CN107850596A - 用于检测组织浸润nk细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测和监测石蜡包埋组织样本中的NK细胞的方法。还提供了特异性结合石蜡包埋组织样本中的NK细胞表面上存在的NKp46的抗体、抗体片段和其衍生物。

Description

用于检测组织浸润NK细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年7月24日提交的美国临时申请No.62/196,409的权益，所述临时申请通过引用整体(包括任何附图和序列表)并入本文。

序列表的引用

本申请与序列表一起以电子格式提交。所述序列表以命名为“NKp46-5PCT_ST25txt”的文件提供，其创建于2016年6月28日，大小为7KB。所述序列表的电子格式的信息通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于检测石蜡包埋组织样本中的组织浸润NK细胞的研究和诊断工具。本发明还涉及使用所述工具检测呈离散细胞群体形式的组织浸润NK细胞，特别是肿瘤浸润NK细胞以及将检测与非NK特异性标志物组合的方法。

背景技术

需要能够更特异性地利用免疫系统来靶向癌细胞并且因此避免传统化学治疗剂的典型副作用的新型癌症治疗方法。为了更好地了解免疫浸润，需要检测患者组织样本中的NK细胞，例如检测NK细胞是否浸润肿瘤(或更一般地任何炎症部位)和/或是否存在于肿瘤周边或者邻近组织中。这通常使用冷冻组织样本来进行。这不仅在研究中有用，而且还可以帮助决定使用何种类型的治疗，例如通过检测组织(例如肿瘤环境)是否以包括NK细胞的炎症为特征和/或表征组织(例如肿瘤、炎症性病症)中存在的免疫细胞的类型。该信息可能是有价值的，以便选择能够调节可用免疫细胞的活性的治疗。

除了冷冻组织外，还可以从已经保存为甲醛(例如福尔马林)固定的石蜡包埋(FFPE)样本的组织样本中检测标志物。脱蜡后，载玻片适合于例如免疫组织化学方法来检测特定蛋白质的表达。所述方法已被常规用于检测肿瘤组织样本中的肿瘤抗原。不幸的是，通常不可能找到在FFPE切片中有效地且特异性地起作用的单克隆抗体。这被认为是由于福尔马林固定对蛋白质结构的影响。在FFPE中使用时，被描述为对重组蛋白或细胞具有特异性的抗体所结合的表位经常存在于其它蛋白质上，使得所述抗体为非特异性的。在其它情况下，天然细胞蛋白上的许多表位被福尔马林固定所破坏，导致使用重组蛋白或细胞鉴定的抗体对于FFPE切片染色无效。

在肿瘤学领域，肿瘤浸润T细胞已经成为广泛研究的课题。目前，FFPE切片中的多重测定允许研究T细胞(使用CD4和CD8作为标志物)和B细胞(使用CD20作为标志物)。然而，肿瘤浸润NK细胞，尽管已报道它们的存在，却很少受到关注。Levi等,(2015)《肿瘤靶标(Oncotarget)》,Advance Publications 2015,第1-9页使用抗CD56抗体对肿瘤浸润细胞染色。通常，用于对浸润淋巴细胞染色的标志物不允许直接检测呈单谱系的细胞，这导致多种标志物的组合以努力估计所存在细胞的类型。另外，不同的细胞群体在成熟时表达不同的标志物。因此，评估组织样本中的免疫概况涉及相当大的不确定性和/或需要更大数量的待评估标志物。

虽然NK细胞上存在的各种蛋白的抗体经过几十年的研究已经存在，但是这些蛋白一般对NK细胞的表达没有高度选择性，并且许多激活性或抑制性NK细胞受体的表达由至少一些T细胞或其它免疫细胞所共有。同时，许多受体不适合产生在石蜡包埋切片中特异性结合的配体(例如在福尔马林固定后没有特异性表位可用)。因此，需要可明确检测石蜡包埋样本中的NK细胞的方法。本发明解决了这些和其它的需求。

发明内容

本发明尤其涉及研究和/或监测FFPE组织样本中的NK细胞。本发明涉及呈离散细胞群体形式的组织浸润人类(和非人类灵长类动物)NK细胞的检测，并且任选地将这种检测与并非NK细胞所独有的标志物的评估相结合，所述标志物包括但不限于其它人类免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。并非NK细胞所独有的标志物可能在非NK谱系上特异性存在，或者可能在除NK细胞以外的非NK谱系上存在。

本公开提供使用单谱系特异性和成熟独立性标志物在FFPE样本中检测组织浸润NK细胞，包括肿瘤浸润NK细胞。特别地，NKp46在FFPE样本中存在的组织浸润NK细胞和肿瘤浸润NK细胞上表达，而在组织样本中的非NK细胞上不表达。令人惊讶的是，尽管广泛多种非谱系特异性人类免疫球蛋白超家族(IgSF)成员在NK细胞上表达，但单克隆抗体可以将FFPE中的NK谱系特异性NKp46与非谱系特异性IgSF成员区分开来。因此，提供了新的FFPE方法，其中在横跨基本上所有NK细胞群体的谱系特异性方法中对NK细胞染色，包括横跨成熟阶段，以及横跨CD56^亮和CD56^暗NK细胞(以及更通常横跨所有的细胞或免疫细胞群体)。当进行免疫谱分析时，该方法特别有用，其中细胞群体用非谱系标志物染色，特别是用也能够由NK细胞表达的标志物(例如其它IgSF多肽)染色。还提供了可用抗体，其允许在FFPE切片中进行NK细胞的细胞谱系特异性检测，其能够可靠地区分NK细胞与其它淋巴细胞群体或NK亚群。

本公开源自抗NKp46抗体和人类组织样本的表征。已知的抗NKp46抗体在FFPE方案中不染色或失去特异性。通过开发基于使用表达NKp46的石蜡包埋细胞团块和不表达NKp46的阴性对照的测定法的筛选方案，本发明人获得了识别FFPE材料中的NKp46特异性表位的抗体。所述抗体允许在对人类NKp46的特异性下进行人类FFPE组织样本的染色和研究。

此外，识别FFPE材料中的NKp46特异性表位的抗体也特异性识别冷冻组织切片中以及培养细胞(例如血细胞计数中)和蛋白质印迹法中的NKp46。因此，所述抗体提供在多种类型的样本制备方法和格式中在NKp46检测中使用单一工具的优点。

本公开提供特异性结合人类NKp46多肽的单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合于已使用甲醛(例如福尔马林、多聚甲醛)处理(或固定)的生物样本中的细胞上的所述NKp46多肽。特别是使用甲醛固定来制备石蜡包埋组织切片，其然后可以脱蜡并分析感兴趣的标志物(例如NKp46)的存在。

另一方面，提供了特异性结合于石蜡包埋样本中的NK细胞的单克隆抗体。任选地，所述抗体可以表征为不结合于FFPE样本中的粒细胞、单核细胞、B细胞或T细胞，或者FFPE样本中的任选地任何非NK细胞。任选地，所述抗体可以表征为结合CD56^亮NK细胞以及CD56^暗NK细胞。任选地，所述抗体与石蜡包埋样本中的NK细胞上存在的人类NKp46多肽上的表位结合。

在一个实施方案中，不同于可以结合FFPE样本中除NKp46以外的蛋白质上的共用表位(例如由于因固定过程而出现表位)的其它单克隆抗体或多克隆抗体，本公开的抗体可以表征为不与任何非谱系特异性IgSF家族成员(例如除NKp46以外的IgSF成员；非谱系特异性天然细胞毒性受体如NKp44或NKp30)结合。

另一方面，提供了一种单克隆抗体，其特异性结合(a)石蜡包埋样本中的NK细胞，(b)冷冻组织样本中的NK细胞和(c)培养中的NK细胞。任选地，所述抗体在还原条件下(例如在蛋白质印迹法中)还结合于NKp46。任选地，所述抗体可以表征为不结合于FFPE样本中的非NK细胞，例如粒细胞、单核细胞、B细胞或T细胞。任选地，所述抗体可以表征为结合CD56^亮NK细胞以及CD56^暗NK细胞。任选地，所述抗体与石蜡包埋样本中的NK细胞上存在的人类NKp46多肽上的表位结合。

另一方面，提供了一种单克隆抗体，其特异性结合已经在石蜡中保存的细胞(例如已被保存为石蜡包埋细胞团块的细胞)所表达的人类NKp46多肽。任选地，使细胞形成团块，用甲醛(例如甲醛、福尔马林、多聚甲醛)处理，然后石蜡包埋。任选地，表达人类NKp46多肽的细胞是在抗体结合和分析之前已被脱蜡的生物样本中。

本公开还提供了基于经甲醛处理的石蜡包埋细胞团块(FFPE细胞团块)的筛选方法，所述细胞团块显示在福尔马林处理后存在的NKp46表位。所述方法可以用于鉴定与福尔马林处理后产生和/或存在于细胞NKp46多肽上的表位结合的抗体。因此，在一方面，本公开提供了在作为石蜡包埋细胞团块(并且在分析之前脱蜡)保存的样本中特异性结合表达NKp46多肽的细胞(例如使其表达NKp46的细胞)的单克隆抗体。任选地，所述抗体还表征为不与石蜡包埋细胞团块中的NKp46阴性细胞(不表达NKp46的细胞)结合。任选地，所述抗体还表征为与石蜡包埋组织切片中的NK细胞结合。

甲醛固定(例如福尔马林固定、多聚甲醛固定)的石蜡包埋(FFPE)组织相比于其它免疫学方法提供两个主要优点：(1)组织不需要特殊处理；和(2)细胞学和结构学特征被充分认识，从而允许改进组织病理学解释。本公开提供了通过使用在FFPE中保持谱系特异性的抗体试剂对石蜡包埋组织切片进行免疫染色来检测人类NK细胞的表达。因此，并非根据浸润免疫细胞的分析独立地研究来自FFPE组织的组织的细胞学和结构学特征，而是本发明方法提供了直接和/或联合分析FFPE中的NK细胞的可能性。

使用该方法，可以获得薄的组织(例如通过活组织检查获得的癌组织)切片，将其固定在例如福尔马林中，石蜡包埋，然后切成非常薄的切片并安装在载玻片上。脱蜡后，载玻片适合于免疫组织化学方法以使用抗NKp46抗体来检测NKp46的表达，从而提供NK细胞在其它免疫细胞群体中的特异性鉴定。这种方法特别有用，因为它可产生检测或鉴定NK细胞的特定细胞和细胞内定位的方法。

本公开提供了新型组合物和方法，其涉及允许特异性结合于已经用福尔马林处理(例如保存为FFPE组织)的生物样本内的NKp46的抗体和抗体片段。所述组合物和方法可用于多种应用，特别是用于检测(包括定量)组织中的NK细胞和NK细胞上的NKp46表达水平，例如在抗癌或抗炎疗法之前，特别是在免疫疗法之前。为了研究和诊断目的，本文公开的抗体可以通常用于NK细胞的检测(包括定量)和/或表征，包括但不限于研究NK细胞和/或其性质、活性、定位或迁移。石蜡组织切片的免疫组织化学研究可以例如用来评估组织抗原在NK细胞和组织中的正常表达模式；诊断造血功能障碍(例如区分NK细胞与其它细胞)；确定细胞抗原是否从NK细胞中失去；鉴定与NK细胞相关的抗原表达的变化；并鉴定与癌症或炎症性病变相关或者与癌症或炎症性病症中的免疫应答或潜在免疫应答相关的免疫细胞类型(例如NK细胞、NK细胞亚型)。本文所公开的抗体可以通常用于检测和/或表征NK细胞以用于预测疾病进程或治疗反应的预后测试，以及在伴随诊断中用于鉴定适合于用特定治疗剂治疗的患者。

本文公开的方法和试剂提供了已经用福尔马林处理的样本、尤其是作为FFPE切片保存的样本中的NK细胞的特定标志物，并且可以用作唯一的标志物来鉴定NK细胞。然而，应理解的是，本文公开的试剂也可以用于其它基于非FFPE的方法中来检测人类NK细胞，例如蛋白质印迹法、流式细胞术、冷冻组织切片中的IHC。应理解，检测人类NK细胞的方法也可以利用额外的染色试剂(例如抗体)来鉴定其它细胞(例如非NK细胞)，鉴定存在于NK细胞上的标志物(例如鉴定NK细胞的亚群)，或鉴定由NK细胞表达的其它蛋白质。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗体，其与培养中和/或在冷冻组织切片中由纯化的NK细胞表达的NKp46和/或重组NKp46多肽上存在的表位结合，其中所述表位也存在于福尔马林固定的NK细胞上(即是与福尔马林固定的NK细胞共有的共同抗原决定簇)。

在一个实施方案中，本公开提供一种抗体，其与单克隆抗体8E5B竞争结合相同的NKp46表位(例如存在于NKp46多肽上，或存在于培养中、冷冻细胞团块中和/或石蜡包埋细胞团块中表达NKp46的细胞上)。任选地，所述抗体是人类抗体或小鼠抗体。任选地，所述抗体选自抗体文库，例如噬菌体展示文库。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合的，例如含有非鼠类、任选地人类恒定区。在另一个实施方案中，所述抗体基本上不与任何非NKp46超家族IgSF受体家族成员结合。在一个实施方案中，所述抗体缺乏Fc结构域(例如F(ab)'2片段)或包含基本上不与人类Fcγ受体(例如CD16)结合的Fc结构域。在一个实施方案中，所述抗体基本上不与石蜡包埋细胞团块中不表达NKp46但表达人类免疫球蛋白超家族IgSF受体家族的一个或多个成员的细胞结合。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:2的8E5B轻链可变区序列的一个、两个或全部三个CDR的轻链。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:3的8E5B重链可变区序列的一个、两个或全部三个CDR的重链。在另一个实施方案中，所述抗体包含具有包含SEQ ID NO:4至6中的任一个的氨基酸序列的CDR的轻链。在另一个实施方案中，所述抗体包含具有包含SEQ ID NO:7至9中的任一个的氨基酸序列的CDR的重链。在另一个实施方案中，所述抗体是8E5B或其片段或衍生物。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:2的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列。

在一个实施方案中，所述抗体是选自Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv、双功能抗体、单链抗体片段或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体的抗体片段。在另一个实施方案中，所述抗体与可检测部分缀合或共价结合。

在一个实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含任何抗NKp46抗体，优选地连同其例如根据本文提供的治疗或诊断方法的使用说明。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含特异性识别初级抗NKp46抗体的被标记的二级抗体。在一个这样的实施方案中，所述二级抗体与HRP或AP缀合。在另一个实施方案中，所述HRP或AP与聚合物缀合。

在一个实施方案中，本公开提供了产生本文公开的抗NKp46抗体的细胞，例如通过选择与包含被8E5B抗体特异性识别的NKp46表位的抗原结合而筛选的产生抗NKp46抗体的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是克隆8E5B。在一个相关方面，本发明提供了一种杂交瘤，其包含：a)来自已经用NKp46多肽免疫并通过在包含被8E5B抗体特异性识别的NKp46表位的抗原上选择而筛选的非人类哺乳动物宿主的B细胞，其与b)永生化细胞融合，其中所述杂交瘤产生特异性结合所述表位的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗原由石蜡包埋细胞团块中的细胞表达。

在这些方面中的任一方面的一个实施方案中，所述单克隆抗体与抗体8E5B结合相同的表位。

在一个实施方案中，本公开提供了产生与石蜡包埋组织中的NKp46特异性结合的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个候选抗体；和b)从所述多个候选抗体制备或选择与石蜡包埋细胞样本中的细胞所表达的NKp46多肽结合的抗体，任选地从所述多个候选抗体制备或选择与抗体8E5B竞争结合由石蜡包埋细胞表达的NKp46多肽的抗体。

在一个实施方案中，本公开提供了产生特异性结合石蜡包埋组织中的NKp46的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个候选单克隆抗体；和b)从所述多个候选单克隆抗体制备或选择与石蜡包埋细胞团块中的细胞所表达的NKp46多肽结合的抗体。

