JP2013539355A - 癌の診断および/または予後のための新規な抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
− CDR‐L1は、配列番号1もしくは17の配列、または最適アライメント後に、配列番号1もしくは17の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み;
− CDR‐L2は、配列番号2もしくは18の配列、または最適アライメント後に、配列番号2もしくは18の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み;ならびに、
− CDR‐L3は、配列番号3の配列、または最適アライメント後に、配列番号3の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含む。
− CDR‐H1は、配列番号4もしくは19の配列、または最適アライメント後に、配列番号4もしくは19の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含み;
− CDR‐H2は、配列番号5もしくは20の配列、または最適アライメント後に、配列番号5もしくは20の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含み;ならびに、
− CDR‐H3は、配列番号6もしくは21の配列、または最適アライメント後に、配列番号6もしくは21の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含む。
− CDR‐L1は、配列番号9もしくは22の配列、または最適アライメント後に、配列番号9もしくは22の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含み;
− CDR‐L2は、配列番号10もしくは23の配列、または最適アライメント後に、配列番号10もしくは23の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含み;ならびに、
− CDR‐L3は、配列番号11の配列、または最適アライメント後に、配列番号11の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含む。
− CDR‐H1は、配列番号12もしくは24の配列、または最適アライメント後に、配列番号12もしくは24の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含み;
− CDR‐H2は、配列番号13もしくは25の配列、または最適アライメント後に、配列番号13もしくは25の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含み;ならびに、
− CDR‐H3は、配列番号14もしくは26の配列、または最適アライメント後に、配列番号14もしくは26の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列を含む。
− 配列番号1の配列、または最適アライメント後に、配列番号1の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L1;
− 配列番号2の配列、または最適アライメント後に、配列番号2の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L2;および、
− 配列番号3の配列、または最適アライメント後に、配列番号3の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L3、
を含む軽鎖、ならびに、
IMGTに従う以下の3つのCDR:
− 配列番号4の配列、または最適アライメント後に、配列番号4の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H1;
− 配列番号5の配列、または最適アライメント後に、配列番号5の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H2;および、
− 配列番号6の配列、または最適アライメント後に、配列番号6の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H3、
を含む重鎖、
を有する。
− 配列番号9の配列、または最適アライメント後に、配列番号9の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L1;
− 配列番号10の配列、または最適アライメント後に、配列番号10の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L2;および、
− 配列番号11の配列、または最適アライメント後に、配列番号11の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L3、
を含む軽鎖、ならびに、
IMGTに従う以下の3つのCDR:
− 配列番号12の配列、または最適アライメント後に、配列番号12の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H1;
− 配列番号13の配列、または最適アライメント後に、配列番号13の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H2;および、
− 配列番号14の配列、または最適アライメント後に、配列番号14の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H3、
を含む重鎖、
を有する。
− 配列番号17の配列、または最適アライメント後に、配列番号17の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L1;
− 配列番号18の配列、または最適アライメント後に、配列番号18の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L2;および、
