CN104087557B - 杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用 - Google Patents

杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用。所述杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9105。基于所述杂交瘤细胞株产生的抗Nodal的单克隆抗体，所述抗Nodal的单克隆抗体与抗Nodal的多克隆抗体组成一种新的可应用于检测肿瘤细胞的试剂盒。本发明提供单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1:1024000，在western bolt检测中，本发明提供的抗体仅在目标位置检测到特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。所述试剂盒可以较好地用于血清中Nodal蛋白的含量检测，且具有较高的灵敏性和特异性。

Description

杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿 瘤细胞方面的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株
的抗Nodal单克隆抗体和多克隆抗体及检测肿瘤细胞方面的应用。
背景技术
目前，早期诊断癌症的最便捷的方法是通过验血寻找肿瘤标志物，肿瘤标志物是指在肿瘤发生、发展过程中能反映细胞恶变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标记物的检测，可以对辅助相应肿瘤做早期诊断、判断预后、检测疗效和肿瘤复发状况的判断等。
Nodal属于TGF-β家族成员，它是一胚胎期高表达、而在成体组织中几乎没有表达的蛋白质。Nodal在细胞内以无活性的前体形式存在，在经过一系列加工修饰除去N端信号肽和一段包含200多个氨基酸的前肽序列后，便形成由110个氨基酸的成熟Nodal蛋白被分泌至胞外，成熟Nodal蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，分子量约为12kDa（人和小鼠的结构非常接近，氨基酸一致性达98.29%）。其中，通过比对TGF-β家族蛋白分析所得Nodal高特异性序列如SEQ ID NO:2所示。Nodal蛋白的功能是介导胚胎发育中外胚层的上皮细胞向内、外胚层之间迁徙以形成间质组织。已知在胚胎发育过程中，Nodal信号主要通过细胞膜上丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样I型受体（ActRI）和II型受体（ActRII）的介导传入胞内。活化的ActRI （ALK4或ALK7）随即激活胞内调节蛋白Smad (Sma/Mothers AgainstDecapenta-plegic)家族的Smad2/Smad3复合物。此后该复合物与Smad4形成具有活性的三聚体并转运至胞核内，结合到目的基因的顺式作用元件或启动子区域，调控相关基因的转录，参与了肿瘤恶性生物学行为的发生过程。
新近，人们发现Nodal蛋白在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤等多数肿瘤中再度表达，且其表达水平与肿瘤浸润、转移和预后不良有关系。因此，通过检测血清中Nodal蛋白的表达情况，有望成为一种更加快速、方便、准确广泛的肿瘤体外普查诊断方法。
目前，对血清中蛋白的表达情况监测方法通常需要用到抗体，因此，研制一种效价高、特异性好的Nodal蛋白抗体十分必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对Nodal蛋白抗体及其相关技术的不足，提供一种杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株，可以产生优异的抗Nodal的抗体。
本发明要解决的另一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明要解决的还一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体的应用。
本发明基于上述应用，提供一种将可以应用于用于肿瘤检测方面的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9105。
本发明提供优选的上述杂交瘤细胞的制备方法为：
以SEQ ID NO:1所示序列的成熟Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行活性筛选得到第一阳性克隆，以SEQ ID NO:2所示序列的特异性Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行特异性筛选得到阳性克隆，经3次亚克隆至阳性克隆率为100%，制得杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9105。
本发明提供一种抗Nodal的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO.9105的杂交瘤细胞株产生。
基于所述杂交瘤细胞产生的所述单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1:1024000，在Western Blot检测中，本发明提供的抗体仅识别目标位置的Nodal特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。
本发明提供所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，尤其是在制备检测Nodal蛋白的检测工具中具有较好的应用。
