BR112012033406B1

BR112012033406B1 - Anticorpos isolados e uso dos mesmos, hibridoma murino, ácido nucleico isolado, kit, bem como processos in vitro por imunocoloração para detecção da presença e/ou localização, determinação do nível de expressão, diagnóstico, determinação do prognóstico para o desenvolvimento, determinação do estado da forma ativada independente de ligante de cmet expresso em tumor em um indivíduo, e para determinação se uma desordem oncogênica é suscetível a um tratamento com um anticorpo anti-forma ativada independente de ligante de cmet

Info

Publication number: BR112012033406B1
Application number: BR112012033406-9A
Authority: BR
Inventors: Alexandra Jouhanneaud
Original assignee: Pierre Fabre Medicament
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2021-11-09
Also published as: AU2011278562B2; CN102971343B; CA2801996C; NZ705653A; EP2588497B1; CN102971343A; CA3000451A1; NZ606223A; RU2013103029A; MX2012014739A; CA3000451C; RU2651513C2; JP2013539355A; AU2011278562A1; CA2801996A1; WO2012007280A1; AU2011278562C1; US20130102494A1; EP2402370A1; KR20130100963A

Abstract

proteína de ligação, anticorpo, hibridoma de camundongo, anticorpo monoclonal derivado de hibridoma, ácido nucleico isolado, uso de uma proteína de ligação, processo para diferenciação entre a forma ativada por ligante independente de cmet e as outras formas de cmet, processo de detecção por imunomanchamento, kit, processo de identificação do padrão de ligação, processo para a purificação da forma ativada, complexo e processo para a geração de um anticorpo. a presente invenção refere-se ao campo de prognóstico e/ou diagnóstico de uma doença proliferativa em um paciente. a invenção refere-se a novos anticorpos capazes de se ligar especificamente ao receptor de cmet de ser humano, bem como as sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos. a invenção compreende o uso dos ditos anticorpos, e a processo correspondente, para a detecção e diagnóstico de desordens oncogênicas hiperproliferativas patológicas associadas à expressão de cmet. em certas concretizações, as desordens são desordens oncogênicas associadas ao polipeptídeo de expressão de cmet aumentado em relação à normal ou qualquer outra patologia ligada com a ultraexpressão de cmet. a invenção compreende produtos e/ou composições ou kits compreendendo pelo menos tais anticorpos para o prognóstico ou diagnóstico de certos cânceres.

Description

[001] A presente invenção refere-se a o campo de prognóstico e/ou diagnóstico de uma doença proliferativa em um paciente. Mais particularmente, a invenção refere-se a novos anticorpos capazes de se ligar especificamente ao receptor de cMet de ser humano, bem como as sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos. A invenção do mesmo modo compreende o uso dos ditos anticorpos, e processo correspondente, para a detecção e diagnóstico de desordens oncogênicas hiperproliferativas patológicas associadas à expressão de cMet. Em certas concretizações, as desordens são desordens oncogênicas associadas a polipeptídeo de expressão de cMet aumentado em relação a normal ou qualquer outra patologia ligada com a ultraexpessão de cMet. A invenção finalmente compreende produtos e/ou composições ou kits compreendendo pelo menos tais anticorpos para o prognóstico ou diagnóstico de certos cânceres.

[002] Agentes direcionados de cinase de tirosina de receptor (RTK) tais como inibidores de trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, imatinib e gefitinib ilustravam o interesse de direcionamento dessa classe de proteínas para o tratamento de cânceres selecionados.

[003] cMet, é o membro prototípico de uma subfamília de RTKs que também inclui RON and SEA. A família de cMet RTK é estruturalmente diferente de outras famílias de RTK e é o único receptor de alta afinidade conhecido para fator de crescimento de hepatócito (HGF), também chamado fator de dispersão (SF) [D.P. Bottaro e outros, Science 1991, 251 : 802-804; L. Naldini e outros, Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. cMet e HGF são amplamente expressos em uma variedade de tecido e sua expressão é normalmente restrita para células de origem epitelial e mesenquimal respectivamente [M.F. Di Renzo e outros, Oncogene 1991, 6: 1997-2003; E. Sonnenberg e outros, J. Cell. Biol. 1993, 123 :223-235]. Eles são ambos necessários para o desenvolvimento de mamífero normal e demonstraram ser particularmente importante na migração de célula, diferenciação morfogênica, e organização das estruturas tubulares tridimensionais bem como crescimento e angiogênese [F. Baldt e outros, Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt e outros, Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty e outros, Science 1994, 263:98-101]. Enquanto a regulação controlada de cMet e HGF demonstraram ser importante no desenvolvimento de mamífero, manutenção e reparo de tecido [Nagayama T e outros, Cérebro Res. 2004, 5;999(2): 155-66; Tahara Y e outros, J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51], sua desregulação é implicada na progressão de cânceres.

[004] Sinalização anômala dirigido por ativação inapropriada de cMet é uma das alterações mais frequentes observadas em cânceres de ser humano e desempenha um papel crucial em tumorigênese e metástase [Birchmeier e outros, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300].

[005] Ativação de cMet inapropriada pode surgir por mecanismos independente e dependente de ligante, que incluem ultraexpressão de cMet, e/ou ativação de parácrino ou autócrino, ou através de ganho na mutação funcional [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226: 1-26]. No entanto uma oligomerização de receptor de cMet, na presença ou na ausência do ligante, é exigido regular a cinética de ligação e afinidade de ligação da cinase em relação a ATP e substratos de peptídeo contendo tirosina [Hays JL e outros, Biochemistry, 17 de agosto de 2004, 43: 10570-8]. cMet ativado recruta efeto- res de sinalização para seu sítio de multialojamento no domínio do citoplasma, que resulta na ativação de várias trajetórias de sinalização, incluindo Ras-MAPK, PI3K, Src e Stat3 [Gao CF e outros, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Essas trajetórias são essenciais para proliferação, invasão e angiogênese de célula de tumor e para evasão de apoptose [Furge KA e outros, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 12230; Fan S e outros, Oncogene. 27 de abril de 2000, 19(18):2212-23]. Além disso, uma única faceta da sinalização de cMet signalling em relação a outra RTK é sua interação relatada com complexos de adesão focal e padrões de ligação de não cinase tais como alfa6beta4 integri- nas [Trusolino L e outros, J Biol Chem. 1999, 274(10):6499-506], Ple- xin Bl ou semaforinas [Giordano S e outros, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P e outros, Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23:5131-7] que podem ulteriormente adicionar à complexidade de regulação da função celular por esse receptor. Finalmente dados recentes demonstram que cMet poderiam estar envolvidos na resistência de tumor a gefitinib ou a erlotinib que sugere que combinação de composto que direciona tanto EGFR quanto cMet poderiam ser de interesse significativo [Engelman JA e outros, Science, 2007, 316: 1039-43].

[006] A poucos anos atrás, muitas estratégias diferentes foram desenvolvidas como atenuando sinalização de cMet na linhas de célu- las de câncer. Essas estratégias incluem i) neutralização de anticorpos contra cMet ou HGF/SF [Cao B e outros, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T e outros, Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] ou o uso de HGF/SF antagonista NK4 para evitar que ligante se ligue a cMet [Kuba K e outros., Cancer Res., 2000, 60:673743], ii) inibidores de sítio de ligação de ATP pequenos a cMet que bloqueiam atividade de cinase [Christensen JG e outros, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) polipeptídeo de domínio de SH2 engenheirado que interfere com acesso ao sítio de multialojamento e RNAi ou ribo- zima que reduz expressão de ligante ou receptor. A maioria dessas abordagens exigem uma inibição seletiva de cMet que resulta no inibição de tumor e que mostra que cMet poderia ser de interesse para intervenção terapêutica no câncer.

[007] A presente invenção visa prover pelo menos um reagente que pode ser usado como um biomarcador de prognóstico ou diagnóstico para a detecção e/ou monitoramento de desordens oncogênicas especialmente aquelas caracterizadas por expressão de cMet ou aqueles que são mediadas por expressão de cMet anômala.

[008] Descritos aqui são novos anticorpos que satisfaçam seus critérios.

[009] Outras características e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição detalhada e exemplos que se seguem.

[0010] Em um primeiro aspecto, um objetivo da invenção é uma proteína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que se liga especificamente à forma ativada independente de ligante da proteína de cMet (cMet) de preferência cMet de ser humano, com alta afinidade e pode assim ser útil nos métodos para diagnosticar desordens oncogênicas hiperproliferativas patológicas mediadas por forma ativada independente de ligante de expressão de cMet.

[0011] Uma ativação independente de ligante está relacionada com uma fosforilação constitutiva de cMet consecutivo a i) ou uma di- merização do receptor que ocorre na ausência de HGF em um caso de ultraexpressão de cMet (usualmente ligada a uma ampliação de gene de cMet) ou ii) a mutações de ativação dentro do domínio intracelular de cMet ou iii) ambos.

[0012] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma prote ína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga à forma(s) ativadas dependentes de ligante ou não ativadas de cMet.

[0013] Pela expressão " proteína de ligação ", deve ser entendido que qualquer cadeia peptídica tendo uma afinidade específica ou geral com uma outra proteína ou molécula. Proteínas são postas em contato e formam um complexo quando ligação é possível. A proteína de ligação da invenção pode de preferência ser, sem limitação, um anticorpo, um fragmento ou derivado de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo. As expressões "derivado(s) e/ou fragmento(s) funcional(ais) " serão definidas em detalhes mais tarde do presente relatório.

[0014] Pela expressão "no tumor", deve ser entendido que as pro priedades relatadas da proteína de ligação de acordo com a invenção estão existindo no ambiente tumoral in vivo e não apenas nos exemplos in vitro. Mais particularmente, eles foram demonstrados, como será evidente a partir dos seguintes exemplos, com experiências vivo que representam um ambiente tão próximo quanto possível como aquele natural ou análise no microensaio de tecido (TMA)-comercial de tumor de ser humano.

[0015] Deve ser entendido aqui que a invenção não se refere à proteína em forma natural, isto é, ela não está em seu ambiente natural, mas que ela é capaz de ser isolada ou obtida por purificação das fontes naturais, ou então obtida por recombinação genética, ou por síntese química, e ela pode então conter aminoácidos não naturais como serão descritos mais adiante.

[0016] De acordo com uma concretização da invenção, é revelada uma proteína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado, como descritos antes que não bloqueie a ligação do fator de crescimento de hepatócito de ligante (HGF) a cMet.

[0017] Mais particularmente, a proteína de ligação, ou um frag mento funcional ou seu derivado, da invenção interage com a região extracelular de cMet entre resíduos de aminoácidos 1 e 950.

[0018] De acordo com uma primeira concretização, a invenção re fere-se a uma proteína de ligação, ou a um fragmento funcional ou a seu derivado, compreendendo pelo menos uma CDR escolhida entre as CDRs das sequências compreendendo pelo menos SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20 ou 21 ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%>, 95% e 98%) de identidade depois de ótimo alinhamento com as sequências SEQ ID No. 1,2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20 ou 21.

[0019] De acordo com uma segunda concretização, a invenção refere-se a uma proteína de ligação, ou a um fragmento funcional ou a seu derivado, compreendendo pelo menos uma CDR escolhida entre as CDRs das sequências compreendendo pelo menos SEQ ID No. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25 ou 26 ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95%) e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com as sequências SEQ ID No. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25 ou 26.

[0020] Um "fragmento funcional " de um anticorpo significa em par ticular um fragmento de anticorpo, tais como fragmentos Fv, scFv (sc=cadeia simples), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja semivida foi aumentada. Tais fragmentos funcionais serão descritos em detalhes mais tarda na presente descrição.

[0021] Um "composto derivado" ou "derivado" de um anticorpo significa em particular uma proteína de ligação constituída de uma armação de peptídeo e pelo menos uma das CDRs do anticorpo original a fim de preservar a capacidade de ser reconhecido. Tais compostos derivados, bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica, serão descritos em mais detalhes mais tarde na presente descrição.

[0022] Em uma primeira concretização, a proteína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado, da invenção compreende um domínio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos uma CDR selecionada do grupo que consiste nas sequências SEQ ID Nos. 1-6.

[0023] Em outra concretização, a proteína de ligação, ou um frag mento funcional ou seu derivado, da invenção compreende um domínio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos uma CDR selecionada do grupo que consiste nassequências SEQ ID Nos. 9-14.

[0024] Ainda em uma concretização preferida da invenção, a dita proteína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado, consiste em um anticorpo isolado.

[0025] Mais de preferência, a invenção compreende os anticorpos, seus compostos derivados ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, obtidos por recombinação genética ou síntese química.

[0026] De acordo com uma concretização preferida, o anticorpo de acordo com a invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que ele consiste em um anticorpo monoclonal.