在另一方面，本发明提供了检测福尔马林处理和/或石蜡包埋组织样本中的NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)使所述组织样本与抗NKp46抗体接触；和b)在所述组织样本中检测结合抗体的存在。如果检测到NKp46，则所述样本可以被确定为包含NK细胞，例如组织浸润或肿瘤浸润NK细胞。在一个实施方案中，抗NKp46抗体与NKp46上的表位结合，所述表位存在于培养的NK细胞上并且仍然存在于已被福尔马林处理和/或以石蜡包埋细胞团块保存的细胞上。

在一个实施方案中，本公开提供了检测来自人类个体的样本内的组织浸润人类NK细胞(例如组织浸润人类CD56^亮NK细胞)的体外方法，所述方法包括提供来自所述个体的石蜡包埋样本，并使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的人类NK细胞谱系特异性多肽的单克隆抗体来检测所述样本中的组织浸润NK细胞，其中所述NK细胞谱系特异性多肽的检测指示组织浸润NK细胞的存在。任选地，所述方法还包括使用与石蜡包埋组织样本中的第二多肽特异性结合的单克隆抗体来检测所述样本中的所述第二多肽，其中所述第二多肽是由NK细胞表达的谱系非特异性多肽。任选地，所述单克隆抗体能够检测CD56^暗和CD56^亮NK细胞。任选地，NKp46是用于确定NK细胞谱系的唯一标志物。

在一个实施方案中，本发明提供了检测组织样本中NKp46和/或NK细胞的存在和/或水平的方法，所述方法包括以下步骤：a)使所述组织样本与本文描述的抗NKp46抗体接触；和b)在所述组织样本中检测结合抗体的存在。任选地，所述组织样本是福尔马林处理和/或石蜡包埋的组织样本，培养细胞，包含生物体液(例如血清、淋巴液、血液、滑液)的生物样本、细胞样本或组织样本(例如骨髓或组织活检，包括例如来自肠道、肠道固有层或肺的粘膜组织)。任选地，所述组织样本来自患有癌症、炎症性或自身免疫性病症或感染性疾病的个体。在一个实施方案中，所述方法还包括步骤(c)：如果检测到NKp46的表达，则向所述患者施用免疫治疗剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是例如通过与免疫细胞上的细胞表面受体结合，能够直接调节免疫细胞，任选地NK细胞，任选地T细胞，任选地NK细胞和T细胞的活性的药剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是例如通过与作为免疫细胞上的细胞表面受体的天然配体的多肽结合，能够间接调节免疫细胞，任选地NK细胞，任选地T细胞，任选地NK细胞和T细胞的活性的药剂。

在另一方面，例如为了评估免疫细胞浸润(例如NK细胞、T细胞、单核细胞、粒细胞等)和/或由这些细胞表达的多肽，NKp46提供由所有NK细胞表达的谱系特异性NK细胞标志物，而且基本上在其整个生命周期中允许这种NK细胞标志物检测与在NK细胞上和/或在非NK细胞上表达的一种或多种非谱系特异性或成熟依赖性标志物的检测相结合。所述非谱系特异性标志物可以是例如另一种IgSF成员，例如IgSF激活性(例如共刺激)或抑制性受体，特别是CD28家族的分子，例如CD28、CTLA-4、程序性死亡-1(PD-1)、B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA、CD272)和其诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；和其属于B7家族的IgSF配体；CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、ICOS配体、PD-L1(B7-H1)、PD-L2(B7-DC)、B7-H3和B7-H4(B7x/B7-S1)，或任何其它IgSF家族成员，例如抗原呈递分子，天然细胞毒性受体(NKp30、NKp44)，共受体，抗原受体辅助分子，IgSF CAM，细胞因子受体如白细胞介素-6受体或集落刺激因子1受体，生长因子受体如PDGFR或SCFR，c-kit，CD117抗原，受体酪氨酸激酶/磷酸酶如IIa型和IIb型受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)，或Ig结合受体如Fc受体。在一个实施方案中，所述标志物是CD56和/或CD16。例如，除了NKp46之外，还发现NK细胞表达非谱系特异性蛋白PD-1，因此可以使用抗NKp46抗体和抗PD-1抗体来鉴定例如在肿瘤环境中是否存在表达PD-1的NK细胞。

例如，在一个实施方案中，本发明提供了检测(例如，表征、定量)来自个体的福尔马林处理和/或石蜡包埋组织样本中的NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)使所述组织样本与抗NKp46抗体以及与结合非NKp46多肽的抗体(例如本文讨论的非谱系特异性多肽)，任选地能够由NK细胞表达的非NKp46多肽接触；和b)在组织样本中检测结合抗体的存在。任选地，使所述组织样本与1、2、3、4、5或10种以上结合不同非NKp46多肽的不同单克隆抗体接触。任选地，所述非NKp46多肽是非NK细胞群体的标志物，NK亚群的标志物，与NK细胞成熟阶段相关的标志物。任选地，所述非NKp46多肽是与细胞激活、抑制、失能/耗竭或压制和/或增殖相关的标志物；任选地所述标志物是非谱系特异性的，任选地所述标志物能够被NK细胞和T细胞表达。任选地，所述非NKp46多肽选自：免疫细胞激活性或抑制性受体，能够在NK和/或T细胞上表达的激活性受体，能够在NK和/或T细胞上表达的抑制性受体，和由药物(例如治疗性抗体)靶向的免疫细胞表达的细胞表面多肽。例如，样本中检测到抗NKp46抗体表明存在NK细胞。当非NKp46多肽是非NK细胞群体的标志物时，样本中检测到结合非NKp46多肽的抗体表明存在所述非NK细胞群体。当非NKp46多肽是NK细胞亚群的标志物时，样本中检测到结合非NKp46多肽的抗体表明存在所述NK细胞亚群。

浸润NK和/或其它细胞的存在可以用作施用调节这些细胞的治疗剂可能具有治疗益处的指示，因为由所述治疗剂调节或靶向的细胞群体(例如NK细胞)存在于相关组织(例如肿瘤)中。因此，在一个实施方案中，所述方法还包括步骤(c)：如果检测到NKp46和/或非NKp46多肽的表达，则向所述个体施用免疫治疗剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是能够直接或间接调节免疫细胞，任选地效应细胞，任选地NK细胞，任选地T细胞，任选地NK细胞和T细胞的活性的药剂。

当非NKp46多肽是与细胞激活、抑制、失能/耗竭或压制和/或增殖相关的标志物时，样本中检测到结合非NKp46多肽的抗体分别指示存在已经或可能被激活、抑制、失能/耗竭或压制和/或增殖的细胞。组织浸润NK和/或其它细胞已经或可能被激活、抑制、失能/耗竭或压制和/或增殖的研究结果可用作施用调节其激活、抑制、失能/耗竭、压制和/或增殖的治疗剂可能具有治疗益处的指示。因此，在一个实施方案中，所述方法还包括步骤(c)：如果检测到NKp46和/或非NKp46多肽的表达，则向所述个体施用能够直接或间接调节免疫细胞，任选地效应细胞，任选地NK细胞，任选地T细胞，任选地NK细胞和T细胞的激活、抑制、失能/耗竭、压制和/或增殖的免疫治疗剂。

在另一个实施方案中，可以使用抗NKp46抗体与鉴定由治疗剂靶向的多肽的第二抗体的组合来检测石蜡包埋样本中的浸润NK细胞和任选地其它浸润免疫细胞。由治疗剂靶向的多肽存在于所需的免疫细胞(例如NK细胞、T细胞、其它免疫细胞和/或肿瘤细胞)上，和/或NK和/或其它细胞以所需数量存在，和/或所述多肽以足够水平存在于这些细胞上的研究结果，可以表明施用所述治疗剂(例如免疫治疗剂)可能具有治疗益处。在一个实施方案中，本发明提供了治疗剂的治疗和/或预后方法，所述方法包括以下步骤：a)使来自患有疾病(例如癌症、感染性或炎症性病症)的个体的福尔马林处理和/或石蜡包埋疾病组织样本与抗NKp46抗体以及与结合由免疫治疗剂(例如治疗性抗体)靶向的多肽的抗体接触；和b)在所述组织样本中检测结合抗体的存在。在样本中检测到抗NKp46抗体和结合由免疫治疗剂靶向的多肽的抗体表明，NK细胞存在于疾病组织中，并且由免疫治疗剂靶向的多肽存在于疾病组织内的细胞上，并且此外任选地，所述个体适合(可能受益于)用免疫治疗剂治疗。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是能够介导针对靶细胞(例如，表达由免疫治疗剂结合的抗原的细胞；癌细胞)的ADCC的药剂(例如包含结合CD16多肽的Fc结构域的抗体)。例如，在肿瘤环境中存在表达NKp46的细胞和表达肿瘤抗原的肿瘤细胞的研究结果可以表明，靶向肿瘤抗原的ADCC诱导抗体将能够引起NK细胞介导的肿瘤细胞ADCC。在另一个实施方案中，所述免疫治疗剂是双特异性抗原结合剂，例如结合由靶细胞(例如肿瘤细胞)和NKp46多肽表达的抗原(例如肿瘤抗原)的双特异性抗体；在肿瘤环境中存在表达NKp46的细胞(NK细胞)和表达抗原(肿瘤抗原)的细胞(例如肿瘤细胞)的研究结果可以表明，双特异性试剂将能够诱导NK细胞介导的靶细胞溶解。在一个实施方案中，所述方法还包括步骤(c)：如果检测到免疫治疗剂靶向的NKp46和/或多肽的表达，则向所述个体施用免疫治疗剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是能够直接或间接调节免疫细胞，任选地效应细胞，任选地NK细胞，任选地T细胞，任选地NK细胞和T细胞的活性的药剂。

在一个实施方案中，所述组织样本包括选自以下的人类组织：癌组织，例如，来自癌症患者的组织，接近癌症或在癌症周边的组织，癌旁组织，邻近非肿瘤组织或正常邻近组织。在一个实施方案中，所述组织来自癌瘤、黑素瘤或肉瘤。在一个实施方案中，所述癌症或肿瘤是癌瘤、黑素瘤或肉瘤。

在另一个实施方案中，所述组织样本包括选自发炎组织(例如来自具有炎症性病症的个体中的炎症部位)的人类组织。在另一个实施方案中，所述组织是选自以下的肿瘤组织：皮肤、乳房、肺、食道、胃、喉、肾脏和子宫颈。

在本文中任何方法或组合物的一个实施方案中，NK细胞可被指定为细胞毒性和/或活性NK细胞，例如具有溶解靶细胞和/或增强其它细胞的免疫功能的能力。

在任一方法的一个实施方案中，如果在步骤b)中检测到的NKp46以升高的水平检测，则在步骤c)中向患者施用免疫治疗剂。在另一个实施方案中，所述癌组织选自乳房、肺、食道、胃、喉、肾脏和子宫颈。在另一个实施方案中，所述组织是结肠组织，此外任选地所述患者具有结肠直肠癌。在另一个实施方案中，所述组织是黑素瘤。

尽管NKp46对NK细胞具有高度特异性(例如在非恶性细胞内)，但是已经发现某些淋巴瘤如T细胞淋巴瘤能够表达NKp46。因此，在本文的任何实施方案中，组织样本(或肿瘤或癌症)可以被指定为除淋巴瘤(或T细胞淋巴瘤、CD4T细胞淋巴瘤)以外的样本或组织样本(或肿瘤或癌症)。例如，组织可能是癌瘤或肉瘤组织；癌症或肿瘤是癌瘤或肉瘤。

鉴于某些表达NKp46的淋巴瘤的存在，在另一方面，本发明提供了检测(例如表征)和/或治疗表达NKp46的癌症(例如NK细胞或T细胞淋巴瘤)的方法。在一个方面，提供在患有淋巴瘤的个体中检测表达NKp46的恶性细胞的体外方法，所述方法包括：提供来自患有淋巴瘤的个体的石蜡包埋样本，并根据本公开的方法或使用本公开的抗体检测所述样本中表达NKp46的恶性细胞。任选地，表达NKp46的癌症是CTCL(例如Sezary综合征、蕈样真菌病)，NK-LDGL，鼻型NK/T淋巴瘤，外周T细胞淋巴瘤(PTCL)(例如肠病相关T细胞淋巴瘤(EATL)、非特指型PTCL(PTCL-NOS)或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL))，或PTCL的恶变前病状如乳糜泻，任选地难治性乳糜泻(RCD)，任选地I型或II型RCD。任选地，所述方法还包括使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的第二多肽的单克隆抗体检测所述样本中的所述第二多肽，其中所述第二多肽是由淋巴瘤细胞表达的多肽，任选地其中所述第二多肽是CD4或CD30。在一个方面，本发明提供了治疗患有淋巴瘤(例如CTCL或PTCL)的个体的方法，所述方法包括：a)提供来自所述个体的福尔马林处理和/或石蜡包埋癌症样本；b)检测所述癌症样本中的NKp46；任选地NKp46的检测表明个体适合用抗NKp46剂(例如消耗表达NKp46的细胞的药剂)治疗。在一个方面，所述石蜡包埋癌症样本是石蜡包埋细胞团块。在一个方面，本发明提供了治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括：a)提供来自所述个体的福尔马林处理和/或石蜡包埋癌症样本；b)检测癌症样本中的NKp46，其中NKp46的检测表明所述个体适合用抗NKp46剂治疗；和任选地：c)如果在癌症样本中检测到NKp46表达，则向患者施用导致表达NKp46的细胞(例如抗NKp46抗体)消除的治疗剂。在任一实施方案的一个方面，所述癌症或淋巴瘤是CTCL、Sezary综合征、蕈样真菌病、NK-LDGL、鼻型NK/T淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、肠病相关T细胞淋巴瘤(EATL)、非特指型PTCL(PTCL-NOS)或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。

在本文的任何实施方案中，可以通过检测细胞或样本脱蜡后的结合来评估与石蜡包埋细胞或组织样本的结合。在任何实施方案中，提及福尔马林或石蜡可以用任何或等同的材料代替，例如如本文所进一步公开。

本发明的这些和另外的有利方面和特征可以在本文其它地方进一步描述。

附图说明

图1显示NKp46染色的结果，说明NKp46存在于所有NK细胞上，包括CD56^亮，占NKp46阳性细胞的11.1％，而在CD56^亮亚群中缺少NKp30。CD56^亮NK细胞亚群数量在外周血中占少数，但在二级淋巴组织以及肿瘤组织中构成NK细胞的大多数。

图2显示NKp46染色的结果，说明NKp46和NKp30对NK细胞具有高度特异性，粒细胞、单核细胞、B细胞或T细胞没有染色。另一方面，CD56在亚群T细胞(CD3+)上表达。

图3显示在Raji-huNKp46低、高和SNK6(内源性表达NKp46的NK/T淋巴瘤细胞系)上用PE偶联抗NKp46抗体进行免疫荧光染色后通过流式细胞术获得的平均荧光强度。

具体实施方式

定义

如本文所用，“石蜡包埋样本”(或石蜡包埋“细胞”、“细胞团块”、“载玻片”或“组织”)是指从生物体或从已经固定、石蜡包埋、切片、脱蜡并转移到载玻片上的体外细胞培养物获取的细胞或组织。应理解，固定和石蜡包埋是一种常见操作，其可以在许多方面变化，例如关于所使用的固定和包埋方法，关于所遵循的方案等，并且为了本发明的目的涵盖任何这种变体方法，只要其涉及组织固定(例如通过福尔马林处理)，石蜡或等同材料包埋，切片和转移到载玻片即可。

如本文所用的术语“生物样本”或“样本”包括但不限于生物体液(例如血清、淋巴液、血液)，细胞样本，或组织样本(例如骨髓或组织活检，包括例如来自肠道、肠道固有层或肺的粘膜组织)。

如本说明书中所用，“一个”可以表示一个或多个。如权利要求书中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”可以表示一个或多于一个。