本发明提供的单克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。
作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。
本发明提供所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S01：以Nodal蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞；
S02：将小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，获得所述杂交瘤细胞AH12，体内诱生或体外培养，经纯化，即得所述单克隆抗体。
作为优选，免疫的剂量为200μg/只小鼠，免疫的次数为4次。
作为优选，小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合的体积比例为5:1。
作为优选，融合的融合剂为质量分数为50%的PEG4000。
作为优选，Nodal蛋白与弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
作为优选，融合后、筛选前还包括HAT培养的步骤S03，具体为用HAT选择培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养，融合后第3 d开始每隔2 d更换新鲜HAT培养基。
作为优选，体内诱生具体为：取10周龄左右 BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，注射量为0.5 mL/只；1周后用PBS缓冲液重悬CGMCC NO.9105的杂交瘤细胞株至细胞密度为1×106个/mL，每只小鼠腹腔注射1 mL；10 d～15 d后待小鼠腹部明显隆起时收集腹水，2000 rpm/min离心10 min，取上清。
作为优选，纯化采用Protein A柱。
本发明还同时提供了一种抗Nodal的多克隆抗体。所述多克隆抗体的制备方法为：以Nodal蛋白免疫新西兰兔，免疫4次后收集血清，经Protein A柱亲和纯化，即得。本发明提供的多克隆抗体效价可达1: 32000。
本发明提供所述多克隆抗体在制备检测Nodal蛋白的检测工具中的应用。
本发明提供所述多克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。
作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。
优选的，肿瘤为为结直肠癌、卵巢癌或乳腺癌。
本发明还提供了一种用于肿瘤检测的试剂盒，包括：本发明提供的单克隆抗体或本发明提供的多克隆抗体。
由于本发明提供的单克隆抗体或多克隆抗体具有良好的效价、纯度和特异性。因此，本发明提供的试剂盒具有较高的特异性和检测的准确度。
作为优选，试剂盒中还包括以下包被液和封闭液等组成；
所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST；
所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST。
优选的，本发明提供的用于肿瘤诊断的试剂盒中还包括：HRP标记的羊抗鼠抗体、nodal标准品、底物缓冲液、体积分数为30%的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2M的浓硫酸。
其中，底物缓冲液的配制方法为：称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000 mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得。
本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S11：以包被液稀释本发明所述多克隆抗体，4℃放置16h，将该多克隆抗体包被至96孔板，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；
S12：加入封闭液，37℃封闭2h后，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；
S13：加入待测样品、由保藏编号为CGMCC NO.9105的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体，37℃封闭2h后，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；
S14：加入HRP标记的羊抗鼠抗体，18～30℃孵育2h，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；
S15：加入邻苯二胺显色液，显色15min后，以摩尔浓度为2mol/L的硫酸终止反应，检测OD450；
所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST；
所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST。
邻苯二胺显色液包括：100ml底物缓冲液加入100μL 30%双氧水、50mg OPD（邻苯二胺），即得OPD显色液，现配现用。
作为优选，S11中稀释为4000倍体积稀释。
作为优选，S13中本发明提供的单克隆抗体经稀释4000倍体积。
采用本发明提供的方法，当检测结果表明血清中Nodal蛋白含量为10ng/mL～80ng/mL时为健康人群范围，血清中Nodal蛋白含量为高于100 ng/mL时为肿瘤警戒范围。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9105。基于所述杂交瘤细胞可产生具有优异特异性的抗Nodal单克隆抗体。
