CN102971343B - 用于癌症诊断和/或预后的新型抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及患者中增殖性疾病的预后和/或诊断领域。更特别地，本发明涉及能够特异性结合人cMet受体的新型抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。同样地，本发明包括所述抗体的用途、和相应的用于检测和诊断与cMet表达相关的病理性过度增殖的致癌疾患的方法。在特定实施方式中，所述疾患是相对于正常而言与增加的cMet多肽表达有关的致癌疾患，或与cMet过度表达关联的任何其它病理。最后，本发明包括包含至少用于特定癌症预后或诊断的此种抗体的产品和/或组合物或试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及患者中增殖性疾病的预后和/或诊断的领域。更特别地，本发明涉及能够特异地结合人cMet受体的新型抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。同样地，本发明包括所述抗体的用途，以及用于检测和诊断与cMet表达相关的病理性过度增殖的致癌疾患的方法。在特定实施方式中，疾患是与相对于正常而言增加的cMet多肽表达相关的致癌疾患，或任何其它与cMet过表达相关的病理。最后，本发明包括包含至少用于特定癌症预后或诊断的此种抗体的产品和/或组合物或试剂盒。
背景技术
靶向酪氨酸激酶受体（RTK）的药剂如曲妥珠单抗（trastuzumab）、西妥昔单抗（cetuximab）、贝伐单抗（bevacizumab）、伊马替尼（imatinib）和吉非替尼（gefitinib）抑制剂已经表明了靶向这类蛋白用于选定癌症的治疗的兴趣。
cMet是也包括RON和SEA的RTK亚家族的原型成员。cMet RTK家族结构上不同于其它RTK家族，且其为唯一已知的肝细胞生长因子（HGF）（也称为scater因子（SF））的高亲和性受体（D.P.Bottaro等人，Science 1991,251:802-804;L.Naldini等人，Eur.Mol.Biol.Org.J.1991,10:2867-2878）。cMet和HGF广泛表达于多种组织，且它们的表达通常分别局限于上皮和间质来源的细胞（M.F.Di Renzo等人，Oncogene 1991,6:1997-2003;E.Sonnenberg等人,J.Cell.Biol.1993,123:223-235）。不仅正常的哺乳动物发育需要它们，且已经表明其在细胞迁移、形态分化和三维管结构的组织以及生长和血管生成中特别重要（F.Baldt等人，Nature1995,376:768-771;C.Schmidt等人，Nature.1995:373:699-702;Tsarfaty等人，Science1994,263:98-101）。已经表明cMet和HGF的受控调节在哺乳动物的发育、组织维持和修复中是重要的（Nagayama T等人，Brain Res.2004,5;999(2):155-66;Tahara Y等人，J Pharmacol Exp Ther.2003,307(1):146-51），其调节异常参与癌症的进展。
由cMet不恰当激活所引发的异常信号传导是在人癌症中观察到的最常见的改变之一，其在肿瘤生成和转移中起重要作用（Birchmeier等人，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2003,4:915-925;L.Trusolino和Comoglio P.M.,Nat Rev.Cancer.2002,2(4):289-300）。
通过配体依赖和非依赖的机制（其包括cMet的过度表达、和/或旁分泌或自分泌的激活）或者通过获得功能的突变能够引起不恰当的cMet的激活（J.G.Christensen,Burrows J.和SalgiaR.,Cancer Latters.2005,226:l-26）。但是，存在或不存在配体时，为调节激酶对ATP和含有酪氨酸的多肽底物的结合亲和力和结合动力学，需要cMet受体的寡聚化（Hays JL等人，Biochemistry,2004Aug 17,43:10570-8）。激活的cMet将信号传导效应子募集到位于细胞质结构域的多停靠（multidocking）位点，导致一些重要信号传导通路的激活，包括Ras-MAPK、PI3K、Scr和Stat3（Gao CF等人，Oncogene.2000,19(49):5582-9）。这些通路对于肿瘤细胞增殖、侵入和血管生成以及对于避免凋亡是必要的（Furge KA等人，Trends CellBiol.2003Mar,13(3):122-30;Fan S等人，Oncogene.2000Apr 27,19(18):2212-23）。另外，相对于其它RTK，cMet信号传导的独特方面是已报道的其与黏着斑复合物和非激酶结合配偶体（partner）如α6β4整联蛋白（integrin）（Trusolino L等人，J BiolChem.1999,274(10):6499-506）、丛蛋白B1（PlexinB1）或semaphorin（无对应译文）的相互作用（Giordano S等人，Nat Cell Biol.2002,4(9):720-4;Conrotto P等人，Blood.2005,105(11):4321-9;Conrotto P,Corso S,Gamberini S,Comoglio PM,Giordano S,Oncogene.2004,23:5131-7），其可以通过该受体进一步添加至细胞功能调节的复杂性。最后，最近的数据证实了cMet可参与对吉非替尼或厄洛替尼（erlotinib）的肿瘤抗性，表明靶向EGFR和cMet两者的化合物的组合可能是显著的感兴趣的（Engelman JA等人，Science,2007,316:1039-43）。
在过去的一些年中，已经开发了许多不同的策略减弱癌症细胞系中cMet的信号传导。这些策略包括i）中和抗cMet或HGF/SF的抗体（Cao B等人，Proc Natl AcadSci U S A.2001,98(13):7443-8;Martens T等人，Clin Cancer Res.2006,12(20):6144-52）或使用HGF/SF拮抗剂NK4，防止配体与cMet结合（Kuba K等人，CancerRes.,2000,60:6737-43），ii）对cMet的小ATP结合位点抑制剂，封闭激酶活性（Christensen JG等人，Cancer Res.2003,63:7345-55），iii）工程化的SH2结构域多肽，其干扰进入多停靠位点，以及减少受体或配体表达的RNAi或核酶。这些方法中的大多数表现出导致肿瘤抑制的cMet的选择性抑制，并表明cMet可能是癌症治疗性干预所感兴趣的。
发明内容
本发明的目的在于提供至少一种试剂，其能够用作检测和/或检测致癌疾患、特别是其特征为cMet表达或那些异常cMet表达介导的疾患的诊断或预后的生物标志物。
文中描述的是符合此准则的新型抗体。
本发明的其它特征和优点将在随后的详细说明和实施例中变得明显。
在第一方面，本发明的主题是一种结合蛋白，或其功能片段或衍生物，其以高亲和性特异地结合配体非依赖激活形式的cMet蛋白（cMet），优选人cMet，并因而能够用于诊断由配体非依赖激活形式的cMet表达介导的病理性过度增殖致癌疾患的方法中。
配体非依赖的激活涉及cMet的组成性磷酸化，其随后是（consecutive to）i）在cMet过度表达（通常与cMet基因的扩增相关）的情况下，在不存在HGF时发生的受体二聚化，或ii）在cMet细胞内结构域内激活突变，或iii）两者皆有。
在第一方面，本发明涉及结合蛋白，或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet。
通过“结合蛋白”的表述，应当理解为与其它蛋白或分子具有特异的或广泛的亲和性的任何肽链。当结合可能时，使蛋白接触并形成复合体。本发明的结合蛋白优选，单不局限为抗体、抗体的片段或衍生物、蛋白或肽。
表述“功能片段和/或衍生物”将在本发明的说明书的后面详细定义。
通过表述“在肿瘤上”，应当理解根据本发明的结合蛋白报道的性质存在于体内的肿瘤环境中，并不仅仅在体外的实例中。更特别地，其已被证实，如从以下实施例中明确的，用代表尽可能最接近天然的环境的离体实验或在人肿瘤组织的商业微阵列（TMA）上的分析。
应当理解此处本发明不涉及天然形式的蛋白，即，这些蛋白不是存在于其天然环境中的，而是其能够被从天然来源分离或获得，或通过遗传重组、或通过化学合成获得的，然后如下面描述的，其能够含有非天然的氨基酸。
根据本发明的实施方式，公开了一种结合蛋白，或其功能片段或衍生物，如上面所述，其不阻断配体肝细胞生长因子（HGF）结合至cMet。
更特别地，本发明的结合蛋白或其功能片段或衍生物在氨基酸残基1和950之间与cMet的细胞外区域相互作用。
根据第一个实施方式，本发明涉及一种结合蛋白，其功能片段或衍生物，其包含选自包含至少SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、17、18、19、20或21的序列的CDR中的至少一个CDR或最佳比对后其序列与序列SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、17、18、19、20或21具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个CDR。
根据第二个实施方式，本发明涉及一种结合蛋白，或其功能片段或衍生物，其包含选自包含至少SEQ ID No.9、10、11、12、13、14、22、23、24、25或26的序列的CDR中的至少一个CDR或最佳比对后其序列与序列SEQ ID No.9、10、11、12、13、14、22、23、24、25或26具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个CDR。
抗体的“功能片段”表示，尤其是，抗体片段，比如片段Fv、scFv（sc=简单链）、Fab、F（ab’）2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体、或任何半衰期延长的片段。本说明书中将随后详细描述这种功能片段。
抗体的“衍生化合物”或“衍生物”表示，尤其是，由肽支架和为了保留其被识别的能力的至少一个原始抗体CDR组成的结合蛋白。这种本领域技术人员公知的衍生化合物，将随后在本说明书中详细描述。
在第一个实施方式中，本发明的结合蛋白或其功能片段或衍生物包括抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括至少一个选自序列SEQ ID No.1-6的CDR。
在另一个实施方式中，本发明的结合蛋白或其功能片段或衍生物包括抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括至少一个选自序列SEQ ID No.9-14的CDR。
在本发明的又一个优选实施方式中，所述结合蛋白或其功能片段或衍生物由分离的抗体组成。
更优选地，本发明包括通过遗传重组或化学合成获得根据本发明的抗体、其衍生的化合物或其功能片段。
根据一个优选的实施方式，根据本发明的抗体或其衍生的化合物或功能片段的特征在于其由单克隆抗体组成。
“单克隆抗体”理解为表示来自早期均质抗体群的抗体。更具体地，除了以极小比例可以发现的少数可能天然发生的突变外，群的个体抗体是一致的。换言之，单克隆抗体由来自单个细胞克隆（例如杂交瘤、转染有编码均质抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染有编码均质抗体的DNA分子的原核宿主细胞等）生长的均质抗体组成，通常其特征在于一类且仅一类及亚类的重链和仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的，并针对单一抗原。此外，和制备多克隆抗体（其通常包括针对多种决定簇、或表位的多种抗体）对比，各单克隆抗体针对单个抗原表位。
此处必须了解，本发明不涉及天然形式的抗体，即，它们不取自其天然环境，但它们通过纯化分离自或获得自天然来源、或者通过遗传重组或者通过化学合成获得，因此它们可以带有非天然氨基酸，正如将在此后描述的。
更特别地，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个轻链，该轻链包含至少一个序列SEQ ID No.1、2、3、17、18的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ IDNo.1、2、3、17、18具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
甚至更优选地，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个轻链，该轻链包含以下3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