在使用“包含”的情况下，这可以任选地被“基本上由……组成”代替，更任选地被“由……组成”代替。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指包含能够免疫特异性结合于表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施方案中，所述结构域可以包含高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施方案中，所述结合结构域可以包含抗体链的一个、两个或全部三个互补决定区(CDR)。在另一个实施方案中，所述结合结构域可以包含来自非免疫球蛋白骨架的多肽结构域。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且具体包括全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段和衍生物，只要它们表现出所需的生物学活性即可。在例如Harlow等,《抗体：实验室手册(ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)中提供了与抗体产生有关的各种技术。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，例如其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂、F(ab)₃、FV(典型地为抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(通常是VH和CH1结构域)，和dAb(通常是VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和κ抗体(参见例如Ill等,《蛋白质工程(Protein Eng)》,1997；10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及由抗体片段形成的多特异性抗体片段，和一个或多个分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起以形成功能性抗体片段。已经在例如Holliger和Hudson,《自然-生物技术(Nat Biotechnol)》,2005；23,1126-1136；WO2005040219，和已公开美国专利申请20050238646和20020161201中描述或评述了各种类型的抗体片段。

如本文所用，术语“抗体衍生物”包含全长抗体或例如至少包含其抗原结合或可变区的抗体片段，其中一个或多个氨基酸例如通过烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯形成或酰胺形成等被化学修饰。这包括但不限于聚乙二醇化抗体、半胱氨酸-聚乙二醇化抗体和其变体。

当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等,1991)，和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》,1987；196:901-917)。通常，该区域中的氨基酸残基的编号由Kabat等(同上)中所述的方法进行。本文中诸如“Kabat位置”、“Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”的短语是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的这种编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包括在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域处比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。任一定义的应用是指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖常用编号方案所定义的CDR的适当氨基酸残基作为比较列于下表1中。涵盖特定CDR的确切残基数量将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以根据抗体的可变区氨基酸序列常规地确定哪些残基包含特定的CDR。

表1

CDR	Kabat	Chotia	AbM
				HCDR1	31-35	26-32	26-35
HCDR2	50-65	52-58	50-58
				HCDR3	95-102	95-102	95-102
VCDR1	24-34	26-32	24-34
				VCDR2	60-56	50-52	50-56
VCDR3	89-97	91-96	89-97

如本文所用的“框架”或“FR”残基是指除了定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR隔开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

如本文所定义的“恒定区”是指由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因之一编码的抗体来源的恒定区。如本文所用的“恒定轻链”或“轻链恒定区”是指由κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体区域。恒定轻链通常包含单个结构域，并且如本文所定义是指Cκ或Cλ的位置108-214，其中编号是根据EU索引(Kabat等,1991,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)》,第5版,United States Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda)。如本文所用的“恒定重链”或“重链恒定区”是指由μ、δ、γ、α或ε基因编码以将抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE的抗体区域。对于全长IgG抗体，如本文所定义的恒定重链是指CH1结构域的N端到CH3结构域的C端，因此包含位置118-447，其中编号是根据EU索引。

如本文所用的“Fab”或“Fab区”是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以孤立地指该区域，或者在多肽、多特异性多肽或ABD的情形下的该区域，或者如本文所概述的任何其它实施方案。

如本文所用的“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，其使得scFv形成抗原结合所需的结构。用于产生scFv的方法在本领域中是众所周知的。关于产生scFv的方法的综述，参见《单克隆抗体的药理学(Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。

如本文所用的“FV”或“FV片段”或“FV区”是指包含单个抗体的VL和VH结构域的多肽。

如本文所用的“Fc”或“Fc区”是指包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此，FC是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N端。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2(CH2)和Cγ3(CH3)，以及Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管Fc区的边界可以变化，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包含残基C226、P230或A231，其中编号是根据EU索引。Fc可以孤立地指该区域，或者在Fc多肽的情形下的该区域，如下所述。如本文所用的“Fc多肽”或“Fc衍生多肽”是指包含全部或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括但不限于抗体、Fc融合物和Fc片段。

如本文所用的“可变区”是指包含一个或多个基本上由分别构成轻链(包括κ和λ)和重链免疫球蛋白基因座的任何VL(包括Vκ(VK)和Vλ)和/或VH基因编码的Ig结构域的抗体区域。轻链或重链可变区(VL或VH)由被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区中断的“框架”或“FR”区组成。框架区和CDR的范围已经被精确地确定，例如在Kabat中(参见"免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)",E.Kabat等,U.S.Department of Health and Human Services,(1983))，以及在Chothia中。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于定位和比对CDR，所述CDR主要负责与抗原结合。

术语“特异性结合”是指抗体或多肽可以优选在竞争性结合测定法中结合至结合搭配物，例如NKp46，如使用重组形式的蛋白质、其中的表位或存在于分离的靶细胞表面上的天然蛋白质所评估的。下面进一步描述用于确定特异性结合的竞争性结合测定法和其它方法，并且是本领域众所周知的。

当抗体或多肽被称为与特定的单克隆抗体“竞争”时，这意味着所述抗体或多肽与单克隆抗体在使用适当的靶分子或表面表达的靶分子(例如由石蜡包埋细胞团块中的细胞表达的NKp46)的结合测定法中竞争。例如，如果测试抗体在结合测定法中降低8E5B与NKp46多肽或NKp46表达细胞的结合，则所述抗体被称为分别与8E5B“竞争”。

如本文所用，术语“亲和力”是指抗体或多肽与表位结合的强度。抗体的亲和力由解离常数K_D给出，定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度并且[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数K_A由1/K_D定义。用于测定mAb的亲和力的优选方法可见于：Harlow等,《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988；Coligan等编,《免疫学实验室指南(Current Protocols in Immunology)》,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)；和Muller,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》,92:589-601(1983)，所述参考文献全部通过引用并入本文。本领域众所周知的用于确定mAb亲和力的一种优选且标准的方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcore^TM SPR分析装置分析)。

在本发明的上下文中，“决定簇”表示多肽上的相互作用或结合位点。

术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体或多肽所结合的抗原上的范围或区域。蛋白质表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸残基，即在抗体的“足迹”内的氨基酸残基。它是复杂抗原分子上可与例如抗体或受体结合的最简单形式或最小结构区域。表位可以是线性的或构象的/结构的。术语“线性表位”被定义为由在氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基组成的表位。术语“构象或结构表位”定义为由并非全部连续的氨基酸残基组成的表位，并且因此表示氨基酸的线性序列的分开的部分，它们通过分子折叠而彼此靠近(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于三维结构。因此，术语“构象”经常与“结构”互换使用。

本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中氨基酸修饰的实例是取代。本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用另一氨基酸代替蛋白质序列中给定位置处的氨基酸。例如，取代Y50W是指亲本多肽的变体，其中第50位的酪氨酸被色氨酸代替。多肽的“变体”是指具有与参考多肽(通常为天然或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体可以在天然氨基酸序列内的某些位置上具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

“保守性”氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似物理化学性质的侧链的氨基酸残基代替的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中是已知的，并且包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

术语“同一性”或“相同的”当在两种或更多种多肽的序列之间的关系中使用时是指多肽之间的序列相关性程度，如由两个或更多个氨基酸残基串之间的匹配数所确定。“同一性”测量两个或更多个序列中较小者与特定数学模型或计算机程序(即“算法”)所寻址的空位比对(如果有的话)之间的相同匹配百分比。相关多肽的同一性可以通过已知方法容易地计算出来。这样的方法包括但不限于以下中所述者：《计算分子生物学(ComputationalMolecular Biology)》,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988；《生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)》,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；《序列数据的计算机分析(Computer Analysisof Sequence Data)》,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,NewJersey,1994；《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)》,von Heinje,G.,Academic Press,1987；《序列分析入门(Sequence Analysis Primer)》,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo等,《SIAM应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)》,48,1073(1988)。

用于确定同一性的优选方法被设计为在所测试的序列之间给出最大的匹配。在公众可用的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等,《核酸研究(Nucl.Acid.Res.)》,12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,215,403-410(1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST手册,Altschul等,NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等,同上)公开获得。众所周知的SmithWaterman算法也可以用来确定同一性。

“分离的”分子是作为关于其所属分子类别所存在的组合物中的主要物质的分子(即它构成组合物中的分子类型的至少约50％，并且通常将构成组合物中的分子(例如肽)物质的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。通常，对于在组合物中所有存在的肽物质的情形下的多肽或至少关于在预期用途情形下的基本上活性肽物质，多肽组合物将显示98％、98％或99％同源性。

在本文中，除非上下文相矛盾，否则“治疗”是指预防、减轻、管理、治愈或降低疾病或病症的一种或多种症状或临床相关表现。例如，已经鉴定出没有疾病或病症的症状或临床相关表现的患者的“治疗”是防止性或预防性治疗，而已经鉴定出具有疾病或病症的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成防止性或预防性治疗。

如本文所用，“NK细胞”是指参与非常规免疫的淋巴细胞的亚群。NK细胞可以通过某些特征和生物学特性来鉴定，特别是人类NK细胞对于表面抗原NKp46(NK细胞特异性)和/或CD56的表达，细胞表面上不存在α/β或γ/δTCR复合物，能够结合并杀死不能通过特异性细胞溶解机制激活来表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死表达NK激活受体的配体的肿瘤细胞或其它患病细胞，并且能够释放刺激或抑制免疫反应的蛋白质分子(称为细胞因子)。使用本领域众所周知的方法，任何这些特征和活性都可以用于鉴定NK细胞。术语NK细胞也将涵盖NK细胞的任何亚群。在本文中，“活性”NK细胞表示生物学活性NK细胞，包括能够溶解靶细胞或增强其它细胞的免疫功能的NK细胞。NK细胞可以通过本领域已知的各种技术获得，例如从血液样本、细胞单采(cytapheresis)、组织或细胞收集物等中分离。可用于涉及NK细胞的测定法的方案可见于《自然杀手细胞方案(Natural Killer CellsProtocols)》,(由Campbell KS和Colonna M编辑).Human Press.第219-238页(2000)。

“NKp46”是指由Ncr1基因或由该基因制备的cDNA编码的蛋白质或多肽。术语NKp46多肽涵盖任何天然存在的同功异型物、等位基因或变体(例如，与SEQ ID NO 1具有90％、95％、98％或99％同一性的NKp46多肽或其至少20、30、50、100或200个氨基酸残基的连续序列)。人类NKp46(同功异型物a)的304氨基酸残基序列如下所示：

KRTRERASRA STWEGRRRLN TQTL(SEQ ID NO:1)。SEQ ID NO:1对应于NCBI登录号NP_004820，其公开内容通过引用并入本文。人类NKp46mRNA序列描述于NCBI登录号NM_004829中，其公开内容通过引用并入本文。

如本文所用，术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可互换使用，并且是指由癌细胞差异表达的抗原，从而可被利用以靶向癌细胞。癌抗原是可能潜在地明显刺激肿瘤特异性免疫反应的抗原。这些抗原中的一些被正常细胞编码，但不一定被正常细胞表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的那些抗原，仅在分化的某些阶段表达的那些抗原和短暂表达的那些抗原如胚胎抗原和胎儿抗原。其它癌抗原由突变细胞基因如致癌基因(例如激活的ras致癌基因)、抑制基因(例如突变型p53)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。还有其它癌抗原可由病毒基因如在RNA和DNA肿瘤病毒上携带的病毒基因编码。癌抗原通常是正常的细胞表面抗原，它们以异常次数过表达或表达。理想情况下，靶抗原仅在增殖性细胞(例如肿瘤细胞)上表达，但是在实际上很少观察到。因此，通常根据增殖组织和健康组织之间的差异表达来选择靶抗原。已经产生靶向特异性肿瘤相关抗原的抗体，包括：受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Cripto、CD4、CD20、CD30、CD19、CD38、CD47、糖蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、CD22(Siglec2)、CD33(Siglec3)、CD79、CD138、CD171、PSCA、L1-CAM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、CD52、CD56、CD80、CD70、E-选择蛋白、EphB2、黑素转铁蛋白、Mud6和TMEFF2。癌抗原的实例还包括B7-H3，B7-H4，B7-H6，PD-L1，MAGE，MART-1/Melan-A，gp100，腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)，亲环蛋白b，结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733，杀手Ig样受体3DL2(KIR3DL2)，蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，受体蛋白酪氨酸激酶3(TYRO-3)，连接蛋白(例如连接蛋白4)，癌胚抗原(CEA)和其免疫原性表位CAP-1和CAP-2，etv6，aml1，前列腺特异性抗原(PSA)，T细胞受体/CD3-ζ链，MAGE-肿瘤抗原家族，GAGE-肿瘤抗原家族，抗缪勒氏II型受体，δ样配体4(DLL4)，DR5，BAGE，RAGE，LAGE-1，NAG，GnT-V，MUM-1，CDK4，MUC家族，VEGF，VEGF受体，血管生成素-2，PDGF，TGF-α，EGF，EGF受体，人类EGF样受体家族成员如HER-2/neu、HER-3、HER-4或包含至少一个HER亚基的异二聚体受体，胃泌素释放肽受体抗原，Muc-1，CA125，αvβ3整联蛋白，α5β1整联蛋白，αIIbβ3整联蛋白，PDGFβ受体，SVE-钙粘蛋白，IL-8，hCG，IL-6，IL-6受体，IL-15，甲胎蛋白，E-钙粘蛋白，α-连锁蛋白，β-连锁蛋白和γ-连锁蛋白，p120ctn，PRAME，NY-ESO-1，cdc27，腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)，胞衬蛋白(fodrin)，连接蛋白37，Ig-独特型，p15，gp75，GM2和GD2神经节苷脂，病毒产品如人类乳头状瘤病毒蛋白，imp-1，P1A，EBV编码的核抗原(EBNA)-1，脑糖原磷酸酶，SSX-1，SSX-2(HOM-MEL-40)，SSX-1，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7，以及c-erbB-2，但这并非旨在是详尽的。

制造抗NKp46抗体

本发明的抗体与NKp46多肽(例如人类细胞表面上的NKp46多肽)特异性结合，特别是在福尔马林固定样本如石蜡包埋组织切片中。所述抗体特异性结合石蜡包埋组织切片中的NKp46多肽的能力使其可用于众多应用，特别是用于检测NK细胞以及NK细胞和/或NKp46表达的水平或分布，以用于诊断或治疗目的，如本文所述。在某些优选的实施方案中，所述抗体用于确定取自患者的样本(例如活组织检查)中的肿瘤组织内或附近的NK细胞的存在或水平，并且如果在组织样本中检测到NKp46，则确定存在NK细胞。

所述抗体与NKp46结合的检测可以用许多方法中的任何一种进行。例如，所述抗体可以用以下直接标记：可检测部分，例如发光化合物如荧光部分，或放射性化合物，金，生物素(其允许后续的扩增的与抗生物素蛋白的结合，例如抗生物素蛋白-AP)，或酶如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。可选地并且优选地，所述抗体与样本中的人类NKp46的结合通过使用与初级抗NKp46抗体结合并且自身优选用酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的二级抗体来评估；然而，应理解，可以使用任何合适的方法来标记或检测二级抗体。在一个优选的实施方案中，使用扩增系统来增强由二级抗体提供的信号，例如EnVision系统，其中二级抗体与结合于可检测化合物或酶如HRP或AP的许多拷贝的聚合物(例如葡聚糖)结合(参见例如Wiedorn等,(2001)《组织化学与细胞化学杂志(The Journalof Histochemistry&Cytochemistry)》,第49(9)卷:1067-1071；等,(2001)《组织化学与细胞化学杂志(Journal of Histochemistry and Cytochemistry)》,第49卷,623-630；其全部公开内容通过引用并入本文)。

在一个有利的方面，本发明提供了与单克隆抗体8E5B竞争并且对于NKp46分子上与单克隆抗体8E5B大体上或基本上相同或者相同的表位或“表位位点”进行识别、结合或具有免疫特异性的抗体。在其它实施方案中，所述单克隆抗体由抗体8E5B组成，或者是抗体8E5B的衍生物或片段。