[0027] "Anticorpo monoclonal"é entendido como significando um anticorpo se originando de uma população de anticorpo quase homogênea. Mais particularmente, os anticorpos individuais de uma população são idênticos exceto que poucas mutações de ocorrência natural possíveis que podem ser encontradas em proporções mínimas. Em outras palavras, um anticorpo monoclonal consiste em um anticorpo homogêneo se originando do crescimento de um clone de célula única (por exemplo, um hibridoma, uma célula de hospedeiro eucariótica transfectada com uma molécula de DNA que codifica o anticorpo homogêneo, uma célula de hospedeiro procariótica transfectada com uma molécula de DNA que codifica o anticorpo homogêneo, etc.) e é em geral caracterizada por cadeias pesadas de uma e apenas uma classe e subclasse e cadeias leves de apenas um tipo. Anticorpos mo- noclonais são altamente específicos e são dirigidos contra um único antígeno. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem vários anticorpos dirigidos contra várias determinantes, ou epitopos, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único epitopo do antígeno.

[0028] Deve ser entendido aqui que a invenção não se refere a anticorpos em forma natural, isto é, eles não são tirados de seu ambiente natural mas são isolados ou são obtidos por purificação de fontes naturais ou foram obtidos por recombinação genética ou síntese química e assim eles podem portar aminoácidos não naturais como serão descritos abaixo.

[0029] Mais particularmente, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma das CDRs das sequências SEQ ID Nos. 1 , 2, 3, 17, 18 ou pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98%> de identidade depois de ótimo alinhamento com as sequências SEQ ID Nos. 1 , 2, 3, 17, 18.

[0030] Ainda mais de preferência, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs, respectivamente CDR-L1 , CDR-L2 e CDR-L3, em que: - CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 1 ou 17, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 1 ou 17; - CDR-L2 compreende as sequências SEQ ID No. 2 ou 18, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 2 ou 18; e - CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 3, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 3.

[0031] A presente invenção assim descreve um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores, i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-L1 , CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 1 , CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 2 e CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 3.

[0032] De acordo com uma outra particular concretização, o anti corpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com Kabat, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 17, CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 18 e CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 3.

[0033] De acordo com uma outra concretização, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada com- preendendo pelo menos uma das CDRs das sequências SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 19, 20 ou 21 ou pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%>, 95% e 98%> de identidade depois de ótimo alinhamento com as sequências SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 19, 20 ou 21.

[0034] De um modo preferido, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que: - CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 4 ou 19, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 4 ou 19; - CDR-H2 compreende as sequências SEQ ID No. 5 ou 20, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 5 ou 20; e - CDR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 6 ou 21, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 6 ou 21.

[0035] A presente invenção assim descreve um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 4, CDR-H2 compreende a sequência SEQ ID No. 5 e CDR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 6.

[0036] De acordo com outra particular concretização, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é ca-racterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada com-preendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com Kabat, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR- H1 compreende a sequência SEQ ID NO. 19, CDR-H2 compreende a sequência SEQ ID No. 20 e CDR- H3 compreende a sequência SEQ ID No. 21.

[0037] Mais particularmente, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma das CDRs das sequências SEQ ID Nos. 9, 10, 11,22, 23 ou pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com as sequências SEQ ID Nos. 9, 10, 11,22, 23.

[0038] Ainda mais de preferência, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que: - CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 9 ou 22, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 9 ou 22; - CDR-L2 compreende as sequências SEQ ID No. 10 ou 23, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 10 ou 23; e - CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 11, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 11.

[0039] A presente invenção assim descreve um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 9, CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 10 e CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 11.

[0040] De acordo com outra particular concretização, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é ca-racterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com Kabat, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 22, CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 23 e CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 11.

[0041] De acordo com outra concretização, o anticorpo da inven ção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das CDRs das sequências SEQ ID Nos. 12, 13, 14, 24, 25, 26 ou pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com as sequências SEQ ID Nos. 12, 13, 14, 24, 25, 26.

[0042] De um modo preferido, o anticorpo da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs, respectivamente CDR-H1 , CDR-H2 e CDR-H3, em que: - CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 12 ou 24, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 12 ou 24; - CDR-H2 compreende as sequências SEQ ID No. 13 ou 25, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 13 ou 25; e - CDR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 14 ou 26, ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 14 ou 26.

[0043] A presente invenção assim descreve um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 12, CDR-H2 compreende a sequência SEQ ID No. 13 e CDR- H3 compreende a sequência SEQ ID No. 14.

[0044] De acordo com uma outra particular concretização, o anticor po da invenção, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada com-preendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com Ka- bat, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 24, CDR-H2 compreende a se quência SEQ ID No. 25 e CDR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 26.

[0045] Na presente descrição, os termos "polipeptídeos", "sequên cias de polipeptídeos", "peptídeos" e "proteínas ligados aos compostos de anticorpo ou a suas sequências" são intercambiáveis.

[0046] Deve ser entendido aqui que a invenção não se refere a anti corpos em forma natural, isto é, eles não são tirados de seu ambiente natural mas são isolados ou são obtidos por purificação de fontes naturais ou foram obtidos por recombinação genética ou síntese química e assim eles podem portar aminoácidos não naturais como serão descritos abaixo.

[0047] Em uma primeira concretização, região de determinação de complementaridade, ou CDR, significa as regiões hipervariáveis das cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas como definidas por Kabat e outros. (Kabat e outros., Sequences of proteins of imunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, e later editions). Há três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve. Aqui, os termos "CDR" e "CDRs"são usados para indicar, dependendo do caso, uma ou mais, ou ainda a totalidade de, das regiões contendo a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela afinidade de ligação do antígeno para o antígeno ou epitopo que ele reconhece.

[0048] Em uma segunda concretização, por regiões de CDR ou CDR(s), destina-se a indicar as regiões hipervariáveis das cadeias leves e pesadas das imunoglobulinas como definidas por IMGT.

[0049] A única numeração de IMGT foi definida para comparar os domínios variáveis qualquer que seja o receptor de antígeno, o tipo de cadeia, ou da espécie [Lefranc M.-P., Imunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Imunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin- Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Imunol, 27, 55-77 (2003)]. Na única numeração de IMGT, os aminoácidos conservados sempre tinham a mesma posição, por exemplo, cisteína 23 (lst-CYS), triptofano 41 (CON- SERVED-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2nd-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J- TRP). A única numeração de IMGT provê uma delimitação padronizada das regiões da estrutura (FR1- IMGT: porções de 1 a 26, FR2-IMGT: de 39 a 55, FR3-IMGT:

[0050] de 66 a 104 e FR4-IMGT: de 118 a 128) e das regiões de de terminação de complementaridade: CDR1-IMGT: de 27 a 38, CDR2- IMGT: de 56 a 65 e CDR3-IMGT: de 105 a 117. Uma vez que lacunas representam posições não ocupadas, os comprimentos de CDR-IMGT (mostrados entre parênteses e separados por pontos, por exemplo, [8.8.13]) se tornam informação crucial. A única numeração de IMGT é usada em representações gráficas em 2D, projetadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Imunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], em nas estruturas em 3D da estrutura DB de IMGT/3D [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

[0051] Existem três CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é usado aqui a fim de indicar, de acordo com o caso, uma dessas regiões ou várias ou ainda a região inteira, dessas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo para o antígeno ou o epi- topo que reconhece.

[0052] Para mais claridade, deve ser entendido que na seguinte descrição e mais particularmente nas tabelas 2a, 2b e 3, as CDRs serão definidas por numeração de IMGT e por numeração de Kabat.

[0053] No sentido da presente invenção, a "identidade de percenta gem" entre duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a percentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtidas depois do ótimo alinhamento, essa percentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente ao longo de seu comprimento. A comparação de duas sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos é tradicionalmente realizadas por comparação com as sequências depois de ter ótimo alinhamento delas, a dita comparação sendo capaz de ser conduzida por segmento ou por uso de uma "janela de alinhamento"". Ótimo alinhamento das sequências para a comparação pode ser realizada, além da comparação manual, por meio do algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por meio do algoritmo de homologia local de Neddle- man and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por meio do método de busca de similaridade de Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444] ou por meio de software de computador usando-se esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou pela software de comparação BLAST NR ou BLAST P).

[0054] A identidade de percentagem entre duas sequências de áci dos nucleicos ou de aminoácidos é determinada por comparação das duas sequências otimamente alinhadas em que a sequência de ácidos nucleicos ou de aminoácidos para comparar pode ter adições ou deleção comparadas com a sequência de referência para ótimo alinhamento entre as duas sequências. Identidade de percentagem é calculada por determinação do número de posições em que o aminoácido nucleotídeo ou resíduo é idêntico entre as duas sequências, divisão do número de posições idênticas pela o número total de posições na janela de alinhamento e multiplicação do resultado por 100 para se obter a identidade de percentagem entre as duas sequências.

[0055] Por exemplo, o programa BLAST, "sequências de BLAST 2 " (Tatusova e outros, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotídeo sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250) disponível no site

[0056] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, pode ser usado com os parâmetros de default (notavelmente para os parâmetros "pênalti de lacuna aberta": 5, e "pênalti de lacuna extensão": 2; a matriz selecionada sendo por exemplo, a matriz de "BLOSUM 62" proposta pelo programa); a identidade de percentagem entre as duas sequências para comparar é calculada diretamente pelo programa.

[0057] Para a sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%>, 95% e 98% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência, exemplos preferidos incluem aqueles contendo a sequência de referência, certas modificações, notavelmente uma deleção, uma adição ou uma substituição de pelo menos um aminoácido, truncação ou extensão. No caso de substituição de uma ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, substituições são preferidas em que os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos "equivalentes". Aqui, a expressão "aminoácidos equivalentes " destina-se a indicar quaisquer aminoácidos provavelmente serem usados como substituto de um dos aminoácidos estruturais sem no entanto modificação das atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e daqueles exemplos específicos definidos abaixo.

[0058] Aminoácidos equivalentes podem ser determinados ou na sua homologia estrutural com os aminoácidos para os quais eles estão substituídos ou nos resultados de testes comparativos de atividade biológica entre os vários anticorpos provavelmente serem gerados.

[0059] Como um exemplo não limitante, tabela 1 abaixo sumariza as possíveis substituições prováveis de serem realizadas sem resultar em uma modificação significativa da atividade biológica do anticorpo modificado correspondente; substituições inversas são naturalmente possíveis sob as mesmas condições. Tabela 1

[0060] É conhecido por aqueles versados na técnica que no esta do atual da técnica a maior variabilidade (comprimento e composição) entre as seis CDRs são encontrados nas três CDRs de cadeia pesada e, mais particularmente, a CDR-H3 dessa cadeia pesada.

[0061] Em uma concretização específica, a presente invenção re fere-se a um anticorpo de camundongo, ou compostos derivados ou fragmentos funcionais do mesmo.

[0062] Outra concretização da invenção revela um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, compreendendo uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com IMGT: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 1 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 1; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 2; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 3, e uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com IMGT: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 4 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 4; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 5; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 6 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 6.

[0063] Em uma concretização preferida, o anticorpo, ou um frag mento funcional ou seu derivado, da invenção que nos tumores i) es-pecificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, compreende a) uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 1, CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 2 e CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 3 e b) uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 4, CDR-H2 compreende a sequência SEQ ID No. 5 e CDR- H3 compreende a sequência SEQ ID No. 6. Ainda outra concretização da invenção revela um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, compreendendo uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com IMGT: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 9 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 9; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 10 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 10; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 11 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 11, e a cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com IMGT: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 12 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 12; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 13 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 13; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 14 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 14.

[0064] Em uma concretização preferida, o anticorpo, ou um frag mento funcional ou seu derivado, da invenção que nos tumores i) es-pecificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, compreende a) uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 9, CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 10 e CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 11 e b) uma cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs como definidas de acordo com IMGT, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID No. 12, CDR-H2 compreende a sequência SEQ ID No. 13 e CDR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 14.

[0065] Ainda outra concretização da invenção revela um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, compreendendo uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com Kabat: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 17 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 17; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 18 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 18; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 3, e a cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com Kabat: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 19 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 19; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 20 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 20; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 21 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 21.

[0066] Ainda outra concretização da invenção revela um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, compreendendo uma cadeia leve compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com Kabat: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 22 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 22; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 23 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 23; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 11 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 11, e a cadeia pesada compreendendo as seguintes três CDRs de acordo com Kabat: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 24 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 24; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 25 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 25; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 26 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 26.

[0067] De acordo com ainda outra concretização, o anticorpo da invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, é caracterizado pelo fato de que ele compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 7 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 7; e/ou um domínio variável de cadeia pesada da sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 8 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 8.

[0068] A invenção assim descreve um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, o dito anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 7 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 8.

[0069] De acordo com ainda outra concretização, o anticorpo da invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, é caracterizado pelo fato de que ele compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 15 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 15; e/ou um domínio variável de cadeia pesada de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 16 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade depois de ótimo alinhamento com a sequência SEQ ID No. 16.

[0070] A invenção assim descreve um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet, o dito anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 15 e um domínio variável de cadeia pesada da sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 16.

[0071] Como visto acima, a invenção também refere-se a qualquer composto derivado de um anticorpo como descrito na invenção.