− 配列番号3の配列、または最適アライメント後に、配列番号3の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L3、
を含む軽鎖、ならびに、
Kabatに従う以下の3つのCDR:
− 配列番号19の配列、または最適アライメント後に、配列番号19の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H1;
− 配列番号20の配列、または最適アライメント後に、配列番号20の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H2;および、
− 配列番号21の配列、または最適アライメント後に、配列番号21の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR‐H3、
を含む重鎖、
を有する。
− 配列番号22の配列、または最適アライメント後に、配列番号22の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L1;
− 配列番号23の配列、または最適アライメント後に、配列番号23の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR‐L2;および、
− 配列番号11の配列、または最適アライメント後に、配列番号11の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐L3、
を含む軽鎖、ならびに、
Kabatに従う以下の3つのCDR:
− 配列番号24の配列、または最適アライメント後に、配列番号24の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H1;
− 配列番号25の配列、または最適アライメント後に、配列番号25の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H2;および、
− 配列番号26の配列、または最適アライメント後に、配列番号26の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、および98%の同一性を有する配列のCDR‐H3、
を含む重鎖、
を有する。
− 系統発生的保存が良好であること;
− 三次元構造が既知であること(例えば、結晶学、NMR分光、または当業者に公知であるその他のいずれかの技術による);
− サイズが小さいこと;
− 転写後修飾がほとんど、もしくはまったくないこと;および/または、
− 作製、発現、および精製が容易であること、
の最も多くを満たす必要があることが公知である。
a) 上述の結合タンパク質をコードする核酸、DNA、またはRNA;
b) 上述の抗体をコードする核酸、DNA、またはRNA;
c) 配列番号27から32、または35から40の配列を含むDNA配列を有する核酸;
d) 配列番号33、34、41、または42の配列を含むDNA配列を有する核酸;
e) c)またはd)に定める核酸の対応するRNA核酸;ならびに、
f) a)、b)、c)、およびd)に定める核酸の相補核酸、
から選択されることを特徴とする単離された核酸を取り扱う。
a) 本発明に従う宿主細胞の、培地中における、宿主細胞に適する培養条件での培養;および、
b) このようにして産生された前記抗体またはその機能性断片の1つの、培地からの、または前記培養された細胞からの回収、
を含むことを特徴とする。
a) 前記サンプルを、本発明に従う結合もしくは抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体と接触させる工程、ならびに、
b) 前記結合タンパク質もしくは抗体のサンプルとの結合を検出する工程、
を含む。
a) 好ましくは標識された、本発明の結合タンパク質および/または抗体を、それを必要とする患者へ投与する工程;ならびに、
b) 前記結合タンパク質または抗体の、患者体内にて、好ましくは腫瘍細胞または腫瘍の存在が疑われるかまたは既知である患者の器官によって発現されたcMetのリガンド非依存性活性化形態との結合を、好ましくはイメージングによって検出する工程(特に、ステージングのために)、
を含む。
a)前記標識結合タンパク質または抗体とcMetのリガンド非依存性活性化形態との間の結合度合いを検出するのに有用である試薬;ならびに、
b)cMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルのスコア付けに有用であるポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、
を含む。
i) マウス抗体に特異的である第二の標識ポリクローナル抗体:
ii) 前記第二の標識抗体と、cMetのリガンド非依存性活性化形態に対するマウス抗体との間の結合度合いを検出するのに有用である試薬;ならびに、
iii) cMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルのスコア付けに有用であるポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、
を含んでよい。
a) cMetのリガンド非依存性活性化形態を、本発明に従う結合タンパク質もしくは抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体と接触させる工程;
b) a)の複合体を、化合物ライブラリと接触させる工程、
c) a)の複合体を分解する化合物を識別する工程、
を含む。
a) 本発明に従う結合タンパク質もしくは抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体を、サンプルと共に、前記結合タンパク質または抗体とcMetのリガンド非依存性活性化形態との特異的結合を可能とする条件下にてインキュベートする工程;ならびに、
b) サンプルから結合タンパク質または抗体を分離し、精製されたcMetのリガンド非依存性活性化形態を得る工程、
を含む。
a) cMetタンパク質またはその断片を発現するトランスフェクトされた、または腫瘍細胞株により、動物を免疫化する工程;
b) 抗体産生細胞を動物から取り出す工程;
c) 前記抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得る工程;