应理解，虽然优选的抗体与抗体8E5B结合相同的表位，但是本发明的抗体可以识别NKp46多肽的任何部分并且针对其而产生。例如，可以使用NKp46的任何片段，优选但非排他地人类NKp46或NKp46片段的任何组合作为免疫原来产生抗体，并且本发明的抗体可以识别NKp46多肽内的任何位置处的表位，只要它们可在如本文所述的石蜡包埋切片上这样做即可。优选地，所识别的表位存在于细胞表面上，即它们可被存在于细胞外的抗体接近。最优选地，表位是抗体8E5B特异性识别的表位。此外，识别NKp46内不同表位的抗体可以组合使用，例如在不同的个体中或在不同的组织样本中以最大的功效和广度与NKp46多肽结合。

本发明的抗体可通过本领域已知的各种技术产生。通常，它们通过用包含NKp46多肽，优选人类NKp46多肽的免疫原使非人类动物，优选小鼠免疫而产生。所述NKp46多肽可包含人类NKp46多肽的全长序列，或其片段或衍生物，通常是免疫原性片段，即包含暴露于表达NKp46多肽的细胞表面上的表位，优选由8E5B抗体识别的表位的多肽的一部分。这些片段通常含有成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选至少约10个其连续氨基酸。片段通常基本上来源于受体的细胞外结构域。在一个优选的实施方案中，免疫原在脂质膜中，通常在细胞表面上，包含野生型人类NKp46多肽。在一个具体的实施方案中，免疫原包含完整的细胞，特别是完整的人类细胞，任选地被处理或溶解。在另一个优选的实施方案中，所述多肽是重组NKp46多肽。

用抗原使非人类哺乳动物免疫的步骤可以本领域众所周知的用于刺激小鼠中抗体产生的任何方式进行(参见例如E.Harlow和D.Lane,《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual.)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1988)，其全部公开内容通过引用并入本文)。将免疫原悬浮或溶解在任选含有佐剂如完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂的缓冲液中。用于确定免疫原量、缓冲液类型和佐剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并且不以任何方式对本发明进行限制。这些参数对于不同的免疫原可能是不同的，但很容易阐明。

类似地，足以刺激抗体产生的免疫的位置和频率在本领域中也是众所周知的。在典型的免疫方案中，非人类动物在第1天经腹膜内注射抗原，约一周后再次注射抗原。接下来在大约第20天恢复注射抗原，任选地使用佐剂如不完全弗氏佐剂。恢复注射是经静脉内进行的，并且可以连续几天重复。随后在第40天通过静脉内或腹膜内加强注射，通常不使用佐剂。该方案导致在约40天后产生抗原特异性抗体产生B细胞。也可以使用其它方案，只要它们导致产生表达针对免疫所用抗原的抗体的B细胞即可。

对于多克隆抗体制备，从经过免疫的非人类动物获得血清，并且通过众所周知的技术分离其中存在的抗体。可使用与固体支撑物连接的任何上述免疫原对血清进行亲和纯化，以获得与NKp46多肽反应的抗体。

在一个替代实施方案中，将来自非免疫非人类哺乳动物的淋巴细胞分离，在体外生长，然后在细胞培养中暴露于免疫原。然后收集淋巴细胞并进行下述融合步骤。

可以从免疫的非人类哺乳动物中分离脾细胞，随后将这些脾细胞与永生化细胞融合以形成抗体生产杂交瘤。从非人类哺乳动物中分离脾细胞是本领域众所周知的，并且通常涉及从麻醉的非人类哺乳动物中取出脾脏，将其切成小片，并通过细胞过滤器的尼龙网从脾囊中挤压脾细胞进入适当的缓冲液以产生单细胞悬液。将细胞洗涤，离心并重悬在溶解任何红血细胞的缓冲液中。将溶液再次离心并将团块中的剩余淋巴细胞最终重悬在新鲜缓冲液中。

一旦分离并存在于单细胞悬液中，淋巴细胞可以与永生细胞系融合。这通常是小鼠骨髓瘤细胞系，但是可用于产生杂交瘤的许多其它永生细胞系在本领域中是已知的。优选的鼠类骨髓瘤细胞系包括但不限于来自以下的那些：从美国圣地亚哥Salk研究所细胞分布中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,U.S.A.)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，从美国马里兰州罗克维尔市的美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection,Rockville,Maryland U.S.A.)获得的X63Ag8653和SP-2细胞。使用聚乙二醇等实现融合。然后使所得到的杂交瘤在含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的选择性培养基中生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。

杂交瘤通常在巨噬细胞的饲养层上生长。巨噬细胞优选来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝出生仔畜，并且在将杂交瘤铺板之前数天通常用不完全弗氏佐剂等进行引发。Goding在“单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles andPractice)”,第59-103页(Academic Press,1986)中描述了融合方法，其公开内容通过引用并入本文。

使细胞在选择培养基中生长足够的时间以用于集落形成和抗体产生。这通常在约7与约14天之间。

然后对杂交瘤集落测定特异性结合NKp46多肽，优选由抗体8E5B特异性识别的表位的抗体的产生。该测定法通常是比色ELISA型测定法，但是可使用任何可以适合杂交瘤生长的孔的测定法。其它测定法包括放射免疫测定法或荧光激活细胞分选。检查对于所需抗体产生呈阳性的孔以确定是否存在一个或多个不同的集落。如果存在多于一个的集落，则细胞可以被重新克隆并生长以确保只有一个细胞产生了产生所需抗体的集落。通常，抗体也将被测试与石蜡包埋组织切片或细胞团块中的NKp46多肽结合的能力(参见实施例)。不能天然表达NKp46的细胞可变得表达人类NKp46(例如通过用表达人类NKp46的核酸转染)，制备成细胞团块，福尔马林固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，并转移到载玻片上。可以使用不表达NKp46的对照细胞(例如与上述相同但未用NKp46转染的细胞)作为阴性对照。

确认产生本发明单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基如DMEM或RPMI-1640中大量生长。可选地，杂交瘤细胞可以在动物中以腹水肿瘤的形式体内生长。在充分生长以产生所需的单克隆抗体之后，将含有单克隆抗体(或腹水)的生长培养基与细胞分离，并且纯化其中存在的单克隆抗体。典型地通过凝胶电泳，透析，使用蛋白A或蛋白G-Sepharose的色谱法，或与固体支撑物如琼脂糖或Sepharose珠粒连接的抗小鼠Ig来实现纯化(全部描述于例如《抗体纯化手册(Antibody Purification Handbook)》,Biosciences,出版号18-1037-46,AC版，其公开内容通过引用并入本文)。通常通过使用低pH缓冲液(pH 3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白A/蛋白G柱中洗脱结合的抗体，并且立即中和含有抗体的洗脱份。将这些洗脱份汇集，透析并根据需要浓缩。

通常重复克隆具有单一表观集落的阳性孔，并重新测定以确保仅检测和产生一种单克隆抗体。

抗体也可以通过选择免疫球蛋白的组合文库产生，如例如(Ward等,《自然(Nature)》,341(1989),第544页，其全部公开内容通过引用并入本文)中所公开。

对于一种或多种与NKp46结合的抗体，特别是与单克隆抗体8E5B结合大体上或基本上相同表位的抗体的鉴定，可以使用多种免疫学筛选测定法中的任何一种容易地确定，其中抗体竞争可以根据实施例中描述的方法或任何其它合适的方法来评估。应理解，实际上确定本文所述抗体所结合的表位对于鉴定与本文所述的单克隆抗体结合相同或基本上相同表位的抗体而言无论如何是不需要的。

例如，当待检查的测试抗体获自不同来源动物，或者甚至是不同的Ig同种型时，可以采用简单的竞争测定法，其中将对照(例如8E5B)和测试抗体混合(或预先吸附)并应用于含有NKp46多肽的样本。基于蛋白质印迹和使用BIACORE分析的方案可用于这种简单的竞争研究。

在某些实施方案中，在施用至NKp46抗原样本之前，将对照抗体(例如8E5B)与不同量的测试抗体(例如约1:10或约1:100)预混合一段时间。在其它实施方案中，在暴露于NKp46抗原样本期间，可以将对照和不同量的测试抗体简单地混合。只要能够区分结合抗体与游离抗体(例如，通过使用分离或洗涤技术来消除未结合的抗体)和区分8E5B与测试抗体(例如通过使用物种特异性或同种型特异性二级抗体或通过用可检测标记来特异性标记8E5B)，可以确定测试抗体是否降低8E5B与抗原的结合，这表明测试抗体与8E5B识别基本上相同的表位。(被标记的)对照抗体在不存在完全不相关抗体的情况下的结合可以用作对照高值。通过将被标记的(8E5B)抗体与具有完全相同类型(8E5B)的未被标记的抗体一起温育，可以获得对照低值，其中会发生竞争并降低被标记抗体的结合。在测试测定法中，在测试抗体存在下被标记抗体反应性的显著降低指示识别基本上相同表位的测试抗体，即与被标记(8E5B)抗体“交叉反应”的测试抗体。在8E5B:测试抗体为约1:10至约1:100的任何比率下，将8E5B与NKp46抗原的结合减少至少约50％、例如至少约60％、或更优选至少约70％(例如约65-100％)的任何测试抗体被认为是与8E5B结合基本上相同表位或决定簇的抗体。优选地，这样的测试抗体将使得8E5B与NKp46抗原的结合减少至少约90％(例如约95％)。

也可以通过例如流式细胞术测试来评估竞争。在这种测试中，例如可以首先将携带给定的NKp46多肽的细胞与8E5B一起温育，然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体一起温育。如果与饱和量的8E5B预温育后获得的结合是通过未用8E5B预温育下的抗体获得的结合(如通过荧光平均值所测量)的约80％，优选约50％，约40％或更少(例如约30％)，则所述抗体被称为与8E5B竞争。可选地，如果用饱和量的测试抗体预温育的细胞上被标记的8E5B抗体(通过荧光染料或生物素)获得的结合是未用所述抗体预温育下获得的结合的约80％，优选约50％，约40％或更少(例如约30％)，则所述抗体被称为与8E5B竞争。

也可使用一种简单的竞争测定法，其中测试抗体被预吸附，并以饱和浓度应用于其上固定有NKp46抗原的表面。所述简单竞争测定法中的表面优选是BIACORE芯片(或适用于表面等离子体共振分析的其它介质)。然后使对照抗体(例如8E5B)以NKp46饱和浓度与表面接触，并测量NKp46和对照抗体的表面结合。将对照抗体的这种结合与不存在测试抗体时对照抗体与含NKp46表面的结合相比较。在测试测定法中，在测试抗体存在下对照抗体结合含NKp46表面的显著降低表明测试抗体识别与对照抗体基本上相同的表位，使得测试抗体与对照抗体“交叉反应”。任何将对照(例如8E5B)抗体与NKp46抗原的结合降低至少约30％或更多、优选约40％的测试抗体，可以被认为是与对照(例如8E5B)结合基本上相同的表位或决定簇的抗体。优选地，这样的测试抗体将使对照抗体(例如8E5B)与NKp46抗原的结合减少至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％或更多)。应理解，对照抗体和测试抗体的顺序可以颠倒：也就是说，可以首先将对照抗体结合到表面，然后在竞争测定法中使测试抗体与表面接触。优选地，对NKp46抗原具有较高亲和力的抗体首先与表面结合，因为预期对于第二抗体(假设所述抗体具交叉反应性)所见的结合减少将具有更大的量值。这些测定法的其它实例提供于例如Saunal H.等,(1995)《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,183:33-41中，其公开内容通过引用并入本文。

优选地，识别NKp46表位的单克隆抗体将会与存在于所有NK细胞上(包括CD56^暗和CD56^亮NK细胞上)的表位反应，但不会与非NK细胞(例如，免疫或非免疫细胞、粒细胞、单核细胞、B细胞、T细胞等)显著反应。

在一个实施方案中，本发明的抗体在免疫测定法中验证以测试其结合NKp46表达细胞的能力。优选地，通过评估抗体在石蜡包埋组织切片中对NKp46表达细胞染色的能力进行验证。例如，扁桃体组织样本取自多个患者，然后使用本领域技术人员熟知的标准方法评估给定抗体对组织内的细胞进行染色的能力。为了评估抗体与细胞的结合，可以对抗体直接或间接标记。当间接标记时，通常添加被标记的二级抗体。这样的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且在本文其它地方进一步描述。

尽管为了举例说明而在8E5B的情形下进行了描述，但是应理解，本文所述的免疫学筛选测定法和其它测定法也可用于鉴定与其它抗NKp46抗体竞争的抗体，只要它们也结合于石蜡包埋组织样本中的NKp46即可。

可以本领域技术人员已知的方式来确定抗体是否结合在上文所定义的表位区之一中。作为这样的映射/表征方法的一个实例，抗NKp46抗体的表位区可以通过使用NKp46蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰的表位“足迹”来确定。这种足迹技术的一个具体实例是使用HXMS(通过质谱法检测的氢-氘交换)，其中受体和配体蛋白的酰胺质子发生氢/氘交换，结合，并反向交换，其中参与蛋白质结合的骨架酰胺基被保护免于反向交换，因此将保持氘代。这里通过消化蛋白酶解，快速微孔高效液相色谱分离和/或电喷雾电离质谱法可以鉴定相关区域。合适的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振(NMR)表位定位，其中通常比较游离抗原和与抗原结合肽(例如抗体)复合的抗原的二维NMR谱中的信号位置。抗原通常用15N选择性同位素标记，因此在NMR谱中只能看到对应于抗原的信号，而无来自抗原结合肽的信号。涉及与抗原结合肽相互作用的源自氨基酸的抗原信号典型地将在复合物的光谱中相对于游离抗原的光谱位移，并且可以这种方式鉴定参与结合的氨基酸。

表位定位/表征也可以使用质谱方法进行。蛋白酶消化技术也可用于表位定位和鉴定的情形。抗原决定簇相关区域/序列可以通过蛋白酶消化来确定，例如，通过使用比率为约1:50的胰蛋白酶与NKp46或在pH 7-8下消化过夜，然后进行肽鉴定的质谱(MS)分析。随后可以通过比较经受胰蛋白酶消化的样本和与抗体一起温育并且然后经受例如胰蛋白酶消化(从而显示粘合剂足迹)的样本来鉴定通过抗NKp46粘合剂保护免于胰蛋白酶裂解的肽。其它酶如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等同样或可选地可以用于类似的表位表征方法中。此外，酶促消化可以为分析潜在的抗原决定簇序列是否在未表面暴露的NKp46多肽的区域内提供快速的方法，因此在免疫原性/抗原性方面最可能不相关。

在脊椎动物或细胞中免疫和产生抗体后，可以进行特定的选择步骤以分离所要求保护的抗体。就此而言，在一个特定实施方案中，本发明还涉及生产这种抗体的方法，其包括：(a)提供抗体文库和/或用包含NKp46多肽的免疫原使非人类哺乳动物免疫并从所述免疫动物制备抗体；和(b)从来自步骤(a)的抗体中选择能够结合石蜡包埋细胞团块(例如FFPE细胞团块)中的所述NKp46多肽的抗体。在一个实施方案中，所述方法还包括步骤(d)：从来自(a)的抗体中选择能够与抗体8E5B竞争结合NKp46的抗体。

根据一个替代实施方案，从本发明杂交瘤中分离编码结合存在于NKp46多肽上的表位的抗体的DNA并置于适当的表达载体中以用于转染到适当宿主中。然后将所述宿主用于重组产生抗体或其变体，例如所述单克隆抗体的人源化形式，抗体的活性片段，包含抗体的抗原识别部分的嵌合抗体，或包含可检测部分的形式。

