CN101962400B

CN101962400B - 人乳头瘤58型病毒l1蛋白的线性抗原表位最小基序肽及其应用

Info

Publication number: CN101962400B
Application number: CN201010292241XA
Authority: CN
Inventors: 徐万祥; 顾少华; 何亚萍; 季朝能; 唐海平; 王健; 孙志达; 谢毅
Original assignee: 刘日廷
Current assignee: Guangdong South Bay Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101962400A

Abstract

本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体为一种人乳头瘤（HPV）58型L1结构蛋白的抗原表位（Bcellepitope）最小基序肽及其应用。本发明提供了16个含最小基序表位肽（包括可与截断GST188等载体蛋白表达的8肽序列）的氨基酸序列，它们可作为抗原单独或组合用于特异检测HPV58型病毒感染患者血清，以及用作研制同时诱导体液免疫的预防性HPV58多表位肽疫苗。这些HPV58型L1抗原表位最小基序肽和短肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1~SEQIDNo.32所示。

Description

人乳头瘤58型病毒L1蛋白的线性抗原表位最小基序肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体涉及导致妇女宫颈癌发生的高危型人乳头瘤病毒（HPV）58型主要衣壳蛋白L1的全部线性B细胞表位（B cell epitope, BCE,或称抗原表位或决定簇）及其最小基序肽，以及这些表位基序肽的应用。

背景技术

化学合成肽疫苗，曾被期待能成为人类应用疫苗发展史上继灭活病毒疫苗和病毒亚单位疫苗之后的第三个里程碑。但一或二个表位组成的预防性合成肽疫苗研制，由于都缺乏充分有效的保护作用，从70年代起至今未有一例被批准人临床应用。因此，为达到符合人临床应用充分的保护有效性，合成肽疫苗原应组合尽可能多的线性抗原表位不言而喻（可通过生物工程制备多表位肽免疫原）。另外，作为病毒感染的血清抗体检测用抗原，由于天然病毒蛋白等稀有抗原的不可获得性，一般都使用15-20肽的单表位肽。已知线性抗原表位通常由3-8肽组成，因而长表位肽上也可能存在能被含成千上万不明抗体的正常人血清识别的其他抗原表位，进而不可避免地易产生有时甚至很高的假阳性检测结果。为了提高病毒感染检测用表位肽抗原的特异性和灵敏度，研制组合一个或蛋白家族中多个靶抗原上尽可能多的线性表位，特别是基于它们最小基序的表位肽检测抗原显然也无疑是今后研制的一个新方向。因为一个抗原的免疫应答必然产生抗其蛋白上全部或绝大多数表位抗体,所以通过并用多个特异表位抗原而富集检测多种特异抗体，势必将成几何级数（1 x 2ⁿ，n=表位数）地大大提高检测灵敏度。显而易见，多表位肽疫苗或检测用抗原这方面研究能否取得突破性进展，乃取决于一靶抗原上全部线性抗原表位及其最小基序的鉴定。

大量研究资料证明，子宫颈癌在全球女性癌症死亡率中位居第二，其中90%与高危型诸如HPV16、18、31和45型等人乳头状瘤病毒（human papillomavirus, HPV）生殖道上皮持续感染有关（Tovar JM, et al. Human papillomavirus, cervical cancer, and the vaccine. Postgrad Med, 120: 79-84, 2008）。目前美国Merck和英国GlaxoSmithKline(GSK)二家公司已分别开发了由HPV6、11、16和18型L1蛋白以及由HPV16和18型L1蛋白构成的预防性HPV疫苗。相关HPV多肽疫苗的研究也很多，但尚无成功上市的报道。鉴于大多数HPV感染者一般都可以自发清除感染HPV病毒，而只有持续性HPV感染才会导致子宫颈癌这一事实，开发价廉且方便实施的HPV感染血清学检测Kit尤为重要，因为这一筛查可以确定需要进行预防性和/或治疗性HPV疫苗接种对象以及确定接种何种特异HPV型疫苗，其意义不言而喻。但由于之前抗原表位鉴定方法学的限制，即无法鉴定出一靶蛋白上全部线性抗原表位，特别是最小基序（可提高这一检测的准确率，即可避免与正常人血清中成千上万不明抗原抗体发生交叉反应），至今尚无特异灵敏的HPV感染的血清学检测方法，尽管早期也有许多利用HPV感染者血清以图发现HPV感染血清学检测特异标志物（Dillner J, et al. Int J Cancer, 45: 529-535, 1990; Dillner J, et al. Int J Cancer, 46: 703-711, 1990; Bleul C, et al. J Clin Microbiol, 29: 1579-1588, 1991; Jenison S, et al. J Virol, 65: 1208-1218, 1991）。

