
よって決定する工程とを含み、前記生物サンプルにおいてプロガストリンの濃度が少なく
とも10pMより高いことは、前記対象における転移した食道癌の存在の示唆である。
ロガストリンの濃度が少なくとも10pM、少なくとも20pM、少なくとも30pM、
少なくとも40pMまたは少なくとも50pMであることは、前記対象における転移した
食道癌の存在の示唆である。
c)参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
d)前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの
レベルまたは濃度と比較する工程と、
e)工程d)での比較から、転移した食道癌の存在を診断する工程とである、さらなる
工程を含む。
て、生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、その得られた値を参照サン
プル中におけるプロガストリンの濃度と比較することとを含む。
サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触させるものであって、前記プ
ロガストリン結合分子は、抗体またはその抗原結合性断片である。
は値と比較したときに、所与の対象について、食道癌に罹患していることの相対的な蓋然
性を決定するということを示している。この発明による方法は、臨床検査、生検などの他
の方法または指標、および、公知の食道癌のバイオマーカーのレベルの決定と組み合わせ
る、前記危険性の評価の際のツールを表している。
濃度の決定を含む、食道癌のイン・ビトロ診断方法であって、前記対象は、食道癌の少な
くとも1つの臨床症状を示しているものである。食道癌の臨床症状としては、体重減少、
痛みを伴う嚥下または嚥下困難、咳、消化不良および胸やけを含む。
ンの濃度の決定を含む、食道癌のイン・ビトロ診断方法に関するものであって、前記対象
は、癌のおよび/または転移の臨床症状を少なくとも1つ示しているものである。
ツールとみなすことが可能である。
であって、前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、公知の食道癌の
バイオマーカーの決定とを含む。
トプロガストリンを示している。誤解を避けるために、いずれの特定がなければ、「ヒト
プロガストリン」という表現は、配列番号1の配列に示されるヒトPGをいう。ヒトプロ
ガストリンは、上記した生物活性なガストリンホルモンの形態には存在しない、N末端お
よびC末端のドメインを顕著に含む。好ましくは、前記N末端のドメインの配列は、配列
番号2で表される。他の好ましい態様においては、前記C末端のドメインの配列は、配列
番号3で表される。
公知である任意の方法によって行われる。
プロガストリン結合分子と接触させることと、前記プロガストリン結合分子とプロガスト
リンとの結合を測定することとを含む。
リン結合分子を用いることによって、特に、ビオチン標識、または、特異的な抗体での免
疫沈降法、ウエスタンブロット、ELISAもしくはELISPOT、酵素結合免疫吸着
測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫組織化学法(IHC)、
免疫蛍光法(IF)、抗体マイクロアレイもしくは免疫組織化学と組み合わせた組織マイ
クロアレイが後に続く他の同等の技術を用いて染色した細胞膜などの周知の技術を用いる
ことによって、顕著に行われ得る。他の好適な技術としては、単一または多重励起波長を
用い、かつ、電気化学的方法(ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技術)などの適
合する光学的方法、原子間力顕微鏡、ならびに、例えば多極の共鳴分光法である高周波法
、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および、複屈折率または屈折率(例
えば、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティングカプラ導波管
法、または、干渉法)の共焦点検出および非共焦点検出、細胞ELISA、フローサイト
メトリ、ラジオアイソトープの磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SD
S-PAGE);HPLC-質量分析;液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析(
LC-MS/MS)による分析のうちのいずれかを適用する、FRETもしくはBRET
のシングルセルの顕微鏡的方法または組織化学的方法を含む。これら技術の全てはこの分
野で周知であるため、ここでのさらなる詳述は不要である。これら様々な技術を用いて、
プロガストリンのレベルを測定することが可能である。
析に基づく方法、クロマトグラフィーに基づく方法、および、フローサイトメトリに基づ
く方法から選択してよい。このアッセイを実施するための任意の好適な手段がこの発明の
範囲内に含まれるが、FACS、ELISA、RIA、ウエスタンブロット、およびIH
Cなどの方法が、この発明の方法を実施するために特に有用である。
酵素アッセイを用いて、好ましくはRIAおよびELISAから選択される技術に基づい
て、対象からの生物サンプルをプロガストリン結合分子と接触させることを含む。
転写物の核酸またはポリペプチドを含む、生物組織または生体液のサンプルである。こう
したサンプルは、プロガストリンの発現レベルの決定を可能にするはずである。プロガス
トリンは、分泌タンパク質であることが知られている。このため、プロガストリンタンパ
ク質のレベルを決定するのに好ましい生物サンプルには、生体液が含まれる。ここで、「
生体液」は、生物由来の物質を含むあらゆる液体を意味する。本発明で用いるのに好まし
い生体液には、例えば哺乳類である動物、好ましくはヒト対象の、体液が含まれる。この
体液は、任意の体液であってよく、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液(CSF)、
唾液、汗、および、尿を含むが、これに限定されない。好ましくは、前記好ましい液体で
ある生物サンプルは、例えば血液サンプル、血漿サンプル、または、血清サンプルなどの
サンプルを含む。より好ましくは、生物サンプルは血液サンプルである。実際に、こうし
た血液サンプルは、患者より収集した完全に害を受けていない血液によって取得すること
ができるため、対象の腫瘍が成長することとなる危険性に関して非侵襲的な評価が可能に
なる。
ンプルを含む。こうした固形癌サンプルにより、当業者は、この発明のバイオマーカーの
レベルのあらゆるタイプの測定を行うことが可能となる。一部の場合において、この発明
による方法は、患者から固形癌サンプルを得る事前工程をさらに含み得る。「固形癌サン
プル」は、腫瘍の組織サンプルを指すものである。癌患者であっても、腫瘍の部位である
組織は、非腫瘍の健常組織をなお含んでいる。そのため、「癌サンプル」は、患者から得
た腫瘍組織に限定されるべきである。前記「癌サンプル」は、生検標本であるかまたは外
科的な切開療法より得たサンプルであり得る。
または、魚より取得したものである。実際に、本明細書に記載の方法に供され得る「対象
」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、イノシシ・ブタ(swine)、ヒツジおよび
サルを含む哺乳動物、または鳥、爬虫類、または、魚のいずれかであり得る。好ましくは
、対象はヒトであり、ヒト対象は「患者」ともいう。
生物サンプルを取得することを意味する。ほとんどの場合、これは動物から細胞サンプル
を取り出すことによってなされることとなるが、予め単離しておいた(例えば、別の時点
でおよび/または別の目的で、別の人物によって単離された)細胞を用いるか、または、
生体内でこの発明の方法を行うことによって、達成することもまた可能である。治療歴ま
たは転帰歴を有する記録保管された組織は、特に有用となる。
れ得る。特に、空腹時の対象よりサンプルを取得するべきであることは、この分野におい
て周知である。
決定と関係している。プロガストリン濃度は、例えば割合または百分率として、参照サン
プルに対して相対的に表すことができる。この濃度はまた、前記濃度の決定に用いられる
方法に応じて、信号の強度または局在として表現されてもよい。好ましくは、サンプル中
のある化合物の濃度は、前記サンプル中の関連化合物の総濃度を標準化した後で表される
ものであって、例えば、サンプル中のタンパク質の総濃度を標準化した後で、あるタンパ
ク質のレベルまたは濃度が表される。
測定されたプロガストリンのレベルを参照レベルと比較することによって決定される。
ンの、参照サンプル中での発現レベルをいう。ここで、「参照サンプル」は、対象であっ
て、好ましくは疾患に罹患していないことがわかっている2以上の対象よりか、または、
代替として母集団より取得したサンプルを意味する。好適な参照のプロガストリン発現レ
ベルは、いくつかの好適な対象における前記マーカーの発現レベルを測定することによっ
て決定することが可能であり、こうした参照レベルは、特定の対象集団に応じて調整する
ことが可能である。参照の値または参照レベルは、絶対値;相対値;上限もしくは下限を
有する値;ある範囲の値;平均値(average value);中央値、中間値(mean value)ま
たは特定の対照もしくはベースライン値と比較した値、であることが可能である。参照値
は、個々のサンプル値、例えば試験されている対象からのサンプルであるが、時期的には
初期の時点でのサンプルから取得した値に基づくことが可能である。参照値は、例えば暦
年齢が合致する群の対象の集団からのサンプルなどの大量のサンプルに基づくか、または
、試験対象のサンプルを含んだまたは除外したサンプルのプールに基づくことが可能であ
る。
プルから取得した、所定のプロガストリンレベルである。特定の態様においては、工程(
b)での試験サンプルとの比較に用いられる参照レベルは、健常な対象からの生物サンプ
ルからか、または、癌に罹患している対象からの生物サンプルから取得していたものであ
り得、参照の発現プロファイルはまた、健常な対象の生物サンプルのプールからか、また
は、癌を有する対象からのサンプルのプールから取得することも可能であるということが
理解される。
あらゆる病理に関与しない対象より収集する。参照サンプルは、患者より収集した生物サ
ンプルの性質にもとづいて、前記生物サンプルと同じ性質の生物サンプルであることとな
るということを理解されたい。
プロガストリンを認識する抗体が結合したプロガストリンの量を決定することによって、
決定する。
ガストリン-17(G17)、ガストリン-34(G34)、グリシン伸長ガストリン-
17(G17-Gly)またはグリシン伸長ガストリン-34(G34-Gly)を結合
させない、任意の分子を指すものである。本発明のプロガストリン結合分子は、例えば抗
体分子または受容体分子などの、任意のプロガストリン結合分子であり得る。好ましくは
、プロガストリン結合分子は、抗プロガストリン抗体またはその抗原結合性断片である。
濃度の決定を含む、食道癌のイン・ビトロ診断方法であって、前記対象は、食道癌の少な
くとも1つの臨床症状を示しているものである。
ンの濃度の決定を含む、食道癌のイン・ビトロ診断方法に関するものであって、前記対象
は、癌のおよび/または転移の臨床症状を少なくとも1つ示しているものである。
で、比較的安定である抗原と複合体を形成するということを意味するものである。2つの
分子が結合しているか否かを判断する方法は、この分野において周知であり、例としては
、平衡透析、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。特定の態様においては、前記抗体ま
たはその抗原結合性断片は、BSAまたはカゼインなどである非特異的分子に結合する自
身の親和性よりも少なくとも2倍大きい親和性をもつプロガストリンに結合する。さらに
特定の態様においては、前記抗体またはその抗原結合性断片は、プロガストリンにのみ結
合する。