－CDR-L1包括序列SEQ ID No.1或17，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.1或17具有至少80%同一性的序列；
-CDR-L2包括序列SEQ ID No.2或18，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.2或18具有至少80%同一性的序列；和
－CDR-L3包括序列SEQ ID No.3，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.3具有至少80%同一性的序列。
因而，本发明描述一种抗体、或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）并不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述抗体的特征在于其包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包括序列SEQ ID No.1，CDR-L2包括序列SEQ ID No.2和CDR-L3包括序列SEQ ID No.3。
根据另一个具体实施方式，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个轻链，该轻链包含如根据Kabat定义的以下3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包括序列SEQ ID No.17，CDR-L2包括序列SEQ ID No.18和CDR-L3包括序列SEQ ID No.3。
根据另一个实施方式，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个重链，该重链包含至少一个序列SEQ ID No.4、5、6、19、20或21的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.4、5、6、19、20或21具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
在一个优选的方式中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个重链，该重链包含以下3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
－CDR-H1包括序列SEQ ID No.4或19，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.4或19具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
－CDR-H2包括序列SEQ ID No.5或20，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.5或20具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
－CDR-H3包括序列SEQ ID No.6或21，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.6或21具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
因而，本发明描述一种抗体、或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）并不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述抗体的特征在于，其包含一个重链，该重链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包括序列SEQ ID No.4，CDR-H2包括序列SEQ ID No.5和CDR-H3包括序列SEQ IDNo.6。
根据另一个具体实施方式，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个重链，该重链包含如根据Kabat定义的以下3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包括序列SEQ ID No.19，CDR-H2包括序列SEQ ID No.20和CDR-H3包括序列SEQ ID No.21。
更特别地，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个轻链，该轻链包含至少一个序列SEQ ID No：9、10、11、22、23的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ IDNo：9、10、11、22、23具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
甚至更优选地，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个轻链，该轻链包含以下3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
－CDR-L1包括序列SEQ ID No.9或22，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.9或22具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
－CDR-L2包括序列SEQ ID No.10或23，或在最佳比对后与序列SEQ IDNo.10或23具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
－CDR-L3包括序列SEQ ID No.11，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.11具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
因而，本发明描述一种抗体、或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）并不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述抗体的特征在于，其包含一个轻链，该轻链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包括序列SEQ ID No.9，CDR-L2包括序列SEQ ID No.10和CDR-L3包括序列SEQ IDNo.11。
根据另一个具体实施方式，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个轻链，该轻链包含如根据Kabat定义的以下3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包括序列SEQ ID No.22，CDR-L2包括序列SEQ ID No.23和CDR-L3包括序列SEQ ID No.11。
根据另一个实施方式，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个重链，该重链包含至少一个序列SEQ ID No.12、13、14、24、25、26的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.12、13、14、24、25、26具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
在一个优选的方式中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个重链，该重链包含以下3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
－CDR-H1包括序列SEQ ID No.12或24，或在最佳比对后与序列SEQ IDNo.12或24具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
－CDR-H2包括序列SEQ ID No.13或25，或在最佳比对后与序列SEQ IDNo.13或25具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；以及
－CDR-H3包括序列SEQ ID No.14或26，或在最佳比对后与序列SEQ IDNo.14或26具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
因而，本发明描述一种抗体、或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述抗体的特征在于其包含一个重链，该重链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包括序列SEQID No.12，CDR-H2包括序列SEQ ID No.13和CDR-H3包括序列SEQ ID No.14。
根据另一个具体实施方式，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一个重链，该重链包含如根据Kabat定义的以下3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包括序列SEQ ID No.24，CDR-H2包括序列SEQ ID No.25和CDR-H3包括序列SEQ ID No.26。
在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“附着至抗体化合物或其序列的蛋白质”是可互换的。
此处必须了解，本发明不涉及天然形式的抗体，即，它们不取自其天然环境，但它们通过纯化分离自或获得自天然来源、或者通过遗传重组或者通过化学合成获得，因此它们可以带有非天然氨基酸，正如将在此后描述的。
在第一个实施方式中，互补决定区、或CDR表示如Kabat等人定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区（Kabat等人,Sequences of proteins ofimmunological interest,5thEd.,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991，及其随后的版本）。有三个重链CDR和三个轻链CDR。此处，术语“CDR”用于表示，取决于具体情况，一种或更多种、或甚至所有区，所述区含有负责对其识别的抗原或表位的抗体结合亲和性的大部分氨基酸残基。
在第二个实施方式中，通过CDR区或CDR，意图表示如IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。
无论抗原受体、链的类型、或物种如何，定义了IMGT独特编号来比较可变结构域（Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)）。在IMGT独特编号中，保守的氨基酸总是具有相同的位点，例如半胱氨酸23（第一-CYS）、色氨酸41（保守的-TRP）、疏水氨基酸89、半胱氨酸104（第二-CYS）、苯丙氨酸或色氨酸118（J-PHE或J-TRP）。IMGT独特编号提供框架区的标准界限（FR1-IMGT：位点1至26、FR2-IMGT：39至55、FR3-IMGT：66至104以及FR4-IMGT：118至128）以及互补决定区的标准界限：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65以及CDR3-IMGT：105至117。正如间隔代表未占据的位点，CDR-IMGT长度（显示于括号之间，并由点隔开，如（8.8.13））成为重要的信息。在二维图示中使用IMGT独特编号，如IMGT Colliers de Perles所指定的（Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)），以及在IMGT/3D结构-DB中的三维结构中（Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHCstructural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)）。
存在三个重链CDR和三个轻链CDR。术语CDR此处根据情况用于表示，这些区的一个或几个、或甚至这些区的全部，所述区含有负责对其识别的抗原或表位的抗体结合亲和性的大部分氨基酸残基。
为了更加明确，应当理解在下面的描述中，更特别地在表2a、2b和3中，将通过IMGT编号和Kabat编号定义CDR。