本发明提供的抗Nodal单克隆抗体类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1:1024000，在Western Blot检测中，本发明提供的抗体仅识别目标位置的Nodal特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。
本发明所述抗Nodal单克隆抗体结合抗Nodal多克隆抗体（效价可达1:32000）建立了一套制备肿瘤细胞检测的方法、试剂和试剂盒。所述试剂盒可以精确检测血清中的Nodal蛋白含量，具有较高的灵敏性和特异性。实验表明，本发明提供的试剂盒对血清中Nodal检测的浓度范围为20ng/mL～500ng/mL，经验证采用本发明提供的试剂盒对27例结直肠癌患者血清样本进行鉴定，其检测结果与预期完全一致，准确性可达100%。
附图说明
图1 第4次免疫后小鼠血清中的抗体效价。
图2 杂交瘤细胞的单克隆。
图3本发明提供的单克隆抗体经纯化后效价测定。
图4 本发明提供的单克隆抗体经ProteinA纯化前后的SDS-PAGE对比。
图5本发明提供的多克隆抗体经纯化后效价测定，示本发明提供的多克隆抗体纯化前的OD450值，示本发明提供的多克隆抗体纯化后的OD450值。
图6本发明提供的多克隆抗体经ProteinA纯化前后的SDS-PAGE对比。
图7本发明提供的单克隆抗体的特异性检测结果，单克隆抗体与对照抗体WS65与Nodal蛋白结合效果。
图8本发明提供的单克隆抗体的特异性检测结果，单克隆抗体对结直肠癌肿瘤细胞株HCT116和前列腺癌肿瘤细胞株PC3内Nodal蛋白的免疫荧光检测，Con示空白对照，DIPA示荧光视野下蓝色细胞核，Nodal示荧光视野下绿色Nodal蛋白，White示白光视野下细胞形态。
图9本发明提供的单克隆抗体通过流式细胞术检测检测肿瘤细胞株PC3和HCT116中Nodal表达情况，示不加一抗的空白对照，示本发明提供的单克隆抗体作为一抗的流式细胞检测，二者在一抗孵育后均经过相同的荧光二抗孵育处理。
图10以不加抗体的实验为阴性对照(Con)，以加入抗体WS65的实验为阳性对照(WS65)，采用本发明提供的单抗对肿瘤组织中的Nodal蛋白进行免疫组化检测。
图11单克隆抗体2000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线，显示单克隆抗体的检测浓度对检测的影响。
图12单克隆抗体4000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线，显示单克隆抗体的检测浓度对检测的影响。
图13单克隆抗体8000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线，显示单克隆抗体的检测浓度的对检测的影响。
图14单克隆抗体10000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线，显示单克隆抗体的检测浓度的对检测的影响。
图15多克隆抗体的包被浓度的对检测的影响，多克隆抗体2000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线。
图16多克隆抗体的包被浓度的对检测的影响，多克隆抗体4000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线。
图17多克隆抗体的包被浓度的对检测的影响，多克隆抗体8000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线。
图18多克隆抗体的包被浓度的对检测的影响，多克隆抗体10000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线。
图19以本发明提供的方法检测Nodal蛋白的标准曲线。
图20以本发明提供的方法检测健康人与直肠癌患者血清中Nodal蛋白含量结果。
图21以本发明提供的试剂盒检测Nodal蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。本发明采用的仪器皆为常规市售品，皆可于市场购得。
实施例1 本发明所述单克隆抗体的制备与纯化
BALB／c小鼠购自广东省实验动物中心；骨髓瘤细胞SP2/0购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；Nodal蛋白纯品购自R&D，3218-ND。
制备方法为：
（1）小鼠免疫：以Nodal蛋白纯品为抗原，对6～8周龄雌性BALB／c小鼠进行免疫，共免疫4次。免疫剂量200μg/只，其中第1次免疫用弗氏完全佐剂与重组表达的Nodal蛋白等量混匀、乳化。此后每间隔2周加强免疫1次，第2到第4次免疫均用等量弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量相同。免疫时采用背部皮下多点注射。最后一次免疫3 天后，对小鼠进行尾静脉采血并分离血清，检测血清效价。第4次免疫后小鼠血清中的抗体效价为1∶64000以上，如附图1所示，证明小鼠免疫成功。
（2）Nodal单克隆杂交瘤细胞株的建立：取第4次免疫后3 d的BALB/c小鼠的脾细胞，按5:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，以质量分数为50％的PEG4000溶液作为融合剂。融合后的细胞平均铺在96孔板中，用HAT选择培养基于37℃、5% CO2培养箱中培养。融合后第3 d开始每隔2 d更换新鲜HAT培养基（组成参照现有常规）。融合成功后，每次换液时通过间接ELISA法两步筛选阳性孔，将融合得到的单克隆细胞上清作为检测抗体，用兔抗nodal多抗作为包被抗体，孵育活性Nodal片段（R&D，3218-ND），筛选抗SEQ ID NO:1所示序列的活性Nodal蛋白的抗体，检测得到的阳性孔做进一步筛选用。将第一步筛选的到的阳性孔上清作为检测抗体，兔抗nodal多抗作为包被抗体，孵育SEQ ID NO:2所示序列的Nodal高特异性序列，最后将筛选得到的阳性孔杂交瘤细胞再经过3次亚克隆，确保每个孔中细胞均是由1个细胞分裂而来，如图2所示，最终所有克隆孔的阳性克隆率达到100%时，将该细胞株建系（即分泌单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞），将该细胞株命名为AH12，并将其保存至中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为CGMCC NO.9105。