编码本发明的单克隆抗体(例如抗体8E5B)的DNA可以容易地分离并使用常规方法测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，否则不会产生免疫球蛋白，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。如本说明书其它地方所描述的，这种DNA序列可以针对许多目的中的任何一种进行修饰，例如用于人源化抗体，产生片段或衍生物，或用于修饰抗体的序列，例如在抗原结合位点中以优化抗体的结合特异性。

抗体8E5B

在一个方面，所述抗体与FFPE细胞团块中的NK细胞上的NKp46上存在的抗原决定簇结合。在一个方面，所述抗体与FFPE细胞团块中的NK细胞上的NKp46以及在培养NK细胞的细胞表面处表达的NKp46上存在的共同抗原决定簇结合。

在一个方面，所述抗体与抗体8E5B结合基本上相同的表位。在一个实施方案中，所述抗体与NKp46上与抗体8E5B所结合的表位至少部分重叠或包括抗体8E5B所结合的表位中的至少一个残基的表位结合。抗体所结合的残基可以被指定为存在于NKp46多肽的表面上，例如在细胞表面上表达的NKp46多肽中。

可以测量抗NKp46抗体与用NKp46突变体转染的细胞的结合，并且与抗NKp46抗体结合野生型NKp46多肽(例如SEQ ID NO:1)的能力进行比较。抗NKp46抗体和突变NKp46多肽之间的结合降低意味着结合亲和力降低(例如，如通过已知方法测量，例如表达特定突变体的细胞的FACS测试，或通过与突变多肽结合的Biacore测试)和/或抗NKp46抗体的总结合能力降低(例如，如通过抗NKp46抗体浓度相对于多肽浓度的曲线图中的Bmax降低所证明的)。结合的显著降低表明突变的残基直接参与抗NKp46抗体的结合，或者当抗NKp46抗体与NKp46结合时紧邻结合蛋白。

在一些实施方案中，结合的显著降低意味着抗NKp46抗体和突变NKp46多肽之间的结合亲和力和/或能力相对于抗体与野生型NKp46多肽之间的结合降低了大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合降低到可检测限度以下。在一些实施方案中，当抗NKp46抗体与突变NKp46多肽的结合是抗NKp46抗体与野生型NKp46多肽之间所观测到的结合的小于50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。

在一些实施方案中，提供抗NKp46抗体，其对于其中包含由抗体8E5B结合的氨基酸残基的区段中的残基被不同的氨基酸取代的突变NKp46多肽显示出显著较低的结合。

抗体8E5B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一个具体实施方案中，本发明提供了与单克隆抗体8E5B结合基本上相同表位或决定簇的抗体；任选地所述抗体包含抗体8E5B的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体8E5B可以由编码其的氨基酸序列和/或核酸序列来表征。在一个实施方案中，单克隆抗体包含8E5B的Fab或F(ab')₂部分。还提供了包含8E5B的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含8E5B的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，其进一步包含8E5B的可变轻链可变区或者8E5B的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可含有一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体8E5B的部分或全部抗原结合区的任何轻链和/或重链可变区与人类IgG类型的免疫球蛋白恒定区，任选地人类恒定区，任选地人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型融合，任选地还包含氨基酸取代以降低效应功能(与人类Fcγ受体结合)。

在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体包含：8E5B的HCDR1区域，其包含如表A-1所示的氨基酸序列，或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可被另一种氨基酸取代；8E5B的HCDR2区域，其包含如表A-1所示的氨基酸序列，或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可被另一种氨基酸取代；8E5B的HCDR3区域，其包含如表A-1所示的氨基酸序列，或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可被另一种氨基酸取代；8E5B的LCDR1区域，其包含如表A-2所示的氨基酸序列，或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可被另一种氨基酸取代；8E5B的LCDR2区域，其包含如表A-2所示的氨基酸序列，或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可被另一种氨基酸取代；8E5B的LCDR3区域，其包含如表A-2所示的氨基酸序列，或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可能缺失或可被另一种氨基酸取代。HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可任选地指定为全部(或每个，独立地)是Kabat编号系统的那些(如表A中针对每个CDR所示)，Chotia编号系统的那些(如表A中针对每个CDR所示)，IMGT编号系统的那些(如表A中针对每个CDR所示)，或任何其它合适的编号系统。

指定的可变区和CDR序列可包含序列修饰，例如取代(1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个序列修饰)。在一个实施方案中，重链和轻链的CDR1、2和/或3包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中所取代的残基是人类来源序列中存在的残基。在一个实施方案中，所述取代是保守修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代通常是其中氨基酸残基被具有类似物理化学性质的侧链的氨基酸残基代替的氨基酸取代。指定的可变区和CDR序列可包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代时，优选的取代将是保守修饰。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基代替，并且可以使用本文所述的测定法来测试变异抗体的保留功能(即，本文所述的性质)。

根据IMGT、Kabat和Chothia定义系统，CDR的序列总结在下表A-1和A-2中。下表B列出了根据本发明的抗体的可变区序列(如果存在前导序列，则任何抗体链都可以指定为从紧接前导序列末端之后的氨基酸位置开始)，并且每个CDR加下划线。在本文的任何实施方案中，可以对VL或VH序列指定或编号以包含或缺少信号肽或其任何部分。

表A-1

表A-2

表B

在一个实施方案中，本发明的抗体是保留了本发明抗体的结合和/或功能特性的抗体片段。本发明抗体的片段和衍生物(除非另有说明或与上下文明显相矛盾，否则其被如本申请中所用的术语“抗体”涵盖)，优选地8E5B样抗体，可以通过本领域已知的技术产生。“片段”包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂和Fv片段；双功能抗体；具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列构成的初级结构的多肽的任何抗体片段(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于：(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或其含有轻链可变结构域的三个CDR而没有相关联的重链部分的片段，和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或其含有重链可变区的三个CDR而没有相关联的轻链部分的片段；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

FFPE样本的制备和染色

本发明抗体具有能够有效和特异性结合固定组织或细胞样本中存在的NKp46多肽的特定性质。制备和使用这种组织制剂的各种方法在本领域中是众所周知的，并且可以使用任何合适的制备方法或类型。所述抗体还能够结合由培养物以及冷冻组织切片和重组NKp46多肽(例如作为可溶性多肽、NKp46-His或NKp46-Fc多肽)中的细胞(例如NK细胞)所表达的NKp46。

FFPE材料通常是一个组织。FFPE组织是首先通过解剖或活组织检查从样本动物(例如人类患者)分离的一片组织。然后，将该组织固定以防止其衰变或退化并允许人们在显微镜下清楚地检查以用于组织学、病理学或细胞学研究。固定是组织被固定化，杀死和保存以便在显微镜下染色和观察的过程。固定后处理使得组织可渗透染色试剂并交联其大分子，使其稳定并锁定在适当位置。然后将该固定组织包埋在蜡中以使其被切成薄切片并用苏木精和伊红染色剂染色。之后，通过切成精细切片来进行显微切片以在显微镜下研究抗体染色。

应理解，例如，本发明抗体可以与任何固定的细胞或组织制剂一起使用，并且它们不受所使用的特定固定或包埋方法的限制。例如，虽然最常见的基于甲醛的固定程序涉及福尔马林(例如10％)，但是替代方法如多聚甲醛(PFA)、Bouin溶液(福尔马林/苦味酸)、酒精、锌基溶液(举例而言，参见例如Lykidis等,(2007)《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》,2007,1-10，其全部公开内容整体并入本文)和其它(参见例如HOPE方法,《病理学研究和实践(Pathology Research and Practice)》,第197卷,第12期,2001年12月,第823-826(4)页，其全部公开内容通过引用并入本文)。类似地，虽然石蜡是优选的，但是也可以使用其它材料来包埋，例如聚酯蜡，基于聚乙二醇的配方，甲基丙烯酸乙二醇酯，JB-4塑料等。关于制备和使用组织制剂的方法的综述，参见例如Gillespie等,(2002)《美国病理学杂志(Am J Pathol.)》,2002年2月；160(2):449-457；Fischer等,《冷泉港实验室实验方案(CSH Protocols)》；2008；Renshaw(2007),《免疫组织化学：明确方法系列(Immunohistochemistry:Methods Express Series)；Bancroft(2007),《组织学技术的理论与实践(Theory and Practice of Histological Techniques)》；和PCT专利申请no.WO06074392；其全部公开内容通过引用并入本文)。

在本发明的一个实施方案中，所述FFPE组织是肿瘤组织，例如人类肿瘤组织。所述肿瘤特别选自鳞状上皮、膀胱、胃、肾脏、头、颈、结肠、食道、子宫颈、甲状腺、肠、肝脏、脑、前列腺、泌尿生殖道、淋巴系统、胃、喉和/或肺的肿瘤。所述肿瘤还特别选自肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结肠癌和乳腺癌。另外，优选血液和免疫系统的肿瘤，更特别是选自外周T细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病和/或慢性淋巴细胞性白血病的肿瘤。在本发明的意义上，这样的肿瘤也可以被称为癌症。

将抗NKp46抗体与FFPE材料一起温育以用于NK细胞检测。术语温育步骤涉及将FFPE材料与本发明抗体接触不同时期，这取决于材料、抗体和/或抗原的种类。温育过程还取决于各种其它参数，例如检测灵敏度，该优化遵循本领域技术人员已知的常规程序。添加化学溶液和/或应用物理程序，例如热量的影响，可以提高样本中目标结构的可达性。温育结果形成特定的温育产物。

适用于检测所形成的抗体/抗原复合物的测试是本领域技术人员已知的，或者可以容易地设计为常规问题。许多不同类型的测定法是已知的，其实例在下面阐述。尽管所述测定法可以是适合于使用抗NKp46mAb结合来检测和/或定量NKp46表达的任何测定法，但后者优选通过与初级抗NKp46抗体特异性相互作用的物质来确定。

因此，例如，待检查的样本(组织或细胞)通过活组织检查从生物体液、肿瘤组织(例如乳房肿瘤、黑素瘤)或健康组织获得，并且切片(例如，3mm厚或更小厚度)并使用福尔马林或等同固定方法固定(见上文)。固定时间取决于应用，但范围可以从几个小时到24小时或更长时间。在固定之后，将组织包埋在石蜡(或等同材料)中，并且在切片机中切成非常薄的切片(例如5微米)，然后安装到优选涂覆的载玻片上。然后将载玻片干燥，例如风干。

在载玻片上的固定和包埋组织切片可以被无限期地干燥和储存。对于免疫组织化学，将载玻片脱蜡，然后再水化。例如，最初用二甲苯，然后用二甲苯和乙醇，然后用降低百分比的乙醇水溶液进行一系列洗涤。

在抗体染色之前，可以对组织进行抗原回收步骤(例如酶促或基于加热)，以便破坏在固定期间形成并且可以掩蔽表位的甲烷桥。在一个优选的实施方案中，使用沸腾的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中的处理。

一旦载玻片重新水合并且抗原回收理想地进行，它们可以与初级抗体一起温育。首先，用例如TBS洗涤载玻片，然后在利用例如血清/BSA的阻断步骤之后，可以施用抗体。抗体的浓度将取决于其形式(例如纯化的)、其亲和力、所用的组织样本，但合适的浓度是例如1-10μg/ml。在一个实施方案中，使用的浓度是10μg/ml。温育时间也可能改变，但过夜温育通常是合适的。在例如TBS中进行抗体后洗涤步骤后，然后处理载玻片以检测抗体结合。

所使用的检测方法将取决于所使用的抗体、组织等，并且可以例如包括检测与初级抗体缀合的发光或其它可见或可检测部分，或通过使用可检测的二级抗体。抗体检测方法在本领域中是众所周知的，并且教导于例如Harlow等,《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第1版(1988年12月1日)；Fischer等,《冷泉港实验室实验方案(CSH Protocols)》；2008；Renshaw(2007),《免疫组织化学：明确方法系列(Immunohistochemistry:Methods Express Series)；Bancroft(2007)《组织学技术的理论与实践(Theory and Practice of Histological Techniques)》；PCT专利公开no.WO06074392；其中每一个的全部公开内容整体并入本文。

许多直接或间接的检测方法是已知的，并且可能适合使用。直接标记包括附着到抗体上的荧光或发光标签，金属，染料，放射性核素等。可以使用碘-125(¹²⁵I)标记的抗体。使用蛋白质特异性化学发光抗体的化学发光测定法适用于蛋白质水平的敏感的非放射性检测。用荧光染料标记的抗体也是合适的。荧光染料的实例包括但不限于DAPI、荧光素、Hoechst 33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。

间接标记包括本领域众所周知的各种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿素酶等。抗NKp46抗体与酶的共价连接可以通过不同的方法进行，例如与戊二醛的偶联。酶和抗体都通过游离氨基与戊二醛相互连接，并且除去网状酶和抗体的副产物。在另一个方法中，如果酶是糖蛋白，例如过氧化物酶，则其通过糖残基与抗体偶联。所述酶被高碘酸钠氧化并且与抗体的氨基直接相连。其它含酶的碳水化合物也可以以这种方式与抗体偶联。酶偶联也可以通过使用异双功能连接子如6-(N-马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯将抗体的氨基与酶如β-半乳糖苷酶的游离硫醇基团相互连接来进行。辣根过氧化物酶检测系统可以用于例如显色底物四甲基联苯胺(TMB)，其在450nm下可检测的过氧化氢存在下产生可溶性产物。碱性磷酸酶检测系统可以用于例如显色底物磷酸对硝基苯酯，其产生在405nm下容易检测的可溶性产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可以用于显色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，其产生在410nm下可检测的可溶性产物。脲酶检测系统可以用于底物如尿素-溴甲酚紫。

在一个实施方案中，通过结合被标记的二级抗体，优选与诸如HRP或AP的酶共价连接的二级抗体，检测初级抗体的结合。在一个特别优选的实施方案中，通过使用用于扩增抗体检测的多种方法中的任何一种来扩增由二级抗体结合产生的信号。例如，可以使用EnVision方法(参见例如美国专利no.5,543,332和欧洲专利no.594,772；等,(2001)《组织化学和细胞化学杂志(Journal of Histochemistry and Cytochemistry)》,第49卷,623-630；Wiedorn等,(2001)《组织化学和细胞化学杂志(The Journal ofHistochemistry&Cytochemistry)》,第49(9)卷:1067-1071；其全部公开内容通过引用并入本文)，其中二级抗体与自身连接到AP或HRP的许多拷贝的聚合物(例如葡聚糖)连接。

组合物和在诊断、预后和治疗中的用途

如本文所证明的，本发明的抗体在检测生物样本中的NK细胞方面特别有效，所述生物样本包括但不限于制备为FFPE并且对不表达NKp46多肽的组织或细胞没有非特异性染色的那些。因此，所述抗体在其中NK细胞的检测和/或定位感兴趣的病理学的研究、评估、诊断、预后和/或预测中具有优势。例如，有研究报道在肿瘤或肿瘤邻近组织以浸润NK细胞为特征的患者中预后良好。

例如，可以使用本文公开的抗体来表征或评估患者的癌症，以评估NK细胞是否已经浸润肿瘤，包括NK细胞是否存在于肿瘤外部或肿瘤周边。在患有自身免疫性或炎症性疾病的患者中，可以使用本文公开的抗体来表征或评估来自炎症部位(例如滑液)的生物样本，以评估NK细胞是否存在于炎症部位，包括NK细胞是否存在于感兴趣的其它组织中的炎症部位之外，例如在炎症部位周边。所述方法可用于确定患者是否具有以可能适合通过治疗剂调节的NK细胞为特征的病变，所述治疗剂例如通过作用于T细胞、免疫抑制性免疫细胞或其它可以调节NK细胞活性的细胞，例如通过产生可调节NK细胞活性的细胞因子或其它信号分子，而直接作用于NK细胞或者间接作用于NK细胞。所述方法可用于确定患者是否具有可能适合通过治疗剂调节的病变，所述治疗剂例如通过作用于NK细胞以间接调节病变中所涉及的细胞活性，例如通过产生细胞因子或其它信号分子，而作用于炎症部位附近或其中的NK细胞。本文所述的方法还可以任选地包括：如果其确定个体具有可能适合通过作用于炎症部位附近或其中的NK细胞的治疗剂来调节的病变，则向所述个体施用这种治疗剂。