在本发明的意思中，两条核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”表示最佳比对后获得的待比较的两条序列之间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分比，此百分比是纯统计学的，并且两条序列之间的差异沿着其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列的比较传统上在它们最佳比对之后通过比较序列来进行，所述比较能够通过节段或通过使用“比对窗”进行。可以进行用于比较的序列的最佳比对，除了手工比较，通过Smith和Waterman的局部同源算法（1981）（Ad.App.Math.2:482）、通过Neddleman和Wunsch（1970）（J.Mol.Biol.48:443）的局部同源算法、通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法（1988）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444）、或通过使用这些算法的计算机软件（Wisconsin遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.Madison,WI，或者通过比较软件BLASTNR或BLAST P）。
两条核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可以通过比较两条最佳-比对的序列来确定，其中待比较的核酸或氨基酸序列，同两序列间用于最佳比对的参考序列相比，有增加或删除。通过确定两条序列间一致的氨基酸核苷酸或残基的位点数，将一致位点的数除以比对窗中整个位点数，结果乘以100获得两条序列间的同一性百分比，来计算同一性百分比。
例如，BLAST程序，网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可获得的“BLAST 2序列”（Tatusova等人,“Blast 2sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174:247–250），可配合使用缺省参数（尤其地，参数“空位开放罚分”：5，以及“空位扩展罚分”：2；选择矩阵例如程序推荐的“BLOSUM 62”矩阵）；直接通过程序计算待比较的两条序列间的同一性百分比。
对于和参考氨基酸序列表现出至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列，优选的实例包括那些含有参考序列、某些修饰、尤其是至少一个氨基酸的删除、增加或取代、截短或延长的序列。在取代一个或更多个连续或非连续氨基酸的情况下，取代优选其中取代的氨基酸被“等价”氨基酸代替。此处，表述“等价氨基酸”意图表示任何可能被结构氨基酸中的一个所取代的氨基酸，而不改变相应抗体的生物活性，那些具体实例如下描述。
可以通过其和被取代的氨基酸的结构同源性，或通过可能产生的各种抗体间的生物活性的比较测试结果，来确定等价氨基酸。
作为非限定性实例，如下表1总结了可能实施的不导致相应的修饰抗体显著的生物活性改变的可能取代；在相同条件下，相反的取代在天然中是可能的。
表1
| 原始残基 | 取代 |
| Ala(A) | Val,Gly,Pro |
| Arg(R) | Lys,His |
| Asn(N) | Gln |
| Asp(D) | Glu |
| Cys(C) | Ser |
| Gln(Q) | Asn |
| Glu(G) | Asp |
| Gly(G) | Ala |
| His(H) | Arg |
| Ile(I) | Leu |
| Leu(L) | Ile,Val,Met |
| Lys(K) | Arg |
| Met(M) | Leu |
| Phe(F) | Tyr |
| Pro(P) | Ala |
| Ser(S) | Thr,Cys |
| Thr(T) | Ser |
| Trp(W) | Tyr |
| Tyr(Y) | Phe,Trp |
| Val(V) | Leu,Ala |
本领域技术人员公知在本领域的目前状况下，在3个重链CDR上，更特别地，在该重链的CDR-H3上发现6个CDR间的最大可变性（长度和组成）。
在一个具体实施方式中，本发明涉及小鼠抗体、或其衍生的化合物或功能片段。
本发明的另一个实施方式公开了一种抗体、或其功能片段或衍生物之一，其包括轻链，该轻链包括根据IMGT的下述3种CDR：
－序列SEQ ID No.1或最佳比对后与序列SEQ ID No.1具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L1；
－序列SEQ ID No.2或最佳比对后与序列SEQ ID No.2具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2；和
－序列SEQ ID No.3或最佳比对后与序列SEQ ID No.3具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3；和
重链，该重链含有根据IMGT的下述3种CDR；
－序列SEQ ID No.4或最佳比对后与序列SEQ ID No.4具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H1；
－序列SEQ ID No.5或最佳比对后与序列SEQ ID No.5具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H2；和
-序列SEQ ID No.6或最佳比对后与序列SEQ ID No.6具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，其包含a）轻链，该轻链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包括序列SEQ ID No.1，CDR-L2包括序列SEQ ID No.2和CDR-L3包括序列SEQ ID No.3，和b）重链，该重链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包括序列SEQ ID No.4，CDR-H2包括序列SEQ ID No.5和CDR-H3包括序列SEQ ID No.6。
另外，本发明的另一个实施方式公开了一种抗体、或其功能片段或衍生物之一，其包括轻链，该轻链包括根据IMGT的下述3种CDR：
－序列SEQ ID No.9或最佳比对后与序列SEQ ID No.9具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L1；
－序列SEQ ID No.10或最佳比对后与序列SEQ ID No.10具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2；和
－序列SEQ ID No.11或最佳比对后与序列SEQ ID No.11具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3；和
重链，该重链含有根据IMGT的下述3种CDR；
－序列SEQ ID No.12或最佳比对后与序列SEQ ID No.12具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H1；
－序列SEQ ID No.13或最佳比对后与序列SEQ ID No.13具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H2；和
－序列SEQ ID No.14或最佳比对后与序列SEQ ID No.14具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，其包含a）轻链，该轻链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包括序列SEQ ID No.9，CDR-L2包括序列SEQ ID No.10和CDR-L3包括序列SEQ ID No.11，和b）重链，该重链包含根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包括序列SEQ ID No.12，CDR-H2包括序列SEQ ID No.13和CDR-H3包括序列SEQ ID No.14。
本发明的另一个实施方式公开了一种抗体、或其功能片段或衍生物之一，其包括轻链，该轻链包括根据Kabat的下述3种CDR：
－序列SEQ ID No.17或最佳比对后与序列SEQ ID No.17具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L1；
－序列SEQ ID No.18或最佳比对后与序列SEQ ID No.18具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2；和
－序列SEQ ID No.3或最佳比对后与序列SEQ ID No.3具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3；和
重链，该重链包括根据Kabat的下述3种CDR；
－序列SEQ ID No.19或最佳比对后与序列SEQ ID No.19具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H1；
－序列SEQ ID No.20或最佳比对后与序列SEQ ID No.20具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H2；和
－序列SEQ ID No.21或最佳比对后与序列SEQ ID No.21具有至少80%同一性的序列的CDR-H3。
本发明的另一个实施方式公开了一种抗体、或其功能片段或衍生物之一，其包括轻链，该轻链包括根据Kabat的下述3种CDR：
－序列SEQ ID No.22或最佳比对后与序列SEQ ID No.22具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L1；
－序列SEQ ID No.23或最佳比对后与序列SEQ ID No.23具有至少80%同一性的序列的CDR-L2；和
－序列SEQ ID No.11或最佳比对后与序列SEQ ID No.11具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3；和
重链，该重链含有根据Kabat的下述3种CDR；
－序列SEQ ID No.24或最佳比对后与序列SEQ ID No.24具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H1；
－序列SEQ ID No.25或最佳比对后与序列SEQ ID No.25具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H2；和
－序列SEQ ID No.26或最佳比对后与序列SEQ ID No.26具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3。
根据另一个实施方式，本发明的抗体或其功能片段或衍生物，其特征在于，其含有序列的轻链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQ ID No.7或最佳比对后与序列SEQ ID No.7具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和/或序列的重链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQ ID No.8或最佳比对后与序列SEQ ID No.8具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
因而，本发明描述一种抗体、或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID No.7的序列的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID No.8的序列的重链可变结构域。
根据另一个实施方式，本发明的抗体或其功能片段或衍生物，其特征在于，其含有序列的轻链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQ ID No.15或最佳比对后与序列SEQ ID No.15具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和/或序列的重链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQ ID No.16或最佳比对后与序列SEQ ID No.16具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
因而，本发明描述一种抗体、或其功能片段或衍生物，其在肿瘤上，i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID No.15的序列的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID No.16的序列的重链可变结构域。