d) スクリーニングアッセイを行って、i)cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合するが、ii)cMetの(1もしくは複数の)非活性化および/またはリガンド依存性活性化形態へは結合しない抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選別する工程;
e) 選別されたハイブリドーマを、抗体を産生する細胞培養液中にて培養する工程;ならびに、
f) 細胞培養液から抗体を取り出す工程、
を含むことを特徴とする。
a) 異なる形態のcMetを発現する腫瘍から組織セクションを採取する工程、
b) 上述のi)cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合するが、ii)cMetの(1もしくは複数の)非活性化および/またはリガンド依存性活性化形態へは結合しない抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体を作製するための方法の工程c)のハイブリドーマ細胞を用いて、工程a)の異なる組織セクションを同時にIHC染色する工程、
c) cMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する組織セクション上では特異的な反応性を有するが、その他の組織セクション上では反応性を有さないハイブリドーマ細胞を選別する工程、
を含む。
抗cMet抗体の作製のために、8週齢のBALB/cマウスに対して、その細胞膜上でcMetを発現するCHOトランスフェクション細胞株によって3から5回皮下に免疫化を施すか(20×106細胞/投与/マウス)、またはcMet細胞外ドメイン融合タンパク質(10〜15μg/投与/マウス)(R&Dシステムズ、カタログ#358MT)、もしくはこの組換えタンパク質の断片を、最初の免疫化では完全フロイントアジュバントと、以降については不完全フロイントアジュバントと混合して2から3回免疫化を施した。細胞融合の3日前に、組換えタンパク質または断片により、i.p.またはi.v.にてマウスに追加免疫を施した。次に、マウスの脾臓を回収し、SP2/0‐Ag14骨髄腫細胞(ATCC)へ融合し、HAT選別に掛けた。一般的に、モノクローナル抗体またはその機能性断片を作製する場合、特にマウス由来のものについては、マニュアル"Antibody"(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に特に記載されている技術、またはKohler and Milstein(Nature, 256:495-497, 1975)によって記載されるハイブリドーマの作製技術を参照することが可能である。
診断用Mabのさらなる特性決定のために、HGF競合アッセイを実施した。試験すべきMabが存在するか、または存在しない、cMetタンパク質を含む第一の反応混合物を、別々の飽和(PBS 1X中0.5%のゼラチン)プレート上にて調製した。マウス抗体(レファレンスおよび調べるべきMab)の1:2の段階希釈を行った(40μg/mLから開始し、12のカラムにわたる)。次に、ELISA希釈剤(PBS 1X中の0.1% ゼラチン、0.05% Tween20)のみを含むネガティブコントロールライン以外に、0.8μg/mLのrh cMet‐Fcタンパク質を添加した(RDシステムズ、ref. 358‐MT/CF)。ホモジナイズ後、競合サンプルを、PBS中の0.3μg/mL rh HGF溶液(RDシステムズ、ref. 294‐HGN/CF)でコーティングしたHGF‐コーティングプレート上にローディングした。インキュベーションおよび数回の洗浄の後、ヤギ抗ヒトIgG‐HRP(ジャクソン、ref. 109‐035‐098)を用いて、結合したタンパク質を検出する。結合後、TMB基質をプレートに添加した。H2SO4の酸溶液を添加して反応を停止し、得られた光学濃度を、マイクロプレートリーダー装置を用いて、450nmにて読み取った。
Hs746T腫瘍を有するマウスのm224G11処理により、腫瘍成長の著しい低下が誘発された(図6)。この実験からの腫瘍を分析すると、抗腫瘍活性の結果として、コントロールマウス(データ示さず)に対してm224G11処理マウスでのKi67発現の低下、およびウェスタンブロット分析によって示されるcMet発現の劇的な下方調節が見られた(図7)。WB分析を実施するために、腫瘍を取り出し、窒素中にて素早く瞬間冷凍した。次に、それを溶解し、同じ量のタンパク質を免疫ブロットした。最後に、セルシグナリング(Cell Signalling)から市販されている抗Met‐ベータサブユニット25H2 Mabを用いてcMetを出現させた。
上述の、および図9にまとめたプロトコルを用いて、種々のレベルのcMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する一式のパラフィン封入ヒト腫瘍組織を、m205A5 Mabで染色した。
− 0:膜染色がないか、または観察された膜陽性細胞が10%未満である陰性腫瘍、
− 1+:10%超の腫瘍細胞にてほとんど感知されない染色、
− 2+:10%超の腫瘍細胞にて中程度の完全膜染色、
− 3+:10%超の腫瘍細胞にて強い完全膜染色、
としてのスコア付けが可能である。
Claims (25)
- 腫瘍上にて、i)cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合し、
i) cMetの(1もしくは複数の)非活性化および/またはリガンド依存性活性化形態へは結合しないこと;ならびに、所望により所望により、
ii) リガンドHGFのcMetへの結合をブロックしないこと;ならびに、所望により、
iii) アミノ酸残基1から950までのcMetの細胞外領域と相互作用を起こすこと、
を特徴とする、結合タンパク質、またはその機能性断片、もしくは誘導体。 - a)
‐ IMGTに従って定義される以下の3つのCDR、それぞれ、配列番号1の配列を有するCDR‐L1、配列番号2の配列を有するCDR‐L2、および配列番号3の配列を有するCDR‐L3、を含む軽鎖;ならびに、