[0072] Mais particularmente, os anticorpos da invenção, ou com posto derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que os ditos compostos derivados consistem de proteínas de ligação compreendendo uma armação de peptídeo em que é enxertada pelo menos uma CDR de tal modo que preserve a totalidade ou parte das propriedades de reconhecimento de parátopo dos anticorpos iniciais.

[0073] Uma ou mais sequências entre as sequências de CDR descri tas na presente invenção podem também estar presentes nas várias armações de proteína de imunoglobulina. Nesse caso, a sequência de proteínas torna possível recriar um esqueleto de peptídeo favorável ao dobramento das CDRs enxertadas, que permitem que elas preservem suas propriedades de reconhecimento de antígeno de parátopo.

[0074] Em geral, uma pessoa versada na técnica conhece como se determinando o tipo de armação de proteína em que para enxertar pelo menos uma das CDRs se originando do anticorpo original. Mais particularmente, é conhecido que sejam selecionadas tais armações podem satisfazer numerosos critérios como se segue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13: 167-187): boa conservação filogenética; - estrutura tridimensional conhecida (como, por exemplo, por cristalografia, espectrometria de RMN ou qualquer outra técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica); tamanho pequeno; pouca ou nenhuma modificação pós- transcritiva; e/ou fácil de se produzir, expressar e purificar.

[0075] A origem de tais armações de proteína pode ser, mas não é limitada às estruturas selecionadas entre: fibronectina e de preferência domínio 10 de tipo III de fibronectina, lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), proteína Z se originando de domínio B de proteína A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A ou proteínas com um pedaço repetido tal como a " repetição de anquirina" (Kohl e outros, PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700- 1705), a " repetição de armadilo", a "repetição rica em leucina" e a "repetição de tetratrico- peptídeo".

[0076] Armações derivadas de toxinas tais como, por exemplo, toxinas oriundas de escorpiões, insetos, plantas, moluscos, etc., e os inibidores de proteína de sintase de NO neuronal (PIN) também seriam mencionados.

[0077] Um exemplo, de maneira alguma limitante, de tais constru ções híbridas, é a inserção da CDR-H1 (cadeia pesada) de um anticorpo de anticD4, ,a saber, 13B8.2, em um dos laços no PIN, a nova proteína de ligação assim obtida preservando as mesmas propriedades que o anticorpo original (Bes e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344). Em uma base puramente ilustrati- va, enxertando a CDR-H3 (cadeia pesada) de um anticorpo de VHH de anti-lisozima em um dos laços de neocarzinoestatina (Nicaise e outros., Protein Science, 2004, 13(7): 1882-1891) pode também ser mencionado.

[0078] Finalmente, como descrito acima, tais armações de peptí- deo podem compreender de uma a seis CDRs se originando do anticorpo original. De preferência, mas não sendo uma exigência, uma pessoa versada na técnica selecionará pelo menos uma CDR da cadeia pesada, a última sendo conhecido como sendo principalmente responsável pela especificidade do anticorpo. A seleção de uma ou mais CDRs relevantes é óbvio por uma pessoa versada na técnica, o qual então escolherá uma técnica conhecida adequada (Bes e outros, FEBS letters 508, 2001,67-74).

[0079] A presente invenção assim refere-se a um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que a armação de peptídeo é selecionada entre proteínas que são a) filogeneticamente bem preservadas, b) de arquitetura robusta, c) com uma organização molecular em 3-D bem conhecida, d) de tamanho pequeno e/ou e) compreendendo regiões que podem ser modificado por deleção e/ou inserção sem modificar propriedades de estabilidade.

[0080] De acordo com a concretização preferida, o anticorpo da invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que a dita armação de peptídeo é selecionada entre i) armações se originando de fibronectina, de preferência domínio 10 de tipo 3 de fibronectina, lipocalina, anticalina, proteína Z se originando de domínio B de proteína A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A ou proteínas com um pedaço repetido tal como a " repetição de anquirina" (Kohl e outros, PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 17001705), a " repetição de armadilo ", a "repetição rica em leucina" e a "repetição de tetratricopeptídeo" ou iii) inibidores de proteína de sin- tase de NO neuronal (PIN).

[0081] Outro aspecto da invenção refere-se aos fragmentos funci onais do anticorpo descrito acima.

[0082] Mais particularmente, a invenção direciona um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizados pelo fato de que o dito fragmento funcional é selecionado entre os fragmentos Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc e diacorpos, ou qualquer fragmento cuja semi-vida foi aumentada tais como fragmentos PEGilado.

[0083] Tais fragmentos funcionais do anticorpo de acordo com a invenção consistem, por exemplo, dos fragmentos Fv, scFv (sc=cadeia simples), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja semi-vida foi aumentada por modificação química, tal como a adição de polialquileno glicol tais como polietileno glicol (PEGilação) (fragmentos PEGilados são chamados de Fv-PEG, scFv-PEG, Fab- PEG, F(ab')2-PEG e Fab'-PEG), ou por incorporação em um liposso- ma, microesferas ou PLGA, os ditos fragmentos que possuem pelo menos uma das CDRs características da invenção que é notavelmente capaz de exercer em uma atividade de modo geral, mesmo parcial, do anticorpo a partir do qual ele surge.

[0084] De preferência, os dito fragmentos funcionais compreende rão ou incluirão uma sequência parcial da cadeia leve ou pesada variável do anticorpo a partir do qual eles são derivados, a dita sequência parcial sendo suficiente para reter a mesma especificidade de ligação do anticorpo a partir do qual ele surge e afinidade suficiente, de preferência pelo menos igual a 1/100, mais de preferência pelo menos 1/10 daquela do anticorpo a partir do qual ele surge.

[0085] Tal fragmento funcional conterá pelo menos cinco aminoá cidos, de preferência 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 ou 100 sequência de ami- noácidos consecutivos do anticorpo a partir do qual ela surge.

[0086] De preferência, esses fragmentos funcionais serão dos tipos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diacorpos, que em geral têm as mesmas especificidade de ligação como o anticorpo a partir do qual eles resultam. De acordo com a presente invenção, fragmentos do anticorpo da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos descritos acima por métodos tais como digestão de enzima, incluindo pepsina ou papaína e/ou por clivagem das pontes de dissulfeto por redução química. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por técnicas genéticas recombinantes também conhecidas por uma pessoa versada na técnica ou por síntese de peptídeo por meio, por exemplo, de sintetizadores de peptídeo automáticos tais como aqueles vendidos pela Applied BioSystems, etc.

[0087] Para mais claridade, tabela 2a abaixo sumariza as várias se quências de aminoácidos correspondentes ao anticorpo da invenção de acordo com IMGT enquanto que a tabela 2b sumariza as várias sequências de aminoácidos ao anticorpo da invenção de acordo com Kabat. Tabela 2a (em que Mu. = de camundongo)

Tabela 2b (em que Mu. = de camundongo)

[0088] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de camundongo capaz de secretar um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, notavelmente o hibridoma de origem de camundongo depositado no CNCM, Institut Pasteur, Paris, França, em 18 de novembro de2009, sob o número 1-4247. O dito hibridoma foi obtido pela fusão de células e esplenócitos de camundongos imunizados Balb/C do mieloma Sp 2/O-Ag 14 linhas.

[0089] O anticorpo monoclonal, aqui chamado de 227D3, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizados pelo fato de que o dito anticorpo é secretado pelo hibridoma depositado no CNCM em 18 de novembro de2009, sob o número 1-4247 obviamente faz parte da presente invenção.

[0090] A invenção assim também inclui um anticorpo monoclonal derivado de hibridoma 1-4247 ou um seu subclone que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet.

[0091] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de camundongo capaz de secretar um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, notavelmente o hibridoma de origem de camundongo depositado no CNCM, Institut Pasteur, Paris, França, em 18 de novembro de 2009, sob o número 1-4246. O dito hibridoma foi obtido pela fusão de células e esplenócitos de camundongos imunizados Balb/C do mieloma Sp 2/O-Ag 14 linhas.

[0092] O anticorpo monoclonal, aqui chamado de 205 A5, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizados pelo fato de que o dito anticorpo é secretado pelo hibridoma depositado no CNCM em 18 de novembro de 2009, sob o número 1-4246 obviamente faz parte da presente invenção.

[0093] A invenção assim também inclui um anticorpo monoclonal derivado de hibridoma 1-4246 ou um seu subclone que nos tumores i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet.

[0094] Em outra concretização, a invenção trata de um ácido nu- cleico isolado, caracterizado pelo fato de que ele é escolhido a partir dos seguintes ácidos nucleicos:

[0095] um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica uma proteína de ligação como acima descrito;

[0096] um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo como acima descrito;

[0097] um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA compreendendo as sequências SEQ ID Nos. 27 a 32 ou 35 a 40;

[0098] um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA compreendendo as sequências SEQ ID Nos. 33, 34, 41 ou 42;

[0099] os ácidos nucleicos de RNA correspondentes dos ácidos nucleicos como definidas em c) ou d); e

[00100] os ácidos nucleicos complementares dos ácidos nucleicos como definidos em a), b), c) e d).

[00101] Tabela 3 abaixo sumariza as várias sequências de nucleo- tídeos em relação ao anticorpo da invenção. Todas as CDRs são aqui definidas de acordo com IMGT (Definição das CDRs de acordo com Kabat não são representadas na tabela 3, mas, para o homem versado na técnica, será óbvio defini-las levando em consideração as sequências da tabela 2b). Tabela 3

[00102] Os termos "ácido nucleico", "sequência nucléica", "sequência de ácidos nucleicos", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", " sequência de polinucleotídeos" e " sequência de nucleotídeos", usados intercambiavelmente na presente descrição, significam uma sequência precisa de nucleotídeos, modificados ou não, definido um fragmento ou uma região de um ácido nucleico, contendo nucleotídeos não naturais ou não, e sendo ou um DNA de fio duplo, um DNA de fio único ou produtos de transcrição dos ditos DNAs.

[00103] Seriam também incluídas aqui que a presente invenção não se refere às sequências de nucleotídeos no seu ambiente cromosso- mal natural, isto é, em um estado natural. As sequências da presente invenção foram isoladas e/ou foram purificadas, isto é, elas foram amostradas diretamente ou indiretamente, por exemplo, por uma cópia, seu ambiente foi pelo menos parcialmente modificado. Ácidos nu- cleicos isolados obtidos por genética recombinante, por meio, por exemplo, de células de hospedeiro, ou foram obtidas por síntese química seriam também mencionadas aqui. "Sequências nucléicas que exibem a identidade de percentagem de pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%), 95% e 98%>, depois de ótimo alinhamento com uma sequência preferida" significa sequências nucléicas que exibem, com relação à sequência nucléica de referência, certas modificações tais como, em particular, uma deleção, uma truncação, uma extensão, uma fusão quimérica e/ou uma substituição, notavelmente pontual. De preferência, Essas são sequências que codificam as mesmas sequências de aminoácidos que a sequência de referência, isso estando relacionado com a degeneração do código genético, ou sequências de complementaridade que são prováveis de hibridizar especificamente com as sequências de referências, de preferência sob condições altamente rigorosas, notavelmente aquelas definidas abaixo.

[00104] Hibridização sob condições altamente rigorosas significa que condições relacionadas com temperatura e resistência iônica são selecionadas de tal modo que elas permitem que hibridização seja mantida entre dois fragmentos de DNA de complementaridade. Em uma base puramente ilustrativa, sob condições altamente rigorosas da etapa de hibridização para a finalidade de definição dos fragmentos de polinucleotídeo descritos acima são vantajosamente como se segue.

[00105] Hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duas etapas: (1) pré-hibridização a 42oC por três horas no tampão de fosfato (20 mM, pH 7,5) contendo 5X SSC (IX SSC corresponde a uma solução de NaCl a 0,15 M + citrato de sódio a 0,015 M), 50%> forma- mida, 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10X Denhardt's, 5% de sulfato de dextrano e 1% de DNA de esperma de salmão; (2) hibridiza- ção primária por 20 horas a uma temperatura dependendo do comprimento da sonda (isto é: 42oC para uma sonda >100 nucleotídeos de comprimento) seguido por duas lavagens de 20 minutos a 20oC em 2X SSC + 2% de SDS, uma lavagem de 20 minutos a 20oC em 0,1X SSC + 0,1% de SDS. A última lavagem é realizada em 0,1X SSC + 0,1% de SDS por 30 minutos a 60oC para uma sonda >100 nucleotídeos de comprimento. As condições de hibridização altamente rigorosas descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas por uma pessoa versada na técnica para oligonucleotídeos mais longos e mais curtos, de acordo com os procedimentos descritos em Sambrook, e outros. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edição, 2001).

[00106] A invenção também refere-se a um vetor compreendendo um ácido nucleico como descrito na invenção.

[00107] A invenção notavelmente direciona vetores de expressão e/ou clonagem que contêm tal sequência de nucleotídeos.