プルを、少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触させるものであって、プロガス
トリンに対する前記分子の親和性が、少なくとも100nM、少なくとも90nM、少な
くとも80nM、少なくとも70nM、少なくとも60nM、少なくとも50nM、少な
くとも40nM、少なくとも30nM、少なくとも20nM、少なくとも10nM、少な
くとも5nM、少なくとも100pM、少なくとも10pM、または、少なくとも1pM
であり、例えば上記したような方法によって決定される。
プル中におけるプロガストリンの濃度の検出を含むものであって、前記生物サンプルを、
抗hPG抗体またはその抗原結合性断片と接触させる。
とを意味している。抗体(または「免疫グロブリン」)は、ジスルフィド結合によって互
いに連結した少なくとも2つの重(H)鎖と2つの軽(L)鎖とを含む糖タンパク質から
なる。各重鎖は、重鎖可変領域(またはドメイン)(本明細書では、HCVRまたはVH
と省略する)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH
2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、LCVRまたはVLと
省略する)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLを含む。V
HおよびVLの領域は、主に抗原のエピトープを結合することについて一義的な責任を有
する、超可変性の「相補性決定領域」(CDR)または「高頻度可変領域」と称される領
域と、より保たれる領域を点在させた、フレームワーク領域(FR)と称される領域とに
、さらに細分することが可能である。抗体の軽鎖および重鎖内のCDRを同定し、かつ、
それらの配列を決定する方法は、当業者にとって周知である。誤解を避けるために、本文
中に反対の示唆が何もなければ、CDRという表現は、IMGTで定義されているような
抗体の重鎖および軽鎖の超可変性領域を意味するものであって、IMGT固有ナンバリン
グにより、フレームワーク領域と、相補性決定領域であるCDR1-IMGT:27~3
8、CDR2とについての、標準化された境界決定が提供されている。
ン同士を比較するように定義された(Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)
/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommie, C.
, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and
Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))。IMGT固有ナンバリングにおい
ては、保存アミノ酸は常に同じ位置を有し、例えばシステインでは23(1st-CYS
)、トリプトファンでは41(CONSERVED-TRP)、疎水性アミノ酸では89
、システインでは104(2nd-CYS)、フェニルアラニンまたはトリプトファンで
は118(J-PHEまたはJ-TRP)である。IMGT固有ナンバリングにより、フ
レームワーク領域(FR1-IMGT:位置1~26、FR2-IMGT:39~55、
FR3-IMGT:66~104およびFR4-IMGT:118~128)と相補性決
定領域:CDR1-IMGT:27~38、CDR2-IMGT:56~65およびCD
R3-IMGT:105~117とについての、標準化された境界決定が提供されている
。空隙は占有されていない位置を表しているため、CDR-IMGT長(例えば[8.8
.13]のように角括弧内にドットで区切って示される)が、重大な情報となる。IMG
T固有ナンバリングは、IMGT Colliers de Perles[Ruiz, M. a
nd Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-
P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]として示される、二次元のグラフィカ
ル図と、IMGT/3Dstructure-DB[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc,
M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210
(2004)]における三次元構造とにおいて用いられる。
端からカルボキシ末端へ、次の順で配置されている:FR1、CDR1、FR2、CDR
2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合
ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織またはファクターとの免疫グロブリン
の結合を媒介し得、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体
系の第一の成分(Clq)を含む。抗体は、様々なアイソタイプのもの(すなわち、Ig
A、IgD、IgE、IgGまたはIgM)とすることが可能である。
は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ化抗体、
IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、
IgG3抗体、IgG4抗体、および、IgM抗体からなる群から選択する。
た抗体である。概して、ポリクローナル抗体は、あるB細胞から、同一でない抗体を産生
するいくつかの他のB細胞の存在下で産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫動
物から直接取得される。
であって、集団は、最小限の割合で観察可能であるいくつかの可能性のある天然の突然変
異を除外した、同一の抗体を含む。モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマなどの
単一の細胞のクローンの増殖より生じ、1つのクラスおよびサブクラスの重鎖と、1つの
型の軽鎖とによって特徴付けられる。
も称される)に、概してそのエピトープに結合する能力を保持し、かつ、前記抗体のアミ
ノ酸配列の、少なくとも5個の隣接アミノ酸残基、少なくとも10個の隣接アミノ酸残基
、少なくとも15個の隣接アミノ酸残基、少なくとも20個の隣接アミノ酸残基、少なく
とも25個の隣接アミノ酸残基、少なくとも40個の隣接アミノ酸残基、少なくとも50
個の隣接アミノ酸残基、少なくとも60個の隣接アミノ酸残基、少なくとも70個の隣接
アミノ酸残基、少なくとも80個の隣接アミノ酸残基、少なくとも90個の隣接アミノ酸
残基、少なくとも100個の隣接アミノ酸残基、少なくとも125個の隣接アミノ酸残基
、少なくとも150個の隣接アミノ酸残基、少なくとも175個の隣接アミノ酸残基、ま
たは、少なくとも200個の隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、任意のペプチド、
ポリペプチド、またはタンパク質を示すことを意味する。
のCDRを含む。さらに好ましい態様においては、前記抗原結合性断片は、それが由来す
る抗体の2、3、4または5個のCDR、より好ましくは6個のCDRを含む。
F(ab’)2、Fab’、scFv-Fcの断片もしくは二重特異性抗体、または、X
TEN(伸長組換えポリペプチド)もしくはPASモチーフなどの不規則ペプチドとの融
合タンパク質、または、ポリ(エチレン)グリコールなどのポリ(アルキレン)グリコー
ルの添加(「ペグ化(PEGylation)」)(ペグ化された断片を、Fv-PEG、scFv
-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEGまたはFab’-PEGと称する)
(“PEG”はポリ(エチレン)グリコール)などの化学的修飾によって、もしくは、こ
の発明による抗体の特有のCDRのうち少なくとも1つを有する前記断片をリポソーム中
に取り込むことによって、その半減期が増加することとなる任意の断片、からなる群から
選択することが可能である。好ましくは、前記「抗原結合性断片」は、その由来である抗
体の可変の重鎖または軽鎖の部分的な配列で構成されることとなるまたは含むこととなる
ものであって、前記部分的な配列は、ターゲットに対して、それが系統を引いている抗体
と同様の結合特異性と十分な親和性、好ましくはそれが系統を引いている抗体の親和性の
少なくとも1/100と同等、より好ましくは少なくとも1/10である親和性とを保持
するのに十分なものである。
サンプルをプロガストリンに結合する抗体と接触させるものであって、前記抗体は、当業
者に公知の免疫法によって取得されたものであり、免疫原として、そのアミノ酸配列がプ
ロガストリンのアミノ酸配列の全体または一部を含んでいるペプチドを用いるものである
。さらに詳細には、前記免疫原は、
・そのアミノ酸配列が、完全長プロガストリンのアミノ酸配列、特に配列番号1に示さ
れる完全長ヒトプロガストリンを含むまたはからなる、ペプチド
・そのアミノ酸配列が、プロガストリンのアミノ酸配列、特に配列番号1に示される完
全長ヒトプロガストリンの一部に対応する、ペプチド
・そのアミノ酸配列が、プロガストリンのN末端部分のアミノ酸配列の一部または全体
に対応するペプチド、特にアミノ酸配列:SWKPRSQQPDAPLG(配列番号2)
を含むまたはからなる、ペプチド
・そのアミノ酸配列が、プロガストリンのC末端部分のアミノ酸配列の一部または全体
に対応するペプチド、特にアミノ酸配列:QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRS
AEDEN(配列番号3)を含むまたはからなる、ペプチド
・そのアミノ酸配列がプロガストリンのC末端部分のアミノ酸配列の一部に対応するペ
プチド、特にプロガストリンの71~80のアミノ酸に対応するアミノ酸配列FGRRS
AEDEN(配列番号40)を含む、ペプチド
から選択されるペプチドを含む。
ル抗体かのいずれかを生成することができるということを認識するだろう。これらの抗体
の型のそれぞれを取得する方法は、この分野において周知である。そのため、当業者は、
任意の所与の抗原に対するポリクローナル抗体および/またはモノクローナル抗体を生成
する方法を容易に選択して実施するであろう。
列“SWKPRSQQPDAPLG”を含む免疫原を用いることによって生成したモノク
ローナル抗体の例としては、以下の表1から表4に記載するように、mAb3、mAb4
、mAb16およびmAb19およびmAb20として示されるモノクローナル抗体が挙
げられるが、これに限定されない。他のモノクローナル抗体が既に説明されているが、こ
れら抗体が実際にプロガストリンに結合するか否かは不明である(国際公開第2006/
032980号)。エピトープマッピングの実験結果は、mAb3、mAb4、mAb1
6およびmAb19およびmAb20が、前記hPGのN末端のアミノ酸配列内のあるエ
ピトープを特異的に結合するということを示している。配列番号2で表すプロガストリン
のN末端内のあるエピトープを特異的に認識するポリクローナル抗体が、この分野におい
て説明されている(例えば、国際公開第2011/083088号を参照のこと)。
LEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN”(プロガストリンのC末端部分)を含
む免疫原を用いることによって生成することが可能であるモノクローナル抗体の例として
は、以下の表5および6に、mAb8およびmAb13として示される抗体が挙げられる
が、これに限定されない。エピトープマッピングの実験結果は、mAb13が、前記hP
GのC末端のアミノ酸配列内のあるエピトープを特異的に結合するということを示してい
る。
た抗hPGモノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体が挙げられる。