HPV58也是紧随16和18型之后的高危型HPV病毒之一（Lungu O， et al. Obstet Gynecol, 47: 337-342 , 1995）。最近的研究资料也表明HPV58型在我国江西、上海、河北、山西、陕西、北京、香港和台湾等地区等子宫颈癌患者中的检出阳性率相当高（Lin QQ, et al. Int J Cancer, 75: 484-485, 1998; Huang S, et al. Int J Cancer, 70: 408-411, 1997; Cai HB, et al. Oncol, 76: 157-161, 2009; Dai M, et al. Br J Cencer, 95: 96-101, 2006; 高艳娥等. 中华肿瘤杂志，26: 543-546, 2004; Zhao R, et al. Br J Cancer, 101: 1635-1640, 2009; Lai HC, et al. Int J Cancer, 84: 553-557, 1999; Chan PK, et al. J Med Virol, 59: 232-238, 1999; Bao YP, et al. Int J STD AIDS, 19: 106-111, 2008），有的地区检出率甚至仅次于HPV16型，高于HPV18型（李洁等. 中华实验和临床病毒学杂志, 10: 50-55, 1996; 刘宝印等. 中华实验和临床病毒学杂志, 10: 118-121, 1996）。

鉴于以上所述高危型HPV58在我国许多地区高流行性，以及HPV疫苗和检测标志性表位肽研制和国内外尚未开展HPV58型L1蛋白线性抗原表位鉴定研究的现状，为了研制具有我国自主知识产权的预防性HPV58型多表位肽疫苗和/或HPV58型感染多表位肽检测抗原，我们用大肠杆菌表达HPV58型L1N端或L1C端蛋白（两者相互重叠8个氨基酸残基）并制备了兔抗重组L1N和L1C蛋白抗血清，结合采用申请人改良的生物合成肽策略（Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009），对HPV58型L1衣壳蛋白进行了完整且精细的线性抗原表位扫描作图定位。

发明内容

本发明的目的在于提供人乳头瘤病毒（HPV）58型L1蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小基序肽的短肽，同时提供含所述基序肽的应用。

本发明提供的人乳头瘤58型病毒L1蛋白上最小基序肽，共有16个。所述最小基序肽具有SEQ. ID No.1所示氨基酸序列，记为HPV58L1-1^38-43；或者具有SEQ. ID No.2所示氨基酸序列，记为HPV58L1-2^107-112；或者具有SEQ. ID No.3所示氨基酸序列，记为HPV58L1-3^154-157；或者具有 SEQ. ID No.4所示氨基酸序列，记为HPV58L1-4^208-211；或者具有SEQ. ID No.5所示氨基酸序列，记为HPV58L1-5^213-217；或者具有SEQ. ID No.6所示氨基酸序列，记为HPV58L1-6^222-227；或者具有SEQ. ID No.7所示氨基酸序列，记为HPV58L1-7^228-231；或者具有SEQ. ID No.8所示氨基酸序列，记为HPV58L1-8^236-242；或者具有SEQ. ID No.9所示氨基酸序列，记为HPV58L1-9^245-249；或者具有SEQ. ID No.10所示氨基酸序列，记为HPV58L1-10^298-301；或者具有SEQ. ID No.11所示氨基酸序列，记为HPV58L1-11^331-335；或者具有SEQ. ID No.12所示氨基酸序列，记为HPV58L1-12^378-381；或者具有SEQ. ID No.13所示氨基酸序列，记为HPV58L1-13^383-388；或者具有SEQ. ID No.14所示氨基酸序列，记为HPV58L1-14^462-465；或者具有SEQ. ID No.15所示氨基酸序列，记为HPV58L1-15^500-506；或者具有SEQ. ID No.16所示氨基酸序列，记为HPV58L1-16^508-510。