[00108] Os vetores da invenção de preferência contêm elementos que permitem a expressão e/ou a secreção das sequências de nucleotídeos em uma dada célula de hospedeiro. O vetor assim deve conter um promotor, iniciação de tradução e sinais de terminação, bem como regiões de regulação de transcrição adequadas. Deve ser capaz de ser mantido de um modo estável na célula de hospedeiro e pode opcionalmente ter sinais específicos que especificam secreção da proteína traduzida. Esses vários elementos são selecionados e são otimizados por uma pessoa versada na técnica de acordo com a célula de hospedeiro usada. Para essa finalidade, as sequências de nucleotídeos podem ser inseridas nos próprios vetores de replicação dentro do hospedeiro escolhido ou serem vetores integrativos do hospedeiro.

[00109] Tais vetores são preparados por métodos tipicamente usados por uma pessoa versada na técnica e os clones resultantes podem ser introduzidos para dentro do hospedeiro adequado por métodos padrão tais como lipofecção, eletroporação, choque térmico ou métodos químicos.

[00110] Os vetores são, por exemplo, vetores de plasmídio ou de origem viral. Eles são usados para transformar célula de hospedeiros a fim de clonar ou expressar as sequências de nucleotídeos da invenção.

[00111] A invenção também compreende células de hospedeiro transformadas por ou compreendendo um vetor como descrito na presente invenção.

[00112] A célula de hospedeiro pode ser selecionada entre sistemas procarióticos ou eucarióticos tais como células bacterianas, por exemplo, mas também células de levedura ou células de animal, notavelmente células de mamífero. Células de planta ou de inseto podem também ser usadas.

[00113] A invenção também refere-se a animais, outros que não homem, que têm uma célula transformada de acordo com a invenção.

[00114] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para a produção de um anticorpo capaz de se ligar especificamente ao ligante de forma ativada independente de proteína de cMet, de acordo com a invenção, ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende as seguintes etapas:

[00115] a cultura em um meio de e as condições de cultura adequadas para uma célula de hospedeiro de acordo com a invenção; e

[00116] a recuperação do dito anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, assim produzidos a partir do meio de cultura ou a partir da dita células cultivadas.

[00117] As células transformadas de acordo com a invenção são de uso nos métodos para a preparação de polipeptídeos recombinantes de acordo com a invenção. Métodos para a preparação de polipeptí- deo de acordo com a invenção na forma recombinante, caracterizados pelo fato de que os ditos métodos usam um vetor e/ou uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção, estão também contidos na presente invenção. De preferência, uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção é cultivada sob condições de que permite a expressão do polipeptídeo acima mencionado e recuperação do dito peptídeo recombinante.

[00118] Como já mencionado, a célula de hospedeiro pode ser selecionada entre sistemas procarióticos ou eucarióticos. Em particular, é possível identificar as sequências de nucleotídeos da invenção que facilitam a secreção em tal sistema procariótico ou eucariótico. Um vetor de acordo com a invenção, portanto, tal sequência pode assim ser usada vantajosamente para a produção de proteínas recombinantes a serem secretadas. De fato, a purificação dessas proteínas recombinantes de interesse será facilitada pelo fato de que elas estão presentes no sobrenadante da cultura celular ao invés de dentro das células de hospedeiro.

[00119] Os polipeptídeos da invenção podem também ser preparados por sínteses químicas.

[00120] Tal método da preparação é também um objetivo da invenção. Uma pessoa versada na técnica de métodos conhecidos por síntese química, tais como técnicas de fase sólida (vide notavelmente Steward e outros, 1984, Solid phase peptídeos synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) ou técnicas de fase sólida, por condensação de fragmentos ou por síntese de combinação na solução. Polipeptídeos obtidos por sínteses químicas e capazes de conter aminoácidos correspondentes não naturais estão também constituídos na invenção. Os anticorpos, ou os compostos derivados ou frag-mentos funcionais dos mesmos, provavelmente serem obtidos pelo método da invenção estão também contidos na presente invenção.

[00121] A invenção também compreende o uso de uma proteína de ligação ou um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, para a identificação da forma ativada independente de ligante de cMet.

[00122] Em outra concretização, a invenção refere-se a um processo para diferenciação entre a forma ativada por ligante independente de cMet e as outras formas de cMet, incluindo formas ativadas dependentes de ligante ou não ativadas de cMet, em uma amostra, processo esse que compreende as etapas de:

[00123] contato da dita amostra com uma ligação ou um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, e

[00124] detecção da ligação da dita proteína de ligação ou do anticorpo com a amostra. O uso da proteína de ligação, e mais particularmente o anticorpo, da invenção como biomarcador é também revelado. Os métodos podem ser usados para a detecção ou diagnóstico de várias desordens oncogênicas hiperproliferativas associadas a expressão de forma ativada independente de ligante de cMet, exemplificada por, mas não limitada a, osteossarcomas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, glioblastoma, cólon, câncer, câncer gástrico, câncer renal, hepatocarcinomas ou qualquer outro câncer associado à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet. Como seria reconhecido por aquele de habilidade comum nessa técnica, o nível de proteína de ligação e/ou expressão de anticorpo associados à desordem particular variarão dependendo da natureza e/ou da severidade da condição preexistente.

[00125] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método in vivo para a detecção ou diagnóstico ou estágio em um paciente com desordens oncogênicas hiperproliferativas associadas à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet, particularmente as ditas desordens oncogênicas hiperproliferativas como citadas aci- ma, o dito método compreendendo as etapas de:

[00126] administração da proteína de ligação e/ou anticorpos da presente invenção, de preferência marcado, ao paciente que necessita dos mesmos; e

[00127] detecção, de preferência por imagem, da ligação do dito anticorpo ou proteína de ligação com forma ativada independente de ligante de cMet expressa no paciente, de preferência pelo órgão do paciente em que a presença de células tumorais ou tumor são suspeitas ou são identificadas (particularmente como o estágio).

[00128] Administração da proteína de ligação e/ou anticorpos da presente invenção em qualquer um dos modos convencionais conhecidos por aquele versado na técnica (por exemplo, tópica, parenteral, intramuscular, etc.), proverão um método extremamente útil de detecção de células displásica em uma amostra bem como que permite que um médico monitore o regime terapêutico de um paciente que sofre tratamento para uma desordem hiperproliferativa associada a ou mediada por expressão de forma ativada independente de ligante de cMet.

[00129] Em outra concretização, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a imagem in vivo de uma desordem onco- gênica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet, compreendendo a proteína de ligação e/ou anticorpo acima ou seu fragmento que está marcado e que liga forma ativada independente de ligante de cMet in vivo; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00130] A proteína de ligação e o anticorpo da invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, será usado em várias finalidade médicas ou de pesquisa, incluindo a detecção, diagnóstico, e estágio de várias patologias associadas à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet.

[00131] Determinação do estágio tem valor de prognóstico potencial e provê critérios para projetar ótima terapia. Simpson e outros J. Clin. Oncology 18:2059 (2000). Em geral, estágio patológico de câncer de mama, por exemplo, é preferível ao estágio clínico porque o primeiro dá um prognóstico mais exato. No entanto, estágio clínico será preferido se ele fosse tão exato quanto estágio patológico uma vez que não depende de um procedimento invasivo para se obtiver tecido para a avaliação patológica.

[00132] Quando usados como rótulos adequados ou outros produtos químicos ou biomolécula apropriados, a proteína de ligação e/ou anticorpo da invenção são particularmente úteis para aplicações de prognóstico ou diagnósticos in vivo.

[00133] Rótulos para o uso em imune ensaios são em geral conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem enzimas, radioisóto- pos, e fluorescente, luminescente e substâncias cromogênicas, incluindo partículas coloridas tais como contas de látex e dourada coloidal. Imunoensaios adequados incluem ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA). Vários tipos de rótulos e métodos de conjugação dos rótulos à proteína de ligação e/ou os anticorpos da invenção são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como aqueles indicados abaixo.

[00134] Como usado aqui, o termo "uma desordem oncogênica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet"destina-se a incluir doenças e outras desordens em que a presença de altos níveis ou níveis anormalmente baixos da forma ativada independente de ligante de cMet (aberrante) em um indivíduo que sofre da desordem demonstrou ser ou é suspeito de ser ou responsável pela patofisiologia da desordem ou um fator que contribui para uma piora da desordem. Alternativamente, tais desordens podem ser evidenciadas, por exemplo, por um aumento nos níveis da forma ativada independente de ligante de cMet sobre a superfície da célula que resulta em uma autofosforilação de tirosina aumentada de cMet nas células afetadas ou tecidos de um indivíduo que sofre da desordem. O aumento na forma ativada independente de ligante de níveis de cMet pode ser detectado, por exemplo, usando-se o anticorpo 205A5 ou 227D3 da invenção. Além do mais, refere-se a células que exibem crescimento relativamente autônomo, de modo que elas exibam um fenótipo de crescimento anômalo caracterizado por uma perda significativa de controle de proliferação de célula. Alternativamente, as células podem expressar níveis normais da forma ativada independente de ligante de cMet mas são marcadas por proliferação anormal.

[00135] Em certas concretizações, "expressão aumentada" quando se refere à forma ativada independente de ligante de cMet refere-se a níveis de expressão de gene ou proteína que demonstram uma aumento estatisticamente significativo na expressão (como medido por expressão de proteína ou expressão de RNA) em relação a um controle.

[00136] Mais particularmente, é considerado o uso de uma proteína de ligação ou um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, de acordo com a invenção como descrito, para o diagnóstico in vitro de uma desordem oncogênica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet, ou determinação in vitro do prognóstico para o desenvolvimento de uma desordem oncogênica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet.

[00137] Outro amplo aspecto de acordo com a invenção refere-se a um método de diagnóstico de desordem oncogênica hiperproliferativa patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet, em um indivíduo compreendendo determinação da presença ou da ausência da forma ativada independente de ligante de células de expressão de cMet em uma amostra, e diagnóstico de uma condição patológica ou suscetibilidade a uma condição patológica com base na presença ou na ausência da dita forma ativada independente de ligante de células de expressão de cMet. Os usos de diagnósticos da proteína de ligação ou do anticorpo da invenção compreendem tumores primários, cânceres e metástases. A proteína de ligação ou o anticorpo pode estar presente na forma de um imunoconjugado ou de uma proteína de ligação/anticorpo marcado de modo a se obter um sinal detectável e/ou quantificável.

[00138] Mais particularmente, um objetivo preferido de acordo com a invenção é um processo de detecção in vitro da presença e/ou a localização da forma ativada independente de ligante de tumor de expressão de cMet em um indivíduo, em que o dito processo compreende as etapas de

[00139] contato de uma amostra do indivíduo com uma proteína de ligação ou um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, de acordo com a invenção, e

[00140] detecção da ligação do dito anticorpo ou proteína de ligação com a amostra. Outro aspecto do indivíduo é o acompanhamento da forma ativada independente de ligante de expressão de cMet como uma resposta a uma terapia direcionada por cMet durante experiências clínicas, e mais particularmente quando a regulação para baixo e ou degradação da forma ativada independente de ligante de cMet é um dos componentes do mecanismo de ação do composto testado.

[00141] Como estará evidente pelo técnico versado, a detecção da ligação de a proteína de ligação ou do anticorpo da invenção pode ser revelado por vários ensaios. Embora qualquer meio para a realização dos ensaios seja compatível com a invenção, pode ser mencionado, como exemplos, FACS, ELISA ou IHC.

[00142] Como usado aqui, o termo "amostra" destina-se a significar qualquer fluido biológico, célula, tecido, órgão ou sua porção, que in- clui ou potencialmente inclui uma célula neoplásica, tal como célula oriunda do cólon, gástrico, reto, mama, ovário, próstata, rim, pulmão, sangue, cérebro ou outro órgão ou tecido que contém ou é suspeito de conter uma célula neoplásica. O termo inclui amostras presentes em um indivíduo bem como amostras obtidas ou derivadas do indivíduo. Por exemplo, uma amostra pode ser uma seção histológica de uma amostra obtida por biópsia, ou células que são colocadas em ou adaptadas a cultura de tecidos. Uma amostra ulteriormente pode ser um extrato ou fração subcelular, ou uma molécula de ácido nucleico bruta ou substancialmente pura ou preparação de proteína.

[00143] Amostra clínica destina-se a incluir uma variedade de tipos de amostras obtidos a partir de um indivíduo e útil no procedimento da invenção, tal como, por exemplo, um teste de diagnóstico ou de monitoramento da determinação ou detecção da forma ativada independente de ligante de cMet, níveis de expressão. A definição inclui amostras de tecido sólido obtidas por remoção cirúrgica, uma amostra patológica, uma amostra arquivada, ou uma amostra de biópsia, culturas de tecidos ou células derivadas a partir das mesmas e o sua progênie, e seções ou esfregação preparados a partir de qualquer uma dessas fontes. Exemplos não limitantes são amostras obtidas a partir de tecido de mama, linfonodos, cólon, pâncreas, próstata etc. A definição também inclui amostras líquidas de origem biológica, e pode referir-se ou as células ou fragmentos de células suspensas ali, ou ao meio líquido e seus solutos.