‐ IMGTに従って定義される以下の3つのCDR、それぞれ、配列番号4の配列を有するCDR‐H1、配列番号5の配列を有するCDR‐H2、および配列番号6の配列を有するCDR‐H3、を含む重鎖、
を有する抗体、またはその機能性断片、もしくは誘導体、ならびに、
b)
‐ IMGTに従って定義される以下の3つのCDR、それぞれ、配列番号9の配列を有するCDR‐L1、配列番号10の配列を有するCDR‐L2、および配列番号11の配列を有するCDR‐L3、を含む軽鎖;ならびに、
‐ IMGTに従って定義される以下の3つのCDR、それぞれ、配列番号12の配列を有するCDR‐H1、配列番号13の配列を有するCDR‐H2、および配列番号14の配列を有するCDR‐H3、を含む重鎖、
を有する抗体、またはその機能性断片、もしくは誘導体、
からなる群より選択される、単離された抗体、またはその機能性断片、もしくは誘導体からなることを特徴とする、請求項1に記載の結合タンパク質、またはその機能性断片、もしくは誘導体。 - a) 配列番号7のアミノ酸配列を有する配列の軽鎖可変ドメイン、および配列番号8のアミノ酸配列を有する配列の重鎖可変ドメインを含む抗体、またはその機能性断片、もしくは誘導体;ならびに、
b) 配列番号15のアミノ酸配列を有する配列の軽鎖可変ドメイン、および配列番号16のアミノ酸配列を有する配列の重鎖可変ドメインを含む抗体、またはその機能性断片、もしくは誘導体、
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項2に記載の抗体、またはその機能性断片、もしくは誘導体。 - 請求項2または3に記載の抗体を分泌する能力を有するマウスハイブリドーマであって、前記マウスハイブリドーマは、2009年11月18日に、パリのパスツール研究所、CNCMにI‐4247の番号で寄託されたハイブリドーマ、および2009年11月18日に、パリのパスツール研究所、CNCMにI‐4246の番号で寄託されたハイブリドーマから選択される、マウスハイブリドーマ。
- 腫瘍上にて、i)cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合するが、ii)cMetの(1もしくは複数の)非活性化および/またはリガンド依存性活性化形態へは結合しない、ハイブリドーマI‐4247、もしくはI‐4246、またはこれらのサブクローンから得られるモノクローナル抗体。
- 単離された核酸であって、それは、以下の核酸:
a) 請求項1に記載の結合タンパク質をコードする核酸、DNA、またはRNA;
b) 請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸、DNA、またはRNA;
c) 配列番号27から32、または35から40の配列を含むDNA配列を有する核酸;
d) 配列番号33、34、41、または42の配列を含むDNA配列を有する核酸;
e) c)またはd)に定める前記核酸の対応するRNA核酸;ならびに、
f) a)、b)、c)、およびd)に定める前記核酸の相補核酸、
から選択されることを特徴とする、単離された核酸。 - cMetのリガンド非依存性活性化形態の識別のための、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体の使用。
- サンプル中にて、cMetのリガンド非依存性活性化形態と、cMetの非活性化もしくはリガンド依存性活性化形態を含むcMetのその他の形態とを区別するための方法であって、該方法は:
a) 前記サンプルを、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体と接触させる工程、ならびに、
b) 前記結合タンパク質もしくは抗体の前記サンプルとの結合を検出する工程、
を含む、方法。 - cMetのリガンド非依存性活性化形態に関連する発癌性障害を生体外にて診断するための、または前記cMetのリガンド非依存性活性化形態に関連する発癌性障害の発症についての予後を免疫標識によって判定するための、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体;またはそれらの機能性断片もしくは誘導体の使用。
- 対象中にて、cMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する腫瘍の存在および/または位置を、免疫標識によって検出する方法であって、ここで、前記方法は:
a) 前記対象からのサンプルを、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体と接触させる工程、ならびに、
b) 前記結合タンパク質もしくは抗体の前記サンプルとの結合を検出する工程、
を含む、方法。 - 対象からのcMet発現腫瘍中のcMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルを免疫標識によって測定する方法であって、ここで、前記方法は:
a) 前記対象からのサンプルを、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体と接触させる工程、ならびに、
b) 前記サンプル中にて、cMetのリガンド非依存性活性化形態へ結合する結合タンパク質もしくは抗体のレベルを定量する工程、
を含む、方法。 - 前記cMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルが、免疫組織化学分析(IHC)によって測定される、請求項11に記載の方法。
- 対象において、cMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する腫瘍を免疫標識によって診断するための、またはcMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する腫瘍の発症についての予後を免疫標識によって判定するための方法であって、前記方法は:
a) 請求項11に記載の前記cMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルを測定する工程、ならびに、
b) 工程a)の前記発現レベルを、正常組織からのcMetのリガンド非依存性活性化形態のレファレンス発現レベルと比較する工程、