本发明提供的分别含有上述最小表位基序肽的短肽，具有SEQ. ID No.17所示氨基酸序列，记为L1-1，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.18所示氨基酸序列，记为L1-2，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.19所示氨基酸序列，记为L1-3，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.20所示氨基酸序列，记为L1-4，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.21所示氨基酸序列，记为L1-5，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.22所示氨基酸序列，记为L1-6，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.23所示氨基酸序列，记为L1-7，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.24所示氨基酸序列，记为L1-8，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.25所示氨基酸序列，记为L1-9，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.26所示氨基酸序列，记为L1-10，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.27所示氨基酸序列，记为L1-11，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.28所示氨基酸序列，记为L1-12，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.29所示氨基酸序列，记为L1-13，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.30所示氨基酸序列，记为L1-14，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.31所示氨基酸序列，记为L1-15，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基；或者

具有SEQ. ID No.32所示氨基酸序列，记为L1-16，其序列中带有下标X编号代表特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除，或用其他残基替代X编号残基。

本发明提供的人乳头瘤病毒（HPV）58型L1蛋白上申请人第一次鉴定的16个BCE肽的最小基序，以及它们可化学合成或与GST载体蛋白融合表达的含各BCE最小基序8肽或长于8肽抗原。前者可单个或组合用作设计研制治疗性HPV多表位疫苗的抗原肽，后者8肽或其融合蛋白可用于普查正常妇女或子宫颈癌患者血清中是否存在抗HPV58L1抗体的检测抗原。特别是: HPV58L1-1表位最小基序^38-43（YLPPVP）与HPV16L1^38-43、HPV31L1^12-17和HPV33L1^12-17, HPV58L1-3基序^107-112（PNKFGF）与HPV31L1^81-86和HPV73L1^78-83，HPV58L1-3基序^154-157（DDTE）与HPV16L1^153-156、HPV18L1^188-191、HPV30L1^134-137、HPV31L1^128-131、HPV33L1^128-131、HPV39L1^127-130和HPV73L1^125-128，HPV58L1-6基序^222-227（EDGDMV）与HPV18L1^257-262、HPV33L1^196-201和HPV45L1^223-228, HPV58L1-7基序^228-231（DTGF）与HPV31L1^203-206、HPV33L1^202-205和低危型HPV6bL1^198-201，HPV58L1-9基序^245-249(DVPID)与HPV33L1^219-223、HPV73L1^217-221和低危型HPV6bL1^215-209，HPV58L1-10基序^298-301（PDDL）与HPV16L1^298-301、HPV33L1^272-275和HPV73L1^270-273，HPV58L1-11基序^331-335(QLFNK)与HPV18L1^366-371、HPV30L1^312-316、HPV33L1^305-310、HPV45L1^334-339和低危型HPV6bL1^301-305，HPV58L1-14基序^462-465(KEDP)与HPV30L1^443-446、HPV31L1^438-441和HPV33L1^436-439，以及HPV58L1-16基序^508-510(SAP)与HPV18L1^548-550、HPV30L1^{184-186/492-494}和HPV31L1^487-489的序列之间是100％保守的，也就是说用以上基序短肽构建的多表位肽疫苗对上述提及的高危型HPVs都有一定程度的交叉抗感染保护作用。而HPV58L1-4（ATDC^208-211）、-5（PLELF^213-217）、-8（FGTLQAM^236-242）、-12（GTYK^378-381）、-13（DNFKEY^383-388）和-15（KAKPRLK^500-506）是HPV58L1蛋白特异表位，可单独和/或组合用作HPV58型特异感染的血清学检测表位肽标志物。