如上所示，本发明还涉及任何衍生自本发明所述抗体的化合物。
更具体地，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述衍生化合物由包含肽支架的结合蛋白组成，所述肽支架上嫁接有至少一个CDR，以这种方式来保留所有或部分原始抗体的抗体决定簇识别特性。
本发明所述的CDR序列之中的一个或更多个序列还可以出现在各种免疫球蛋白支架上。在这种情况下，蛋白质序列使得能够重新建造适合所嫁接的CDR进行折叠的肽骨架，使其保留其抗体决定簇抗原-识别特性。
通常，本领域技术人员知道如何确定在其上嫁接至少一个来自原始抗体的CDR的蛋白质支架类型。更具体地，已知，要选择这样的支架必须满足如下尽可能多的原则（Skerra A.,J.Mol.Recogn.,2000,13:167-187）：
-良好的系统发育保守性；
-已知的三维结构（如，例如，通过晶体学、NMR光谱或本领域技术人员公知的任何其它技术）；
-尺寸小；
-很少或没有转录后修饰；和/或
-易于生产、表达和纯化。
这种蛋白质支架的来源可以是，但不限于，选自如下的结构：纤维连接蛋白和优选III型纤维连接蛋白结构域10、脂质运载蛋白、抗运载蛋白（anticalin）（SkerraA.,J.Biotechnol.,2001,74(4):257-75）、来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）蛋白A的结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A或带有重复基序比如“锚蛋白重复”（Kohl等人,PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705）、“犰狳蛋白重复”、“富有亮氨酸重复”和“三角形四肽重复（tetratricopeptide repeat）”的蛋白质。
来自毒素的支架，比如，例如来自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素，以及神经NO合成酶（PIN）的蛋白抑制剂也应当提及。
这种杂交构建的一个实例，绝非限制，是将抗-CD4抗体的CDR-H1（重链），即13B8.2，插入到PIN的一个环中，如此获得的新结合蛋白保留了和原始抗体相同的结合特性（Bes等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2006,343(1),334-344）。基于纯粹说明性的基础，也可以提及将抗溶菌酶VHH抗体的CDR-H3（重链）嫁接至新致癌菌素的一个环上（Nicaise等人,Protein Science,2004,13(7):1882-1891）。
最后，如上所述，这种肽支架可包括1至6个来自原始抗体的CDR。优选，但不是必须的，本领域技术人员将选择至少一个来自重链的CDR，后者被认为主要和抗体的特异性有关。一个或更多个相关的CDR的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的，本领域技术人员将随后选择合适的公知技术（Bes等人,FEBSletters 508,2001,67-74）。
本发明从而涉及抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于肽支架选自这样的蛋白质：a)系统发育上保守性良好，b)坚固的结构，c)具有公知的三维分子组织，d)尺寸小和/或e)包括可以通过不改变稳定特性的删除和/或插入进行修饰的区。
根据优选实施方式，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述肽支架选自如下i）来自纤维连接蛋白，优选III型纤维连接蛋白结构域10、脂质运载蛋白、抗运载蛋白、来自金黄色葡萄球菌蛋白A的结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A或带有重复基序比如“锚蛋白重复”（Kohl等人,PNAS,2003,vol.100,No.4,1700–1705）、“犰狳蛋白重复”、“富有-亮氨酸重复”和“三角形四肽重复”的蛋白的支架，或iii）神经NO合成酶（PIN）的蛋白抑制剂。
本发明的另一方面涉及上述抗体的功能片段。
更具体地，本发明针对抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述功能片段选自片段Fv、Fab、F（ab’）2、Fab’、scFv、scFv-Fc或双特异抗体、或任何半衰期延长的片段比如聚乙二醇化的片段。
根据本发明的这种抗体功能片段由，例如，片段Fv、scFv（sc=简单链）、Fab、F（ab’）2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体、或任何通过化学修饰，比如增加聚亚烷基二醇，如聚乙二醇（聚乙二醇化）（聚乙二醇化的片段涉及Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F（ab’）2-PEG和Fab’-PEG）或通过并入脂质体、微球体或PLGA延长半衰期的片段组成，所述片段具有至少一个本发明特有的CDR，其尤其能够，以常规或甚至部分的方式，展现其所来自的抗体的活性。
优选，所述功能片段将包括或包含其所来自的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留和其所来自的所述抗体相同的结合特异性和足够的亲和性，亲和性优选至少等于其所来自的抗体的1/100，更优选至少1/10。
这种功能片段将含有其所来自抗体的序列的至少5个氨基酸，优选6、7、8、10、15、25、50或100个连续氨基酸。
优选这些功能片段将属于Fv、scFv、Fab、F（ab’）2、F（ab’）、scFv-Fc或双特异抗体类型，其通常具有和其所产生的抗体相同的结合特异性。根据本发明，本发明抗体的片段可以通过如方法比如酶消化，包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶、和/或通过化学还原切割二硫桥从上述抗体获得。所述抗体片段还可以通过本领域技术人员公知的重组遗传技术或通过例如自动肽合成仪（比如Applied BioSystems等销售的那些）的方式进行的肽合成来获得。
为了更加清楚，下表2a总结了根据IMGT的对应本发明抗体的各种氨基酸序列，而表2b总结了根据Kabat的对应本发明抗体的各种氨基酸序列。
表2a（其中Mu.=鼠科）
表2b（其中Mu.=鼠科）
根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤，尤其是保藏于CNCM，法国巴黎的巴斯德研究所，保藏日2009年11月18日，保藏号I-4247的鼠来源的杂交瘤。所述杂交瘤通过融合Balb/C免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/O-Ag14系的细胞而获得。
单克隆抗体，此处是指227D3，或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述抗体由2009年11月18日保藏于CNCM号码为I-4247的杂交瘤分泌，其显而易见形成本发明的一部分。
因而，本发明还包括一种源自杂交瘤I-4247或其亚克隆的单克隆抗体，其在肿瘤上i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet。
根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤，尤其是保藏于CNCM，法国巴黎的巴斯德研究所，保藏日2009年11月18日，保藏号I-4246的鼠来源的杂交瘤。所述杂交瘤通过融合Balb/C免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/O-Ag14系细胞而获得。
单克隆抗体，此处称为205A5，或其衍生的化合物或功能片段，其特征在于所述抗体由保藏于CNCM，保藏日2009年11月18日，保藏号I-4246的杂交瘤分泌，其显而易见形成本发明的一部分。
因而，本发明还包括一种源自杂交瘤I-4246或其亚克隆的单克隆抗体，其在肿瘤上i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet。
在另一个实施方式中，本发明涉及分离的核酸，其特征在于其选自以下核酸：
a）编码上述结合蛋白的核酸、DNA或RNA；
b）编码上述抗体的核酸、DNA或RNA；
c）包含DNA序列的核酸，该DNA序列包含序列SEQ ID No.27至32或35至40；
d）包含DNA序列的核酸，该DNA序列包含序列SEQ ID No.33、34、41或42；
e）如c）或d）中定义的核酸的相应的RNA核酸；和
f）如a）、b）、c）和d）中定义的核酸的互补核酸。
下表3总结了关于本发明抗体的多种核苷酸序列。此处所有的CDR是根据IMGT定义的（根据Kabat的CDR定义没有体现在表3中，但是对于本领域技术人员而言考虑表2b的序列来对其进行定义是显而易见的）。
表3
术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换使用，表示，无论有无修饰，确定核酸的片段或区域的核苷酸精确序列，其含有或不含非天然核苷酸，是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。
此处还应当包括，本发明不涉及处于其天然染色体环境中，即，天然状态的核苷酸序列。本发明的序列是经分离和/或纯化的，即，它们直接或间接地取样，例如通过拷贝，其环境至少部分经过修饰。此处还应当提及，通过重组遗传学，通过，例如宿主细胞的方式、或通过化学合成获得分离的核酸。
“和优选序列最佳比对之后表现出至少80%，优选85%、90%、95%和98%百分比同一性的核序列”表示，就参考核序列而言，显示出某些修饰，比如，尤其是，删除、截短、延长、嵌合融合和/或取代，尤其是定点（突变）（punctual）的核序列。优选，这些是编码和参考序列相同氨基酸序列的序列，这涉及遗传密码的简并、或优选在高度严格的条件下，可能与参考序列特异性杂交的互补序列，尤其是那些如下定义的。
在高度严格的条件下杂交表示这样的条件，即其涉及以这样的方式选择温度和离子强度：其允许在两条互补DNA片段之间维持杂交。基于纯粹说明性的基础，出于确定上述多核苷酸片段的目的，杂交步骤高度严格的条件优选如下。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交以两步进行：（1）在含有5×SSC（1×SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠的溶液）、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠（SDS）、10×Denhardt’s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑鱼精子DNA的磷酸缓冲液（20mM，pH 7.5）中，于42°C下预杂交3小时；（2）在取决于探针长度的温度下进行20小时第一杂交（即：42°C对应探针>100个核苷酸长度），随后是在2×SSC+2%SDS中，20°C下进行两个20分钟的洗涤，在0.1×SSC+0.1%SDS中，20°C下进行一个20分钟的洗涤。在0.1×SSC+0.1%SDS中，在对于探针>100个核苷酸长度的60°C下进行30分钟的最终洗涤。根据Sambrook等人中描述的方法，本领域技术人员可以为更长或更短的寡核苷酸，调整特定尺寸多核苷酸的上述高度严格的杂交条件（Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory；第三版，2001）。
本发明还涉及包括本发明所述核酸的载体。
本发明尤其是指包含这种核苷酸序列的克隆和/或表达载体。
本发明的载体优选包含允许核苷酸序列在指定宿主细胞中表达和/或分泌的元件。所述载体因此必须包含启动子、转录起始和终止信号、以及合适的转录调节区。其必须能够在宿主细胞中以稳定的方式维持，并任选地具有指定翻译的蛋白分泌的特定信号。根据所用宿主细胞，本领域技术人员选择并优化这些多种元件。出于此目的，核苷酸序列可以插入至所选宿主中的自我复制载体或所选宿主的整合载体。
通过本领域技术人员通常使用的方法制备这种载体，可以通过标准方法比如脂质转染、电穿孔、热激或化学方法将产生的克隆引入合适的宿主。
所述载体是，例如，质粒或病毒来源的载体。为了克隆或表达本发明的核苷酸序列其用于转化宿主细胞。
本发明还包括转化有或包括本发明所述载体的宿主细胞。
宿主细胞可以在原核或真核系统中选择，比如细菌细胞，例如，还有酵母细胞或动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。也可用昆虫或植物细胞。
除人类外，本发明还涉及具有根据本发明的转化细胞的动物。
本发明的另一方面涉及生产本发明的能够特异地结合配体非依赖激活形式的cMet蛋白的抗体、或其功能片段之一的方法，特征在于所述方法包括如下步骤：