本文所述的抗体可以用于检测，优选体外检测NK细胞的存在，任选地其中涉及NK细胞的病变(例如，具有改善例如在癌症、感染、炎症性或自身免疫性病症中加剧疾病的作用的疾病的有益作用)。这样的方法通常将涉及使来自患者的生物样本(例如脱蜡FFPE样本)与根据本发明的抗体接触，并检测由所述抗体与生物样本之间的免疫学反应产生的免疫复合物的形成。可以通过标记根据本发明的抗体直接检测复合物，或通过加入显示根据本发明抗体存在的分子(二级抗体、抗生蛋白链菌素/生物素标签等)间接检测复合物。例如，可以通过将抗体与放射性或荧光标签偶联来实现标记。这些方法是本领域技术人员众所周知的。因此，本发明还涉及根据本发明的抗体用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物可用于检测NKp46表达细胞(即NK细胞)的存在，任选地用于检测其中存在NKp46表达细胞(即NK细胞)的病变的存在，任选地用于在体内或体外表征癌症或其它病变。

在一些实施方案中，本发明的抗体将用于预测癌症进展。癌症预后，即癌症或癌症进展的预后包括提供对以下任何一项或多项的预报或预测(预后)：对癌症易感或被诊断患有癌症的受试者的存活持续时间，无复发存活的持续时间，易感或诊断患有癌症的受试者的无进展存活的持续时间，对易感或被诊断患有癌症的受试者或受试者群组中的治疗的应答率，和/或在受试者中治疗后的应答持续时间、应答程度或存活率。示例性存活终点包括例如TTP(进展时间)、PFS(无进展存活)、DOR(应答持续时间)和OS(总体存活率)。

本发明的抗体对于确定受试者是否适合用针对NKp46表达细胞的治疗剂(例如可以耗尽NKp46表达细胞的药剂)进行治疗通常也是有用的。例如，WO2007/042573提供了使用抗NKp46抗体消除自身免疫性病症中的细胞的方法；WO2014/125041提供了使用抗NKp46抗体消除外周T细胞淋巴瘤中的细胞的方法。在另一个实施方案中，所述治疗剂是结合或调节(例如激活或抑制)NK细胞上的NKp46多肽从而调节NK细胞活性的抗原结合片段(例如抗体，本发明的抗体)。

有利地，抗NKp46抗体可以用作谱系特异性、成熟独立标志物来检测NK细胞，并且在分析组织样本时与其它标志物(即非NKp46标志物)组合。其它标志物可以包括例如特异性或非特异性鉴定非NK细胞群体的标志物。由NKp46染色赋予的高NK细胞特异性允许将NK细胞与其它细胞群体区分开来，而不管其它标志物是否不具有谱系特异性并且可能能够结合NK细胞以及其它细胞群体。非NK细胞群体的实例包括但不限于任何免疫细胞群体，来源于造血干细胞前体的任何细胞群体，例如骨髓细胞群体(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)，和淋巴谱系(T细胞、B细胞)。其它标志物也可以包括例如特异性或非特异性鉴定任何前述的任何亚群的标志物，例如T_h1或T_h2辅助T细胞，细胞毒性T细胞，抑制性或调节性T细胞，M1和M2巨噬细胞，以及任何前述的肿瘤浸润和/或肿瘤相关群体，例如肿瘤相关巨噬细胞。

可以与NKp46组合使用的其它标志物也包括鉴定NK细胞成熟阶段(即标志物不存在于NK细胞成熟的所有阶段)的任何标志物。可以与NKp46组合使用的标志物可鉴定所需的NK细胞的亚群，例如细胞毒性/粒状NK细胞(例如CD16^暗)、KIR抑制和/或NKG2限制的NK细胞、调节性NK细胞(例如CD16^暗/-)、外周NK细胞、能够浸润组织/肿瘤的NK细胞(例如CD56^亮)、蜕膜NK细胞或记忆NK细胞(NKG2C+和/或其它标志物)。

在一个实施方案中，提供了一种评估组织浸润人类NK细胞在人类个体样本内的成熟状态的体外方法，所述方法包括从个体提供石蜡包埋样本，和使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的NKp46多肽的单克隆抗体检测所述样本中的组织浸润NK细胞，其中NK细胞谱系特异性多肽的检测表明存在组织浸润NK细胞，并且使用与石蜡包埋组织样本中的第二多肽特异性结合的单克隆抗体进一步检测所述样本中的所述第二多肽，其中所述第二多肽是能够由代表NK细胞成熟阶段的NK细胞表达的多肽。

可以与NKp46组合使用的标志物也包括以细胞活性(活化、抑制、增殖、细胞毒性或调节潜能等)为特征或与其相关的任何标志物。细胞活性的标志物可以被多种细胞类型表达，例如NK细胞和非NK细胞。与NKp46组合使细胞活性的标志物定位于NK细胞和/或与NK细胞区分。此外，当这种标志物是治疗剂的直接或间接靶标时，所述标志物可以有利地用于预测对治疗的应答和/或用于鉴别或选择患者以用这种治疗剂进行治疗。

可以与NKp46组合使用的其它标志物的实例包括但不限于CD56，CD16，CD4，CD8，CD3，CD32，CD27，CD40，CD64，CD163，NKG2家族成员(例如NKG2D)，KIR家族成员，siglec家族成员，CD11b，IL-23R，IL-17，CD27，CD107，CD69，CD25，OX-40(CD134)，CD161，SCFR(CD117)，GITR，NKp30，NKp44，DNAM-1，2B4(CD224)，FoxP3，CD28家族的分子如CD28，CTLA-4，程序性死亡-1(PD-1)，B和T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA、CD272)，和诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；以及其属于B7家族的IgSF配体；CD80(B7-1)，CD86(B7-2)，ICOS配体，PD-L1(B7-H1)，PD-L2(B7-DC)，B7-H3，和B7-H4(B7x/B7-S1)，或任何其它IgSF家族成员如抗原呈递分子，天然细胞毒性受体(NKp30、NKp44)，共受体，抗原受体辅助分子，IgSF CAM，细胞因子受体如白细胞介素-6受体或集落刺激因子1受体，生长因子受体如PDGFR或SCFR，c-kit，CD117抗原，受体酪氨酸激酶/磷酸酶如IIa型和IIb型受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)。任选地，非NKp46多肽是NK和/或T细胞激活的标志物(例如CD69、siglec家族多肽、NKp44、CD137、CD107、颗粒酶B、CD25、CD134、核糖体蛋白S6，特别是磷酸化核糖体蛋白S6)。任选地，非NKp46多肽是由NK和/或T细胞表达的激活受体(包括共激活受体)(例如，CD16，TMEM173也称为干扰素基因刺激剂(STING)，OX-40，NKG2D，NKG2E，NKG2C，KIR2DS2，DNAM-1，KIR2DS4，GITR，B7-H3，CD27，CD40，CD137，NKp30，NKp44，DNAM-1，2B4(CD224)或PD-1(CD279))。例如，激活受体的表达可用于指示NK细胞的细胞毒性潜能。任选地，非NKp46多肽是抑制性NK细胞和/或T细胞受体(例如KIR家族成员、Siglec家族成员、NKG2A、TIGIT或CD96)。例如，激活受体的表达可用于指示NK细胞抑制。任选地，非NKp46多肽与淋巴细胞耗竭、抑制或压制有关，例如耗竭标志物TIM-3，或与免疫抑制代谢物产生相关的多肽如IDO、CD39和CD73。任选地，非NKp46多肽是细胞增殖的标志物(例如Ki67)。

本文的方法也可以用于确定来自患者的组织(例如肿瘤、炎症部位)中浸润免疫细胞的概况。本文的方法也可以用于确定具有这种概况的患者是否可以用以该概况为特征的病变有效的疗法来治疗。例如，所述方法可用于确定患者是否会对患有以NK细胞浸润为特征和/或以正常邻近组织中的NK细胞为特征的疾病的患者中的免疫治疗剂(例如抗体)作出应答。确定来自患者的组织中浸润免疫细胞的概况可以包括使用抗NKp46抗体评估NK细胞的存在，以及使用结合非NKp46多肽的抗体评估1、2、3、4、5种或更多种其它免疫细胞群体的存在。示例性群体可以选自骨髓细胞群体、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞、淋巴谱系、T细胞和B细胞。

本发明的抗体将可用于例如在用抗癌剂治疗之前评估具有癌症的受试者的免疫状态。本发明的抗体也将可用于例如在用抗癌剂治疗之前评估患有癌症的受试者中的肿瘤浸润免疫细胞(例如肿瘤浸润NK细胞)的类型。抗NKp46抗体可以单独地或与其它免疫细胞标志物组合用于检测非NK细胞免疫细胞群体，例如CD4、CD8、CD3、CD11b、CD163、CD40、CD56、CD16、CD20、FoxP3等，以表征在肿瘤或肿瘤微环境中，肿瘤周边处，淋巴结中或其它组织中存在的细胞的类型和亚型。

在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括：a)提供来自所述患者的福尔马林处理和/或石蜡包埋组织样本；b)使用抗NKp46抗体检测所述组织样本(例如肿瘤组织)中的NKp46(和任选地进一步检测一种或多种其它标志物，例如非谱系特异性标志物)；和c)如果在所述样本中检测到NKp46表达(任选地连同一种或多种其它标志物)，则向患者施用治疗剂(例如免疫治疗剂)。在一个实施方案中，所述组织样本包括癌组织或癌旁组织(也称为邻近非肿瘤组织或正常邻近组织)。

在一个方面，癌旁组织中的NK细胞可为免疫治疗应答提供有利的预后。在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括：a)提供来自所述患者的福尔马林处理和/或石蜡包埋癌组织样本和癌旁组织样本；b)使用抗NKp46抗体检测所述癌症和癌旁组织样本中的NKp46；和c)如果在癌旁组织样本中在癌组织样本中检测到NKp46表达，则向所述患者施用治疗剂(例如免疫治疗剂)。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是调节癌旁组织NK细胞的活性的药剂。

任选地，在这些方法的任何一种中，可以检测第二、第三或任何数目的其它标志物，以便在施用治疗剂之前进一步表征免疫细胞浸润。免疫细胞浸润的表征可包括检测一个或多个非NK细胞群体，或使用非谱系特异性标志物进一步表征NK和/或其它免疫细胞。这种表征可允许更好地评估治疗剂是否可能对个体有效。例如，在免疫治疗剂是抗肿瘤抗原抗体的情况下，除NK细胞之外，还可以检测肿瘤浸润或肿瘤邻近细胞毒性T细胞标志物的存在，或者可以评估CD16细胞的存在和/或水平。在另一个实例中，在免疫治疗剂是结合激活性或抑制性NK或T细胞受体(或结合抑制剂NK或T细胞受体的配体)的抗体以增加NK和/或T细胞活性的情况下，可以检测NK和T细胞激活、增殖、抑制、细胞毒性潜能、调节潜能(例如细胞因子产生)或耗竭的一种或多种标志物(除NKp46外)。

相应地，在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括：

a)提供来自所述患者的福尔马林处理和/或石蜡包埋癌组织样本和/或癌旁组织样本；

b)使用结合石蜡包埋组织样本中的NKp46的抗NKp46抗体来检测所述癌症和/或癌旁组织样本中的NK细胞；

c)使用结合石蜡包埋组织样本中第二多肽的抗体来检测所述癌症和/或癌旁组织样本中的所述第二多肽；和

d)如果在所述癌症和/或癌旁组织样本中检测到NKp46和/或所述第二多肽的表达，则向所述患者施用治疗剂(例如免疫治疗剂)。

在一个实施方案中，所述第二多肽是NK和T细胞激活、增殖、抑制、细胞毒性潜能、调节潜能(例如细胞因子产生)或耗竭的特征，其中如果检测到所述第二多肽的表达，则施用治疗剂，其中所述治疗剂是结合NK和/或T细胞激活受体、NK和/或T细胞抑制受体或者NK和/或T细胞抑制受体的天然配体的抗体。

在一个实施方案中，所述第二多肽是由选自以下的细胞群体或亚群表达的多肽：单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突状细胞、T细胞、T_h1或T_h2辅助T细胞、细胞毒性T细胞、抑制性或调节性T细胞、M1和M2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞，以及任何前述物的任何其它肿瘤浸润和/或肿瘤相关群体。

在本文的任何实施方案的一个方面，所述免疫治疗剂是调节肿瘤浸润和/或癌旁组织NK细胞，任选地进一步肿瘤浸润和/或癌旁组织T细胞的活性的药剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是与肿瘤抗原结合并且能够诱导ADCC向肿瘤细胞方向移动的抗体。任选地，所述免疫治疗剂结合(例如和激活)由NK和/或T细胞表达的激活受体(包括共激活受体)(例如激活受体CD16，TMEM173也称为干扰素基因刺激剂(STING)，CD40，CD27，OX-40，NKG2D，NKG2E，NKG2C，KIR2DS2，KIR2DS4，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)，CD137，NKp30，NKp44或DNAM-1，2B4(CD224))。任选地，所述免疫治疗剂结合并抑制抑制性NK细胞和/或T细胞受体，或这种抑制性受体的天然配体(例如抑制性KIR家族成员，Siglec家族成员，抑制性NKG2家族成员，KIR或NKG2家族成员的HLA天然配体，LAG-3，PD-1(CD279)或其天然配体PD-L1，TIGIT或CD96)。任选地，所述免疫治疗剂结合抑制与淋巴细胞(例如T和/或NK细胞)耗竭、抑制或压制相关的多肽，例如耗竭标志物TIM-3，或与免疫抑制性代谢物的产生相关的多肽如吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)、CD39和CD73。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂激活CD16，任选地其中所述药剂是包含由FcγR(例如人类CD16)结合的Fc结构域并且能够经由CD16诱导ADCC(例如经由NK细胞上的CD16)的药剂(例如全长IgG1抗体，双特异性抗体)。

在一个实施方案中，所述第二多肽是以NK和/或T细胞激活(包括激活潜能)、增殖、抑制、细胞毒性潜能、调节潜能(例如细胞因子产生)或耗竭为特征的多肽。任选地，所述多肽不具谱系特异性。任选地，所述多肽是IgSF超家族成员。例如与细胞激活、抑制、失能/耗竭或压制和/或增殖相关的标志物的检测可以用作施用调节细胞激活、抑制、失能/耗竭、压制和/或增殖的治疗剂可能具有治疗益处的指示。例如，NK和/或T细胞上的抑制性受体的表达(例如高水平表达)可以指示结合并阻断这种抑制性受体的活性或者结合并阻断其天然配体的活性的治疗剂(例如抗体)可用于治疗个体。抑制性受体及其配体的实例包括例如抑制性KIR家族成员，抑制性Siglec家族成员，抑制性NKG2家族成员，KIR或NKG2家族成员的HLA天然配体，PD-1(CD279)及其配体PD-L1和PD-L2，TIGIT或CD96及其配体CD155。在另一个实例中，与NK和/或T细胞如IDO、CD39和CD73的免疫抑制相关的肿瘤组织中蛋白质的表达(例如高水平表达)，或者在NK和/或T细胞上的表达，可以指示阻断这种免疫抑制过程的活性的治疗剂(例如抗体)可用于治疗个体，并且例如可以施用于个体。例如，可以施用阻断性抗CD73抗体或阻断性抗CD39抗体，或者可以施用抑制IDO的化合物。如果与NK和/或T细胞如TIM-3的失能/耗竭相关的蛋白质的表达(例如高水平表达)或者在NK和/或T细胞上的表达可能表明治疗剂缓解这种失能/耗竭，则例如结合并阻断TIM-3的抗体可用于治疗个体，并且例如可以施用于个体。在另一个实例中，NK和/或T细胞上的激活受体的表达(例如高水平表达)可以表明这样的细胞具有激活潜能并且结合并刺激或增加这种激活受体的活性的治疗剂(例如抗体)可用于治疗个体。NK和/或T细胞所表达的激活受体的实例包括CD16，TMEM173也称为干扰素基因刺激剂(STING)，OX-40，NKG2D，NKG2E，NKG2C，KIR2DS2，KIR2DS4，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)，CD137，NKp30，NKp44或DNAM-1，2B4(CD224)。在又一个实例中，NK细胞上的激活受体CD16的表达(例如高水平表达)可以表明这样的细胞具有激活潜能，并且结合肿瘤抗原并且可以被CD16结合的抗体(例如，包含Fc结构域的抗体)可用于治疗个体。