本发明的内容进一步具体描述如下：

1， HPV58型病毒基因组克隆（Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427, 1991）市购。用常规PCR方法从购得的HPV58型病毒基因组中扩增出全长HPV58型L1的编码cDNA的N端和C端两个片段（L1N和L1C）,然后重组插入pRSET C融合表达质粒，进而纯化在大肠杆菌中热诱导表达的重组L1N^36-233和L1C^226-524蛋白，最后主动免疫新西兰白兔获得兔抗重组HPV58L1N和L1C蛋白抗血清。

2，先前申请人已构建了专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的pXXGST-1融合表达质粒（Xu et al. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009），其大分子蛋白载体是截断的由188个氨基酸残基组成的谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferases,GST，GST188）。因此，首先运用DNA重组技术（化学合成编码DNA正负链片段经退火复性，重组插入表达质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌，重组克隆测序验证插入片段DNA序列，以及热诱导表达目的GST-18肽融合蛋白等步骤），表达了跨越L1N蛋白^36-233序列相互重叠10个氨基酸残基的系列24个18肽(编号P1～P24,最后1个P24为15肽)-GST融合蛋白,以及跨越L1C蛋白^226-524序列的36个系列18肽-GST融合蛋白（编号P25～P60，最后1个P60为19肽)。表达短肽融合蛋白(P1-P60)转印硝酸纤维素膜上后，用兔抗重组HPV58L1N和L1C蛋白多抗对L1蛋白进行表位扫描作图，分别鉴定出L1N蛋白上的10个和L1C蛋白上13个印迹反应阳性BCE表位肽(P1,P9-P10,P14-P16,P21-P24以及P25-P27,P33-P34,P37-P38,P43-P44,P53-P54和P59-P60)（图1）。

进一步构建表达了以GST188为载体的跨越L1N的P1(P61-P71)、P9(P72-P82)、P14-P15-P16(P83-P103,)、P22（P104-P114），P24（P115-P122），P25-P26(P123-P138), P27（P139-P149），P33（P150-160），P37（P161-P171）, P43-P44（P172-P190），P47（P191-P201）， P53-P54（P202-P217）和P59-P60（P218-P237）序列相互重叠7个残基的系列融合表达8肽（印迹阳性18肽相邻片段一般先合成它们中一个系列11个8肽编码片段进行印迹鉴定，如果两个相邻片段非共享一个表位最小基序，再依据其左或右18肽片段合成其去除相互重叠三个8肽片段的5/8个片段，最终统一编号为P61-P237），继而用兔抗重组L1N/L1C多抗对各系列八肽融合蛋白进行最小基序鉴定。结果根据各表位肽印迹反应阳性8肽之间共同的氨基酸序列，确定了L1蛋白上共16个表位最小基序。在所鉴定的23个18肽阳性片段中，有的如P1仅含1个表位（YLPPVP^38-43），有的如P9和P10共享1个表位(PNKFGF^107-112)，有的如P59含独有1个表位（KAKPRLK^500-506）并与P60共享1个表位（SAP^508-510），有的如P25分别与P24和P26各共享1个表位（DTGF^228-231和FGTLQAM^236-242）。图2显示了P27印迹阳性18肽的11个系列8肽的最小基序鉴定结果。

以上HPV58型L1蛋白16个表位肽最小基序的鉴定表明，本发明所述的HPV58型L1蛋白16个抗原表位最小基序和/或扩展的8肽可作为制备包含B细胞抗原表位肽的预防性多价HPV58肽疫苗候选肽段，其中6个HPV58型特异表位与GST188等载体融合表达后，可单独或组合用作HPV58型病毒感染检测试剂盒中的标志性抗原肽段。