a）在培养基中以及合适的培养条件下培养根据本发明的宿主细胞；以及
b）回收从培养基质或从所述培养的细胞中如此产生的所述抗体、或其功能片段之一。
本发明的转化细胞对于用于制备本发明的重组多肽的方法是有用的。用于制备重组形式的根据本发明的多肽的方法，特征在于所述方法使用本发明的载体和/或转化有本发明的载体的细胞，也包括在本发明内。优选，转化有本发明的载体的细胞在允许表达前述多肽和允许回收所述重组肽的条件下进行培养。
如已经提及的，宿主细胞可以选自原核或真核系统。尤其是，有可能识别有助于在这种原核或真核系统中分泌的本发明核苷酸序列。携带这种序列的根据本发明的载体因此可以有利地用于生产待分泌的重组蛋白。事实上，它们存在于细胞培养物上清中而不是宿主细胞内的事实将有助于这些目标重组蛋白的纯化。
也可通过化学合成制备本发明的多肽。这样的制备方法之一也是本发明的目的。本领域技术人员知道化学合成的方法，比如固相技术（参见尤其是Steward等人,1984,Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem.Company，Rockford,111,2nded.）或部分固相技术，通过浓缩片段或通过在溶液中常规的合成。通过化学合成获得的以及能够含有相应的非天然氨基酸的多肽也包括在本发明内。可能通过本发明方法获得的抗体、其衍生化合物或功能片段，也包括在本发明内。
本发明还包括根据本发明的结合蛋白或单克隆抗体、或其功能片段或衍生物用于识别配体非依赖激活形式的cMet的用途。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于区分样本中配体非依赖激活形式的cMet和其它形式的cMet（包括非激活的或配体依赖激活形式的cMet）的方法，所述方法包括步骤：
a）使所述样本与根据本发明的结合或抗体、或其功能片段或衍生物接触，和
b）检测所述结合蛋白或抗体与样本的结合。
还公开了本发明的结合蛋白、更特别地抗体作为生物标志物的用途。该方法可用于检测或诊断多种与配体非依赖激活形式的cMet的表达相关的过度增殖的致癌病患，例如，但不局限于，骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、或其它与配体非依赖激活形式的cMet表达相关的癌症。如本领域普通技术人员能够认识的，与特定疾患相关的结合蛋白和/或抗体表达水平将根据预先存在的病症的性质和/或严重性而不同。
在另一个方面，本发明涉及体内用于检测或诊断或分期患者中与配体非依赖激活形式的cMet表达相关的过度增殖致癌疾患的方法，特别是如上引用的所述过度增殖的致癌疾患，所述方法包括步骤：
a）向需要其的患者施用本发明的结合蛋白和/或抗体，优选标记的；和
b）优选通过成像，检测所述结合蛋白或抗体与患者中（优选由怀疑或已知其中存在肿瘤细胞或肿瘤的患者器官）表达的配体非依赖激活形式的cMet的结合（特别用于分期）。
以本领域技术人员已知的任何常规的方式（如，局部的、肠胃外的、肌肉内的等）施用本发明的结合蛋白和/或抗体将提供非常有用的检测样本中发育不良的细胞以及允许临床医生监测经历与配体非依赖激活形式的cMet表达相关的或被其介导的过度增殖疾患治疗的患者的治疗方案的方法。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于体内与配体非依赖激活形式的cMet表达相关的致癌疾患的成像的药物组合物，及其药学上可接受的载体；所述药物组合物包括标记的、且体内结合配体非依赖激活形式的cMet的上述结合蛋白和/或抗体或其片段。
本发明的结合蛋白和抗体，或其功能片段或衍生物，将被用于多种医疗或研究目的，包括多种与配体非依赖激活形式的cMet表达相关的病理的检测、诊断和分期。
确定分期具有潜在的预后价值，并为最佳治疗的设计提供原则。Simpson等人,J.Clin.Oncology 18:2059(2000)。通常，乳腺癌的病理分期，例如，优于临床分期，因为前者提供更准确的预后。然而，如果和病理分期同样准确，那么将优选临床分期，因为其不依赖于介入性过程来获取组织用于病理评价。
当和合适的标记或其它合适的可检测的生物分子或化学物质一同使用时，本发明的结合蛋白和/或抗体尤其可用于体外和体内诊断和预后应用。
用于免疫分析的标记通常对于本领域技术人员是公知的，且包括酶、放射性同位素、以及荧光、发光和发色物质，包括有色颗粒比如胶体金或乳胶珠。合适的免疫分析包括酶联免疫吸附分析（ELISA）。各种类型的标记和将标记缀合至本发明结合蛋白和/或抗体的方法对于本领域技术人员是公知的，比如如下所述。
如此处所用，术语“和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的致癌疾患”意图包括这样的疾病和其它疾患，其中已证实或疑似正在患病的受试者中出现高水平或异常低水平的配体非依赖激活形式的cMet（异常）与疾患的病理生理或造成疾患恶化的因素有关。或者，可通过，例如，细胞表面的配体非依赖激活形式的cMet水平增加导致在患有所述疾患的受试者的感染细胞或组织中提高的cMet酪氨酸自磷酸化，来证明这种疾患。例如，可使用本发明抗体205A5或227D3检测配体非依赖激活形式的cMet水平的提高。此外，其涉及表现出相对自主性生长的细胞，从而它们表现出异常的生长表型，特征在于明显丧失细胞增殖控制。或者，细胞可表达正常水平的配体非依赖激活形式的cMet，但被标记为异常增殖。
在某些实施方式中，“提高的表达”当涉及配体非依赖激活形式的cMet时，其涉及蛋白或基因的表达水平，其说明相对于对照而言（如通过RNA表达或蛋白表达测量的）表达在统计学上显著提高。
更具体地，考虑本发明所述的抗体、或其功能片段或衍生物，用于体外诊断和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的致癌疾患、或体外确定和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的致癌疾患发展的预后的用途。
根据本发明的另一个广泛的方面，其涉及在患者中诊断与配体非依赖激活形式的cMet表达有关的病理性过度增殖性致癌疾患或对该病理病症敏感性的方法，其包括在样本中确定存在或不存在配体非依赖激活形式的cMet携带细胞，以及基于存在或不存在所述配体非依赖激活形式的cMet携带细胞诊断病理病症或对病理病症的敏感性。本发明的结合蛋白或抗体的诊断用途，包括原发性肿瘤、癌症和转移。所述结合蛋白或抗体可以以免疫缀合物的形式、或以标记的结合蛋白/抗体的形式存在，用来获得可检测和/或可量化信号。
更具体地，根据本发明的优选目的是在受试者中体外检测配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤的存在和/或其位置的方法，其中所述方法包括步骤a）使来自受试者的样本与根据本发明的结合蛋白或抗体、或其功能片段或衍生物接触，以及b）检测所述结合蛋白或抗体和样本的结合。所述目的的另一方面是配体非依赖激活形式的cMet表达的后续方面，其作为在临床试验期间对cMet靶向治疗的响应，以及更具体地，当配体非依赖激活形式的cMet下调和或降解成为受试化合物作用机制的组成之一时。
对于技术人员显而易见地，检测本发明的结合蛋白或抗体的结合可以通过多种分析来揭示。尽管用于进行分析的任何方法和本发明是兼容的，作为实例，可以提及FACS、ELISA或IHC。
如此处所用，术语“样本”意图表示任何生物液体、细胞、组织、器官或其部分，其包括或潜在包括赘生细胞，比如来自含有或疑似含有赘生细胞的结肠、胃、直肠、乳房、卵巢、前列腺、肾、肺、血液、脑或其它器官或组织的细胞。术语包括存在于个体的样本以及从个体获得的或来自个体的样本。例如，样本可以是活检获得标本的组织切片、或置于组织培养中或适应组织培养的细胞。样本还可以是亚细胞组分或提取物、或粗的或基本纯的核酸分子或蛋白质制备物。
临床样本意图包括从受试者获得的各种样本类型，并可用于本发明的步骤，比如例如，确定或检测配体非依赖激活形式的cMet表达水平的诊断或监测测试。定义包括通过外科去除获得的固体组织样本、病理标本、保存的样本、或活检标本、组织培养物或来自这些的细胞及其后代、以及从任何这些来源制备的切片或涂片。非限定性实例是从乳房组织、淋巴结、结肠、胰腺、前列腺等获得的样本。定义还包括生物来源的液体样本，并可涉及其中悬浮的细胞或细胞碎片、或涉及液体培养基及其溶质。
根据本发明的另一方面，涉及在来自受试者的cMet表达肿瘤中体外确定配体非依赖激活形式的cMet表达水平的方法，其中所述方法包括步骤a）用来自受试者的样本接触根据本发明的结合蛋白或抗体、或其功能片段或衍生物，以及b）定量确定在所述样本中结合至配体非依赖激活形式的cMet的结合蛋白或抗体水平。
对本领域技术人员是显而易见的，可以以多种方式定量结合蛋白或抗体结合配体非依赖激活形式的cMet的水平，比如通过各种分析。尽管用于进行分析的任何方式和本发明是兼容的，优选方法是根据ELISA技术进行免疫酶方法，通过免疫荧光、通过免疫组织化学或放射免疫法（RIA）技术或等同技术。
在本发明的方法的一个优选的实施方式中，通过免疫组织化学（IHC）测量配体非依赖激活形式的cMet的表达水平。
优选，生物样本通过生物液体，比如人类来源的血清、全血、细胞、组织样本或活检形成的。所述样本，可例如包括，活检组织，其可以方便地用来分析和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的病理性过度增殖性致癌疾患的存在。
一旦确定了配体非依赖激活形式的cMet存在于测试样本中的量，其结果可以和对照样本的值比较，所述对照样本的值是以和测试样本相似的方式获得的，但是其来自未患有或不存在和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的病理性过度增殖性致癌疾患的个体。如果配体非依赖激活形式的cMet水平在测试样本中显著提高，可得出这样的结论，其所来自的受试者患有或将发展为所述疾患的可能性增加。
本发明涉及，更具体地，体外诊断受试者中配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤或体外确定发展成配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤预后的方法，其中所述方法包括步骤a）如上述确定配体非依赖激活形式的cMet表达水平，以及b）比较步骤a）的表达水平和来自正常组织或非表达配体非依赖激活形式的cMet组织的配体非依赖激活形式的cMet参考表达水平。
如本申请中所用“诊断”疾病意图包括，例如，诊断或检测和配体非依赖激活形式的cMet表达有关或由其介导的病理性过度增殖性致癌疾患的存在、监测疾病的进展、以及鉴定或检测预示和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的疾患的细胞或样本。
如本申请中所用“预后”表示疾病痊愈或预测疾病可能的发展或结果的可能性。例如，如果来自受试者的样本用本发明的结合蛋白或抗体染色呈阳性，那么对那个受试者的“预后”优于配体非依赖激活形式的cMet染色呈阴性的样本。如将在此后更加详细描述的，以合适的等级，针对配体非依赖激活形式的cMet表达水平给样本评分。
然而，本发明的另一方面还涉及，针对将诱导cMet降解作为其作用机制之一的治疗性化合物，监测配体非依赖激活形式的cMet表达。在该情况下，配体非依赖激活形式的cMet表达于细胞膜上后，将成为重要的工具来评价临床试验和“个性化”治疗期间的治疗效果。
配体非依赖激活形式的cMet表达水平有利地，相对于对照细胞或样本中的水平（也作“参考水平”或“参考表达水平”），进行比较或测量。“参考水平”、“参考表达水平”、“对照水平”和“对照”在本说明书中是可互换的。广义上讲，“对照水平”表示在相比较的对照细胞中测量的独立的基线水平，其通常是没有疾病或癌症的。其可能来自相同的个体或来自另一个个体，所述个体是正常的或不存在和获得患病的或测试的样本的个体相同的疾病。在本发明的内容中，术语“参考水平”涉及配体非依赖激活形式的cMet表达的“对照水平”，用于评价患者含有癌细胞的样本中配体非依赖激活形式的cMet表达的测试水平。例如，当配体非依赖激活形式的cMet在患者生物样本中的水平高于配体非依赖激活形式的cMet参考水平时，所述细胞将被认为具有配体非依赖激活形式的cMet的高水平表达、或过度表达。可以通过很多方法确定参考水平。表达水平可因此定义配体非依赖激活形式的cMet携带细胞或作为替代，独立于表达配体非依赖激活形式的cMet的细胞的数目的配体非依赖激活形式的cMet表达水平。因此，可以通过配体非依赖激活形式的cMet参考比排除各患者的参考水平，其中所述参考比可以通过任何确定此处所述参考水平的方法确定。