（3）Nodal单克隆抗体的大量制备：取10周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射0．5 mL/只弗氏不完全佐剂。1周后用PBS重悬阳性单克隆杂交瘤细胞株，调密度至1×106个/mL，每只小鼠腹腔注射1 mL。10d～15 d后待小鼠腹部明显隆起时收集腹水，2 000 rpm/min离心10min，取上清分装，-80℃保存。
（4）Nodal单克隆抗体的纯化：采用Protein A亲和纯化腹腔接种杂交瘤细胞获取的小鼠腹水，Protein A亲和纯化步骤如下：
①蛋白A-Sepharose柱的处理：清洗层析柱干净，并垂直固定在铁架台上。向柱中加入少量结合缓冲液（0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl），将柱底气泡赶出，并检查柱子是否漏水，最后柱中保留大约2cm的液体。
②蛋白A-Sepharose的预处理：取适量的蛋白A-Sepharose（Amersham）的乙醇悬浮液，静置等胶沉淀后吸去上层乙醇，再用结合缓冲液多次悬浮彻底洗去乙醇。将结合缓冲液与蛋白A混合成50%～70%的浆状物，把浆状物倒入柱内，打开下端出水口，在凝胶沉降过程中，用玻棒轻轻搅拌凝胶的上层，使沉降后的胶面平整。连接蠕动泵，以50cm/h（对于直径1cm的柱相当于0.7ml/min）的速率装柱，待柱体完全沉降后，继续用5～10倍体积的结合缓冲液清洗柱体。
③抗体溶液的准备：抗体溶液对结合缓冲液透析后，10,000×g，10min离心得样品液。
④上样：将样品液加入亲和柱内。样品进入介质后，将流速调低至0.4ml/min，继续用10倍体积结合缓冲液清洗，直到A280值恢复到本底水平（＜0.02）。
⑤样品洗脱：保持速率不变，换洗脱缓冲液（0.1M 甘氨酸，pH3.0，0.15M NaCl）洗脱结合在柱中的抗体，洗脱液以2ml为洗脱组分分部收集（2ml/管）。收集试管中加入0.1mL中和缓冲液（1M Tris-HCl pH8.0）。检测每管的A280，当A280<0.05时停止洗脱，汇集A280≥0.2的峰组分得纯化后的单克隆抗体。
使用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定本发明制得的抗体类型为IgG。以阴性的2.1倍以上为阳性，AH12纯化后效价约为1024000。由于抗体生产和纯化的过程中会对抗体的活性造成影响，因此本发明采用效价作为评判标准而非浓度，如附图3所示。且纯化后的抗体在SDS-PAGE电泳，如附图4所示，目标位置仅发现两个条带。说明，纯化后的Nodal单克隆抗体表现出高效价与高纯度。
实施例2 本发明提供的多克隆抗体的制备与纯化
新西兰兔购自中山大学动物实验中心，Nodal蛋白纯品购自R&D，3218-ND。
制备方法为：
（1）以Nodal蛋白纯品免疫新西兰兔，免疫方法与实施例1中免疫BALB/c小鼠的方法一致。（2）免疫4次之后收集血清。（3）得到的多抗血清用Protein A柱亲和纯化，纯化方法与实施例1中纯化Nodal单克隆抗体的方法一致。
经检测，以阴性的2.1倍以上为阳性，可知纯化后兔抗的效价约为32,000，如附图5所示，且纯化后的兔多克隆抗体仍有较高的效价和纯度，如附图6所示。
实施例3 本发明提供的单克隆抗体特异性检测
肿瘤细胞株PC3与HCT116购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
取本发明实施例1提供的细胞株AH12分泌的抗体为待测抗体，以购自SANTA的鼠抗Nodal单抗WS65为阳性对照，不加抗体的实验为阴性对照，采用免疫印迹技术(westernblot)、免疫荧光共聚焦技术、流式细胞术以及免疫组织化学技术，分别检测AH12与WS65的特异性。并检测WS65的效价。
经鉴定，WS65的效价为1:2000。而本发明实施例1提供的单克隆抗体经鉴定效价可达1:1024000，说明对照抗体WS65的效价远远低于本发明单克隆抗体。
以Nodal蛋白纯品为检测目标，Western blot结果显示，WS65与本发明提供的实施例1提供的杂交瘤细胞株AH12产生的抗体均能特异性识别Nodal蛋白并与之结合，如附图7所示，如图，本发明实施例1提供的Nodal单克隆抗体与Nodal结合仅产生55KD（未成熟肽）和35KD（成熟肽）的特异性条带，而对照WS65抗体的检测实验结果显示了多条明显的条带。
取肿瘤细胞株PC3与HCT116为检测目标，荧光共聚焦结果显示本发明提供的实施例1提供的单克隆抗体能与两种肿瘤细胞内Nodal蛋白特异性识别并结合，如附图8所示，该单克隆抗体可用于免疫荧光检测，具有较好的特异性。
以本发明实施例1提供的单克隆抗体作为一抗孵育肿瘤细胞株PC3与HCT116后孵育荧光二抗，进行流式检测，检测以不加抗体的实验为阴性对照。结果表明，本单克隆抗体可成功应用于流式细胞术中检测Nodal蛋白，如附图9所示）。
分别以WS65、和实施例1制备的单克隆抗体作为一抗，进行肿瘤组织的免疫组化检测，以不加一抗的实验作为阴性对照，结果如附图10所示，结果显示与对照单抗WS65相比，本发明实施例1提供的单克隆抗体更能特异性识别并结合Nodal蛋白，具有更高的特异性。可见，结果显示本发明实施例1提供的单克隆抗体具有很好的特异性。