[00144] Outro aspecto de acordo com a invenção refere-se a um processo de determinação do nível de expressão in vitro da forma ativada independente de ligante de cMet, em um tumor de expressão de cMet oriundo de um indivíduo, em que o dito processo compreende as etapas de

[00145] contato de uma amostra do indivíduo com uma proteína de ligação ou um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, de acordo com a invenção, e b) quantificação do nível de anticorpo ou proteína de ligação que se liga à forma ativada independente de ligante de cMet na dita amostra.

[00146] Como estará evidente pelo técnico versado, o nível de anticorpo ou proteína de ligação que se liga a forma ativada independente de ligante de cMet pode ser quantificada em numerosos meios tais como por vários ensaios. Embora qualquer meio para a realização dos ensaios seja compatível com a invenção, um método preferido põe em jogo processos imunoenzimáticos de acordo com a técnica de ELISA, por técnica de imunofluorescência, por técnica de imunohistoquímica ou técnica radioimunoensaio (RIA) ou equivalente.

[00147] Em uma concretização preferida do processo da invenção o nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet é medido por imunohistoquímica (IHC).

[00148] De preferência, a amostra biológica é formada por um fluido biológico, tais como soro, sangue total, célula, uma amostra de tecido ou biópsias de origem humana. A amostra pode, por exemplo, incluir, tecido submetido à biópsia, que pode ser convenientemente analisado quanto a presença de uma desordem oncogênica hiperproliferativa patológica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet.

[00149] Uma vez que uma determinação é feita da quantidade da forma ativada independente de ligante de cMet presente na amostra de teste, os resultados podem ser comparados com aqueles de amostras de controle, que são obtidos de modo similar às amostras de teste mas a partir de indivíduos que não têm ou apresentam com a desordem oncogênica hiperproliferativa associada à expressão da forma ativada independente de ligante de cMet. Se o nível da forma ativada independente de ligante de cMet for significativamente elevada na amostra de teste, ela pode ser concluída que ali é uma probabilidade aumentada do indivíduo a partir do qual ele foi derivado tem ou desenvolverá a dita desordem.

[00150] A invenção refere-se, mais particularmente, a um processo de diagnóstico in vitro da forma ativada independente de ligante de tumor de expressão de cMet ou determinação in vitro do prognóstico para o desenvolvimento da forma ativada independente de ligante de tumor de expressão de cMet em um indivíduo, em que o dito processo compreende as etapas de

[00151] determinação do nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet, como acima descrito, e

[00152] comparação do nível de expressão da etapa a) com um nível de expressão de referência da forma ativada independente de ligante de cMet, a partir de um tecido normal ou uma não expressão da forma ativada independente de ligante de tecido de cMet.

[00153] "Diagnóstico" uma doença como usado na aplicação destina-se a incluir, por exemplo, diagnóstico ou detecção da presença da desordem oncogênica hiperproliferativa patológica associada a ou mediada por expressão de forma ativada independente de ligante de cMet, monitoramento da progressão da doença, e identificação ou detecção de células e amostras que são indicativas de uma desordem associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet.

[00154] "Prognóstico" como usado nessa aplicação significa a probabilidade da recuperação de uma doença ou da previsão do desenvolvimento provável ou resultado de uma doença. Por exemplo, se uma amostra oriunda de um indivíduo for positiva para coloração com a proteína de ligação ou o anticorpo da invenção, então o "prognóstico" para aquele indivíduo é melhor do que se a forma de amostra negativa para forma ativada independente de ligante de coloração de cMet. Amostras podem ser classificadas quanto a forma ativada independente de ligante de níveis de expressão de cMet em uma escala apropriada como será mais detalhada aqui em seguida.

[00155] No entanto outro aspecto da invenção também está relacionada com o monitoramento da forma ativada independente de ligante de expressão de cMet para os compostos terapêuticos que induzem uma degradação de cMet como um de seu mecanismo de ação. Naquele caso após a forma ativada independente de ligante de expressão de cMet sobre membrana de célula poderia ser uma ferramenta crítica para avaliar a eficácia do tratamento durante experiências clínicas e terapias "personalizadas".

[00156] O nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet é vantajosamente comparado ou medido em relação a níveis em uma amostra ou célula de controle também chamado de um "nível de referência" ou "nível de expressão de referência". "Nível de referência", "nível de expressão de referência", "nível de controle" e "controle" são usados intercambiavelmente no relatório. Amplamente falando, um "nível de controle"destina-se a separar nível de linha de base medido em uma célula de controle comparável, que é em gera livre de câncer ou doença. Pode ser do mesmo indivíduo ou de outro indivíduo que é normal ou presente com a mesma doença a partir do qual a amostra de teste ou doente é obtida. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "nível de referência"refere-se a um "nível de controle" de expressão de forma ativada independente de ligante de cMet usado para avaliar um nível de teste da expressão de forma ativada independente de ligante de cMet em uma amostra contendo célula de câncer de um paciente. Por exemplo, quando o nível de forma ativada independente de ligante de cMet na amostra biológica de um paciente são mais altos que o nível de referência da forma ativada independente de ligante de cMet, as células serão consideradas terem um alto nível de expressão, ou ultraexpressão , da forma ativada independente de ligante de cMet. O nível de referência pode ser determinado por uma pluralidade de métodos. Níveis de expressão podem assim definir forma ativada independente de ligante de células de expressão de cMet ou alternativamente o nível de expressão de forma ativada independente de ligante de cMet independente do número de células que expressam forma ativada independente de ligante de cMet. Assim o nível de referência para cada paciente pode ser proscrita por uma razão de referência da forma ativada independente de ligante de cMet, em que a razão de referência pode ser determinada por qualquer um dos métodos para a determinação dos níveis de referência descritos aqui.

[00157] Por exemplo, o controle pode ser um valor predeterminado, que pode tomar uma variedade de formas. Pode ser um único valor de corte, tal como médio ou mediano. O "nível de referência" pode ser um único número, igualmente aplicável a cada paciente individualmente, ou o nível de referência pode variar, de acordo com subpopulações específicas de pacientes. Assim, por exemplo, homens mais velhos devem ter um diferente nível de referência dos homens mais jovens para o mesmo câncer, e mulheres podem ter um diferente nível de referência do que homens para o mesmo câncer Alternativamente, o "nível de referência" pode ser determinado por medição do nível de expressão de forma ativada independente de ligante de cMet em células de câncer não oncogênicas oriundas do mesmo tecido que o tecido das células neoplásicas a serem testadas. Também, o "nível de refe-rência"poderia ter uma certa razão da forma ativada independente de ligante de cMet nas células neoplásicas de um paciente em relação à forma ativada independente de ligante de níveis de cMet em células de não tumor dentro do mesmo paciente. O "nível de referência" pode também ser um nível da forma ativada independente de ligante de cMet de células cultivadas in vitro, que podem ser manipuladas para estimular células de tumor, ou podem ser manipuladas em qualquer outro modo que fornece níveis de expressão que exatamente determinam o nível de referência. Por outro lado, o "nível de referência" pode ser estabelecido com base nos grupos comparativos, tais como em grupos não tendo forma ativada independente de ligante elevada de níveis de cMet e grupos tendo forma ativada independente de ligante elevada de níveis de cMet. Outro exemplo de grupos comparativos seriam grupos tendo uma doença, condição ou sintomas particulares e grupos sem a doença. O valor predeterminado pode ser disposto, por exemplo, onde uma população testada é dividida igualmente (ou desigualmente) em grupos, tais como grupos de baixo risco, grupos de risco médio e um grupo de alto risco ou em quadrantes ou quintiles, o quadrante ou quintile mais baixo sendo indivíduos com o risco mais baixo ou quantidades mais altas da forma ativada independente de ligante de cMet e o quadrante ou quintile mais alto sendo indivíduos com os riscos mais altos ou quantidades menores da forma ativada independente de ligante de cMet.

[00158] O nível de referência pode também ser determinado por comparação do nível de forma ativada independente de ligante de cMet nas populações de pacientes tendo o mesmo câncer. Isso pode ser realizado, por exemplo, por análise de histograma, em que uma coorte total de pacientes são graficamente apresentados, em que um primeiro eixo representa o nível de forma ativada independente de ligante de cMet, e um segundo eixo representa o número de pacientes na coorte cujas células tumorais expressam forma ativada indepen-dente de ligante de cMet em um dado nível. Dois ou mais grupos separados de pacientes podem ser determinados por identificação de populações de subconjuntos da coorte que têm níveis iguais ou similares da forma ativada independente de ligante de cMet. Determinação do nível de referência pode então ser feita com base em um nível que melhor distingue esses grupos separados. A nível de referência também pode representar os níveis de dois ou mais marcadores, um dos quais é forma ativada independente de ligante de cMet. Dois ou mais marcadores podem ser representados, por exemplo, por uma razão de valores para níveis de cada marcador.

[00159] Do mesmo modo, uma população aparentemente saudável terá uma diferente faixa 'normal' do que terá uma população que é conhecida como tendo uma condição associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet. Correspondentemente, o valor predeterminado selecionado pode levar em consideração a categoria em que um indivíduo cai. Faixas e categorias apropriadas podem ser selecionadas com não mais do que a experimentação rotineira por aqueles de habilidade comum na técnica. Por "elevado", "aumentado" quer se dizer alta relação a um controle selecionado. Tipicamente o controle será com base nos indivíduos normais aparentemente saudáveis em uma idade apropriada entre parênteses.

[00160] Será também entendido que os controles de acordo com a invenção podem ser, além dos valores predeterminados, amostras de materiais testados em paralelo com os materiais experimentais. Exemplos incluem tecidos ou células obtidos ao mesmo tempo a partir do mesmo indivíduo, por exemplo, partes de uma única biópsia, ou partes de uma amostra de única célula oriunda do indivíduo.

[00161] No diagnóstico ou monitoramento clínico de pacientes com uma forma ativada independente de ligante de doenças mediadas por cMet, a detecção da forma ativada independente de ligante de células de expressão de cMet ou um aumento nos níveis da forma ativada independente de ligante de cMet, em comparação com os níveis em uma amostra biológica correspondente oriunda de tecido não canceroso ou de indivíduo normal é em geral indicativo de um paciente com ou suspeito da apresentar com uma forma ativada independente de ligante de desordem mediada por cMet.

[00162] De acordo com o exposto acima, a invenção provê um método para a previsão de suscetibilidade a câncer compreendendo detecção do nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet, em uma amostra de tecido, sua presença indicando suscetibilidade a câncer, em que o grau da forma ativada independente de ligante de expressão de cMet se correlaciona com o grau de suscetibilidade. Assim, em concretizações específicas, a expressão de forma ativada independente de ligante de cMet em, por exemplo, tecidos de próstata, tecido de osteossarcomas, tecido de pulmão, tecido de pan- creático, tecido de cólon, tecido de mama, tecido de glioblastoma, tecidos ovarianos ou qualquer outro tecido suspeito de células que expressam forma ativada independente de ligante de cMet é examinada, com a presença de forma ativada independente de ligante de cMet na amostra provendo uma indicação de suscetibilidade a câncer ou a emergência ou existência de um tumor de tecido específico.

[00163] Um método para a avaliação de tumor agressividade é também provida. Em uma concretização, um método para a observação da progressão de uma malignidade em um indivíduo durante um tempo compreende a determinação do nível de forma ativada independente de ligante de cMet expresso por células em uma amostra do tumor, em comparação com o nível assim determinada para o nível de forma ativada independente de ligante de cMet expresso em uma amostra de tecido equivalente tirada do mesmo indivíduo em um tempo diferente, em que o grau da forma ativada independente de ligante de expressão de cMet na amostra de tumor durante um tempo provê informação na progressão do câncer.

[00164] Em ainda outra concretização, a aplicação provê métodos para a determinação do protocolo terapêutico apropriado para um indi- víduo. Especificamente, a proteína de ligação ou os anticorpos da invenção serão muito útil para o monitoramento do curso de melhoramento de malignidade em um indivíduo, especialmente naquelas circunstâncias onde o indivíduo está sendo tratado com uma anticorpo ou proteína de ligação de cMet que não compete com a proteína de ligação ou os anticorpos da invenção para que se liga a forma ativada independente de ligante de cMet. A presença ou a ausência ou uma mudança no nível de forma ativada independente de ligante de cMet de acordo com a invenção pode ser indicativa que o indivíduo é provável ter uma recaída de câncer ou um câncer progressivo ou um câncer persistente associado à forma ativada independente de ligante de cMet. Assim, por medição de um aumento no número de células que expressam forma ativada independente de ligante de cMet ou mudanças na concentração da forma ativada independente de ligante de cMet presente em vários tecidos ou células, é possível determinar se um regime terapêutico particular visado no melhoramento de uma malignidade associada à forma ativada independente de ligante de cMet é eficaz.