を含む、方法。 - 対象における腫瘍のcMetのリガンド非依存性活性化形態の状態を免疫標識によって判定する方法であって、ここで、前記方法は:
a) 請求項11に記載のcMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルを測定する工程、
b) cMetのリガンド非依存性活性化形態の発現レベルについて、前記腫瘍のスコア付けを行う工程、ならびに、
c)前記スコアをコントロールサンプルから得られたものと比較する工程、
を含む、方法。 - 抗‐cMetのリガンド非依存性活性化形態結合タンパク質もしくは抗体、またはその断片もしくは誘導体による治療に対して、発癌性障害が感受性を有するかどうかを判定する方法であって、ここで、前記方法は:
a) 請求項11に記載の対象における腫瘍の前記cMetのリガンド非依存性活性化形態の状態を免疫標識によって判定する工程、ならびに、
b)前記状態が、cMetのリガンド非依存性活性化形態(+)である場合、前記発癌性障害は、抗‐cMetのリガンド非依存性活性化形態結合タンパク質もしくは抗体、またはその断片もしくは誘導体による治療に対して感受性を有すると判定する工程、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体を少なくとも含み、前記結合タンパク質または抗体は標識されている、キット。
- 対象におけるcMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する腫瘍の存在および/または位置を免疫標識によって検出するための請求項16に記載のキットであって、前記キットは、さらに、前記標識された結合タンパク質または抗体とcMetのリガンド非依存性活性化形態との結合の度合いを検出するのに有用である試薬を含む、請求項16に記載のキット。
- cMetのリガンド非依存性活性化形態への結合について、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体と交差競合する(cross-compete)ことを特徴とする、抗体を含む結合タンパク質、またはその機能性断片もしくは誘導体。
- 請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体の、cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合することができる、抗体を含む結合タンパク質の識別のための使用。
- cMetのリガンド非依存性活性化形態に対する結合パートナーを識別する方法であって、
a) 前記cMetのリガンド非依存性活性化形態を、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体と接触させる工程;
b) a)の複合体を、化合物ライブラリと接触させる工程、
c) a)の複合体を分解する化合物を識別する工程、
を含むことを特徴とする、方法。 - cMetのリガンド非依存性活性化形態を精製するための方法であって、それは、以下の工程:
a) 請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体を、サンプルと共に、前記結合タンパク質または抗体と前記cMetのリガンド非依存性活性化形態との特異的結合を可能とする条件下にてインキュベートする工程;ならびに、
b) 前記サンプルから前記結合タンパク質または抗体を分離し、精製された前記cMetのリガンド非依存性活性化形態を得る工程、
を含むことを特徴とする、方法。 - 請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体とcMetのリガンド非依存性活性化形態との結合によって形成される複合体。
- 生物活性化合物を、cMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する細胞へ特異的に標的化することを意図する媒体としての、請求項1に記載の結合タンパク質、または請求項2、3、および5のいずれか一項に記載の抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体の使用。
- i)cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合するが、ii)cMetの(1もしくは複数の)非活性化および/またはリガンド依存性活性化形態へは結合しない抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体を作製するための方法であって、前記方法は、それが:
a) cMetタンパク質またはその断片を発現するトランスフェクトされた、または腫瘍細胞株により、動物を免疫化する工程;
b) 抗体産生細胞を前記動物から取り出す工程;
c) 前記抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得る工程;
d) スクリーニングアッセイを行って、i)cMetのリガンド非依存性活性化形態へ特異的に結合するが、ii)cMetの(1もしくは複数の)非活性化および/またはリガンド依存性活性化形態へは結合しない抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選別する工程;
e) 前記選別されたハイブリドーマを、前記抗体を産生する細胞培養液中にて培養する工程;ならびに、
f) 前記細胞培養液から前記抗体を取り出す工程、
を含むことを特徴とする、方法。 - 工程d)の前記スクリーニングアッセイが、IHCスクリーニングアッセイから成り、前記IHCスクリーニングアッセイは、好ましくは:
a) 異なる形態のcMetを発現する腫瘍から組織セクションを採取する工程、b) 請求項24の工程c)に記載のハイブリドーマ細胞を用いて、工程a)の前記異なる組織セクションに対して同時にIHC染色を施す工程、
c) 前記cMetのリガンド非依存性活性化形態を発現する組織セクション上では特異的な反応性を有し、その他の組織セクション上では反応性を有さないハイブリドーマ細胞を選別する工程、
を含むことを特徴とする、請求項24に記載の方法。
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