G抗体またはその抗原結合性断片と接触させるものであって、前記抗hPG抗体は、N末
端の抗hPG抗体およびC末端の抗hPG抗体から選択される。
PGのN末端部分に位置するアミノ酸を含むエピトープまたはhPGのC末端部分に位置
するアミノ酸を含むエピトープに結合する抗体を示している。好ましくは、「N末端の抗
hPG抗体」という語は、配列番号2で表される配列をもつプロガストリンのドメイン内
に位置するエピトープに結合する抗体をいう。他の好ましい態様においては、「C末端の
抗hPG抗体」という語は、配列番号3で表される配列をもつプロガストリンのドメイン
内に位置するエピトープに結合する抗体をいう。
造または機能として規定されてもよい。機能的なエピトープは、概して、構造的なエピト
ープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するそれらアミノ酸を有する。エ
ピトープはまた、立体構造であってもよい。或る態様においては、エピトープは、アミノ
酸、糖の側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの、分子の化学的に活性表面の分類であ
る決定因子を含んでよく、また或る態様においては、特定の三次元構造的な特性および/
または特定の電荷特性を有してよい。抗体が結合するエピトープの決定は、当業者に公知
である、任意のエピトープマッピング技術によって行うことができる。あるエピトープは
、タンパク質のアミノ酸配列内に連続的に配置される、様々なアミノ酸を含み得る。ある
エピトープはまた、タンパク質のアミノ酸配列内に連続的に配置されない、アミノ酸を含
み得る。
・それぞれ配列番号4、5および6のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメ
ント後にそれぞれ配列番号4、5および6の配列と少なくとも80%、好ましくは85%
、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、CDR-H2
およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含
む重鎖と、それぞれ配列番号7、8および9のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号7、8および9と少なくとも80%、好ましくは85%
、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-L1、CDR-L2
およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含
む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号10、11および12のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号10、11および12の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号13、14および15のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号13、14および15と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号16、17および18のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号16、17および18の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号19、20および21のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号19、20および21と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号22、23および24のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号22、23および24の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号25、26および27のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号25、26および27と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号28、29および30のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号28、29および30の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは少なくとも3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号31、32および33のアミノ酸配
列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号31、32および33と
少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列
である、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは
少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体;並びに
・それぞれ配列番号34、35および36のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号34、35および36の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号37、38および39のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号37、38および39と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。
の同一性」は、好適なアラインメント後に取得される、比較対象の2つの配列間で一致し
ているヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味し、この百分率は、純粋に統計的
なものであり、この2つの配列間における差異が、それらの長さに沿ってランダムに分布
している。2つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来、それらを最適に配列した後で
該配列を比較することによって実施されるが、前記比較は、セグメントによってかまたは
「アラインメントウィンドウ」を用いることによって行うことが可能である。比較のため
の配列の最適なアラインメントは、人手による比較に加えて、当業者による公知の方法に
よって実施することが可能である。
よび98%の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、該参照配列や、
或る修飾であって特に少なくとも1つのアミノ酸の削除、付加もしくは置換や、切断、ま
たは、伸長を含むアミノ酸配列が挙げられる。1つまたは複数の連続または非連続のアミ
ノ酸を置換する場合、置換されたアミノ酸が、「同等」のアミノ酸で置き換わるような置
換が好ましい。ここで、「同等のアミノ酸」という表現は、構造上のアミノ酸のうちのひ
とつを置換しようとするものであるが、対応する抗体の生物活性および以下に規定する具
体的な例の生物活性を変えることのないように置換される、任意のアミノ酸を示すことを
意味する。
する種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果のいずれかにおいて決定することが可能で
ある。
抗体を意味し、抗体分子のその他の部分は、1つまたはいくつかのヒト抗体から生じたも
のである。また、骨格セグメントの残基(フレームワークのFRと称される)の一部は、
当業者による公知の技術に従って、修飾されて、結合親和性を維持することが可能である
(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986)。ヒト化の目指すところは、完全な抗原
結合親和性と、抗体の特異性とを維持しながら、ヒトへの導入のために、例えばマウス抗
体などの外因性の抗体の免疫原性を減少させることである。
することが可能である(例えば、Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992の文
献に記載のものなど)。こうしたヒト化抗体は、イン・ビトロ診断または生体内での予防
的および/または治療的な治療に関与する方法におけるそれらの使用に関して好ましいも
のである。他のヒト化技術もまた、当業者にとって公知である。実際に、抗体は、CDR
グラフティング(欧州特許第0451261号;欧州特許第0682040号;欧州特許
第0939127号;欧州特許第0566647号;米国特許第5,530,101号;
米国特許第6,180,370号;米国特許第5,585,089号;米国特許第5,6
93,761号;米国特許第5,639,641号;米国特許第6,054,297号;
米国特許第5,886,152号;および米国特許第5,877,293号)、ベニアリ
ング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)(欧州特許第059210
6号;欧州特許第0519596号;Padlan E. A., 1991 , Molecular Immunology 28(4
/5): 489-498;Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814;R
oguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 91:969-973)およびチェー
ンシャッフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)を含む、様
々な技術を用いてヒト化することが可能である。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を
含む、この分野で公知の様々な方法によって作製することが可能である。米国特許第4,
444,887号、第4,716,111号、第5,545,806号および5,814
,318号、ならびに、国際特許出願公開番号、国際公開第98/46645号、国際公
開第98/50433号、国際公開第98/24893号、国際公開第98/16654
号、国際公開第96/34096号、国際公開第96/33735号および国際公開第9
1/10741号もまた参照されたい。
・それぞれ配列番号4、5および6のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメ
ント後にそれぞれ配列番号4、5および6の配列と少なくとも80%、好ましくは85%
、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、CDR-H2
およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含
む重鎖と、それぞれ配列番号7、8および9のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号7、8および9と少なくとも80%、好ましくは85%
、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-L1、CDR-L2
およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含