[00165] Outro objetivo da invenção é um método in vivo de imagem de uma desordem oncogênica associada à expressão de forma ativada independente de ligante de cMet. Por exemplo, tal método pode ser usado em um paciente que apresenta sintomas de uma desordem oncogênica. Se o paciente tiver, por exemplo, níveis de expressão aumentada da forma ativada independente de ligante de cMet, então o paciente é provável de sofrer de uma desordem cancerosa. Também, o método pode ser útil para o monitoramento da progressão e/ou resposta ao tratamento em pacientes os quais foram anteriormente diagnosticados com a forma ativada independente de ligante de câncer mediado por cMet. De acordo com o objetivo acima, a invenção provê um reagente de imagem in vivo compreendendo uma proteína de ligação ou um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento fun- cional ou seu derivado, de preferência marcado, especialmente radio- marcador, e seu uso na imagem médica. Assim, um método geral de acordo com a invenção trabalha por administração a um paciente uma quantidade eficaz de imagem de um reagente de imagem tal como anticorpo ou proteína de ligação descrito acima que é marcado e um veículo farmaceuticamente eficaz e então detecção do agente depois que se ligou a forma ativada independente de ligante de cMet presente na amostra. Em certas concretizações, o método trabalha por administração de uma quantidade eficaz de um agente de imagem por administração de uma quantidade eficaz de imagem de um agente de imagem compreendendo uma porção de direcionamento e uma porção ativa. O agente de imagem é administrado em uma quantidade eficaz para o uso de diagnóstico em um mamífero tal como ser humano e a localização e acúmulo do agente de imagem é então detectado. A localização e acúmulo do agente de imagem pode ser detectado por método de imagem de radionuclídeo, radiocintigrafia, imagem de ressonância magnética nuclear, tomografia computadorizada, tomografia de emissão de positron, tomografia axial computadorizada, raios X ou imagem de ressonância magnética nuclear, detecção de fluorescência, e detecção de quimioluminescente.

[00166] Em relação ao desenvolvimento de terapia antitumoral direcionada, o diagnóstico com técnicas imunohistológicas dá, in situ, informação no nível de expressão de receptor e assim permitem selecionar pacientes suscetíveis a serem tratados seguindo o nível de expressão de receptores necessários para tal tratamento.

[00167] Para imunoterapia usando-se anticorpos monoclonais, a resposta ao tratamento dependendo do nível de expressão direcionado a receptor quando tratamento com trastuzumab onde determinação da ul- traexpressão de Her2 em carcinoma de mama é agora de principal importância clínica com o advento do anticorpo monoclonal de anti-Her2 humanizado trastuzumab. Demonstração da ultraexpressão de Her2 é um pré-requisito para o tratamento com trastuzumab como ele age por direcionamento específico de células de carcinoma de ultraexpressão de Her2. Testagem exata quanto a Her2 visa assegurar que tratamento com trastuzumab potencialmente tóxico e dispendioso não é dado a paciente com tumores de não ultraexpressão e que cada paciente o qual poderia se beneficiar de trastuzumab recebe o tratamento apropriado.

[00168] O ensinamento com trastuzumab em relação à seleção de paciente que Her2 ultraexpresso mostrou o benefício de determinar o nível de expressão de receptor quando usando uma terapia com um anticorpo monoclonal e de se desenvolver, no mesmo tempo do que um anticorpo monoclonal terapêutico, um anticorpo monoclonal que pode ser usado para a seleção de paciente.

[00169] Como uma consequência, a invenção refere-se a um processo de determinação in vitro da forma ativada por ligante independente do estado de cMet de um tumor de um indivíduo, em que o dito processo compreende as etapas de

[00170] determinação do nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet, como acima descrito,

[00171] classificação do dito tumor quanto a forma ativada independente de ligante de nível de expressão de cMet, e c) comparação da dita classificação com aquela obtida a partir de uma amostra de controle.

[00172] "Forma ativada independente de ligante de estado de cMet " dentro do significado da invenção, refere-se à classificação de tumor para a forma ativada independente de ligante de cMet de classe positiva [forma ativada independente de ligante de cMet (+)] ou forma ativada independente de ligante de cMet de classe negativa [forma ativada independente de ligante de cMet (-)]com base na determinação do nível de expressão do forma ativada independente de ligante de gene de cMet como medido por quaisquer métodos tais como hibridização de fluorescên- cia in situ (FISH), hibridização cromogênica in situ (CISH), lasca de gene ou outros métodos conhecidos pelo homem versado na técnica.

[00173] Em uma concretização preferida, o anticorpo para diagnóstico tem de ser capaz de se ligar o receptor direcionado quanto amostras de tecido são formalina fixa e parafina embebida.

[00174] Mais particularmente, a forma ativada por ligante independente de nível de expressão de cMet é medido por imunohistoquímica (IHC).

[00175] Como um exemplo, amostras podem ser classificadas quanto a forma ativada independente de ligante de nível de expressão de cMets em uma escala de0-3+ para níveis de anticorpo ou proteína de ligação coloração, onde 0 é negativo e l+-3+ representa coloração positiva a quatro etapas semiquantitativas de intensidade crescente. Classificações l+-3+ podem ser registradas como positivas uma vez que cada classificação positiva pode estar associada a risco significativamente reduzido para recaída e doença fatal quando comparada com classificação 0 (negativa), mas intensidade crescente entre as classificações positivas podem prover redução de risco adicional. Qualquer método de análise de risco convencional pode ser usado para estimar o valor de prognóstico da forma ativada independente de ligante de cMet. Métodos de análise representativos incluem análise de regressão de Cox, que é um método semiparamétrico para exibição de dados de sobrevivência ou tempo para evento na presença de caos censurados (Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972). Em contraste com outras análises de sobrevivência, por exemplo, Tabelas de Vida ou Kaplan-Meyer, Cox permite a inclusão de variáveis previsoras (co- variáveis) nos modelos. Usando-se um método de análise convencional, por exemplo, Cox pode ser capaz de testar hipótese em relação a correlação da forma ativada independente de ligante de estado de expressão de cMet em um tumor primário pelo tempo para início ou da recaída da doença (tempo de sobrevivência livre de doença, ou tempo para doença metastásica), ou tempo para morte da doença (tempo de sobrevivência total). Análise de regressão de Cox é também conhecida como análise de risco proporcional de Cox. Esse método é padrão para a testagem do valor de prognóstico de um marcador de tumor no tempo de sobrevivência de paciente. Quando usado no modo multiva- riado, o efeito de várias covariáveis é testado em paralelo de modo que covariáveis individuais que tenham valor de prognóstico independente podem ser identificadas, isto é a maioria dos marcadores úteis. O termo "forma ativada independente de ligante de estado de cMet " positiva ou negativa [também mencionada como forma ativada independente de ligante de cMet (+) ou forma ativada independente de ligante de cMet (-)] de tumores refere-se a classificações 0 ou classificações l+-3+, respectivamente.

[00176] Uma amostra pode ser "classificada" durante o diagnóstico ou monitoramento de câncer. Em sua forma mais simples, classificação pode ser negativa ou positiva quando julgada por exame visual de amostras por imunohistoquímica. Classificação mais quantitativa envolve o julgamento de dois parâmetros intensidade de coloração e a proporção de células coradas ("positiva") que são analisadas. Com base nesses dois números de parâmetros podem ser atribuídos que refletem níveis crescentes de coloração positiva. Alfred e outros (Alfred, Harvey e outros. 1998) descreveram um meio de alcançar isso, que envolvia classificação de ambos os parâmetros em uma escala de 0 (negativa) a 3+, e sumarização das classificações dos parâmetros individuais para uma classificação total. Esses resultados em uma escala com possíveis classificações de 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 (Payne e outros. Marcadores previsíveis no câncer de mama - a presente. Histopathology 2008, 52, 82-90) (observar que uma classificação de 1 não é possível na escala de Allred). Um método de classificação um pouco mais simples integra a intensidade de coloração nuclear e a proporção de células que exibem núcleos corados em uma escala combinada de 0 a 3+. Qualquer método de classificação pode ser aplicado a intensidade de classificação e proporção de coloração de Stat5 ativado nos núcleos de células. Os termos "forma ativada independente de ligante de estado de cMet" positiva ou negativa de tumores usados na presente descrição refere-se a níveis de expressão de forma ativada independente de ligante de cMet que correspondem às classificações 0 ou l+-3+ na escala simplificada, respectivamente.

[00177] Em geral, os resultados de um teste ou um ensaio de acordo com a invenção podem ser apresentados em qualquer uma de uma variedade de formatos. Os resultados podem ser apresentados em uma forma qualitativa. Por exemplo, o relatório de teste pode indicar apenas se ou não um polipeptídeo particular fosse detectado, talvez também com uma indicação dos limites de detecção. Os resultados podem ser apresentados em uma forma semiquantitativa. Por exemplo, várias faixas podem se definidas, e as faixas podem ser atribuídas uma classificação (por exemplo, de 1+ a 3+) que provê certo grau de informação quantitativa. Tal classificação pode refletir vários fatores, por exemplo, o número de células em que forma ativada independente de ligante de cMet é detectada, a intensidade do sinal (que pode indicar o nível de expressão de forma ativada independente de ligante de cMet ou forma ativada independente de ligante de células de expressão de cMet), etc. Os resultados podem ser apresentados em uma forma quantitativa, por exemplo, como uma percentagem de células em que o polipeptídeo (forma ativada independente de ligante de cMet) é detectado, como uma concentração de proteína, etc. Como será apreciado por aquele de habilidade comum na técnica, o tipo de saída provido por um teste variará dependendo das limitações técnicas do teste e da significância biológica associadas a detecção do polipeptídeo. Por exemplo, no caso de certos polipeptídeos uma saída pura mente qualitativa (por exemplo, se ou não o polipeptídeo é detectado em certo nível de detecção) provê informação significativa. Em outros casos uma saída mais quantitativa (por exemplo, um razão do nível de expressão do polipeptídeo na amostra sendo testada versus o nível normal) é necessária.

[00178] Em uma concretização mais preferida, classificação da forma ativada independente de ligante de nível de expressão de cMet é graduada de 0 a 3+, com base em uma avaliação da intensidade do produto de reação e a percentagem de células positivas. Para mais claridade, tabela 4 aqui em seguida sumariza esses parâmetros. Apenas reatividade de membrana circunferencial completa do tumor inva- sivo seria considerada e frequentemente parecia uma aparência de "arame de galinheiro". Sob diretrizes atuais, amostras classificadas como limítrofe (classificação de 2+ ou mais) para forma ativada independente de ligante de cMet IHC deve ser considerada como forma ativada independente de ligante de cMet (+) e são exigidas como sofrendo outra avaliação. As análises de IHC seriam rejeitadas, e ou repetidas ou testadas por FISH ou qualquer outro método se, como exemplo não limitativo, controles não são como esperados, artefatos envolvem a maior parte da amostra e a amostra tem positividade de membrana forte de dutos de mama normais (controles internos) sugerindo recuperação de antígeno excessivo. Tabela 4

[00179] Em uma concretização mais preferida do processo de acordo com a invenção, a dita classificação compreende usando-se uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensidade da coloração e a percentagem de células positivas.

[00180] Em uma concretização preferida, o processo de acordo com a invenção, refere-se a uma escala apropriada é uma escala de 0 a 3+ em que na reatividade de membrana de células de tumor é classificada 0, e forte reatividade completa em mais do que 10%> de células de tumor é classificada 3+. Em mais detalhes, como acima descrito, a dita escala apropriada é uma escala de 0 a 3 em que na reatividade de membrana de células de tumor é classificada 0; fraca reatividade de membrana perceptível em mais do que 10% de células de tumor é classificada 1+; reatividade de membrana completa de fraca a moderada em mais do que 10% de células de tumor é classificada 2+; e forte reatividade completa em mais do que 10% de células de tumor é classificada 3+.

[00181] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é forma ativada independente de ligante de cMet (+) com uma classificação de 2+.

[00182] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é forma ativada independente de ligante de cMet (+) com uma classificação de 3+.

[00183] Em outro aspecto particular da invenção, um tumor é forma ativada independente de ligante de cMet (+) com uma classificação de 2+ ou 3+.

[00184] De acordo com a invenção, é também descrito um processo de determinação se uma desordem oncogênica é suscetível a tratamento com uma forma ativada independente de antiligante de ligação de proteína ou anticorpo de cMet , ou um fragmento ou seu derivado, em que o dito processo compreende as etapas de

[00185] determinação in vitro da forma ativada por ligante independente de estado de cMet de um tumor de um indivíduo como acima descrito, e

[00186] determinação que, se o estado é forma ativada independente de ligante de cMet (+), a desordem oncogênica é suscetível a um tratamento com uma forma ativada independente de antiligante de ligação de proteína ou anticorpo de cMet , ou um fragmento ou seu derivado.

[00187] Em outro aspecto da invenção, é considerado um kit útil para tal processo de diagnóstico ou prognóstico, o dito kit compreendendo a proteína de ligação e/ou o anticorpo da invenção.