附图说明

图1 HPV58L1蛋白线性抗原表位扫描定位图(A-D)。其中：1-24, 用抗重组L1N抗血清（A）和免疫前正常兔血清（B）为探针的L1N端相互重叠10 aa的系列GST-18肽(P1-P24)融合蛋白免疫印迹结果；25-60, 用抗重组L1C抗血清（C）和（D）为探针的L1C端相互重叠10 aa的系列GST-18肽(P25-P60)融合蛋白印迹结果（C）；图1A、C和D中箭头分别指示印迹阳性18肽融合蛋白和能被正兔血清识别的对照蛋白（与GST188融合表达的HPV58E6-13^73-87）。

图2 HPV58L1C的P27表位肽最小基序的免疫印迹图。A：用兔抗重组L1C多抗与P139-P149融合蛋白（Lane 1-11）的印迹结果，箭头分别指示印迹反应阳性的条带；B:阴影部分显示印迹阳性肽（P139-P142）共有最小基序的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J. 萨姆布鲁克和D.W. 拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”（科学出版社，2002）和[美]E. 哈洛和D. 莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南” （科学出版社，2002）中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。

实施例1：人乳头瘤病毒58型（HPV58）L1蛋白线性BCE扫描作图

材料和方法：

1. HPV58基因克隆（pLink322/HPV58质粒）市购。pRSET C质粒购自美国Invitrogen 公司。热诱导表达质粒pXXGST-1由本专利发明人构建(专利申请号： 200710173305.2)。大肠杆菌BL21（DE3）菌株市购。

2. 限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sal I、Taq酶和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa Biotechnology公司，预染蛋白分子量标准和辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（IgG /HRP）上海生工生物技术服务公司。ECL化学发光显色试剂盒购自GE Healthcare UK公司。 0.2 μm硝酸纤维素膜购自Whatman Gmbh Hahnestr公司。6 × His单抗购自上海睿星生物技术有限公司。

3. QIAprep spin miniprep Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。

4. 新西兰白兔购自上海BK实验动物有限公司。

5. 两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为P1-P237编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

6. 抗HPV58L1N^1- 和L1C^-524蛋白抗血清制备依据HPV58病毒L1基因序列公开信息（Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427, 1991）和参照文献方法（宋力雯等. 人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合. 生理学报，57： 682-688, 2005）。制备过程摘要如下：从pLink322/HPV58质粒中PCR扩增出两端为BamH I和EcoR I覆盖全长L1蛋白序列相互重叠8个氨基酸残基的两个L1N^36-233和L1C^226-524编码基因；双酶切后重组插入pRSET C质粒，重组质粒经DNA测序验证后转化大肠杆菌宿主菌；诱导表达的重组含6 × His标签L1N和L1C蛋白用6 × His单抗鉴定后，用纯化的重组L1N和L1C蛋白免疫新西兰白兔，加强免疫二次后抽取它们的抗血清备用。

HPV58病毒L1蛋白线性抗原表位扫描作图的具体步骤如下：

1. 依据HPV58型L1基因序列公开信息，设计跨越L1N^36-233（删除了信号肽）和L1C^226-524全序列的系列相互重叠10个氨基酸残基的18肽(编号P1-P60)编码DNA正负链片段（正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’），外送DNA合成。

2. 将1或2个OD的互补正负链片段用ddH₂O溶解成20 mmol/ml储存液（根据DNA合成报告单数据）；各取10 ml储存液和20 ddH₂O于1.5 ml Eppendorf管中，94℃水浴加热5 min,自然降至室温后，在15 ml反应体积中吸入2 ml退火片段、1 ml 约200 ng/ml经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒、1 ml T4 DNA连接酶和其1.5 ml缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21（DE3）宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3 ml LB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-18肽（P1-P60）融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认（与对照蛋白电泳迁移率相差约2 kDa），挑取各重组克隆外送进行DNA测序；

3．将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3 ml LB 培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2 ～ 3 h 至菌体浓度达到0.6 ～ 0.8 OD后，调高温度至42℃热诱导4 h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min备用；