む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号10、11および12のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号10、11および12の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号13、14および15のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号13、14および15と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号16、17および18のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号16、17および18の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号19、20および21のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号19、20および21と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号22、23および24のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号22、23および24の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号25、26および27のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号25、26および27と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号28、29および30のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号28、29および30の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号31、32および33のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号31、32および33と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体;並びに
・それぞれ配列番号34、35および36のアミノ酸配列であるか、または、最適なア
ライメント後にそれぞれ配列番号34、35および36の配列と少なくとも80%、好ま
しくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、CDR-H1、
CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好まし
くは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号37、38および39のアミノ酸配列であるか
、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号37、38および39と少なくとも
80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性をもつ配列である、C
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも
2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
からなる群から選択されるヒト化抗体であって、
前記抗体はまた、ヒト抗体から生じた軽鎖および重鎖の定常領域を含む。
であって、hPGのC末端部分内に位置する前記エピトープにまたはhPGのN末端部分
内に位置するエピトープに結合する抗hPG抗体と接触させることを含む。
ピトープであって、hPGの10~14のアミノ酸、hPGの9~14のアミノ酸、hP
Gの4~10のアミノ酸、hPGの2~10のアミノ酸、および、hPGの2~14のア
ミノ酸に対応するアミノ酸配列から選択される、プロガストリンのN末端部分のアミノ酸
配列に対応するアミノ酸配列を含む前記エピトープに結合する抗hPG抗体と接触させる
ことを含み、上記hPGのアミノ酸配列は、配列番号1である。
ピトープであって、hPGの71~74のアミノ酸、hPGの69~73のアミノ酸、h
PGの71~80のアミノ酸(配列番号40)、hPGの76~80のアミノ酸、および
hPGの67~74のアミノ酸に対応するアミノ酸配列から選択される、プロガストリン
のC末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む前記エピトープに結合する抗
hPG抗体と接触させることを含み、上記hPGのアミノ酸配列は、配列番号1である。
応するアミノ酸配列を含むエピトープを認識する抗体を含む。
プであって、プロガストリンのN末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む
前記エピトープを認識する抗体を含み、前記アミノ酸配列は、hPGの10~14の残基
、hPGの9~14の残基、hPGの4~10の残基、hPGの2~10の残基、または
、hPGの2~14の残基を含み得、上記hPGのアミノ酸配列は、配列番号1である。
プであって、プロガストリンのC末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む
前記エピトープを認識する抗体を含み、前記アミノ酸配列は、hPGの71~74の残基
、hPGの69~73の残基、hPGの71~80の残基(配列番号40)、hPGの7
6~80の残基、またはhPGの67~74の残基を含み得、上記hPGのアミノ酸配列
は、配列番号1である。
対象からの生物サンプルを、プロガストリンの第一の部分に結合する第一の分子と、プロ
ガストリンの第二の部分に結合する第二の分子とに接触させる工程を含む。さらに特定の
態様においては、前記プロガストリン結合分子は抗体であり、対象からの生物サンプルを
、プロガストリンの第一のエピトープと結合する抗体と、プロガストリンの第二のエピト
ープと結合する第二の抗体とに接触させる。
中におけるプロガストリンの検出を含む。
ンプル中におけるプロガストリンの濃度の検出を含む。
プル中におけるプロガストリンの濃度の検出を含むものであって、前記生物サンプルは、
血液、血清および血漿から選択する。
ような抗hPG抗体と接触させることを含むものであって、上記サンプル中における前記
抗hPG抗体の結合は、前記対象における食道癌の存在を示唆する。
うな抗hPG抗体と接触させることを含むものであって、前記サンプル中においてプロガ
ストリンの濃度が10pMを超えていることは、前記対象における食道癌の存在の示唆で
ある。
抗体と接触させることを含むものであって、前記サンプル中においてプロガストリンの濃
度が10pM、20pM、30pMまたは40pMを超えていることは、前記対象におけ
る食道癌の存在の示唆である。
hPG抗体と接触させることを含むものであって、前記血漿中においてプロガストリンの
濃度が10pM、20pM、30pM、40pMを超えていることは、前記対象における
転移した食道癌の存在の示唆である。
おける食道癌の治療の有効性を、食道癌の治療前に患者より取得した体液または食道癌の
生検などである第一のサンプル中におけるプロガストリンの濃度を決定することと、その
後第一のサンプル中におけるプロガストリンの濃度を、治療後の同じ患者より取得した第
二のサンプル中におけるプロガストリンの濃度と比較することとによって、モニタリング
する方法に関するものであって、前記第一のサンプルと比較した前記第二のサンプル中に
おけるプロガストリンの濃度の減少が、治療が有効であったことを示唆するものである。
けるプロガストリンの濃度を、サンプル中におけるプロガストリンの濃度についての所定
の値と比較することを含み、さらに特定の態様においては、前記所定の値は、食道癌でな
い集団における値の中間(mean)または平均(average)の決定に基づく、サンプル値の
中間または平均、上記患者が食道癌でないことがわかった場合に取得されるプロガストリ
ンの濃度の値、から選択する。
からのサンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、食道癌の第二の診断の試験と
を含む。さらに特定の態様においては、食道癌のイン・ビトロ診断のこの発明による方法
は、前記患者からのサンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、食道癌の第二の
診断の試験とを含む。
している患者からのサンプル中における経時的なプロガストリンのレベルの決定を含む。
であって、前記組成物は、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を含む。
内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、点滴または急速投与を含む様々な経路で投与する、
水性懸濁液を含むがこれに限定されない様々な剤形として調製することが可能である。い
くつかの態様においては、組成物は、非経口投与用に処方され、またいくつかの具体的な
態様においては、点滴による静脈内注射用とされる。
01mg/kgから約250mg/kgの範囲をとる有効量のこの発明の抗プロガストリ
ン抗体を含むものであって、それは一回投与かまたは複数回にわたる間隔を空けた投与で
与えることができる。
ローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ化抗体、IgA1抗
体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗
体、IgG4抗体、および、IgM抗体から選択される、プロガストリン結合抗体または
その抗原結合性断片を含む。好ましくは、前記抗体は上述した抗体である。より好ましく
は、前記抗体はヒト化抗体である。
例えば上述した方法によって決定されるような、少なくとも5000nM、少なくとも5
00nM、100nM、80nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM
、10nM、7nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1n
M、50pM、10pM、5pM、1pM、または、少なくとも0.1pMである、プロ
ガストリンに対する親和性を有するプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を
含む。
ン結合抗体を含むものであって、前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片
は、中和抗体である。
、結果的に腫瘍細胞中での、特に食道腫瘍細胞中でのPG誘発反応を抑制するものである
、抗体を示す。食道癌細胞のPG誘発反応の抑制は、細胞分化の抑制、細胞死の抑制、お
よび/または、細胞増殖の刺激によって媒介させることができる。
抗体を含むものであって、前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片は、ヒ
ト化抗体である。
を含むものであって、前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片は、細胞毒
性分子が結合されている。
ン結合抗体を含むものであって、前記患者は本発明による方法によって食道癌と診断され
たものであり、プロガストリンの濃度が、参照サンプル中よりも前記患者からの生物サン
プル中でより高いものである。
成物に関するものであって、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片は、
N末端の抗プロガストリン抗体およびC末端の抗プロガストリン抗体から選択される。
療法と組み合わせるかまたは他の治療法を補助することが可能である。他の治療法の非限
定的な例としては、化学療法による治療、放射線治療、外科的切除術および抗体療法が挙
げられる。