[00188] Do ponto de vista de conveniência, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para a realização do ensaio de diagnóstico, por exemplo, kits estão também dentro do escopo da invenção. O kit contém as proteínas de ligação ou anticorpos para a detecção e quantificação da forma ativada independente de ligante de cMet in vitro, por exemplo, em uma ELISA ou um Western blot. A proteína de ligação ou o anticorpo da presente invenção pode ser provido em um kit para a detecção e quantificação da forma ativada independente de ligante de cMet in vitro, por exemplo, em uma ELISA ou um Western blot. Onde a proteína de ligação ou o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores exigidos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que provê o fluoróforo ou cromóforo). Além disso, outros aditivos podem estar incluídos tais como estabilizadores, tampões (por exemplo, um tampão por blocos ou tampão de lise) e semelhantes. Tal kit pode compreender um receptáculo sendo comportamenta- lizado para receber um ou mais recipientes tais como frascos, tubos e semelhantes, tais recipientes mantendo elementos separados da invenção. Por exemplo, um recipiente pode conter um primeiro anticorpo ou proteína de ligação ligando a um veículo insolúvel ou parcialmente solúvel. Um segundo recipiente pode conter segundo anticorpo ou proteína de ligação detectavelmente marcado solúvel, na forma liofilizada ou em solução. O receptáculo pode também conter um terceiro recipiente mantendo um terceiro anticorpo ou proteína de ligação detectavelmente marcado na forma liofilizada ou na solução. Um kit dessa natureza pode ser usado no ensaio de tipo sanduíche da invenção. O rótulo ou inserto de embalagem pode prover uma descrição da composição bem como instruções para o uso de diagnóstico ou in vitro pretendido.

[00189] As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas amplamente para prover concentrações na solução dos reagentes que substancialmente aperfeiçoam a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser providos como pós-secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que na dissolução proverá uma solução de reagente tendo a concentração apropriada.

[00190] Em ainda outro aspecto da invenção, proteínas de ligação, anticorpos ou seus fragmentos de ligação quando detalhados aqui são providos marcados com uma porção detectável, tal que eles podem ser embalados e usados, por exemplo, em kits, para diagnosticar ou identificar células tendo o antígeno acima mencionado. Exemplos não limitantes de tais rótulos incluem fluoróforos tais como fluoresceína, isotiocianato; cromóforos, radionuclídeos, ou enzimas. Tais fragmentos de ligação ou anticorpos marcados podem ser usados para a localização histológica do antígeno, ELISA, classificação de célula, bem como outras técnicas imunológicas para a detecção ou quantificação da forma ativada independente de ligante de cMet, e células que portam esse antígeno, por exemplo.

[00191] Kits são também providos que são úteis como um controle positivo para ensaios de apoptose, para a purificação e imunoprecipi- tação da forma ativada independente de ligante de cMet de células. Para o isolamento e purificação da forma ativada independente de ligante de cMet, o kit pode conter os anticorpos descritos aqui ou seus fragmentos de ligação de antígeno acoplados a contas (por exemplo, contas de sefarose). Kits podem ser providos que contêm a proteína de ligação ou os anticorpos para a detecção e quantificação da forma ativada independente de ligante de cMet in vitro, por exemplo, em uma ELISA ou um Western blot. Como com o artigo de fabricação, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de embalagem no ou associado ao recipiente. O recipiente mantém uma composição compreendendo pelo menos uma forma ativada independente de antiligan- te de ligação de proteína ou anticorpo de cMet ou seu fragmento de ligação da invenção. Recipientes adicionais podem ser incluídos que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controle. O rótulo ou inserto de embalagem pode prover uma descrição da composição bem como instruções para o uso de diagnóstico ou in vitro pretendido.

[00192] Mais particularmente, a invenção refere-se a um kit para a determinação de forma ativada independente de ligante de estado de cMet de um tumor por qualquer método conhecido pelo homem versado na técnica. Em uma concretização preferida, como será descrito no exemplo, a invenção refere-se a um kit para a determinação da forma ativada independente de ligante de estado de cMet de um tumor por método de IHC.

[00193] Em uma concretização particular, a invenção consiste em um kit compreendendo pelo menos uma proteína de ligação ou um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, como descrito acima, o dito anticorpo ou proteína de ligação sendo marcado.

[00194] Deve ser entendido que qualquer método de marcação pode ser usado pelo homem versado na técnica tal como, por exemplo, o uso de rótulos mencionados acima.

[00195] Em uma concretização preferida, o kit de acordo com a invenção, útil para detecção in vitro da presença e/ou a localização da forma ativada independente de ligante de tumor de expressão de cMet em um indivíduo, ulteriormente compreende um reagente útil para detecção da extensão da ligação entre a dita proteína de ligação ou anticorpo e forma ativada independente de ligante de cMet.

[00196] Em outra concretização preferida, o kit da invenção útil para a determinação in vitro o nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet na forma ativada independente de ligante de tumor de experssão de cMet, ulteriormente compreende um reagente útil para quantificação do nível de ligação entre a dita proteína de ligação ou anticorpo e forma ativada independente de ligante de cMet.

[00197] Em ainda outra concretização, o kit de acordo com a invenção útil para determinação in vitro a forma ativada por ligante independente de estado de cMet of a tumor, ulteriormente compreende:

[00198] um reagente útil para detecção da extensão de ligação entre a dita proteína de ligação ou anticorpo e forma ativada independente de ligante de cMet; e

[00199] amostras de controle positivas e negativas úteis para a classificação da forma ativada por ligante independente de nível de expressão de cMet.

[00200] O dito kit para determinação in vitro a forma ativada por ligante independente de estado de cMet de um tumor pode ulteriormente compreender:

[00201] um segundo anticorpo policlonal marcado específico para anticorpos de camundongo;

[00202] ii) um reagente útil para detecção da extensão de ligação entre o dito segundo anticorpo marcado e anticorpos de camundongo à forma ativada independente de ligante de cMet; e

[00203] iii) amostras de controle positivas e negativas úteis para a classificação da forma ativada por ligante independente de nível de expressão de cMet.

[00204] A invenção também compreende uma proteína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado incluindo anticorpo, que compete cruzadamente para ligação à forma ativada independente de ligante de cMet com uma proteína de ligação de acordo com a invenção.

[00205] A invenção também compreende uma proteína de ligação, ou um fragmento funcional ou seu derivado incluindo anticorpo, que compete cruzadamente para ligação à forma ativada independente de ligante de cMet com um anticorpo de acordo com a invenção.

[00206] Em outra concretização, a invenção refere-se também ao uso de uma proteína de ligação ou um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, para a identificação de proteínas de ligação, incluindo anticorpos, capaz de especificamente se ligar à forma ativada independente de ligante de cMet.

[00207] Mais particularmente, em uma concretização preferida, é descrito um processo de identificação de um padrão de ligação à forma ativada independente de ligante de cMet, que compreende as etapas de:

[00208] contato da forma ativada por ligante independente de cMet com uma proteína de ligação ou um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado;

[00209] contato do complexo de a) com uma biblioteca de composto,

[00210] identificação de um composto que rompe o complexo de a).

[00211] A invenção também compreende um processo para a purificação da forma ativada por ligante independente de cMet, em que o dito processo compreende seguintes etapas:

[00212] incubação de uma proteína de ligação ou um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado com uma amostra sob condições para permitir ligação específica do dito anticorpo ou proteína de ligação e a forma ativada por ligante independente de cMet; e

[00213] separação de um anticorpo ou proteína de ligação da amostra e obtenção da forma ativada independente de ligante purificada de cMet.

[00214] Em outro aspecto particular, a invenção compreende um complexo formado pela ligação de uma proteína de ligação de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado e a forma ativada por ligante independente de cMet.

[00215] Similarmente, a invenção também compreende um complexo formado pela ligação de um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado e a forma ativada por ligante independente de cMet.

[00216] Em outra concretização, a invenção trata do uso de uma proteína de ligação ou um anticorpo de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional ou seu derivado, como um veículo que se destina ao direcionamento específico de um composto biologicamente ativo para células que expressam a forma ativada por ligante independente de cMet. Mais particularmente, o dito composto ativo biológico é selecionado do grupo que consiste em quimioterapêuticos, radioisótopos ou toxinas.

[00217] Em ainda outra concretização, a invenção consiste em um processo para a geração de um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante ou não ativadas de cMet, o dito processo sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende as etapas de:

[00218] imunização de um animal com linhas de células transfectadas ou tumorais que expressam proteína de cMet ou um seu fragmento;

[00219] remoção de células de produção de anticorpo a partir do animal;

[00220] fusão das ditas células de produção de anticorpo com células de mieloma de modo a se obter células de hibridoma;

[00221] realização dos ensaios de triagem de modo a selecionar células de hibridoma que produzem anticorpo que i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga à(s) forma(s) ativadas dependentes de ligante ou não ativadas de cMet;

[00222] cultura do hibridoma selecionada em uma cultura de célula que produz o anticorpo; e

[00223] remoção do anticorpo da cultura de célula.

[00224] Em uma concretização mais preferida, o ensaio de triagem da etapa descrita acima d) consiste em um ensaio de triagem de IHC.

[00225] Em outra concretização mais preferida, o dito ensaio de triagem de IHC compreende as etapas de:

[00226] coleta de seções de tecido a partir de tumores que expressam diferentes formas de cMet,

[00227] realização de coloração de IHC simultaneamente nas diferentes seções de tecido da etapa a) usando-se células de hibridoma da etapa c) do processo para a geração de um anticorpo, ou um fragmento funcional ou seu derivado, que i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, mas ii) não se liga às forma(s) ativadas dependentes de ligante e/ou não ativadas de cMet descrito acima,

[00228] seleção de células de hibridoma tendo uma reatividade específica em seções de tecido que expressam a forma ativada por ligante independente de cMet e nenhuma reatividade em outras seções de tecido.

[00229] Outras características e vantagens da invenção aparecem na continuação da descrição com os exemplos e as figuras cujas legendas são representadas abaixo.

[00230] Figuras 1A-1B: Reconhecimento de FACS de cMet pela m205A5 (A) ou o Mabs m227D3 (B)

[00231] Figura 2: Titulação curves de m205A5 e m227D3 Mabs na proteína de cMet dimérica imobilizada.

[00232] Figuras 3A-3C: Padrão de IHC de m227D3 e m205A5 IHC nos tumores embebidos em parafina (MCF7, U87MG e Hs746T).

[00233] Figuras 4A-4C: Painel de IHC de reconhecimento do m227D3 e anti cMet anticorpo 3D4 comercial em tumores embebidos de parafina (MCF7, U87MG, Hs746T, MK 45 e EBC-1).

[00234] Figura 5: Ensaio de competição de HGF o Mabs de m205A5 ou m227D3 por ELISA.

[00235] Figura 6: atividade antitumoral do m224Gl 1 no modelo de xenoenxerto de Hs746T.

[00236] Figura 7: análise ex vivo da expressão de cMet nos tumores de Hs746T de camundongos de controle e camundongos tratados com m224Gl 1 por análise de Western Blot.

[00237] Figuras 8A-8B: análise ex vivo da expressão de cMet em tumores de Hs746T de camundongos de controle e camundongos tratados com m224Gl 1 por IHC usando-se o m205A5

[00238] Figura 9: coloração de IHC de seções embebidos com pa rafina de tecidos de tumor de fígado que expressam vários níveis de cMet.

Exemplo 1: Geração de um anticorpo contra forma ativada inde pendente de ligante de cMet que poderia ser usada para finalidade de diagnóstico.

[00239] Para gerar anticorpos de anticMet de camundongos de BALB/c 8 semanas de idade foram imunizados ou 3 a 5 vezes subcu- taneamente com uma linha de célula transfectada com CHO que expressam cMet em sua membrana de plasma (20xl06 célu- las/dose/camundongo) ou de 2 a 3 vezes com uma proteína de fusão de domínio extracelular de cMet (10-15 μg/dose/camundongo) (R&D Systems, Católogo # 358MT) ou fragmentos dessa proteína recombi- nante misturados com auxiliar de Freund completo para a primeira imunização e auxiliar de Freund incompleta para as seguintes. Três dias antes da fusão celular, camundongos foram reforçados i.p. ou i.v. com a proteína recombinante ou fragmentos. Então baços de camundongos foram coletados e foram fundidos a células de mieloma de SP2/0-Agl4 (ATCC) e foram submetidos a seleção de HAT. Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem de camundongo, é possível se relacionar com técnicas que são descritas em particular no manual "An- tybodys" (Harlow and Lane, Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ou para a técnica de prepração de hibridomas descritas por Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

[00240] Hibridomas obtidas foram inicialmente triados por ELISA na proteína recombinante de cMet-Fc dimérica. Resumidamente, a proteína de cMet de ser humano recombinante foi revestida de um dia para o outro a 4oC a placas de 96 cavidades de Immulon II e, depois de uma etapa de bloqueamento de 1 h com uma solução de gelatina de 0,5%, sobrenadante de hibridoma puro foi adicionado por 1 h adicional a 37oC.