例如，对照可以是预定的值，其可以采取各种形式。其可以是单个的截止值（cut-off值），比如中位数或均值。所述“参考水平”可以是单个数字，均等地适用于每个患者，或参考水平可以根据具体的患者亚群而不同。因此，例如，对于相同的癌症，年长的男性和年轻的男性相比，可能具有不同的参考水平，以及对于相同的癌症，女性和男性相比，可能具有不同的参考水平。或者，所述“参考水平”可以通过测量配体非依赖激活形式的cMet在来自和待测试赘生细胞的组织相同组织的非致癌癌症细胞中的表达水平来确定。而且，所述“参考水平”可能是配体非依赖激活形式的cMet在患者赘生细胞中相对于在相同患者非肿瘤细胞中配体非依赖激活形式的cMet水平的特定比。所述“参考水平”也可以是体外培养细胞的配体非依赖激活形式的cMet水平，该培养细胞可以经操作来模拟肿瘤细胞、或可以以任何其它方式操作产生准确确定参考水平的表达水平。另一方面，可以基于可比较的组建立“参考水平”，比如在不具有升高的配体非依赖激活形式的cMet水平的组和具有升高的配体非依赖激活形式的cMet水平的组中。可比较的组的另一个实例是具有特定疾病、病症或症状的组以及没有疾病的组。可以安排预定值，例如，当测试群体均等地（或不均等）分至各组时，比如低-风险组、中等-风险组和高-风险组、或分至四分之一或五分之一，最低的四分之一或五分之一是具有最低风险或最高量配体非依赖激活形式的cMet的个体，且最高的四分之一或五分之一是具有最高风险或最低量配体非依赖激活形式的cMet的个体。
也可以通过比较患有相同癌症的患者群体中配体非依赖激活形式的cMet水平确定参考水平。这可以通过，例如，柱状图分析来完成，其中整个患者群体以图形呈现，其中第一个轴代表配体非依赖激活形式的cMet水平，第二个轴代表群体中其肿瘤细胞表达给定水平配体非依赖激活形式的cMet的患者数目。可以通过鉴定具有相同或相似配体非依赖激活形式的cMet水平的群体亚群来确定两个或更多个分开的患者组。然后可以基于最能区分这些分组的水平来确定参考水平。参考水平还可以代表两个或更多个标志物的水平，其中之一是配体非依赖激活形式的cMet。可以通过，例如，各标志物水平值的比，表示两个或更多个标志物。
同样，明显地看起来健康的群体将具有与已知患有和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的病症的群体不同的“正常”范围。因此，所选的预定值可考虑个体所落入的类别。本领域普通技术人员可以只用常规实验选择合适的范围和类别。通过“升高的”、“增加的”表示高于所选的对照。通常，对照将基于合适的年龄段内明显健康的正常个体。
还应了解，根据本发明的对照可能是，除了预定值外，和实验材料平行检测的材料样本。实例包括同时从相同受试者获得的组织或细胞，例如，来自受试者单个活检标本的部分、或单细胞样本的部分。
在患有配体非依赖激活形式的cMet介导的疾病的患者的临床诊断或监测中，和来自正常受试者或非癌组织相应生物样本中的水平比较，检测到配体非依赖激活形式的cMet表达细胞或配体非依赖激活形式的cMet表达水平提高，通常表示患者患有或疑似患有配体非依赖激活形式的cMet介导的疾患。
根据上述，本发明提供用于预测对癌症的敏感性的方法，其包括检测组织样本中的配体非依赖激活形式的cMet表达水平，其存在表示对癌症的敏感性，其中配体非依赖激活形式的cMet表达的程度和敏感性程度有关。因此，在具体的实施方式中，检验在，例如，前列腺组织、骨肉瘤组织、肺组织、胰腺组织、结肠组织、乳房组织、胶质母细胞瘤组织、卵巢组织、或任何疑似表达配体非依赖激活形式的cMet的细胞的其它组织中的配体非依赖激活形式的cMet的表达，在样本中出现配体非依赖激活形式的cMet提供了癌症敏感性或组织特异性肿瘤的出现或存在的指征。
还提供了评价肿瘤侵袭性的方法。在一个实施方式中，用于在个体中一段时间内观察恶性肿瘤进展的方法，其包括确定肿瘤样本中细胞表达的配体非依赖激活形式的cMet的水平，比较这样确定的水平和在不同时间从相同个体取出的等价组织样本中表达的配体非依赖激活形式的cMet水平，其中肿瘤样本中一段时间内配体非依赖激活形式的cMet表达程度提供癌症进展的信息。
在另一个实施方式中，本申请提供用于确定受试者合适的治疗方案的方法。具体地，本发明的结合蛋白或抗体对于在个体中监测恶性肿瘤的改善进程是非常有用的，尤其在这样的情况下，其中用不与本发明的结合蛋白或抗体竞争结合配体非依赖激活形式的cMet的cMet结合蛋白或抗体治疗受试者。根据本发明的配体非依赖激活形式的cMet水平的存在或不存在或变化可表示受试者倾向于具有和配体非依赖激活形式的cMet相关的癌症复发或进行性、或持久性癌症。因此，通过测量表达配体非依赖激活形式的cMet的细胞数目的增加或各种组织或细胞中配体非依赖激活形式的cMet浓度变化，有可能确定目的在于改善和配体非依赖激活形式的cMet有关的恶性肿瘤的特定治疗方案是否有效。
本发明的另一个目的是和配体非依赖激活形式的cMet表达有关的致癌疾患体内成像的方法。例如，这种方法可用在出现致癌疾患症状的患者上。如果患者具有，例如提高的配体非依赖激活形式的cMet表达水平，那么所述患者可能患有癌症疾病。同时，所述方法可用于在患者中监测对治疗的进展和/或响应，所述患者之前诊断患有配体非依赖激活形式的cMet介导的癌症。根据上述目的，本发明提供了一种体内成像试剂，其包括根据本发明的结合蛋白或抗体、或其功能片段或衍生物，优选标记的，尤其是放射标记的，及其在医学成像中的用途。因此，根据本发明的一般方法通过如下发挥作用，向患者施用成像有效量的成像试剂（比如上述标记的结合蛋白或抗体）和药学上有效的载体，然后其结合样本中存在的配体非依赖激活形式的cMet之后检测该试剂。在某些实施方式中，所述方法是通过施用包括靶向部分（moiety）和活性部分的成像有效量的成像试剂发挥作用的。在哺乳动物比如人类中以诊断用途的有效量施用成像试剂，然后检测成像试剂的定位和积累。可通过放射性核素成像、放射性闪烁摄影术、核磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、计算机轴断层扫描、X-射线或磁共振成像法、荧光检测和化学发光检测来检测成像试剂的定位和积累。
关于靶向抗肿瘤治疗的发展，采用免疫组织学技术的诊断给出，原位，受体表达水平的信息，从而根据受体表达水平，使得能够选择需要这种治疗的对治疗敏感的患者。
对于使用单克隆抗体的免疫治疗，对治疗的响应取决于受体靶向的表达水平，正如用曲妥珠单抗的治疗，其中，随着人化抗-Her2单克隆抗体曲妥珠单抗的出现，现今确定乳癌中Her2的过度表达具有主要的临床重要性。显示出Her2过度表达，是用曲妥珠单抗治疗的前提条件，因为其通过特异性靶向Her2过度表达的癌细胞来发挥作用。准确的Her2测试目的在于保证没有给非过度表达的肿瘤的患者施加昂贵的和潜在毒性的曲妥珠单抗治疗，以及保证每个可能受益于曲妥珠单抗的患者接受合适的治疗。
曲妥珠单抗的教导关注选择过度表达Her2的患者，其显示当采用使用单克隆抗体的治疗时确定受体表达水平的益处，以及对发展可用于患者选择的单克隆抗体（同时不仅是治疗性单克隆抗体）的益处。
结果，本发明涉及体外确定受试者肿瘤的配体非依赖激活形式的cMet状态的方法，其中所述方法包括步骤a）如上述确定配体非依赖激活形式的cMet表达水平，b）为所述肿瘤进行配体非依赖激活形式的cMet表达水平评分，以及c）比较所述评分和对照样本获得的评分。
在本发明的意义内，“配体非依赖激活形式的cMet状态”涉及基于通过如荧光原位杂交（FISH）、发色原位杂交（CISH）、基因芯片或本领域技术人员已知的其它方法中的任何方法测量的配体非依赖激活形式的cMet表达水平的确定，将肿瘤分类至配体非依赖激活形式的cMet阳性（配体非依赖激活形式的cMet（+））或配体非依赖激活形式的cMet阴性（配体非依赖激活形式的cMet（-））的类别。
在优选实施方式中，当组织样本是福尔马林固定和石蜡包埋的时，用于诊断的抗体应能够结合靶向受体。
更具体地，通过免疫组织化学（IHC）测量配体非依赖激活形式的cMet表达水平。
作为实例，在从0到3+的结合蛋白或抗体染色水平等级上，针对配体非依赖激活形式的cMet表达水平给样本评分，其中，在四个强度逐渐提高的半定量阶梯上，0是阴性，以及1+-3+代表阳性染色。得分1+-3+可以被记录为阳性，因为各阳性评分和零分（阴性）比较时，可能和显著降低的复发和致命性疾病风险有关，但是阳性评分中提高的强度可能提供额外的风险降低。任何常规的危害分析方法可用于评价配体非依赖激活形式的cMet预后值。代表性分析方法包括Cox回归分析，这是用于，在删失数据存在时，存活或时间-对-事件数据建模的半参数方法（Hosmer和Lemeshow,1999;Cox,1972）。相对于其它存活分析，如寿命表或Kaplan-Meyer，Cox允许在模型中纳入预测变量（协变量）。用常规分析方法，如，Cox，人们能够检验关于原发性肿瘤中配体非依赖激活形式的cMet表达状态和时间-对-疾病复发的发生（无疾病存活时间、或时间对转移性疾病）或时间-对-因疾病死亡（整个存活时间））的关系的假设。Cox回归分析也被视为Cox比例危害分析。这种方法是检验肿瘤标志物对患者存活时间预后值的标准方法。当用于多变量模型时，平行测试多种变量的作用，从而可以确定具有独立预后值的各变量，即最有用的标志物。术语肿瘤的阳性或阴性“配体非依赖激活形式的cMet状态”（也称作配体非依赖激活形式的cMet(+)或配体非依赖激活形式的cMet(-)）分别涉及0分或1+-3+分。
在诊断或监测癌症期间可给样本“评分”。以其最简单的形式，通过免疫组织化学目测检验样本，评分可直截了当地判断为阴性或阳性。更加定量的评分涉及判断两个参数，取样细胞的染色强度和染色（“阳性”）细胞的百分比。基于这两个参数，可以指定数值来反应阳性染色的提高水平。Allred等人（Allred,Harvey等人1998）已经描述了获得其的一种途径，其中涉及在从0（阴性）至3+的等级上评分两个参数，并综合各参数的评分获得总分。等级中的结果具有可能的评分0、2、3、4、5、6、7或8（Payne等人Predicitive markers in breast cancer-the present.Histopathology 2008,52,82-90）（注意到在Allred等级中1分是不可能的）。一个多少更简单些的评分方法，以从0至3+的组合等级，整合了核染色强度以及显示核染色的细胞比例。各评分方法均可用于在细胞核中评分激活的Stat5的强度和染色比例。用于本说明书的术语肿瘤的阳性或阴性“配体非依赖激活形式的cMet状态”分别涉及在简化等级上对应着评分0或1+-3+的配体非依赖激活形式的cMet表达水平。
通常，根据本发明的测试或分析结果可以以任何各种格式体现。结果可以以定性形式体现。例如，测试报告可仅表示是否测试了特定的多肽，也许还表明检测限。结果可以以半定量形式体现。例如，可以确定各种范围，以及范围可以指定为提供定量信息的特定程度的评分（如1+至3+）。这种评分可体现各种因素，如在其中检测到配体非依赖激活形式的cMet的细胞数目、信号强度（其可表示配体非依赖激活形式的cMet或配体非依赖激活形式的cMet携带细胞的表达水平）等。结果可以以定量形式体现，如，作为在其中检测到多肽（配体非依赖激活形式的cMet）的细胞百分比、作为蛋白浓度等。如对于本领域普通技术人员是显而易见的，测试提供的输出类型将依据测试的技术限制以及和多肽检测有关的生物重要性而不同。例如，在某些多肽的情况下，纯定性输出（如在特定检测水平是否检测到多肽）提供重要的信息。在其它情况下，更加定量的输出（如待测试样本中多肽表达水平相对于正常水平的比例）是必要的。
在更优选实施方式中，配体非依赖激活形式的cMet表达水平评分的等级从0至3+，基于对反应产物强度和阳性细胞百分比的评价。为了更加清楚，随后表4总结了这些参数。只应当考虑完整的圆周的侵袭性肿瘤的膜反应性，并通常认为是“铁丝织网”外观。根据目前的指南，样本对于配体非依赖激活形式的cMet IHC评分为交界性的（评分2+或以上）必须认为是配体非依赖激活形式的cMet(+)，并需要经历进一步评价。应当通过FISH或任何其它方法拒绝、以及重复或测试IHC分析，如果，作为非限定性实例，对照不符合预期、伪影参与大部分样本以及样本具有正常乳房导管（内对照）的强的膜阳性，这表明过度的抗原复原。
表4
一个根据本发明的方法的更优选实施方式中，所述评分包括使用基于两个参数的适当的等级，其中所述参数为染色强度和阳性细胞百分比。
在优选实施方式中，本发明的方法涉及适当等级是0至3+的等级，其中没有肿瘤细胞膜反应性得分为0，在10％以上肿瘤细胞中强烈完整的反应性得分为3+。
更详细地，如上所述，所述适当等级是0至3的等级，其中没有肿瘤细胞膜反应性得分为0；在10％以上肿瘤细胞中微弱察觉的膜反应性得分为1+；在10％以上肿瘤细胞中从弱到中等完整的膜反应性得分为2+；以及在10％以上肿瘤细胞中强烈完整的反应性得分为3+。
在本发明的具体方面中，肿瘤是得分为2+的配体非依赖激活形式的cMet(+)。
在本发明的具体方面中，肿瘤是得分为3+的配体非依赖激活形式的cMet(+)。
在本发明的另一个具体方面中，肿瘤是得分为2+或3+的配体非依赖激活形式的cMet(+)。
根据本发明，还描述了确定致癌疾患对用抗-配体非依赖激活形式的cMet结合蛋白或抗体、或其片段或衍生物的治疗是否敏感的方法，其中所述方法包括步骤（a）如上述，体外确定受试者的肿瘤配体非依赖激活形式的cMet状态，以及（b）如果状态是配体非依赖激活形式的cMet(+)，确定致癌疾患对用抗-配体非依赖激活形式的cMet结合蛋白或抗体、或其片段或衍生物的治疗敏感。
在本发明的另一方面中，考虑用于这种诊断或预后方法的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的结合蛋白和/或抗体。