化学療法分子、標的療法分子から選択される抗癌治療分子とを含むパーツのキットに関す
る。
の発明による食道癌の治療のための組成物および化学療法分子を含む、パーツのキットに
関する。この目的に有用である化学療法分子としては、葉酸拮抗剤、プリン拮抗剤、ピリ
ミジン拮抗剤、DNAアルキル化分子、DNA架橋剤、抗生物質、白金錯体、プロテアソ
ーム阻害剤、有糸分裂紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およ
びその他のものが挙げられるが、これに限定されない。
、この発明による組成物と他の標的療法分子を含む組成物とを含む、パーツのキットに関
する。こうした標的療法分子には、セツキシマブまたはパニツムマブなどの、EGFRを
標的とする抗体、ベバシズマブなどの、VEGFを標的とする抗体、トラスツズマブまた
はペルツズマブなどの、HER2を標的とする抗体、ペンブロリズマブなどの、PD-1
およびPDL-1を標的とする抗体、イピリムマブなどの、CTLA-4を標的とする抗
体、エルロチニブなどの、EGFRを標的とする小分子薬剤、ベムラフェニブまたはダブ
ラフェニブなどの、BRAFを標的とする小分子薬剤、アフリベルセプトなどの、VEG
Fを標的とする組換え融合タンパク質が含まれるが、これに限定されない。
体またはその抗原結合性断片の使用に関する。
リン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関する。
ロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関するものであって、前記患者
の生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度が決定されて、参照の生物サンプルのプ
ロガストリンの濃度よりも高いものである。
ロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関するものであって、前記患者
に転移が認められる。
、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関するものであって、前記
患者に転移が認められ、前記患者の生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度が決定
されて、参照の生物サンプルのプロガストリンの濃度よりも高いものである。
時に、別々に、または、連続的に投与してよいものであり、投与毎に急速投与から連続灌
流までその持続時間を変更することが可能である。
とをいう。ここで、「別々に投与」は、この発明による組成物の2つの化合物を、別個の
製剤で、同時に投与することをいう。ここで、「連続投与」は、この発明による組成物の
2つの化合物を、それぞれ別個の製剤で、立て続けに投与することをいう。
治療中の患者の生存時間を延ばすのに有効である、ある化合物(または化合物)の最小濃
度または最小量をいう。
[1]対象における食道癌のイン・ビトロ診断方法であって、
a)前記対象からの生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
b)前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を検出する工程とを含み、前記結合は前記対象における食道癌の存在を示唆するものである、方法。
[2]工程b)が、前記プロガストリンの濃度を決定することをさらに含み、前記生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも10pMであることは、前記対象における食道癌の存在の示唆である、上記[1]記載の方法。
[3]c)参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
d)前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの濃度と比較する工程と、
e)工程d)での比較から、食道癌の存在を判断する工程とをさらに含む、上記[2]記載の方法。
[4]前記プロガストリン結合分子が、抗体またはその抗原結合性断片である、上記[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記抗体またはその抗原結合性断片が、N末端の抗プロガストリンモノクローナル抗体およびC末端の抗プロガストリンモノクローナル抗体から選択される、上記[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]プロガストリンに結合する前記抗体はが、
・それぞれ配列番号4、5および6のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号7、8および9のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号10、11および12のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号13、14および15のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号16、17および18のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号19、20および21のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号22、23および24のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号25、26および27のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号28、29および30のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号31、32および33のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体;並びに
・それぞれ配列番号34、35および36のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号37、38および39のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、上記[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]前記生物サンプルが、プロガストリンの第一の部分に結合する第一の分子と、プロガストリンの第二の部分に結合する第二の分子とに接触させられる、上記[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]生物サンプルが、血液、血清および血漿から選択される、上記[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記生物サンプルが血漿であり、プロガストリンの濃度が少なくとも10pMであることが、前記対象における食道癌の存在の示唆である、上記[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]食道癌の予防または治療用組成物であって、前記組成物が、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を含む、組成物。
[11]前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片が、ヒト化抗体、単鎖抗体、ラクダ化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体およびIgM抗体から選択される、上記[10]記載の組成物。
[12]前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片が、N末端の抗プロガストリン抗体およびC末端の抗プロガストリン抗体から選択される、上記[10]または[11]に記載の組成物。
[13]前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片が、中和抗体である、上記[10]~[12]のいずれかに記載の組成物。
[14]前記プロガストリン結合分子が、
・それぞれ配列番号4、5および6のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号7、8および9のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号10、11および12のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号13、14および15のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号16、17および18のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号19、20および21のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号22、23および24のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号25、26および27のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号28、29および30のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号31、32および33のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、抗体;並びに
・それぞれ配列番号34、35および36のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む重鎖と、それぞれ配列番号37、38および39のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは3つを含む軽鎖とを含む、抗体
から選択されるヒト化抗体である、上記[10]~[13]のいずれかに記載の組成物。
[15]食道癌のイン・ビトロ診断のための、上記[10]~[14]のいずれかに記載のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用。
この発明の態様の特徴は、以下の実施例についての続く詳細な説明よりさらに明らかになることとなる。
血漿のプロガストリンのレベルを、2つの特異的な抗プロガストリン抗体を用いてEL
ISAによって定量した。捕捉抗体をプレートのウェル上に被覆させて、一方、顕色抗体
(revelation antibody)を用いてプロガストリンを検出し、シグナルの顕色を媒介させ
るようにする。
に保持される抗原に結合する抗体の発光量に比例する値を割り当てることを可能にする、
ELISA法に基づく。
表7に、試薬および装置を列記する。
)で、または、hPGの71~80のアミノ酸に対応し、かつ、配列FGRRSAEDE
N(配列番号40)を有するC末端プロガストリンで、ウサギを免疫することによって取
得した。
とおりである:G34-Gly、G34、G17-Gly、G17に結合せず、完全長の
プロガストリンに結合する。
によって、50mM、pH9.6の炭酸塩すなわち重炭酸ナトリウムの溶液を調製して被
覆した。プロガストリンのC末端、FGRRSAEDEN(配列番号40)を用いること
によって取得されるポリクローナル抗体に対応する、捕捉抗体の溶液(3μg/ml)を
、炭酸塩バッファー中で調製する。100マイクロリットルの抗体溶液を各ウェルに加え
、4℃で16時間(一晩)インキュベートする。その後プレートを、抗体溶液を除去する
ことによってブロックし、300μlの1×PBS/0.1%Tween-20で3回洗
浄して、その後1ウェル当たり200μlのブロッキングバッファー(1×PBS/0.