4. 将诱导的细菌总蛋白样品同时走15％SDS-PAGE，电泳结束后，一块凝胶用考马斯亮蓝染色，二块凝胶进行硝酸纤维素膜电(100 mA)转移2 h，用丽春红染色转印迹膜2 min，数码相机拍照后用水冲洗掉丽春红染色；

5. 印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8 ～ 10 ml 反应液中加入30 ml一抗兔抗重组L1N/L1C血清或正兔血清，室温反应2 h，PBS缓冲液洗涤后加入5 ml二抗羊抗兔IgG /HRP（1: 2000稀释），室温反应1 h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色后曝光于X光胶片（图1A-D）。

6. 依据用抗L1N/L1C血清（图1A）和正兔血清（图1C）印迹结果，确定HPV58型L1蛋白上存在23个线性BCE肽。

实施例2： HPV58病毒L1C蛋白P27表位肽最小基序鉴定

材料和方法：

见实施例1相应部分。

P27表位肽最小基序鉴定的具体步骤如下：

1. 依据实施例1中L1C蛋白抗原表位扫描定位结果，以P27表位肽为例实施其最小基序鉴定。设计跨越P27表位肽的18肽序列相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽（P139-P149）编码DNA正负链片段（正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’），外送DNA合成。

2-4操作步骤同实施例1中的2-4步骤。

5．印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8 ～ 10 ml 反应液中加入30 ml一抗兔抗人重组L1C血清(1:200稀释)，室温反应2 h，PBS缓冲液洗涤后加入5 ml二抗羊抗人IgG /HRP（1: 2000稀释），室温反应1 h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色（图2A）。

6. 依据4个印迹阳性连续片段（P139-P142）共有残基序列（图2B, Lane 1-4），确定其表位最小基序为DVPID。

尽管本发明描述了HPV58/L1致癌性蛋白共16个抗原表位最小基序，以及可单独和/或组合用含最小基序的8肽或8肽融合蛋白研制治疗性HPV58多表位疫苗，或可单独和/或组合用作检测人HPV58型特异感染的抗原肽（或化学合成或融合表达），但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序8肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

SEQ ID No.1: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-1^38-43(P1)表位肽最小基序一字简写的氨基酸序列

YLPPVP

SEQ ID No.2: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-2^107-112(P9与P10共享1个表位)表位肽最小基序

PNKFGP

SEQ ID No.3: 人乳头瘤病毒/HPV58L1-3^154-157(P15)表位肽最小基序

DDTE

SEQ ID No.4: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-4^208-211(P21与P22共享1个表位)表位肽最小基序

ATDC

SEQ ID No.5: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-5^213-217(P22与P23共享1个表位)表位肽最小基序

PLELF

SEQ ID No.6: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-6^222-227(P23与P24共享1个表位)表位肽最小基序

EDGDMV

SEQ ID No.7: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-7^228-231(P24与P25共享)表位肽最小基序

DTGF

SEQ ID No.8: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-8^236-242(P25与P26共享1个表位)表位肽最小基序

FGTLQAN

SEQ ID No.9: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-9^245-249(P26与P27共享1个表位)表位肽最小基序

DVPID

SEQ ID No.10: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-10^298-301(P33与P34共享1个表位)表位肽最小基序

PDDL

SEQ ID No.11: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-11^331-335(P37与P38共享1个表位)表位肽最小基序

QLFNK

SEQ ID No.12: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-12^378-381(P43与P44共享1个表位)表位肽最小基序

GTYK

SEQ ID No.13: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-13^383-388 (P44)表位肽最小基序

DNFKEY

SEQ ID No.14: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-14^462-465 (P53与P54共享1个表位)表位肽最小基序

KEDP

SEQ ID No.15: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-15^500-506 (P59)表位肽最小基序