[00241] Então placas foram lavadas e uma IgG HRP específica de anticamundongo de cabra foi adicionada por 1 h a 37oC. Desenvolvimento de reação foi realizado usando-se a solução de substrato de TMB. Então uma segunda triagem foi realizada por análise de FACS na linha de célula de A459, que expressa níveis de cMet moderados a altos, estarem seguros que os anticorpos produzidos serão capazes de reconhecer o receptor nativo nas células de tumor. Para aquela fi-nalidade 2xl05 células foram incubadas com ou 10 μg/ml de m205A5, m227D3 ou mlOD9 (IgGl isótipo controle Mab) por 20 min a 4oC. Depois de 3 lavagens na solução salina tamponada por fosfato (PBS) suplementada com 1% de BSA e 0,01%de NaN3, células foram incubadas com Alexa 488 de anticamundongo de cabra de anticorpo secundário de (diluição de 1/500) por 20 minutos a 4oC. Depois de 3 lavagens adicionais em PBS suplementado com 1% de BSA e 0,1% de NaN3, células foram analisadas por FACS (Facscalibur, Becton- Dickinson). Pelo menos 5000 células foram avaliadas para calcular o valor médio de intensidade de fluorescência. Tabela 5

[00242] Dados oriundos de aná ise de citometria (MFI) realizados com os 205 A5 e 227D3 Mabs em 5 linhas de células de ser humano tumorais (ATCC)

[00243] Hibridomas positivos nesse ensaio foram ampliados, foram clonados, foram submetidos a isótopos e foram expandidos. Então novos sobrenadantes de hibridoma foram coletados, seu teor de IgG determinado. Análises de citometria complementares foram realizadas em um painel de 5 linhas de células tumorais de ser humano (A459, BXPC3, MCF7, U87MG, e HepG2). Todas essas linhas de células foram providas pelo ATCC. Dados obtidos são apresentados na Figura 1 e valores de MFI são apresentados na Tabela 5.

[00244] Experiências complementares foram feitas com anticorpos de 205A5 ou 227D3 purificados. Primeira titulação de anticorpo na proteína de cMet-Fc dimérica foi realizada. Curvas de titulação são apresentadas na Figura 2.

[00245] Anticorpos de 205A5 e 227D3 tinham satisfeitos os 2 critérios descritos acima (i) reconhecimento de cMet em um teste de ELISA, (ii) ligação no cMet nativo expresso sobre a superfície de linhas de células tumorais de ser humano e foram selecionadas para outros ensaios.

[00246] Mabs foram selecionados para o teste de reconhecimento de cMet final nas seções embebidas em parafina a partir de xenoen- xertos de tumor que expressam cMet. Para aquela avaliação, seções de tumor oriundos de xenoenxertos deMCF7, U87-MG e Hs746T (tumores conhecidos como expressando níveis variáveis cMet) foram desparafinizadas, foram reidratados e foram colocados em um tampão de recuperação alvo IX (Dako SI 699) em um banho de ebulição pré- aquecido a 98oC para recuperação de epitopo induzido por calor a 98oC por 30 minutos e então por 30 minutos adicionais no Tampão de recuperação alvo. Depois de 3 lavagens na solução salina de tampão de Tris -0,05% de tween 20 (TBS-T) (Dako S3006), a atividade de pe-roxidase endógena foi bloqueada usando-se Reagente de bloquea- mento de peroxidase (Dako K4007) por cinco minutos. Seções foram lavadas com TBS-T e foram incubadas com reagente de bloqueamen- to (UltraV block-TA-125UB- Lab Vision) por 5 minutos antes da adição do anticorpo monoclonal de camundongo de cMet a ser testado (5 μg/ml). Uma IgGl/kappa de camundongo (5 μg/ml, X0931, Dako) foi usada como um controle negativo. Seções foram então incubadas por 2 horas a temperatura ambiente, foram lavadas com TBS-T e foram incubadas com Envision Dual Link Peroxydase System (Dako K4061). Substrato de peroxidase de diaminobenzinidina (DAB) foi usado para o desenvolvimento de um produto marrom.

[00247] Resultados mostrados na Figura 3 demonstraram que, como esperado nenhuma coloração foi observada com um controle de isótipo de IgGl (Figura 3 Painel A) e que tanto 227D3 (Figura 3 Painel B) quanto 205 A (Figura 3 Painel C) eram capazes de reconhecer cMet apenas nos tumores de xenoenxerto de Hs746T enquanto que todos os 3 tumores expressaram vários níveis de cMet. Esses primeiros resultados sugerem que tanto anticorpos de 205A5 quanto anticorpos de 227D3 reconhecem uma forma particular de cMet que é apenas expresso em células de tumor ampliadas.

[00248] Para confirmar o padrão de reconhecimento desses Mabs, um painel de tumores oriundos de camundongos xenoenxertados foram testados quanto a expressão de cMet usando-se ou 205 A5, 227D3 ou 3D4, um anticorpo comercialmente disponível a partir de In- vitrogen descrito para seu reconhecimento de cMet em IHC. Como mostrado na Figura 4 Painel C, 3D4 reconheceu cMet em todos os tipos de tumores. Usando-se 227D3 (Painel A) ou 205A5 (dados não mostrados, uma forte coloração de membrana foi apenas observado nos três tipos de tumores que portam uma forma constitutivamente ativada de cMet (devido à ampliação de cMet que resulta em uma ultra-expressão de cMet): Hs746T, MK 45 e

[00249] EBC-1. Como esperado, nenhuma coloração foi observada com o controle de isótipo de mlgGl (Figura 4 Painel B).

Exemplo 2: Experiências de competição de HGF realizadas na presença dos anticorpos de 205A5 ou 227D3.

[00250] Para ulteriormente caracterizar Mabs de diagnósticos, ensaios de competição HGF foram realizados. Primeira mistura de reação compreendendo a proteína de cMet na presença ou não do Mabs a ser testada, foram preparados em uma placa saturada separada (0,5% de gelatina em PBS IX). Diluições 1:2 em série (partindo de 40 μg/ml sobre 12 colunas) de anticorpos de camundongo (referências e Mabs para estudar) foram realizadas. Então 0,8 μg/ml da proteína de rh cMet-Fc foi adicionado (RDSystems, ref. 358-MT/CF), exceto quanto à linha de controle negativa que continha apenas diluente de ELISA (0,1% e gelatina, 0,05% de Tween 20 em PBS IX). Depois da homo-geneização, as amostras de competição foram carregadas em placas revestidas com HGF com uma solução de rhHGF de 0,3 μg/ml em PBS (RDSystems, ref. 294-HGN/CF). Depois de uma incubação e várias lavagens, proteínas de cMet ligadas são detectadas usando-se uma IgG-HRP de anti-humano de cabra (Jackson, ref. 109-035-098). Uma vez que ligada, o substrato de TMB foi adicionado às placas. A reação foi parada por adição de solução de ácido de H2SO4 e as densidades óticas obtidas lidas a 450 nm usando-se um instrumento de leitora de microplaca.

[00251] A experiência foi realizada com 205A5 e 227D3 na presença ou na ausência de proteína recombinante de cMet-Fc, (vide Figura 5). Essa experiência mostrou que 205A5 e 227D3 Mabs não competem com a ligação de cMet em seu receptor de ligante imobilizado.

Exemplo 3: Especificidade de Anticorpos

[00252] Tratamento com m224Gl l de camundongos que portam tumor de Hs746T induziu uma doença significativa de crescimento de tumor (Figura 6). Quando tumor oriundo dessa experiência foi analisado, a atividade antitumoral resultou em uma diminuição de expressão de Ki67 em camundongos tratados com m224Gl l vs camundongos de controle (dados não mostrados) em uma regulação para baixo dramática de expressão de cMet demonstrada pela análise de western Blot (Figura 7). Para realizar análise de WB, tumores foram removidos e foram rapidamente congelados em nitrogênio. Então eles foram lisa- dos e a mesma quantidade de proteína foi imunocorada. Finalmente, cMet foi revelado usando-se o 25H2 Mab de subunidade de anti-Met- beta comercialmente disponível a partir de sinalização de célula.

[00253] Quando tumores oriundos da mesma experiência foram analisados por IHC usando-se o 205 A5, a regulação para baixo esperada de expressão de cMet foi observada nos camundongos tratados, enquanto que todas as células de tumor do grupo de controle eram positivos a Met (Figura 8).

[00254] De fato, como mostrado na Figura 8A, quando tumores oriundos de camundongos de controle forem corados usando-se 205 A5 Mab, uma forte coloração homogênea e de membrana foi observado em células de tumor em todos os três camundongos. Quando tumores oriundos de camundongos tratados com m224Gl l foram corados com 205 A5, uma diminuição dramática da coloração de membrana foi observada (Figura 8B). Esses dados de acordo com aqueles anteriormente observados por análise de Western Blot (Figura 7) demonstram que 205 A5 reconhecem especificamente cMet.

[00255] Exemplo 4: Classificação de tecidos quanto a forma ativada independente de ligante de expressão de cMet com o m224Gll Mab

[00256] Usando-se o protocolo descrito acima e sumarizado na Figura 9, um conjunto de tecidos de tumor de ser humano embebidos em parafina, que expressam níveis variáveis da forma ativada independente de ligante de cMet foram corados com o m205A5 Mab.

[00257] Resultados mostrados na Figura 9 demonstrados, no carcinoma hepatocelular, que m205A5 era capaz de discriminar tumores de ser humano com níveis variáveis da forma ativada independente de ligante de cMet. Usando-se esse anticorpo, tumores poderiam ser classificados como: 0: tumores negativos em que na coloração de membrana ou menos do que 10% de célula positiva a membrana foram observadas, 1+: apenas coloração perceptível em mais do que 10% de células de tumor, 2+: coloração de membrana completo moderado observado em mais do que 10% de células de tumor, 3+: uma forte coloração completa de mais do que 10% de células de tumor.

Claims

1. Anticorpo isolado, ou um fragmento funcional do mesmo, em que em tumores (i) especificamente se liga à forma ativada independente de ligante de cMet, (ii) não se liga à forma não-ativada de cMet, e (iii) não se liga à forma ativada dependente de ligante de cMet, caracterizado pelo fato de que: (i) não bloqueia a ligação do ligante HGF a cMet; (ii) interage com a região extracelular de cMet entre resíduos de aminoácidos 1 e 950; e (iii) é selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) um anticorpo, ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; e (b) um anticorpo, ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16.

2. Hibridoma murinho, caracterizado pelo fato de que é capaz de secretar um anticorpo, como definido na reivindicação 1, o referido hibridoma murinho sendo selecionado do hibridoma depositado no CNCM, Institut Pasteur, Paris, em 18 de novembro de 2009, sob o número I-4247, e o hibridoma depositado no CNCM, Institut Pasteur, Paris, 18 de novembro de 2009, sob o número I-4246.

3. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma, como definido na reivindicação 2.

4. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que é escolhido dentre os seguintes ácidos nucleicos: (a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 27 a 32 ou 35 a 40; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 33 e 34 ou 41 e 42.

5. Uso in vitrodo anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que é para a identificação da forma ativada independente de ligante de cMet.

6. Processo in vitropara detecção por imunocoloração da presença e/ou da localização da forma ativada independente de ligante de cMet expresso em tumor em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) contato de uma amostra do indivíduo com o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 3, e (b) detecção da ligação do referido anticorpo com a amostra.

7. Processo in vitropara determinação por imunocoloração do nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet em um tumor expressando cMet de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) contato de uma amostra do indivíduo com o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 3, e (b) quantificação do nível de anticorpo que se liga à forma ativada independente de ligante de cMet na referida amostra.

8. Processo in vitro, de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizado pelo fato de que o nível de expressão da forma ativada in-dependente de ligante de cMet é medido por imunohistoquímica (IHC).

9. Processo in vitropara diagnóstico por imunocoloração de uma forma ativada independente de ligante de tumor expressando cMet ou determinação por imunocoloração do prognóstico para o de-senvolvimento de uma forma ativada independente de ligante de tumor expressando cMet em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) determinação do nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet, com definido na reivindicação 7, e (b) comparação do nível de expressão da etapa (a) com um nível de expressão de referência da forma ativada independente de ligante de cMet de um tecido normal.

10. Processo in vitropara determinação por imunocoloração da forma ativada independente de ligante do estado de cMet de um tumor de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) determinação do nível de expressão da forma ativada independente de ligante de cMet, como definido na reivindicação 7, (b) classificação do referido tumor quanto à forma ativada independente de ligante do nível de expressão de cMet, e (c) comparação da referida classificação com aquela obtida a partir de uma amostra controle.

11. Processo in vitropara determinação se uma desordem oncogênica é suscetível a um tratamento com um anticorpo ou proteína de ligação anti-forma ativada independente de ligante de cMet, ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) determinação por imunocoloração da forma ativada in-dependente de ligante do estado de cMet de um tumor de um indivíduo, como definido na reivindicação 7, e (b) determinação que, se o estado for forma ativada independente de ligante de cMet(+), a desordem oncogênica é suscetível a um tratamento com um anticorpo ou proteína de ligação anti-forma ati- vada independente de ligante de cMet, ou um fragmento do mesmo.

12. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 3, o referido anticorpo sendo marcado.

13. Kit, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é para a detecção por imunocoloração da presença e/ou da localização da forma ativada independente de ligante de tumor expressando cMet em um indivíduo, o referido kit compreendendo ainda um reagente útil para detecção da extensão da ligação entre o referido anticorpo marcado e a forma ativada independente de ligante de cMet.