1%Tween-20/0.1%BSA)を加えて、22℃で2時間インキュベートする
。その後ブロッキングバッファーを除去して、ウェルを300μlの1×PBS/0.1
%Tween-20で3回洗浄する。
/10に希釈する。希釈液は、純粋な血漿から1×PBS/0.1%Tween20/0
.1%BSA中で調製する。
トリンの希釈は次のとおりに調製される:ストック組換えPG(フランス国パリ、パスツ
ール研究所からの、大腸菌中で産生し、グルタチオンアガロース/タグ除去(Tev)/
IMACカウンター精製/透析でアフィニティ精製された完全長ヒトプロガストリン)を
、0.45mg/ml(45マイクロM)の濃度に三つ組で調製する。プロガストリンの
濃度の範囲は、次のとおりに調製した:
・溶液A:1/10の事前希釈、2μlのストック+18μlのバッファー
・溶液B:1/100の事前希釈、10μlのA+90μlのバッファー
・溶液C:1/1000の事前希釈、10μlのB+90μlのバッファー
・溶液D:500pM、5.55μlのC+494.5μlの希釈液
・溶液E:250pM、250μlのD+250μlの希釈液
・溶液F:100pM、200μlのE+300μlの希釈液
・溶液G:50pM、250μlのF+250μlの希釈液
・溶液H:25pM、200μlのG+200μlの希釈液
・溶液I:10pM、100μlのH+150μlの希釈液
とがある。
および必要であれば確認)するまで保存しておく。この範囲の各点および/または血漿に
ついて100μlを、純粋な、1/2、1/5および1/10に希釈したものをアッセイ
し、プレート上で22℃で2時間インキュベートする。
20で3回洗浄する。ポリクローナルウサギ抗プロガストリン抗体の溶液であって、前記
抗体が、免疫原としてプロガストリンのN末端部を用いて取得され、ビオチンに結合した
、0.5μg/mlとなるものである、ポリクローナルウサギ抗プロガストリン抗体の溶
液を、1×PBS/0.1%Tween-20/0.1%BSAで希釈することによって
調製する。この溶液100μlを、各ウェルに加える。22℃で1時間、インキュベーシ
ョンを行う。ストレプトアビジン-HRPでの顕色は、検出抗体を除去することと、30
0μlの1×PBS/0.1%Tween-20で3回洗浄することと、その後1×PB
S/0.1%Tween-20/0.1%BSA中で希釈した20ng/mlのストレプ
トアビジン-HRPの溶液を調製することとによって行うものであって、100Addの
100μlのこの溶液を、22℃で1時間のインキュベーション前に、各ウェルに加える
。
/0.1%Tween-20での3回の洗浄と、その後1ウェル当たり100μlの化学
発光基質溶液を加えることとからなる。この基質溶液は、使用の30分前に、Super
Signal ELISA Femtoキットの2つの溶液を、20ml+20mlで当
量で混合することによって調製し、暗闇中、室温で保存する。暗闇中、室温でのインキュ
ベーションの5分後に、発光を読み取る。
て発光における変化を示すグラフとして表されることとなる。血漿の希釈液毎に、プロガ
ストリンの濃度を、対応する範囲(1/10番とした範囲は1/10で希釈されたサンプ
ル)の線形回帰直線の式を用いて決定する。
食道癌を有する患者(n=12)のプロガストリンの血漿濃度の中央値は、42.3p
Mであるのに対し、対照の患者(n=103)のプロガストリンの血漿濃度の中央値は0
pMである(図1)。これらのデータは、食道癌を有する患者は、彼らの血漿中のプロガ
ストリンの濃度が健常対照の個人と比べて高いということを示している。
健常対照の個人と比べて高いということを示している。
Nunc MaxiSORP96ウェルプレートのウェルを、次のとおり第一のプロガ
ストリン特異性抗体で被覆する。プロガストリンのカルボキシ末端領域に特異的である抗
プロガストリンモノクローナル抗体を、50mM、pH9.6の炭酸ナトリウム/重炭酸
ナトリウムバッファーのミリQ水溶液で、3μg/mlの濃度に希釈する。
一晩インキュベートした。結合後、抗体溶液をウェルから取り除き、その後ウェルを10
0μl洗浄バッファー(1×PBS/0.1%Tween-20)で3回洗浄する。その
後、合計100μlのブロッキングバッファー(1×PBS/0.1%Tween-20
/0.1%BSA)を各ウェルに加えて、22℃で2時間インキュベートする。その後、
ブロッキングバッファーを取り除き、ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄した。その後、
患者より単離した血漿または血清サンプルを、典型的には1:1、1:2、1:5および
1:10の希釈液となる希釈系列で、100μlの容量でウェルに加え、その後22℃で
2時間インキュベートする。血漿または血清サンプルは、デュプリケートで分析する。
1ng、0.5ng、0.25ng、0.1ng、0.05ng、0.01ngおよび0
ngの組換えプロガストリンの希釈液を用いて作製する。陰性の対照として機能する第二
の標準曲線は、試験サンプルと同じ希釈液で、すなわち1:1、1:2、1:5および1
:10で、ブロッキングバッファーで希釈したプロガストリン陰性のヒト血清より作製す
る。あるいは、血漿サンプルがアッセイされている場合、陰性の対照として機能する第二
の曲線は、試験サンプルと同じ希釈液で、すなわち1:1、1:2、1:5および1:1
0で、ブロッキングバッファーで希釈したプロガストリン陰性のヒト血漿より作製する。
、ウェルを100μl/ウェルの洗浄バッファーで3回洗浄し、その後、次のように、プ
ロガストリンが第一の抗体に結合したことを、プロガストリンに対して特異的である第二
の抗体を用いて検出する。
モノクローナル抗体を、抗体に応じて、0.1から10μl g/mlの濃度にブロッキ
ングバッファーで希釈する。その後、合計100μlの抗体溶液を各ウェルに加えて、2
2℃で1時間インキュベートした。
浄し、その後100μlのストレプトアビジン-HRP溶液(ブロッキングバッファー中
25ng/ml)を各ウェルに加えて、22℃で1時間インキュベートする。ストレプト
アビジン-HRP溶液とのインキュベーションの完了後、プレートを100μl/ウェル
の洗浄バッファーで3回洗浄する。その後、Pierce SuperSignal E
LISA Femto Maximum Sensitivity化学発光基質キットを
用いて調製した100μlの化学発光基質を、ウェルごとに加えて、暗闇中、室温で5分
間インキュベートし、その後ルミノメーターで読み取る。
する直線の式を導く。この式を用いて、その後、様々な患者のサンプル中におけるプロガ
ストリンの濃度を算出する。
の血漿中におけるプロガストリンの血漿濃度の中央値と比較する。これらのデータは、食
道癌を有する患者は、彼らの血漿中におけるプロガストリンのレベルが健常対照の個人と
比べて高かったということを示している。
3.1.抗hPGモノクローナル抗体の中和活性
TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、FLO-1、OE19およびOE33
は、食道癌の研究に通常用いられる細胞株であり、プロガストリンを産生および分泌する
。PGに対するモノクローナル抗体は、これら様々な細胞株中での増殖を阻害するそれら
の能力に関して試験される。様々な抗hPGモノクローナル抗体を用いて、TE-1、T
E-4、TE-6、KYSE30、FLO-1、OE19およびOE33の各細胞株から
の細胞の生存が試験される。
播種し、8時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後24時間で
開始するものとし(時間“T0”)、細胞を、ウシ胎児血清のない状態で、48時間で1
2時間毎に、1~20μg/mlのモノクローナル対照抗体(モノクローナル抗体の抗ピ
ューロマイシン)(CT mAb)で、または、1~20μg/mlの抗hPG mAb
で、六つ組で処理するものであって、前記mAbは、C末端の抗hPGモノクローナル抗
体またはN末端の抗hPGモノクローナル抗体である。
・配列番号28、29および30のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2お
よびCDR-H3を含む重鎖と、配列番号31、32および33のアミノ酸配列であるC
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、抗体
・配列番号34、35および36のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2お
よびCDR-H3を含む重鎖と、配列番号37、38および39のアミノ酸配列であるC
DR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、抗体
から選択される。
または、N末端の抗hPG抗体であり、
・それぞれ配列番号4、5および6のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2
およびCDR-H3を含む重鎖と、配列番号7、8および9のアミノ酸配列であるCDR
-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号10、11および12のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR
-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号13、14および15のアミ
ノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、抗
体
・それぞれ配列番号16、17および18のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR
-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号19、20および21のアミ
ノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、抗
体
・それぞれ配列番号22、23および24のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR
-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号25、26および27のアミ
ノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、抗
体
から選択される。
実験毎に、T0での対照ウェル中の細胞数を計数する。
両方にある生細胞数を計数し、その後、各細胞計数とT0で決定した細胞計数との間の差
異を算出する。その後、得られた抗hPG mAbで処理した細胞の数を、対照のmAB
で処理した細胞の数の百分率として表す。
する。統計的有意性は、テューキーのポストホック検定により一元配置ANOVAを用い
て決定した:*=p<0.05、**=p<0.01、および、***=p<0.001
。各細胞株において、抗hPG抗体が、細胞の生存を減少させる。
PGに対するヒト化抗体は、TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、FLO-
1、OE19およびOE33の細胞株の増殖を阻害するそれらの能力に関して試験される
。TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、FLO-1、OE19およびOE33
の各細胞株からの細胞の生存が、様々な抗hPGヒト化抗体を用いて試験される。
播種し、8時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後24時間で
開始するものとし(時間“T0”)、細胞は、ウシ胎児血清のない状態で、48時間で1
2時間毎に、1~20μg/mlのヒト化対照抗体(BioXCell社製、抗ヒトFc
G1)(CT Hz)で、または、1~20μg/mlの抗hPG Hzで、六つ組で処
理するものであって、前記Hzは、C末端の抗hPGヒト化抗体またはN末端の抗hPG
ヒト化抗体である。実験毎に、T0での対照ウェル中の細胞数を計数する。
にある生細胞数を計数し、その後、各細胞計数とT0で決定した細胞計数との間の差異を
算出する。その後、得られた抗hPG Hzで処理した細胞の数を、対照のmABで処理
した細胞の数の百分率として表す。
計的有意性は、テューキーのポストホック検定により一元配置ANOVAを用いて決定し
た:*=p<0.05、**=p<0.01、および、***=p<0.001。各細胞
株において、抗hPG抗体が、細胞の生存を減少させる。
PGに対するモノクローナル抗体は、Extreme Limiting Dilut
ion Assay(ELDA)を用いて、TE-1、TE-4、TE-6、KYSE3
0、FLO-1、OE19およびOE33の細胞株における癌幹細胞(CSC)頻度を減
少させるそれらの能力が試験される。TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、F
LO-1、OE19およびOE33の各細胞株からのCSC頻度が、様々な抗hPGモノ
クローナル抗体を用いて試験される。
り決まった細胞濃度で、超低接着(ULA(ultra-low attachment))P96(96ウェ
ルプレート)に播種し、濃度の範囲としては、1ウェル当たり1個から500個の細胞を
用いる。該細胞は、最大11日間ULAプレート内でM11培地(Macari et al, Oncoge
ne, 2015)で培養し、1~20μg/mlのモノクローナル対照抗体(モノクローナル抗
体の抗ピューロマイシン)(CT mAb)で、または、1~20μg/mlの抗hPG
mAbで、3または4日毎に処理するものであって、実施例3.1で記載したように、
前記mAbは、C末端の抗hPGモノクローナル抗体またはN末端の抗hPGモノクロー
ナル抗体である。
胞濃度当たりの陽性ウェル数を評価する。最後に、ELDAのウェブツール(http://www
.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)を用いて各治療群のCSC頻度を算出し、群間の
あらゆる統計上の差異を試験する(修正カイ二乗検定)。
低下する。
・スフィア形成アッセイ
よびOE33の細胞株における癌幹細胞(CSC)頻度を低下させるそれらの能力に関し
て試験される。
は、最大10日間ULAプレート内でM11培地(Macari et al, Oncogene, 2015)で培
養し、20μg/mlのヒト化対照抗体(BioXCell社製、抗ヒトFcG1)(C
T Hz)で、または、20μg/mlの抗hPG Hz(PG Hz)で、3または4
日毎に処理するものであって、前記Hzは、C末端の抗hPGヒト化抗体またはN末端の
抗hPGヒト化抗体である。
、その写真を分析し、平均直径が25μmを超えるスフィアを計数する。
。
・Extreme Limiting Dilution Assay
Assay(ELDA)を用いて、TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、FL
O-1、OE19およびOE33の細胞株における癌幹細胞(CSC)頻度を低下させる
それらの能力に関して試験される。TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、FL
O-1、OE19およびOE33の各細胞株からのCSC頻度が、様々な抗hPGヒト化
抗体を用いて試験される。
り決まった細胞濃度で、超低接着(ULA)P96(96ウェルプレート)に播種し、濃
度の範囲としては、1ウェル当たり1個から500個の細胞を用いる。該細胞は、最大1
1日間ULAプレート内でM11培地(Macari et al, Oncogene, 2015)で培養し、1~
20μg/mlのヒト化対照抗体(BioXCell社製、抗ヒトFcG1)(CT H
z)で、または、1~20μg/mlの抗hPG Hzで、3または4日毎に処理するも
のであって、前記Hzは、C末端の抗hPGヒト化抗体またはN末端の抗hPGヒト化抗
体である。
胞濃度当たりの陽性ウェル数を評価する。最後に、ELDAのウェブツール(http://www
.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)を用いて各治療群のCSC頻度を算出し、群間の
あらゆる統計上の差異を試験する(修正カイ二乗検定)。
。
TE-1、TE-4、TE-6、KYSE30、FLO-1、OE19およびOE33
は、食道癌の研究に通常用いられる細胞株であり、プロガストリンを産生および分泌する
。PGに対するモノクローナル抗体は、読出しとして、周知のWNT/βカテニン経路の
標的遺伝子であるタンパク質サバイビンの発現を用いて、これら様々な細胞株におけるW
NT/βカテニン経路を阻害するそれらの能力に関して試験される。TE-1、TE-4
、TE-6およびKYSE30の各細胞株からのサバイビンの発現が、様々な抗hPGモ
ノクローナル抗体を用いて試験される。
播種し、8時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後24時間で
開始し、細胞を、ウシ胎児血清のない状態で、72時間で12時間毎に、1~20μg/
mlのモノクローナル対照抗体(モノクローナル抗体の抗ピューロマイシン)(CT m
Ab)で、または、1~20μg/mlの抗hPG mAbで、四つ組で処理するもので
あって、前記mAbは、C末端の抗hPGモノクローナル抗体またはN末端の抗hPGモ
ノクローナル抗体である。
ク質を抽出する。その後、CT mAbでまたは抗hPG mAbで処理した細胞からの
同量のタンパク質を、抗サバイビン抗体(Cell Signaling社製、モノクロ
ーナル抗体、#2802)およびローディングコントロールとしての抗アクチン抗体(シ
グマ社製、モノクローナル抗体、#A4700)を用いたウエスタンブロットに供する。
Syngene社製、GBOX chemi systemを用いて、定量する。
発現が低減する。統計的有意性は、独立スチューデントt検定を用いて決定される:*=
p<0.05、**=p<0.01、および***=p<0.001。
PGに対するヒト化抗体は、読出しとして、周知のWNT/βカテニン経路標的遺伝子
であるタンパク質サバイビンの発現を用いて、TE-1、TE-4、TE-6、KYSE
30、FLO-1、OE19およびOE33の細胞株におけるWNT/βカテニン経路を
阻害するそれらの能力に関して試験される。TE-1、TE-4、TE-6、KYSE3
0、FLO-1、OE19およびOE33の各細胞株からのサバイビンの発現が、様々な
抗hPGヒト化抗体を用いて試験される。
播種し、8時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後24時間で
開始し、細胞を、ウシ胎児血清のない状態で、72時間で12時間毎に、1~20μg/
mlのヒト化対照抗体(BioXCell社製、抗ヒトFcG1)(CT Hz)で、ま
たは、1~20μg/mlの抗hPG Hzで、四つ組で処理するものであって、前記H
zは、C末端の抗hPGヒト化抗体またはN末端の抗hPGヒト化抗体である。
ク質を抽出する。その後、CT Hzでまたは抗hPG Hzで処理した細胞からの同量
のタンパク質を、抗サバイビン抗体(Cell Signaling社製、モノクローナ
ル抗体、#2802)およびローディングコントロールとしての抗アクチン抗体(シグマ