实施例4 本发明提供的单克隆抗体最佳工作浓度检测
1、缓冲液配制：
1）、底物缓冲液:称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000 mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得底物缓冲液。
2）、包被液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
3）、封闭液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
4）、邻苯二胺显色液：100ml底物缓冲液加入100μL 30%双氧水、50mg OPD（邻苯二胺），即得OPD显色液，现配现用。
5）、0.5%PBST缓冲液：称取磷酸二氢钾0.12g，磷酸氢二钠0.72g，氯化钠4g，氯化钾0.2g，吐温-201mL，加水至1L。
6）、单克隆抗体的稀释：以包被液将本发明实施例1制备的单克隆抗体稀释，稀释倍数为：1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍。
7）、待测Nodal蛋白溶液浓度为：2000 ng/mL、400 ng/mL、6000 ng/mL、8000 ng/mL、10000 ng/mL、12000 ng/mL。
2、实验设置：
实验设空白孔、待测孔、阳性孔、阴性孔。空白孔仅以质量分数为1%的BSA溶液封闭，不加Nodal蛋白和抗体；阳性孔加入待测Nodal蛋白溶液和100 μL杂交瘤细胞AH12的培养上清；阴性孔加入待测Nodal蛋白溶液和100 μL包被液；待测孔：加入待测Nodal蛋白溶液和100 μL不同稀释倍数的本发明实施例1制备的单克隆抗体，每个稀释度作3个平行复孔。
3、检测方法为：
①用包被液稀释本发明实施例2提供的多克隆抗体，稀释倍数为4000倍，将稀释后的多克隆抗体加入96孔板，每孔100 μL，空白孔仅加入100 μL质量分数为1%的BSA溶液，4℃包被16h，以0.5%PBST缓冲液，洗涤3次，5min/次；
②各孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，以0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
③除空白孔外，每孔加入不同溶度的100μL 待测Nodal蛋白溶液后，分别在阳性孔、阴性孔、待测孔中加入相应溶液；37℃孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
④各孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠抗体（以包被液稀释，稀释倍数为5000倍）室温孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
⑤每孔加入100μL邻苯二胺显色液，室温避光显色15min；
⑥每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸溶液终止反应；
⑦酶标仪450nm波长下测定吸光度值，以检测得到的不同浓度Nodal待测蛋白溶液的OD450值为纵坐标，以Nodal待测蛋白溶液的浓度对数值为横坐标，绘制标准曲线，各浓度Nodal蛋白检测标准曲线如图11～图14所示。
其中，图11是本发明提供的单克隆抗体2000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线，其拟合标准曲线为y=0.0002x+0.418，R2=0.9878。图12是本发明提供的单克隆抗体4000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=0.0002x+0.0398，R2=0.9836。图13是本发明提供的单克隆抗体8000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=0.0002x+0.0507，R2=0.9889。图14是本发明提供的单克隆抗体10000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=0.0001x+0.0497，R2=0.96。
根据阳性孔OD450值(Positive，P)大于1，阴性孔OD450值(Negative，N)较小，P/N值较大，确定最佳单克隆抗体的最佳工作浓度为4000倍稀释。
实施例5 本发明提供的多克隆抗体最佳工作浓度检测
1、缓冲液配制：与实施例4种提供的缓冲液配制方法相同，其中，多克隆抗体的稀释：以包被液将本发明实施例2制备的多克隆抗体稀释，稀释倍数为：2000倍、4000倍、8000倍、10000倍。
2、实验设置：
实验设空白孔、待测孔、阳性孔、阴性孔。空白孔仅以质量分数为1%的BSA溶液封闭，不加Nodal蛋白和抗体；阳性孔以实施例2中免疫新西兰兔后的纯化血清包被；阴性孔加入待测Nodal蛋白溶液和100 μL包被液；待测孔以实施例2中不同稀释倍数的多克隆抗体包被；每个稀释度作3个平行复孔。
3、检测方法为：
①将不同稀释倍数的多克隆抗体加入待测孔，每孔100 μL，空白孔和阴性孔仅加入100 μL质量分数为1%的BSA溶液，阳性孔加入100 μL实施例2中免疫新西兰兔后的血清，4℃包被16h，以0.5%PBST缓冲液，洗涤3次，5min/次；
②各孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，以0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
③除空白孔外，每孔加入不同溶度的100μL 待测Nodal蛋白溶液后，分别在阳性孔、阴性孔、待测孔中加入100μL经包被液稀释的实施例1制备的单克隆抗体（稀释倍数为4000倍）；37℃孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