任选地，在这些方法的任何一个中，可以检测第二、第三或任何数目的其它标志物以评估治疗剂或其天然配体，任选地免疫治疗剂的分子靶标的存在和/或水平。NK谱系特异性抗NKp46抗体将允许表达分子靶标或其天然配体的NK细胞与表达分子靶标或其天然配体的其它免疫细胞相区分。这些信息将有助于评估个体是否可能从治疗中受益。分子靶标可以是例如免疫治疗剂相互作用的蛋白如CD16，肿瘤抗原，免疫细胞激活性或抑制性受体等。在另一个实例中，包括与毒性部分(例如细胞毒性药物)连接的抗体的治疗剂的分子靶标可以是例如这样的抗体-药物缀合物所结合的蛋白质，例如肿瘤抗原。当所述药剂是阻断抗体时，分子靶标可以是例如免疫治疗剂相互作用的蛋白质的天然配体，其存在和/或可能存在导致治疗效果。例如当免疫治疗剂是抗PD-1抗体时，分子靶标可以是肿瘤和/或浸润免疫细胞上的PD-L1或PD-L2。当免疫治疗剂是诱导ADCC的抗肿瘤抗原抗体时，分子靶标可以是免疫细胞(例如NK细胞)上的CD16和/或肿瘤细胞上的肿瘤抗原。

因此，在一个方面，本发明提供了一种用治疗剂治疗癌症患者的方法，所述方法包括：

a)提供来自所述患者的福尔马林处理和/或石蜡包埋癌症和/或癌旁组织样本；

b)使用结合石蜡包埋组织样本中的NKp46的抗NKp46抗体来检测所述癌症和/或癌旁组织样本中的NK细胞；

c)使用与石蜡包埋癌组织样本中的第二多肽结合的抗体，在所述癌症和/或癌旁组织样本中检测由治疗剂结合的所述多肽和/或其天然配体；和

d)如果在所述癌症和/或癌旁组织样本中检测到(i)NK细胞和/或(ii)由治疗剂结合的所述多肽和/或所述多肽的天然配体的表达，则向所述患者施用所述治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是免疫治疗剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是调节肿瘤浸润和/或癌旁组织NK细胞，任选地其它肿瘤浸润和/或癌旁组织T细胞的活性的药剂。

任选地，在任何实施方案中，例如在用治疗剂(例如免疫治疗剂)治疗之前，在取自患者或个体的肿瘤样本中体外测定肿瘤中的NK细胞(例如NKp46表达细胞)浸润水平。在一个实施方案中，参考水平是代表从例如用治疗剂进行治疗获得临床益处的患者群体的肿瘤中表达NKp46的NK细胞浸润水平的值。在一个实施方案中，参考水平是代表从例如用治疗剂进行治疗未获得临床益处的患者群体的肿瘤中表达NKp46的NK细胞浸润水平的值。在一个实施方案中，参考水平是在治疗之前从治疗中获得(或未获得)临床益处的患者中取得的肿瘤样本中体外测定的。在一个实施方案中，当参考水平是未获得临床益处的患者的参考水平时，对NK细胞浸润水平是参考水平的至少1.5倍、至少2倍或至少3倍的患者施用治疗(例如治疗剂)。

在一个实施方案中，例如在用治疗剂(例如免疫治疗剂)治疗之前，在取自患者的肿瘤样本中，体外测定肿瘤周边的NK细胞浸润水平。在一个实施方案中，参考水平是代表从例如用治疗剂进行治疗未获得临床益处的患者群体的肿瘤周边的NK细胞浸润水平的值。在一个实施方案中，参考水平是在治疗之前未从治疗获得临床益处的患者获取的肿瘤样本周边体外测定的。在一个实施方案中，对NK细胞浸润水平为参考水平的至少1.5倍、至少2倍或至少3倍的患者施用治疗(例如治疗剂)。

可以通过任何合适的方法来确定NK细胞浸润水平。例如，NK细胞浸润水平可以确定为给定组织(例如肿瘤)中存在的NK细胞的数量。在一个具体的实施方案中，NK细胞浸润水平由每平方毫米FFPE组织切片(例如从肿瘤活组织检查制备的切片)的NK细胞数来反映。

本发明还提供了一种治疗患者的癌症的方法，其中i)在石蜡包埋的治疗之前的样本中测定患者的肿瘤和/或肿瘤邻近组织中的NK细胞浸润水平，ii)将NK细胞浸润水平与参考水平进行比较，和iii)将免疫治疗剂施用至相比于参考水平具有较高NK细胞浸润水平(更大数目的总NK细胞或特定NK细胞亚群)的患者。肿瘤和/或肿瘤邻近组织中的NK细胞浸润可以根据本文公开的任何方法确定。

在一个实施方案中，在从治疗之前的患者获取的肿瘤和/或肿瘤邻近组织样本中体外测定肿瘤中的NK细胞浸润水平。在一个实施方案中，参考水平是代表未从治疗获得临床益处的患者群体的肿瘤和/或肿瘤邻近组织中的NK细胞浸润水平的值。在一个实施方案中，参考水平是在治疗之前从未从治疗获得临床益处的患者获取的肿瘤和/或肿瘤邻近组织样本中体外测定的。在一个实施方案中，对NK细胞浸润水平为参考水平的至少1.5倍、至少2倍或至少3倍的患者施用免疫治疗剂。

还提供了一种治疗患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用有效量的免疫治疗剂，条件是治疗之前所述患者的肿瘤和/或肿瘤邻近组织中的NK细胞浸润水平高于参考水平。在一个实施方案中，肿瘤和/或肿瘤邻近组织中的NK细胞浸润水平是从治疗之前的患者获取的肿瘤和/或肿瘤邻近组织样本中体外测定的水平。在一个实施方案中，参考水平是代表未从治疗获得临床益处的患者群体的肿瘤和/或肿瘤邻近组织中的NK细胞浸润水平的值。在一个实施方案中，参考水平是在治疗之前从未从治疗获得临床益处的患者获取的肿瘤和/或肿瘤邻近组织样本中体外测定的。在一个实施方案中，NK细胞浸润水平比参考水平高至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍或至少3倍。

还涵盖例如用于癌症的诊断或预后试剂盒，其包含根据本发明的抗体。任选地，所述试剂盒包含本发明的抗体和结合非NKp46多肽的抗体(例如，1、2、3、4、5、10种或更多种抗体)，其用作诊断或预后。任选地所述试剂盒包含用作诊断或预后的本发明抗体，和免疫治疗剂。所述试剂盒可另外包含用于检测由生物样本与本发明抗体之间的免疫学反应产生的免疫复合物的手段，特别是能够检测所述抗体的试剂。

可以使用本发明方法的疾病和病状包括癌症、其它增殖性病症、感染性疾病，或免疫病症如炎症性疾病和自身免疫性疾病。更具体地说，本发明的方法用于治疗多种癌症和其它增殖性疾病，包括但不限于：癌瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌，包括鳞状细胞癌；淋巴谱系造血肿瘤，间叶细胞来源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；肿瘤起源，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤。在优选的实施方案中，所述方法用于诊断或治疗选自结肠癌、黑素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、喉癌、肾癌和子宫颈癌的肿瘤。抗NKp46抗体对于检测肿瘤中的NK细胞特别有用，特别是浸润肿瘤或肿瘤邻近组织的NK细胞。

在某些实施方案中，所述癌症包含恶性的NKp46表达细胞，并且本发明的抗体和方法用于检测细胞中的NKp46表达。可以使用本发明方法的这些疾病和病状的实例包括某些淋巴瘤如CTCL、Sezary综合征、蕈样真菌病、NK-LDGL、鼻型NK/T淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、肠病相关T细胞淋巴瘤(EATL)、非特指型PTCL(PTCL-NOS)或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。

本发明的抗体可以包含在试剂盒中，其可以含有任何数量的抗体和/或其它化合物，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或任何其它数目的抗体和/或化合物，以及在某些实施方案中，用于检测石蜡包埋组织样本中免疫细胞的存在的抗体或其它诊断试剂。这样的诊断抗体经常被直接或间接地标记(例如，使用通常包括在试剂盒中的二级抗体，连同其检测所需的试剂，例如缓冲液、底物)。

本发明的其它方面和优点将在下面的实验部分中公开，其应被认为是说明性的而不是限制本申请的范围。

实施例

实施例1：免疫细胞群体上的NKp46表达

在不同细胞类型上研究了NKp46的表达，并且与其它NK细胞蛋白(包括IgSF成员，尤其是其它天然细胞毒性受体(NCR)成员NKp30)进行比较。

简言之，将来自健康志愿者的100μL新鲜血液与缀合有荧光染料的抗体(抗CD45、抗CD3、抗CD56、抗CD8、抗NKp46、抗NKp30、抗CD19、抗CD20)的混合物在室温下温育30分钟。使用Beckman Coulter Optilyse C试剂根据制造商的说明分析红血细胞并固定细胞。样本在BD FACS CANTO II上获得并用Flowjo软件分析。

粒细胞限定为CD45中等/SSC高细胞。单核细胞为CD45高/SSC中等细胞并且淋巴细胞为CD45高/SSC低细胞。在淋巴细胞内，T细胞被鉴定为CD3阳性细胞，并进一步分为CD8阳性或CD8阴性T细胞。NK细胞被鉴定为CD3阴性、CD56阳性细胞。B细胞被鉴定为CD3阴性、CD56阴性和CD19/CD20阳性细胞。

将CD56、NKp30和NKp46染色覆盖到在仅具有抗CD45/CD3/CD8/CD56的混合物的条件下获得的背景染色上。

图1和图2示出代表性供体的结果。

如图2所示，NKp46和NKp30都对NK细胞具有高度特异性，粒细胞、单核细胞、B细胞或T细胞没有染色。另一方面，CD56在占CD3T细胞总数6％的亚群T细胞上表达。有趣的是，如图1(底部两图)所示，NKp46存在于所有NK细胞上，包括CD56^亮，占NKp46阳性细胞的11.1％(图1，右下图，框中显示CD56^亮亚群)，而CD56^亮亚群上缺失NKp30(图1，左下图)。两个主要的NK细胞亚群分别是CD56^亮CD16^暗/-和CD56^暗CD16⁺。CD56^亮NK细胞亚群在外周血中数量占少数，但在二级淋巴组织以及肿瘤组织中构成NK细胞的大部分。它们是丰富的细胞因子生产者，在激活之前通常仅具有弱的细胞毒性，但是在激活后可能变得具强烈的细胞毒性。因此，NKp46提供单一标志物来检测NK细胞，并且包括CD56^亮亚群。

实施例2：在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本上用于NKp46免疫组织化学(IHC)染色的单克隆抗体的产生

Raji-huNKp46低和Raji-huNKp46高的选择

Raji-huNKp46细胞是通过用人类NKp46转导Raji细胞系产生的。将这些转导的细胞亚克隆后，选择具有两种不同表达水平高和低的两个克隆群体。图3示出用PE偶联的抗NKp46单克隆抗体(Bab281，Beckman Coulter)在Raji-huNKp46低、高和SNK6(内源性表达NKp46的NK/T淋巴瘤细胞系)上通过流式细胞术免疫荧光染色后获得的平均荧光强度。如所预期，PE偶联的同种型对照没有得到染色。

细胞固定、石蜡包埋和切片

收集约20×10⁶个细胞，用PBS洗涤1次，并且离心后在离心管中形成团块。将细胞与在微波中预热的两滴histogel(Microm Microtech)混合，然后放入冰箱中以使histogel固化。将固化后的细胞团块放入盒中并在福尔马林中固定2小时。在PBS中洗涤1次后，将盒在Ottix整形浴(Diapath)中进行温育，以使样本脱水，然后在Ottix plus浴中浸渍样本。然后将盒在石蜡(在60℃预热)中温育45分钟(3次)。使用包埋台AP280(Microm Microtech)将细胞团块包埋在石蜡中。使用切片机(Microm Microtech)将石蜡块切成5μm厚的切片。这些切片在40℃的水浴上展开，然后沉积在载玻片上。将载玻片在60℃的炉子中干燥，然后在室温下储存直至免疫组织化学染色。

免疫和筛选

用内部产生的huNKp46-Fc重组蛋白(3次50μg腹膜内注射+最后一次10μg静脉内加强注射)免疫三只BALB/c雌性小鼠(12周龄)。采集这些小鼠其中两只的脾脏，并与骨髓瘤细胞系(X63-Ag8-656)融合以产生杂交瘤。将细胞铺在甲基纤维素半固体培养基中。然后在液体培养基中人工挑选杂交瘤集落。首先评估杂交瘤上清液(SN)的良好IgG生产能力。然后，利用IHC在FFPE细胞团块(Raji、Raji-huNKp46低、Raji-huNKp46高)上直接筛选约400个杂交瘤SN，其具有以下IHC条件：暴露pH 8持续30分钟，在37℃温育纯SN持续1小时，在Discovery^XT自动机(Ventana)上用抗小鼠IgG OmniMap显色16分钟。并行地，将杂交瘤细胞在RNA提取缓冲液中冷冻以用于随后以小鼠IgG1形式进行的阳性命中的VH和VK克隆。在FFPE细胞团块(Raji转染子+内源性表达NKp46的SNK6)和人类脾脏(暴露pH 8持续30分钟，5和10μg/ml的抗体在细胞上温育1小时，在37℃的组织上温育2小时，用OmniMap显色16分钟)，再次验证所产生的不同抗体(Ab)。选择8E5-B克隆作为在FFPE样本(特异性和无背景染色)中染色NKp46的最佳候选物。利用来自R&D的多克隆抗NKp46抗体将其特异性与NKp46的免疫荧光共染色进行比较。在相同自动机上在两个不同部位(相同试剂、不同批次)上验证染色，并且在表达NKp46的不同组织(脾脏、淋巴结、子宫内膜、胎盘、回肠和结肠)上进行测试。另外，用手动方法验证染色。

实施例3：8E5-B对FFPE NK/T淋巴瘤样本上的NKp46IHC染色的测试

利用8E5-B抗体对10个福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)NK/T淋巴瘤样本评估NKp46表达。IHC染色用手动方法进行。在具有pH 8的EDTA缓冲液(Thermo Scientific)的PTLink模块(Dako)中，在37℃下暴露30分钟。内源性过氧化物酶和非特异性结合位点依次分别用3％H₂O₂(在PBS中稀释1次)封闭3×10分钟，以及用在PBS中稀释1次的5％山羊血清稀释1小时。将样本与在PBS中以5μg/ml稀释1次的8E5-B在室温下温育2小时。用envision试剂盒(Dako)在室温下使8E5B显色16分钟，接着进行5分钟的DAB温育。核用苏木精复染10秒。在所测试的10个样本中，有9个对NKp46染色呈阳性(弱至强)。利用相应的同种型对照进行染色是清洁的。

实施例4：冷冻样本上的8E5-B NKp46IHC染色

在冷冻样本上评估8E5-B抗体的NKp46IHC染色，并与来自BD Pharmingen的9E2参照抗体进行比较。在冷冻细胞团块(Raji、Raji-huNKp46低和SNK6)和人类脾脏切片上测试两种抗体。简言之，将切片与5μg/ml的8E5-B、9E2或同种型对照在室温下温育1小时。用HRP偶联的二级抗体(来自Dako的Envision试剂盒)/DAB底物显示染色。所测试的两种抗体都提供NKp46特异性染色并且强度相当。