社製、モノクローナル抗体、#A4700)を用いたウエスタンブロットに供する。Sy
ngene社製、GBOX chemi systemを用いて、定量する。
減する。統計的有意性は、独立スチューデントt検定を用いて決定される:*=p<0.
05、**=p<0.01、および***=p<0.001。
Kaz et al, Cancer Letters, 2014 Jan 28;342(2):193-9. “Epigenetic biomarkers in
esophageal cancer.”
Claims (20)
- 対象における食道癌の存在の危険性についてのイン・ビトロ評価のための方法であって、
a)前記対象からの生物サンプルを少なくとも1つのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と接触させる工程と、
b)前記サンプル中における前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片とプロガストリンとの結合を検出する工程、ここで、前記結合は前記対象における食道癌の存在の危険性を示す、と
を含む、方法。 - 前記食道癌が転移したものである、請求項1に記載の方法。
- 工程b)が、前記プロガストリンの濃度を決定することをさらに含み、前記生物サンプル中において、ここで、前記生物サンプルは血漿である、プロガストリンの濃度が少なくとも10pM、少なくとも20pM、少なくとも30pMまたは少なくとも40pMであることは、前記対象における食道癌の存在の危険性を示す、請求項1または2に記載の方法。
- c)参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
d)前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの濃度と比較する工程と、
e)工程d)での比較から、工程b)におけるプロガストリンの濃度が工程c)における参照のプロガストリンの濃度よりも高い場合に食道癌の存在の危険性があると決定する工程と
をさらに含む、請求項3に記載の方法。 - 前記参照サンプルが健常な対象から単離された生物サンプルである、請求項4記載の方法。
- さらに食道癌の第二の評価試験を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 患者における食道癌の治療の有効性をモニタリングする方法であって、
i)治療前に前記患者より取得した第一の生物サンプルにおけるプロガストリンの濃度を測定する工程、
ここで、前記工程i)は、
・前記第一の生物サンプルを少なくとも一つのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と接触させる工程と、
・前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と前記第一のサンプルの結合に基づいてプロガストリン濃度を測定する工程とを含む、
ii)治療後に前記患者より取得した第二の生物サンプルにおけるプロガストリンの濃度を測定する工程、
ここで、前記工程ii)は、
・前記第二の生物サンプルを少なくとも一つのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と接触させる工程と、
・前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と前記第二のサンプルの結合に基づいてプロガストリン濃度を測定する工程とを含む、および
iii)工程i)のプロガストリン濃度と工程ii)のプロガストリン濃度を比較する工程、ここで、第二のサンプル中のプロガストリン濃度よりも高い第一のサンプル中のプロガストリン濃度が治療は有効であることを示す、
を含む、方法。 - 前記プロガストリン結合抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロガストリン結合抗体が、N末端の抗プロガストリンモノクローナル抗体およびC末端の抗プロガストリンモノクローナル抗体から選択される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロガストリン結合抗体が、配列番号2または配列番号3に含まれるエピトープに結合する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロガストリン結合抗体が、
・それぞれ配列番号4、5および6のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号7、8および9のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号10、11および12のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号13、14および15のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号16、17および18のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号19、20および21のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号22、23および24のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号25、26および27のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号28、29および30のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号31、32および33のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体;並びに
・それぞれ配列番号34、35および36のアミノ酸配列であるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号37、38および39のアミノ酸配列であるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片のプロガストリンへの結合が、FACS、ELISA、RIA、ウエスタンブロットまたはIHCによって検出および/または測定される、請求項1~6および請求項1を直接的または間接的に引用する請求項8~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の生物サンプルおよび前記第二の生物サンプルにおける前記プロガストリン結合抗体のプロガストリンまたはその抗原結合性断片への結合がそれぞれ、FACS、ELISA、RIA、ウエスタンブロットまたはIHCによって検出および/または測定される、請求項7または請求項7を直接的または間接的に引用する請求項8~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片のプロガストリンへの結合が、ELISAまたはRIAによって検出および/または測定される、請求項1~6および請求項1を直接的または間接的に引用する請求項8~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の生物サンプルおよび前記第二の生物サンプルにおける前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片のプロガストリンへの結合が、ELISAまたはRIAによって検出および/または測定される、請求項7または請求項7を直接的または間接的に引用する請求項8~11および13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物サンプルが、プロガストリンの第一の部分に結合する前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と、プロガストリンの第二の部分に結合する第二のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片とに接触させられる、請求項1~6および請求項1を直接的または間接的に引用する請求項8~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の生物サンプルおよび前記第二の生物サンプルがそれぞれ、プロガストリンの第一の部分に結合する前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片と、プロガストリンの第二の部分に結合する第二のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片とに接触させられる、請求項7または請求項7を直接的または間接的に引用する請求項8~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片がプロガストリンのC末端部分と結合し、かつ、前記第二のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片がプロガストリンのN末端部分に結合する、請求項16または17記載の方法。
- 前記第二のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片が抗プロガストリンポリクローナル抗体である、請求項16~18のいずれか一項に記載の方法。
- 生物サンプルが、血液、血清および血漿から選択される、請求項7または請求項7を直接的または間接的に引用する請求項8~19のいずれか一項に記載の方法。
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