④各孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠抗体（以包被液稀释，稀释倍数为5000倍）室温孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
⑤每孔加入100μL邻苯二胺显色液，室温避光显色15min；
⑥每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸溶液终止反应；
⑦酶标仪450nm波长下测定吸光度值，以检测得到的不同浓度Nodal待测蛋白溶液的OD 450值为纵坐标，以Nodal待测蛋白溶液的浓度对数值为横坐标，绘制标准曲线，各浓度Nodal蛋白检测标准曲线如图15～图18所示。
其中，图15是本发明提供的多克隆抗体2000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=9E-06x+0.0439，R2=0.9406。
图16是本发明提供的多克隆抗体4000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=1E-05x+0.0194，R2=0.9289。
图17是本发明提供的多克隆抗体8000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=9E-06x+0.0296，R2=0.9025。
图18是本发明提供的多克隆抗体10000倍稀释时检测Nodal蛋白的标准曲线；其拟合标准曲线为y=5E-06x+0.0237，R2=0.7672。
根据阳性孔OD450值(Positive，P)大于1，阴性孔OD450值(Negative，N)较小，P/N值较大，确定最佳多克隆抗体的最佳工作浓度为4000倍稀释。
实施例6本发明提供的Nodal蛋白检测方法的检测范围
1、缓冲液配制：
1）、底物缓冲液:称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000 mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得底物缓冲液。
2）、包被液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
3）、封闭液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
4）、邻苯二胺显色液：100ml底物缓冲液加入100μL 30%双氧水、50mg OPD（邻苯二胺），即得OPD显色液，现配现用。
5）、0.5%PBST缓冲液：称取磷酸二氢钾0.12g，磷酸氢二钠0.72g，氯化钠4g，氯化钾0.2g，吐温-20 1mL，加水至1L。
6）、待测Nodal蛋白溶液：以质量分数为1%的BSA溶液溶解Nodal蛋白纯品，将Nodal蛋白纯品配制成浓度为：50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、450ng/mL、500ng/mL、550 ng/mL的溶液。
2、检测方法：
①用包被液稀释本发明实施例2提供的多克隆抗体，稀释倍数为4000倍，将稀释后的多克隆抗体加入96孔板，每孔100μL，4℃包被16h，以0.5%PBST缓冲液，洗涤3次，5min/次；
②加入200μL封闭液，37℃封闭2h，以0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
③每孔加入100μL不同浓度的待测Nodal蛋白溶液和100μL经包被液稀释的实施例1制备的单克隆抗体（稀释倍数为4000倍），37℃孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
④加入100μL HRP标记的羊抗鼠抗体（以包被液稀释，稀释倍数为5000倍）室温孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
⑤每孔加入100μL邻苯二胺显色液，室温避光显色15min；
⑥每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸溶液终止反应；
⑦酶标仪450nm波长下测定吸光度值。
⑧以检测得到的不同浓度Nodal待测蛋白溶液的OD 450值为纵坐标，以Nodal待测蛋白溶液的浓度对数值为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。
绘得标准曲线如图19所示，其回归方程为：y = 8E-05x + 0.0567，R² = 0.9811，根据标准曲线，本发明提供的Nodal蛋白检测方法的线性检测范围为50ng/mL～2000ng/mL。
实施例8 本发明提供的Nodal蛋白检测方法检测人血清样品
通过本发明提供的方法检测个血清中的Nodal蛋白的含量。
1、血清样品收集：
收集27例直肠癌患者血清（14男，14女），收集来源医院消化内科和肿瘤科；另外，收集9例正常对照（4男，5女）来自医院体检中心。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃保存。
2、缓冲液配制：
1）、底物缓冲液:称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000 mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得底物缓冲液。
2）、包被液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
3）、封闭液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