为便利起见，一种以预定量带有说明书用于进行诊断分析的试剂包装组合，如试剂盒，也包括在本发明范围内。所述试剂盒包含用于体外检测和定量配体非依赖激活形式的cMet的结合蛋白或抗体，如在ELISA或Western印迹中。本发明所述结合蛋白或抗体可以在试剂盒中提供，用于体外检测和定量配体非依赖激活形式的cMet，如在ELISA或Western印迹中。当结合蛋白或抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子（如底物前体，其提供可检测的发色团或荧光团）。此外，可包括其它添加剂比如稳定剂、缓冲液（如封闭缓冲液或裂解缓冲液）等。这种试剂盒可包括容器，其经划分来容纳一个或更多个容器比如瓶、管等，这种容器盛放本发明独立的组件。例如，一个容器可包含结合至不溶或部分可溶载体的第一结合蛋白或抗体。第二容器可包含可溶、可检测-标记的第二结合蛋白或抗体，以冻干形式或溶液中。容器还可含有第三容器，其盛放可检测标记的第三结合蛋白或抗体，以冻干形式或溶液中。这种性质的试剂盒可用于本发明的三明治分析。标签或包装插页可提供组成的描述以及体外预期或诊断用途的说明。
各种试剂的相对量可以在很大范围内变化，以供试剂溶液的浓缩，其大大优化了分析的灵敏度。具体地，可以以干粉，通常冻干粉，形式提供包括赋形剂的试剂，经溶解将提供具有合适浓度的试剂溶液。
在本发明的另一方面中，提供此处详述的结合蛋白、抗体或其结合片段，其标记有可检测部分，从而其可包装于和用于，例如，试剂盒中，来诊断或鉴定具有前述抗原的细胞。这种标记的非限定性实例包括荧光团比如异硫氰酸荧光素；发色团、放射性核素、或酶。这种标记抗体或结合片段可用于，例如，抗原的组织学定位、ELISA、细胞分选以及用于检测或定量配体非依赖激活形式的cMet和此抗原携带细胞的其它免疫技术。
试剂盒还提供用于从细胞中纯化或免疫沉淀配体非依赖激活形式的cMet的阳性对照用于凋亡分析。为了分离和纯化配体非依赖激活形式的cMet，试剂盒可包含偶联至珠（如琼脂糖珠）的此处所述抗体或其抗原结合片段。可以提供试剂盒，其包含用于体外检测和定量配体非依赖激活形式的cMet的结合蛋白或抗体，如在ELISA或Western印迹中。如同制造品，试剂盒包括容器以及容器上或附着的标签或包装插页。容器容纳包括至少一种本发明抗-配体非依赖激活形式的cMet结合蛋白或抗体或其结合片段的组合物。可包括其它容器，其包含，如稀释剂和缓冲液、对照抗体。标签或包装插页可提供组成的描述以及体外预期或诊断用途的说明。
更具体地，本发明涉及通过本领域技术人员公知的任何方法确定肿瘤配体非依赖激活形式的cMet状态的试剂盒。在优选实施方式中，正如将在实施例中描述，本发明涉及通过IHC方法确定肿瘤配体非依赖激活形式的cMet状态的试剂盒。
在一个具体实施方式中，本发明由包括至少结合蛋白或抗体、或其功能片段或衍生物的试剂盒组成，如上所述，所述结合蛋白或抗体是经标记的。
必须了解，本领域技术人员可以使用任何标记方法比如，例如，使用上述标记。
在一个优选实施方式中，用于体外检测受试者中配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤的存在和/或位点的本发明的试剂盒，还包括用于检测所述标记的结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet之间结合程度的试剂。
在另一个优选实施方式中，用于体外确定配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤中配体非依赖激活形式的cMet的表达水平的本发明的试剂盒，还包括用于定量所述标记的结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet之间结合水平的试剂。
在另一个实施方式中，用于体外确定肿瘤的配体非依赖激活形式的cMet状态的本发明的试剂盒还包括：
a)用于检测所述标记的结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet之间结合程度的试剂；以及
b)用于配体非依赖激活形式的cMet表达水平评分的阳性和阴性对照样本。
用于体外确定肿瘤的配体非依赖激活形式的cMet状态的所述试剂盒还包括：
i）特异地针对鼠科抗体的第二个标记的多克隆抗体；
ii）用于检测所述第二标记的抗体和鼠科抗体对配体非依赖激活形式的cMet间的结合程度的试剂；和
iii）用于评分配体非依赖激活形式的cMet表达水平的阳性和阴性对照样本。
本发明还包括包含抗体的结合蛋白、或其功能片段或衍生物，其与本发明的结合蛋白交叉竞争去结合配体非依赖激活形式的cMet。
本发明还包括包含抗体的结合蛋白、或其功能片段或衍生物，其与本发明的抗体交叉竞争去结合配体非依赖激活形式的cMet。
在另一个实施方式中，本发明还涉及根据本发明的结合蛋白或抗体，或其功能片段或衍生物用于鉴定能够特异地结合配体非依赖激活形式的cMet的结合蛋白，包括抗体。
更特别地，在一个优选的实施方式中，描述了一种鉴定对配体非依赖激活形式的cMet的结合配偶体的方法，其包括步骤：
a）使配体非依赖激活形式的cMet与根据本发明的结合蛋白或抗体，或其功能片段或衍生物接触；
b）使a）的复合物与化合物库接触；
c）鉴定干扰a）的复合物的化合物。
本发明还包括用于纯化配体非依赖激活形式的cMet的方法，其中所述方法包括如下步骤：
a）在允许所述结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet特异结合的条件下，根据本发明的结合蛋白或抗体、或其功能片段或衍生物与样本一起孵育；和
b）从样本中分离结合蛋白或抗体，并获得纯化的配体非依赖激活形式的cMet。
在另一个具体的方面，本发明包括通过本发明的结合蛋白、或其功能片段或衍生物与配体非依赖激活形式的cMet结合形成的复合物。
相似地，本发明还包括通过本发明的抗体、或其功能片段或衍生物与配体非依赖激活形式的cMet结合形成的复合物。
在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的结合蛋白或抗体、或其功能片段或衍生物作为意图特异地将生物活性化合物靶向表达配体非依赖激活形式的cMet表达细胞的媒介（vehicule）的用途。更特别地，所述生物活性化合物选自化疗剂、放射性同位素或毒素。
在另一个实施方式中，本发明由用于生产抗体、或其功能片段或衍生物的方法组成，其i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，所述方法的特征在于，其包括步骤：
a）用转染的或表达cMet蛋白或其片段的肿瘤细胞系免疫动物；
b）从动物中取出抗体产生细胞；
c）将所述抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞；
d）进行筛选分析，从而选择产生抗体的杂交瘤细胞，其i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet；
e）在细胞培养基中培养产生抗体的选择的杂交瘤；以及
f）从细胞培养物取出抗体。
在一个更优选的实施方式中，上述步骤d）中描述的筛选分析由IHC筛选分析组成。
在另一个更优选的实施方式中，所述IHC筛选分析包括步骤：
a）从表达不同形式的cMet肿瘤中收集组织切片，
b）使用用于产生抗体、或其功能片段或衍生物的方法的步骤c）的杂交瘤，同时在步骤a）的不同的组织切片上进行IHC染色，所述杂交瘤i）特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii）不结合上述非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet，
c）选择在表达配体非依赖激活形式的cMet的组织切片上具有特异反应，而在其它组织切片上没有反应的杂交瘤。
本发明的其它特征和优点见于如下具有实施例和附图的说明书部分，以及附图标记（legend）如下所示。
附图说明
图1A-1B：通过m205A5（A）或m227D3（B）Mab的cMet的FACS识别。
图2：在固定的二聚cMet蛋白上m205A5和m227D3Mab的滴定曲线。
图3A-3C：在石蜡包埋的肿瘤（MCF7、U87MG和Hs746T）上m227D3和m205A5IHC的识别模式。
图4A-4C：在石蜡包埋的肿瘤（MCF7、U87MG、Hs746T、MKN45和EBC-1）上m227D3和商售的抗cMet抗体3D4的IHC识别组（panel）。
图5：通过ELISA用m205A5或m227D3Mab的HGF竞争分析。
图6：m224G11在Hs746T异种移植模型上的抗肿瘤活性。
图7：通过Western印记分析的对照小鼠和m224G11治疗的小鼠的Hs746T肿瘤上cMet表达的离体分析。
图8A-8B：通过IHC使用m205A5的对照小鼠和m224G11治疗的小鼠的Hs746T肿瘤上cMet表达的离体分析。
图9：表达多种水平的cMet的肝肿瘤组织的石蜡包埋的切片形式的IHC染色。
具体实施方式
实施例1：可用于诊断目的的抗配体非依赖激活形式的cMet的抗体的产生。
为了产生抗-cMet抗体，用在其质膜上表达cMet的CHO转染细胞系对8周龄的BALB/c小鼠皮下免疫3至5次（20×106细胞/剂量/小鼠）、或2至3次用cMet胞外结构域融合蛋白（10-15μg/剂量/小鼠）（R&D Systems,Catalog#358MT）或混合完全弗氏佐剂的这种重组蛋白的片段用于第一次免疫，以及不完全弗氏佐剂用于随后的一次。细胞融合的前三天，小鼠用重组蛋白或片段通过腹腔注射或静脉内注射进行加强。然后收集小鼠的肾，与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞（ATCC）融合，进行HAT选择。通常，为了制备单克隆抗体或其功能片段，尤其是鼠科来源的，可能涉及尤其是手册《抗体》中描述的技术（Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726,1988）或涉及Kohler和Milstein描述的制备杂交瘤的技术（Nature,256:495-497,1975）。
首先通过ELISA在二聚的cMet-Fc重组蛋白上对获得的杂交瘤进行筛选。简单来说，重组人cMet蛋白4°C下过夜包被至Immulon II 96-孔板上，用0.5%明胶溶液封闭1小时的步骤后，加入纯杂交瘤上清液，在37°C下持续另外的1小时。然后洗涤板，加入羊抗鼠（Jackson）特异性IgG HRP在37°C下，持续1小时。用TMB底物溶液进行反应显色。然后通过FACS分析在表达中等至高水平cMet的A459细胞系上进行第二次筛选，以确保产生的抗体也能够识别肿瘤细胞上天然受体。出于此目的，2×105细胞与10μg/ml m205A、m227D3或m10D9（IgG1同种型对照Mab）在4°C下孵育20分钟。在补充有1%BSA和0.01%NaN3的磷酸缓冲盐（PBS）中洗涤三次之后，细胞与二抗羊抗鼠Alexa 488（1/500稀释）在4°C下孵育20分钟。在补充有1%BSA和0.1%NaN3的PBS中再洗涤三次之后，通过FACS（Facscalibur,Becton-Dickinson）分析细胞。至少评价5000个细胞来计算荧光强度平均值。
表5
这个测试中的阳性杂交瘤是扩增的、克隆的、同种型和扩展的。然后收集新杂交瘤上清。确定其IgG含量。在五株人类肿瘤细胞系（A549、BXPC3、MCF7、U87MG和HepG2）的组上进行互补细胞计数分析。所有这些细胞系由ATCC提供。获得的数据见于图1，MFI值见于表5。
用纯化的205A5或227D3抗体进行互补实验。在二聚的cMet-Fc蛋白上进行第一抗体滴定。滴定曲线显示于图2中。
205A5和227D3抗体符合上述两个原则（i）在ELISA测试上cMet识别，（ii）结合人肿瘤细胞系表面表达的天然cMet，并被筛选用于进一步的分析。
筛选Mab用于最终的来自表达cMet肿瘤异种移植的石蜡包埋的切片上的cMet识别测试。为了该评估，来自MCF7、U87-MG和Hs746T（已知表达不同cMet水平的肿瘤）异种移植的肿瘤切片脱石蜡、再水化、并放置于在98℃预热的沸水水浴中的Target Retrieval缓冲液1×（Dako S1699）中，以便在98℃持续30分钟热诱导表位恢复，并随后在Target Retrieval缓冲液中放置另外的30分钟。在Tris缓冲盐溶液-0.05%吐温20（TBS-T）（Dako S3006）中冲洗3次后，使用过氧化物酶封闭试剂（Dako K4007）封闭内源的过氧化物酶活性，持续5分钟。用TBS-T冲洗切片，与封闭试剂（UltraVblock-TA-125UB-LabVision）孵育5分钟，之后添加待测试的cMet小鼠单克隆抗体（5μg/ml）。小鼠IgG1/κ（5μg/ml,X0931，Dako）用作阴性对照。然后将切片在室温下孵育2小时，用TBS-T冲洗并与Envision DualLink Peroxydase System（Dako K4061）孵育。二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物用于棕色反应产物的显色。