实施例5：通过流式细胞术研究8E5-B NKp46染色

通过流式细胞术评估8E5-B抗体的NKp46染色。将Raji-huNKp46细胞与一系列剂量的8E5-B(30μg/ml，12个点1/3连续稀释)在4℃下温育45分钟。用APC偶联的抗小鼠IgG二级抗体显示染色。通过流式细胞术，结果显示8E5-B结合于NKp46，这表明FFPE中存在的表位仍然存在于细胞培养物中的细胞上。

实施例6：通过蛋白质印迹研究8E5-B NKp46结合

在还原条件下将人类NKp46-His重组蛋白(100ng、50ng和10ng)加载到SDS-PAGE12％凝胶上。然后将所述凝胶转移到Immobilon-P膜(Millipore，IPVH00010)上。用5％BSA、TBS-Tween 0.05％缓冲液使膜饱和1小时。8E5B抗体以1μg/ml使用，并且染色进行1小时。然后用TBS-Tween缓冲液将膜洗涤三次。将二级抗体(山羊抗小鼠-HRP(Bethyl，A90-131P))稀释到2.5％BSA、TBS-Tween 0.05％缓冲液(1/5000)中并在膜上温育1小时。然后用TBS-Tween缓冲液将膜洗涤三次。然后将膜与显色溶液(Bio-Rad，170-5070)温育1分钟，并且使用凝胶成像仪(Bio-Rad)读取信号。使用8E5B抗体通过蛋白质印迹检测huNKp46-His蛋白。

序列表

<110> 先天制药公司

<120> 用于检测组织浸润NK细胞的方法

<130> NKp46-5

<150> US 62/196,409

<151> 2015-07-24

<160> 16

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ser Ser Thr Leu Pro Ala Leu Leu Cys Val Gly Leu Cys Leu Ser

1 5 10 15

Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Gln Thr Leu Pro Lys Pro Phe Ile Trp

20 25 30

Ala Glu Pro His Phe Met Val Pro Lys Glu Lys Gln Val Thr Ile Cys

35 40 45

Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ala Val Glu Tyr Gln Leu His Phe Glu Gly

50 55 60

Ser Leu Phe Ala Val Asp Arg Pro Lys Pro Pro Glu Arg Ile Asn Lys

65 70 75 80

Val Lys Phe Tyr Ile Pro Asp Met Asn Ser Arg Met Ala Gly Gln Tyr

85 90 95

Ser Cys Ile Tyr Arg Val Gly Glu Leu Trp Ser Glu Pro Ser Asn Leu

100 105 110

Leu Asp Leu Val Val Thr Glu Met Tyr Asp Thr Pro Thr Leu Ser Val

115 120 125

His Pro Gly Pro Glu Val Ile Ser Gly Glu Lys Val Thr Phe Tyr Cys

130 135 140

Arg Leu Asp Thr Ala Thr Ser Met Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Arg

145 150 155 160

Ser Ser His Val Gln Arg Gly Tyr Gly Lys Val Gln Ala Glu Phe Pro

165 170 175

Leu Gly Pro Val Thr Thr Ala His Arg Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly

180 185 190

Ser Tyr Asn Asn His Ala Trp Ser Phe Pro Ser Glu Pro Val Lys Leu

195 200 205

Leu Val Thr Gly Asp Ile Glu Asn Thr Ser Leu Ala Pro Glu Asp Pro

210 215 220

Thr Phe Pro Ala Asp Thr Trp Gly Thr Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Thr

225 230 235 240

Gly Leu Gln Lys Asp His Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Leu

245 250 255

Leu Arg Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe

260 265 270

Leu Val Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser

275 280 285

Arg Ala Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu

290 295 300

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Phe His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

His Asp Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Arg Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile

20 25 30

Asn Gly Asn Thr His Leu Phe Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

Asp Thr Tyr Phe His

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 6

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe His

1 5 10 15

Asp

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 9

Asn Arg Tyr Gly Tyr

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 10

Ala Ala Asn Arg Tyr Gly Tyr

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 11

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Thr His Leu Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 12

Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Thr His

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 13

Lys Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Thr His

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 14

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 15

Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 16

His Leu Glu Tyr Pro Phe

1 5

Claims (59)

1.一种检测来自人类个体的样本内的组织浸润人类NK细胞的体外方法，所述方法包括提供来自个体的石蜡包埋样本，和使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的人类NK细胞谱系特异性多肽的单克隆抗体检测所述样本中的组织浸润NK细胞，其中所述NK细胞谱系特异性多肽的检测指示组织浸润NK细胞的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的第二多肽的单克隆抗体来检测所述样本中的所述第二多肽，其中所述第二多肽是能够由NK细胞表达的谱系非特异性多肽。

3.根据权利要求2所述的方法，其中组织浸润NK细胞的检测是使用结合具NK谱系特异性的IgSF家族多肽的单克隆抗体来检测的，并且其中所述第二多肽是并非NK细胞谱系特异性的IgSF家族多肽。

4.根据权利要求1所述的方法，其中特异性结合人类NK细胞谱系特异性多肽的所述抗体能够检测CD56^暗和CD56^亮NK细胞。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述NK细胞谱系特异性多肽是NKp46。

6.根据权利要求2至5所述的方法，其中所述第二多肽与NK细胞亚群或细胞成熟阶段相关。

7.根据权利要求2至6所述的方法，其中所述第二多肽与NK和/或T细胞激活、增殖、抑制或压制、细胞毒性潜能、调节潜能或耗竭相关。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其还包括使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的第二多肽的单克隆抗体来检测所述样本中的所述第二(或其它)多肽，其中所述第二(或其它)多肽是非NK细胞免疫群体的标志物。

9.根据权利要求2至8所述的方法，其中所述第二多肽是肿瘤抗原。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其用于评估用免疫治疗剂治疗个体的适用性，其还包括使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的第二多肽的单克隆抗体来检测所述样本中的所述第二(或其它)多肽，其中所述第二(或其它)多肽是由免疫治疗剂结合的多肽，或由免疫治疗剂结合的多肽的配体。

11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述石蜡包埋样本是石蜡包埋组织样本。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述样本是癌组织样本或癌旁组织样本，并且其中所述NK细胞谱系特异性多肽的检测指示肿瘤浸润NK细胞的存在。

13.一种表征来自人类个体的样本内的NK细胞的体外方法，所述方法包括：

a.提供来自个体的石蜡包埋组织样本，

b.使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的人类NKp46多肽的第一单克隆抗体来检测所述样本中的组织浸润NK细胞，其中所述NKp46多肽的检测指示组织浸润NK细胞的存在；和

c.使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的所述非谱系特异性多肽的第二单克隆抗体来检测所述样本中与NK细胞激活、增殖、抑制、压制或耗竭、细胞毒性潜能或调节潜能相关的非谱系特异性多肽，其中所述第二多肽的检测分别指示NK细胞激活、增殖、抑制、压制、耗竭、细胞毒性潜能或调节潜能。

14.一种单克隆抗体，其特异性结合由石蜡包埋细胞团块中的细胞表达的人类NKp46多肽。

15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体结合已被制备成石蜡包埋细胞团块的NKp46阳性细胞，但不结合已被制备成石蜡包埋细胞团块的NKp46阴性细胞。

16.根据权利要求14至15所述的抗体，其中所述抗体能够结合于冷冻组织切片中的细胞上以及石蜡包埋细胞团块中的细胞上的NKp46上所存在的共同表位，和/或其中所述抗体能够结合于由培养中的细胞所表达的NKp46上存在的共同表位。

17.根据权利要求14至16所述的抗体，其中所述抗体不结合任何非NK谱系特异性IgSF家族多肽。

18.根据权利要求14至17所述的抗体，其中所述细胞是NK细胞。

19.根据前述权利要求中的任一项所述的抗体或方法，其中所述石蜡包埋样本或细胞团块已经被固定，石蜡包埋，切片，脱蜡和转移到载玻片上。

20.一种抗体，其包含抗体8E5B的高变区氨基酸残基。

21.一种抗体，其包含含有SEQ ID NO:2的8E5B轻链可变区序列的三个CDR的轻链和含有SEQ ID NO:3的8E5B重链可变区序列的三个CDR的重链。

22.根据权利要求20或21所述的抗体，其中所述抗体是抗体片段。

23.根据权利要求20至22中的任一项所述的抗体，其中所述抗体结合已被制备成石蜡包埋细胞团块的NKp46阳性细胞，但不结合已被制备成石蜡包埋细胞团块的NKp46阴性细胞。

24.根据权利要求14至23所述的抗体，其中抗体与可检测部分缀合或共价结合。

25.一种试剂盒，其包含根据权利要求14至24中的任一项所述的抗体，任选地其中所述试剂盒还包含特异性识别根据权利要求14至23中的任一项所述的抗体的被标记的二级抗体。

26.一种核酸，其编码根据权利要求14至24所述的抗体。

27.一种杂交瘤或重组宿主细胞，其产生根据权利要求14至24所述的抗体或包含根据权利要求26所述的核酸。

28.根据权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中结合人类NK细胞谱系特异性多肽的单克隆抗体是根据权利要求14至24中的任一项所述的抗体。

29.一种筛选、测试或产生特异性结合石蜡包埋组织切片中的NKp46多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：提供多个候选抗体；和评估所述抗体中的每一个特异性结合由石蜡包埋细胞团块中的细胞所表达的人类NKp46多肽的能力。

30.根据权利要求29所述的方法，其还包括制造所选单克隆抗体的衍生物的步骤。

31.根据权利要求30所述的方法，其中制造衍生物包括将所述抗体与可检测部分缀合或共价结合。

32.一种抗体，其根据权利要求29至31所述的方法获得或产生。

33.一种检测来自人类个体的石蜡包埋样本内的NKp46表达细胞或NK细胞的体外方法，所述方法包括提供来自个体的石蜡包埋样本，和使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的NKp46多肽的根据权利要求14至24中的任一项所述的单克隆抗体检测所述样本中的细胞，其中NKp46的检测指示所述NKp46表达细胞或NK细胞的存在。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述石蜡包埋样本是石蜡包埋组织样本，任选地此外其中所述组织是肿瘤组织或肿瘤邻近组织。

35.根据权利要求33至34所述的方法，其中所述石蜡包埋组织样本已经被固定，石蜡包埋，切片，脱蜡和转移到载玻片上。

36.根据权利要求28所述的方法，其中NKp46是使用特异性结合于所述抗体的二级抗体来检测的。

37.一种预测患有癌症的个体中的癌症进展的方法，所述方法包括提供来自患有癌症的个体的石蜡包埋样本，和根据权利要求1至13或33至36中的任一项所述的方法或使用根据权利要求14至24中的任一项所述的单克隆抗体来检测所述样本中的浸润NK细胞。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述个体在所述样本中具有浸润NK细胞(或相比于参考值更大量的所述细胞)的测定结果表明癌症进展的有利预后。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述个体在所述样本中具有浸润NK细胞(或相比于参考值更大量的所述细胞)的测定结果表明对于用免疫治疗剂治疗的应答的有利预后。

40.一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括：(a)根据权利要求1至13或33至39中的任一项所述的方法检测来自个体的石蜡包埋样本中的NK细胞，和(b)向所述个体施用免疫治疗剂。

41.根据权利要求37至40所述的方法，其中步骤(a)还包括使用结合石蜡包埋样本中的第二多肽的抗体来检测所述样本中的所述第二非谱系特异性多肽。

42.根据权利要求40至41所述的方法，其中如果在所述样本中检测到NKp46的表达，则向所述个体施用所述免疫治疗剂。

43.根据权利要求40至41所述的方法，其中如果在所述样本中检测到所述第二多肽的表达，则向所述个体施用所述免疫治疗剂。

44.根据权利要求41至43所述的方法，其中所述第二多肽与NK细胞和/或T细胞激活、增殖、抑制、压制或耗竭、细胞毒性潜能或调节潜能相关。

45.根据权利要求44所述的方法，其中与NK细胞和/或T细胞激活、增殖、抑制、压制或耗竭、细胞毒性潜能或调节潜能相关的所述多肽是IgSF多肽。

46.根据权利要求41至45所述的方法，其中所述第二多肽是由免疫治疗剂结合的多肽，或由免疫治疗剂结合的多肽的配体。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述由免疫治疗剂结合的多肽或由免疫治疗剂结合的多肽的配体选自：肿瘤抗原、激活性受体、抑制性受体和具有免疫抑制活性的多肽。

48.根据权利要求41至45所述的方法，其中所述第二多肽与非NK细胞免疫群体相关。

49.根据权利要求39至48所述的方法，其中所述疾病是癌症并且所述免疫治疗剂选自：激活激活性受体的抗体，抑制抑制性受体或其天然配体的抗体，结合肿瘤抗原的抗体，和抑制免疫抑制代谢物形成的药剂。

50.一种筛选或构成患者或生物样本群体的体外方法，所述方法包括：根据权利要求1至13或33至39中的任一项所述的方法检测来自多个患者中的每一个的石蜡包埋样本中的NKp46表达细胞或NK细胞；和如果检测到NKp46表达细胞或NK细胞，则选择患者或样本。

51.一种筛选或构成患者或生物样本群体的体外方法，所述方法包括：基于以下选择患者或样本的群体，其中所述群体中的每个患者或样本具有由根据权利要求14至24所述的抗体结合的肿瘤细胞。

52.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述组织样本包括选自以下的人类组织：皮肤、小肠、结肠、肺、食道、胃、回肠、空肠、十二指肠、结肠、肝脏、胰腺、子宫内膜、睾丸、胎盘、淋巴结、脾脏、胸腺和扁桃体。

53.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述组织是选自以下的人类癌组织：乳腺癌、黑素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、喉癌、肾癌和子宫颈癌。

54.一种检测患有淋巴瘤的个体中的恶性NKp46表达细胞的方法，所述方法包括提供来自患有淋巴瘤的个体的石蜡包埋样本，和根据权利要求1至13或33至36中的任一项所述的方法或使用根据权利要求14至24中的任一项所述的单克隆抗体检测所述表达NKp46的样本中的恶性细胞。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述表达NKp46的癌症是T细胞淋巴瘤，任选地外周T细胞淋巴瘤(PTCL)或皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)；任选地其中所述PTCL是肠病相关T细胞淋巴瘤(EATL)、非特指型PTCL(PTCL-NOS)、NK/T淋巴瘤或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。

56.根据权利要求54或55所述的方法，其还包括使用特异性结合石蜡包埋组织样本中的第二多肽的单克隆抗体来检测所述样本中的所述第二多肽，其中所述第二多肽是由淋巴瘤细胞表达的多肽，任选地其中所述第二多肽是CD4或CD30。

57.根据权利要求1至13和28至56中的任一项所述的方法，其中使用单克隆抗体检测所述样本中的细胞包括：

●获得包含细胞的生物样本(例如作为活组织检查)；

●将所述样本固定，石蜡包埋，切片和脱蜡，并且任选地将所述样本转移到载玻片上；

●使所述切片与所述单克隆抗体接触；和

●检测所述切片内结合的单克隆抗体的存在。

58.一种检测组织浸润NK细胞的方法，所述方法包括：

●从个体获得生物样本(例如作为活组织检查)；

●将所述样本固定，石蜡包埋，切片和脱蜡，并且任选地将所述样本转移到载玻片上；

●使所述切片与特异性结合人类NKp46多肽的单克隆抗体接触，其中所述抗体特异性结合石蜡包埋组织切片中的所述NKp46多肽并结合于可检测部分；和

●检测所述切片内NKp46的存在，其中NKp46存在于所述组织切片中的阳性测定结果指示所述患者具有浸润所述组织的NK细胞。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述单克隆抗体是根据权利要求14至24中的任一项所述的抗体。