4）、邻苯二胺显色液：100ml底物缓冲液加入100μL 30%双氧水、50mg OPD（邻苯二胺），即得OPD显色液，现配现用。
5）、0.5%PBST缓冲液：称取磷酸二氢钾0.12g，磷酸氢二钠0.72g，氯化钠4g，氯化钾0.2g，吐温-20 1mL，加水至1L。
6）、待测血清样品配制：分别用PBS缓冲液5倍稀释各收集的血清。
3、检测方法为：
①用包被液稀释本发明实施例2提供的多克隆抗体，稀释倍数为4000倍，将稀释后的多克隆抗体加入96孔板，每孔100μL，4℃包被16h，以0.5%PBST缓冲液，洗涤3次，5min/次；
②加入200μL封闭液，37℃封闭2h，以0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
③每孔加入100μL待测血清样品和100μL经包被液稀释的实施例1制备的单克隆抗体（稀释倍数为4000倍），37℃孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
④加入100μL HRP标记的羊抗鼠抗体（以包被液稀释，稀释倍数为5000倍）室温孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
⑤每孔加入100μL邻苯二胺显色液，室温避光显色15min；
⑥每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸溶液终止反应；
⑦酶标仪450nm波长下测定吸光度值。
根据测定的OD450值，应用本发明实施例4绘制的标准曲线，计算各样品中Nodal蛋白的含量，乘以稀释倍数，得到样品实际Nodal蛋白含量，结果如图20所示。结果显示：健康人组血清中Nodal蛋白含量平均值为54.7±4.99 ng/ml；全部直肠癌患者血清中Nodal蛋白含量平均值为为153.1±10.33 ng/ml；患者血清中Nodal蛋白含量将近健康人血清中Nodal蛋白含量的3倍。采用SPSS13.0软件分析，P=0.0009，有显著性差异，具有统计学意义（P<0.01）。
由图可见：确诊直肠癌患者血清中Nodal蛋白的含量都明显高于健康人血清中的Nodal含量。表明采用本发明提供的方法，根据测得的Nodal蛋白在血清中的含量对诊断恶性肿瘤具有很好的辅助作用。而27例肿瘤患者的血清中Nodal蛋白的含量皆高于9个健康人的血清中Nodal含量，在27例肿瘤患者的血清Nodal蛋白含量检测中未见低于健康人血清Nodal含量的情况。表明本发明提供的方法具有良好的准确性，与预期结果完全一致，准确率可达100%。
实施例9 本发明提供试剂盒的制备
1、缓冲液配制：
PBST缓冲液：称取磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠4g，氯化钾0.2g，吐温-20 2mL，加水至1L。
底物缓冲液:称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000 mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得底物缓冲液。
包被液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。封闭液：包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST组成，以水配制。
2、取独立包装的：本发明实施例1制备的单克隆抗体、本发明实施例2制备的多克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠抗体、封闭液、包被液、PBST缓冲液、nodal标准品、底物缓冲液、体积分数为30%的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2mol/L的浓硫酸，包装即得。
实施例10 本发明提供的试剂盒的使用方法
取本发明实施例9提供的试剂盒进行大量实验。本实施例以9例健康人血清样品和9例乳腺癌患者血清、9例卵巢癌患者血清、9例结肠癌患者血清为检测物作为举例说明。
1、配制邻苯二胺显色液：100ml底物缓冲液加入100μL 30%双氧水、50mg OPD（邻苯二胺），即得OPD显色液，现配现用。
2、采用实施例6中提供的方法以检测得到的不同浓度Nodal蛋白标准品溶液的OD 450值为纵坐标，以Nodal蛋白标准品溶液的浓度对数值为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。绘得标准曲线如图21所示，其回归方程为：y = 0.004 x+0.0619，R²=0.9972。
3、使用方法为：
①用包被液稀释本发明实施例2提供的多克隆抗体，稀释倍数为4000倍，将稀释后的多克隆抗体加入96孔板，每孔100μL，4℃包被16h，以0.5%PBST缓冲液，洗涤3次，5min/次；
②加入200μL封闭液，37℃封闭2h，以0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
③每孔加入100μL不同浓度的待测Nodal蛋白溶液和100μL经包被液稀释的实施例1制备的单克隆抗体（稀释倍数为4000倍），37℃孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
④加入100μL HRP标记的羊抗鼠抗体（以包被液稀释，稀释倍数为5000倍）室温孵育2h，0.5%PBST缓冲液洗涤3次，5min/次；
⑤每孔加入100μL邻苯二胺显色液，室温避光显色15min；
⑥每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸溶液终止反应；
⑦酶标仪450nm波长下测定吸光度值；
⑧根据标准曲线，读取各血清样品中Nodal蛋白含量，结果如表1所示：
表1 各血清样品中Nodal蛋白含量