图3中所示的结果表明如预期的，使用IgG1同种型对照（图3组A）没有观察到染色，而227D3（图3组B）和205A（图3组C）均能够仅在Hs746T异种移植肿瘤上识别cMet，尽管所有3种肿瘤表达不同水平的cMet。这些第一次的结果表明205A5和227D3抗体均仅识别表达在扩增的肿瘤细胞上cMet的特定形式。
为了确认这些Mab的识别模式，使用205A5、227D3、或3D4（一种来自Invitrogen的商业上可购得的抗体，已经描述了其在IHC上的cMet识别）检测了来自异种移植小鼠的一组肿瘤的cMet表达。如图4组C中所示，3D4在所有肿瘤类型中识别cMet。使用227D3（组A）或205A5（数据未表示）,仅在带有构成激活形式的cMet的3种肿瘤类型上观察到强的膜染色（由于cMet扩增导致cMet的过度表达）：Hs746T、MKN45和EBC-1。如预期的，使用mIgG1同种型对照没有观察到染色（图4组B）。
实施例2：在存在205A5或227D3抗体时进行的HGF竞争实验
为了进一步表征诊断Mab，进行了HGF竞争实验。在存在或不存在待测试Mab下，在分开的饱和（1×PBS中0.5%明胶）板上制备包含cMet蛋白的第一反应混合物。进行鼠科抗体（参考和待研究的Mab）的系列1:2稀释（从40μg/ml开始经过12倍体积）。然后，加入0.8μg/ml rh cMet-Fc蛋白（RDSystems，ref358-MT/CF），除了仅包含ELISA稀释液（0.1%明胶、PBS 1×中的0.05%吐温20）的阴性对照系以外。在均质化后，用PBS中0.3μg/ml rhHGF溶液（RDSystems，ref294-HGN/CF）将竞争样本加载到HGF-包被的板上进行包被。孵育和几次冲洗后，使用羊抗人IgG-HRP（Jackson，ref 109-035-098）检测结合的cMet蛋白。一旦结合，将TMB底物添加到板上。通过添加H2SO4酸溶液终止反应，并使用微板阅读装置在450nm下获得光强度。
在cMet-Fc重组蛋白存在或不存在下用205A5和227D3进行实验（参见图5）。该实验表明205A5和227D3Mab不与cMet竞争结合到其固定的配体受体上。
实施例3：抗体特异性
带有Hs746T肿瘤的小鼠的m224G11处理诱导了肿瘤生长的显著减小（图6）。当分析来自该实验的肿瘤时，抗肿瘤活性导致了m224G11处理小鼠相对对照小鼠中Ki67表达的降低（数据未显示），且导致了通过Western印记分析中证实的cMet表达的强烈的下调（图7）。为了进行WB分析，取出肿瘤并迅速在氮中冰冻。然后，将其裂解，并且相同量的蛋白进行免疫印迹。最后，使用商业可购得的抗Met-beta亚基25H2Mab（来自Cell Signalling）揭示cMet。
当用205A5通过IHC分析来自相同实验的肿瘤时，在处理小鼠中观察到预期的cMet表达的下调，而对照组的所有肿瘤细胞为Met阳性（图8）。
事实上，如图8A所示，当使用205A5MAb染色来自对照小鼠的肿瘤时，在所有3只小鼠的肿瘤细胞中观察到强的膜和均质的染色。当用205A5染色来自m224G11处理小鼠的肿瘤时，观察到膜染色强烈的降低（图8B）。这些数据与之前通过Western印记分析中观察到的一致（图7），表明205A5特异地识别cMet。
实施例4：用m224G11Mab对组织进行配体非依赖激活形式的cMet表达的评分
使用上述方案，和在图9中总结的，用m205A5Mab对表达各种水平的配体非依赖激活形式的cMet的一套石蜡包埋的人肿瘤组织进行染色。
显示于图9中的结果表明在肝细胞癌中，m205A5能够区分具有各种配体非依赖激活形式的cMet的水平的人肿瘤。使用该抗体，肿瘤可被评分为：
-0：阴性肿瘤，其中没有观察到膜染色或观察到10%以下的膜阳性细胞，
-1+:10%以上的肿瘤细胞中观察到几乎难以察觉的染色，
-2+:10%以上的肿瘤细胞中观察到中等的完整膜染色，
-3+:10%以上的肿瘤细胞中观察到强烈的完整染色。
仅供受理局使用
仅供国际局使用
| 国际申请该表格收到该表格 | 2011年7月11日(11.07.2011) |
| 授权局 | Nathalie WAGNER |
Claims (22)
1.一种结合蛋白，其在肿瘤上特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，其特征在于：
i)其不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet；和，
ii)其不阻断配体HGF结合至cMet；和，
iii)其在氨基酸残基1和950之间与cMet的细胞外区域相互作用，
其中
所述结合蛋白选自如下：
a)一种抗体，包括：
-轻链，所述轻链包括根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为SEQ ID No.1所示的CDR-L1、SEQ ID No.2所示的CDR-L2和SEQ ID No.3所示的CDR-L3；和
-重链，所述重链包括根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为SEQ ID No.4所示的CDR-H1、SEQ ID No.5所示的CDR-H2和SEQ ID No.6所示的CDR-H3，和
b)一种抗体，包括：
-轻链，所述轻链包括根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为SEQ ID No.9所示的CDR-L1、SEQ ID No.10所示的CDR-L2和SEQ ID No.11所示的CDR-L3；和
-重链，所述重链包括根据IMGT定义的下面3种CDR，分别为SEQ ID No.12所示的CDR-H1、SEQ ID No.13所示的CDR-H2和SEQ ID No.14所示的CDR-H3。
2.根据权利要求1的结合蛋白，其选自如下：
a)一种抗体，其包括SEQ ID No.7所示的轻链可变结构域和SEQ ID No.8所示的重链可变结构域；和
b)一种抗体，其包括SEQ ID No.15所示的轻链可变结构域和SEQ ID No.16所示的重链可变结构域。
3.一种能够分泌根据权利要求1或2的结合蛋白的鼠杂交瘤，所述鼠杂交瘤选自保藏于2009年11月18日，CNCM，巴黎巴斯德研究所，保藏号I-4247的杂交瘤和保藏于2009年11月18日，CNCM，巴黎巴斯德研究所，保藏号I-4246的杂交瘤。
4.源自杂交瘤I-4247或I-4246或其亚克隆的单克隆抗体，其在肿瘤上i)特异地结合配体非依赖激活形式的cMet，但ii)不结合非激活的和/或配体依赖激活形式的cMet。
5.一种分离的核酸，其特征在于其选自以下的核酸：
a)编码如权利要求1的结合蛋白的核酸；
b)编码如权利要求2所述的抗体或如权利要求4所述的单克隆抗体的核酸；
c)包含DNA序列的核酸，该DNA序列包含序列SEQ ID No.33、34、41或42；
d)如c)中定义的核酸的相应的RNA核酸；和
e)如a)、b)和c)中定义的核酸的互补核酸。
6.根据权利要求5所述的分离的核酸，其特征在于所述核酸是DNA或RNA。
7.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于鉴定配体非依赖激活形式的cMet的试剂盒中的用途。
8.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于区分样本中配体非依赖激活形式的cMet和其它形式的cMet的试剂盒中的用途，其中所述其它形式的cMet包括非激活的或配体依赖激活形式的cMet，所述用途包括步骤：
a)使所述样本与根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体接触，和
b)检测所述结合蛋白或抗体与样本的结合。
9.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于体外诊断与配体非依赖激活形式的cMet相关的致癌疾患的试剂盒或通过免疫标记确定发展成与配体非依赖激活形式的cMet相关的致癌疾患的预后的试剂盒中的用途。
10.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于通过免疫标记检测受试者中配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤的存在和/或位点的试剂盒中的用途，其中所述用途包括步骤：
a)使来自受试者的样本与根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体接触，和
b)检测所述结合蛋白或抗体与样本的结合。
11.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于通过免疫标记确定来自受试者的cMet表达肿瘤中配体非依赖激活形式的cMet表达水平的试剂盒中的用途，其中所述用途包括步骤：
a)使来自受试者的样本与根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体接触，和
b)在所述样本中定量所述结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet结合的水平。
12.根据权利要求11的用途，其中通过免疫组织化学测量配体非依赖激活形式的cMet的表达水平。
13.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于通过免疫标记诊断受试者中配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤的试剂盒或通过免疫标记确定受试者中发展成配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤的预后的试剂盒中的用途，其中所述用途包括步骤：
a)根据权利要求11，确定配体非依赖激活形式的cMet的表达水平，和
b)比较步骤a)的表达水平与来自正常组织的配体非依赖激活形式的cMet的参考表达水平。
14.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于通过免疫标记确定受试者肿瘤的配体非依赖激活形式的cMet状态的试剂盒中的用途，其中所述用途包括步骤：
a)根据权利要求11，确定配体非依赖激活形式的cMet的表达水平，
b)针对所述肿瘤的配体非依赖激活形式的cMet表达水平评分，和
c)比较所述评分与获自对照样本的评分。
15.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于确定致癌疾患是否对用抗配体非依赖激活形式的cMet结合蛋白或抗体的治疗敏感的试剂盒中的用途，其中所述用途包括步骤：
a)根据权利要求11，通过免疫标记确定受试者肿瘤的配体非依赖激活形式的cMet状态，和
b)如果状态是配体非依赖激活形式的cMet(+)，确定致癌疾患对用抗配体非依赖激活形式的cMet结合蛋白或抗体的治疗敏感。
16.一种试剂盒，其包括至少根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体，所述结合蛋白或抗体是被标记的。
17.根据权利要求16的试剂盒，其用于通过免疫标记检测受试者中配体非依赖激活形式的cMet表达肿瘤的存在和/或位点，所述试剂盒进一步包括对检测所述标记的结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet间结合程度有用的试剂。
18.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于鉴定能够特异地结合配体非依赖激活形式的cMet的结合蛋白的试剂盒中的用途，其中所述结合蛋白包括抗体。
19.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于鉴定配体非依赖激活形式的cMet的结合配偶体的试剂盒中的用途，其包括步骤：
a)使配体非依赖激活形式的cMet与根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体接触；
b)使a)的复合物与化合物库接触，
c)鉴定破坏a)的复合物的化合物。
20.一种纯化配体非依赖激活形式的cMet的方法，其特征在于其包括以下步骤：
a)在允许所述结合蛋白或抗体与配体非依赖激活形式的cMet特异地结合的条件下，根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体与样本进行孵育；和
b)从样本中分离结合蛋白或抗体，并获得纯化的配体非依赖激活形式的cMet。
21.由根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体与配体非依赖激活形式的cMet结合形成的复合物。
22.根据权利要求1的结合蛋白、根据权利要求2所述的抗体或根据权利要求4所述的单克隆抗体在制备媒介中的用途，其中所述媒介将生物活性化合物特异地靶向至表达配体非依赖激活形式的cMet的细胞。
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