KAKPRLK

SEQ ID No.16: 人乳头瘤病毒HPV58/L1-16^508-510 (P59与P60共享1个表位)表位肽最小基序

SAP

SEQ ID No.17: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-1表位最小基序扩展8肽

VYLPPVPV

SEQ ID No.18: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-2表位最小基序扩展8肽

DPNKFGPP

SEQ ID No.19: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-3表位最小基序扩展8肽

KFDDTETS

SEQ ID No.20: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-4表位最小基序扩展8肽

AAATDCPP

SEQ ID No.21: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-5表位最小基序扩展8肽

PPLELFNS

SEQ ID No.22: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-6表位最小基序扩展8肽

IEDGDMVD

SEQ ID No.23: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-7表位最小基序扩展8肽

MVDTGFGC

SEQ ID No.24: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-8表位最小基序扩展8肽

DFGTLQAN

SEQ ID No.25: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-9表位最小基序扩展8肽

KSDVPIDI

SEQ ID No.26: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-10表位最小基序扩展8肽

AVPDDLYI

SEQ ID No.27: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-11表位最小基序扩展8肽

ESQLFNKP

SEQ ID No.28: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-12表位最小基序扩展8肽

KEGTYKND

SEQ ID No.29: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-13表位最小基序扩展8肽

NDNFKEYV

SEQ ID No.30: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-14表位最小基序扩展8肽

KEKEDPLN

SEQ ID No.31: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-15表位最小基序扩展8肽

LKAKPRLK

SEQ ID No.32: 人乳头瘤病毒(HPV58)L1-16表位最小基序扩展8肽

LKRSAPTT

Claims

1.一种HPV58型L1蛋白上最小表位基序肽，其特征在于：

氨基酸序列如SEQ. ID No.1所示，记为HPV58L1-1^38-43；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.2所示，记为HPV58L1-2^107-112；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.3所示，记为HPV58L1-3^154-157；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.4所示，记为HPV58L1-4^208-211；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.5所示，记为HPV58L1-5^213-217；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.6所示，记为HPV58L1-6^222-227；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.7所示，记为HPV58L1-7^228-231；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.8所示，记为HPV58L1-8^236-242；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.9所示，记为HPV58L1-9^245-249；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.10所示，记为HPV58L1-10^298-301；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.11所示，记为HPV58L1-11^331-335；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.12所示，记为HPV58L1-12^378-381；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.13所示，记为HPV58L1-13^383-388；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.14所示，记为HPV58L1-14^462-465；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.15所示，记为HPV58L1-15^500-506；或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.16所示，记为HPV58L1-16^508-510。

2.一种含如权利要求1所述的最小表位基序肽的短肽，其特征在于：

氨基酸序列如SEQ. ID No.17所示，记为L1-1，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.18所示，记为L1-2，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.19所示，记为L1-3，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.20所示，记为L1-4，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.21所示，记为L1-5，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.22所示，记为L1-6，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.23所示，记为L1-7，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.24所示，记为L1-8，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.25所示，记为L1-9，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.26所示，记为L1-10，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.27所示，记为L1-11，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.28所示，记为L1-12，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.29所示，记为L1-13，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.30所示，记为L1-14，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.31所示，记为L1-15，或者

氨基酸序列如SEQ. ID No.32所示，记为L1-16。

3.如权利要求1所述的HPV58型L1蛋白上最小基序肽，在制备包含B细胞表位肽待预防性多价HPV58肽疫苗中的应用。

4.如权利要求1所述的HPV58型L1蛋白上最小基序肽，与GST188载体融合表达的单独或组合表位肽作为标志性抗原肽段在制备HPV58病毒感染血清学检测试剂盒中的应用。

5.如权利要求2所述的含最小表位基序肽的短肽，在制备包含B细胞表位肽的预防性多价HPV58肽疫苗中的应用。

6.如权利要求2所述的含最小表位基序肽的短肽，与GST188载体融合表达的单独或组合表位肽作为标志性抗原肽段在制备HPV58病毒感染血清学检测试剂盒中的应用。