结直肠癌患者 Nodal蛋白含量（ng/mL） 乳腺癌患者 Nodal蛋白含量（ng/mL） 卵巢癌患者 Nodal蛋白含量（ng/mL） 健康人 Nodal蛋白含量（ng/mL）
1 167.5 1 117 1 144.7 1 48.2
2 183.2 2 125.5 2 104.9 2 30.1
3 155.7 3 131.3 3 110.6 3 82.1
4 122.2 4 131.3 4 113.8 4 52.7
5 175 5 144.7 5 189.4 5 50.5
6 199.3 6 146.4 6 195.7 6 64
7 199.3 7 152.1 7 213.3 7 41.4
8 117.8 8 152.3 8 165.4 8 64
9 187.4 9 153.2 9 187.3 9 59.5
平均值 167.4889 139.3111 158.3444 54.72222
标准差 30.37814 13.32924 41.19227 14.96962
结果表明：以本发明实施例9提供的试剂盒检测，结肠癌患者血清中Nodal蛋白的平均含量为160.1ng/mL，乳腺癌患者血清中Nodal蛋白的平均含量为139.3ng/mL，卵巢癌患者血清中Nodal蛋白的平均含量为158.2ng/mL；而健康人血清中Nodal蛋白的平均含量为54.7ng/mL；患者血清中Nodal蛋白含量将近健康人血清中Nodal蛋白含量的2～3倍。采用SPSS13.0软件分析，P=0.0032，有显著性差异，具有统计学意义（P<0.01）。
可见：表明采用本发明提供的试剂盒，根据测得的Nodal蛋白在血清中的含量可以准确判定该患者是否患有癌症。而本实施例作为典型举例的27例肿瘤患者的血清中Nodal蛋白的含量皆高于9个健康人的血清中Nodal含量，在27例肿瘤患者的血清Nodal蛋白含量检测中未见低于健康人血清Nodal含量的情况。表明本发明提供的方法具有良好的准确性，能够与预期结果完全一致，准确率可达100%。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用
<130> MP1313288
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
His His Leu Pro Asp Arg Ser Gln Leu Cys Arg Lys Val Lys Phe Gln
1 5 10 15
Val Asp Phe Asn Leu Ile Gly Trp Gly Ser Trp Ile Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Gln Tyr Asn Ala Tyr Arg Cys Glu Gly Glu Cys Pro Asn Pro Val Gly
35 40 45
Glu Glu Phe His Pro Thr Asn His Ala Tyr Ile Gln Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Arg Tyr Gln Pro His Arg Val Pro Ser Thr Cys Cys Ala Pro Val Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Leu Ser Met Leu Tyr Val Asp Asn Gly Arg Val Leu Leu
85 90 95
Asp His His Lys Asp Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Leu
100 105 110
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Pro Asn Pro Val Gly Glu Glu Phe His Pro Thr Asn His Ala Tyr Ile
1 5 10 15
Gln Ser Leu Leu Lys Arg Tyr Gln Pro His Arg Val
20 25

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO.9105；所述杂交瘤细胞株AH12应用于产生类型为IgG的单克隆抗体。
2.一种抗Nodal的单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生，类型为IgG。
3.权利要求2所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测Nodal蛋白方面的检测工具或在制备检测肿瘤细胞的试剂方面的应用。
4.根据权利要求3所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述单克隆抗体和抗Nodal的多克隆抗体；
所述抗Nodal的多克隆抗体的制备方法为：以Nodal蛋白免疫新西兰兔，免疫4次后收集血清，经Protein A柱亲和纯化，即得。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，还包括以下包被液和封闭液组成；
所述包被液包括质量分数为5％的BSA和质量分数为0.5％的PBST；
所述封闭液包括质量分数为5％的BSA和质量分数为0.5％的PBST。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，还包括HRP标记的羊抗鼠抗体、nodal标准品、底物缓冲液、体积分数为30％的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2M的浓硫酸；
其中，底物缓冲液的配制方法为：称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得。
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