CN101914134B - 人乳头瘤58型病毒e7蛋白的线性抗原表位最小基序肽 - Google Patents
人乳头瘤58型病毒e7蛋白的线性抗原表位最小基序肽 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体为一种人乳头瘤（HPV）58型致癌性E7蛋白的抗原表位（Bcellepitope）最小基序肽及其用途。本发明提供了8个可作为抗原单独或组合用于特异检测HPV58型病毒感染患者血清的含最小基序的表位肽（包括可与截断GST188等载体蛋白表达的8肽序列），以及用作研制同时诱导体液免疫的治疗性HPV58多表位肽疫苗的特异最小基序肽氨基酸序列。这些HPV58型E7抗原表位最小基序肽和短肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1~SEQIDNo.16所示。
Description
技术领域
本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体涉及与妇女宫颈癌发生密切相关的高危型人乳头瘤病毒（HPV）58型E7致癌蛋白的全部线性B细胞表位（B cell epitope, BCE,或称抗原决定簇）及其最小基序肽，以及这些表位基序肽的应用。
背景技术
人乳头状瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是可感染女性生殖道等上皮组织的一组病毒总称。已清楚超过100种以上的HPV病毒都编码6个E1、E2、E4 ～ E7早期蛋白和2个L1和L2后期蛋白（Stanley MA. Human papillomavirus vaccines. Rev Med Virol, 16: 139-149, 2006），其中持续感染可导致妇女子宫颈癌等高危型HPV（如HPV16和HPV18等）编码的E7蛋白已被证明具有强致癌性。因此，高危型HPV的E7蛋白是目前研制宫颈癌免疫治疗的重要靶点之一（Preville X, et al. Cancer Res,65: 641-649, 2005）。
HPV58也是紧随16和18型之后的高危型HPV病毒之一（Lungu O， et al. Obstet Gynecol, 47: 337-342 , 1995）。最近的研究资料表明HPV58型在我国江西、上海、河北、北京、香港和台湾等地区等子宫颈癌患者中的检出阳性率也相当高（Lin QQ, et al. Int J Cancer, 75: 484-485, 1998; Huang S, et al. Int J Cancer, 70: 408-411, 1997; Cai HB, et al. Oncol, 76: 157-161, 2009; Zhao R, et al. Br J Cancer, 101: 1635-1640, 2009; Lai HC, et al. Int J Cancer, 84: 553-557, 1999; Chan PK, et al. J Med Virol, 59: 232-238, 1999; Bao YP, et al. Int J STD AIDS, 19: 106-111, 2008），有的地区检出率高于HPV18型，甚至与HPV16的相当（李洁等. 中华实验和临床病毒学杂志，10: 50-55, 1996; 刘宝印等. 中华实验和临床病毒学杂志， 10: 118-121, 1996）。
很显然，靶蛋白上线性抗原表位（BCE）的扫描作图定位是研制特异肽疫苗和特异检测肽抗原的基础。但是，以往的E6和E7表位研究都主要集中于HPV16和HPV18（Dillner J, et al. Int J Cancer, 45: 529-535, 1990; Bleul C, et al. J Clin Microbiol, 29: 1579-1588, 1991; Gao L, et al. J Gen Virol, 75: 157-164, 1994），而HPV58型E7蛋白线性表位鉴定一直未有开展。
因此，基于上述HPV58型在我国妇女中的高流行性和这一病毒型表位鉴定的缺失，以及为了研制具我国自主知识产权的HPV治疗性嵌合肽（组合细胞毒性T细胞表位和BCEs）疫苗和可特异检测HPV58型病毒的诊断试剂盒，我们用大肠杆菌表达HPV58型E7蛋白并制备了兔抗重组E6蛋白抗血清，结合采用申请人改良的生物合成肽策略（Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009），对HPV58型E7蛋白进行了线性表位完整且精细的扫描作图定位。
发明内容
本发明的目的在于提供人乳头瘤病毒（HPV）58型E7蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小基序肽的短肽，同时提供所述基序肽含所述短肽的应用。
本发明提供的人乳头瘤58型病毒E7蛋白上最小基序肽，具有SED. ID No.1所示氨基酸序列，记为HPV58E75-8；或者具有SED. ID No.2所示氨基酸序列，记为HPV58E712-15；或者具有SED. ID No.3所示氨基酸序列，记为HPV58E718-23；或者具有SED. ID No.4所示氨基酸序列，记为HPV58E721-27；或者具有SED. ID No.5所示氨基酸序列，记为HPV58E731-35；或者具有SED. ID No.6所示氨基酸序列，记为HPV58E736-40；或者具有SED. ID No.7所示氨基酸序列，记为HPV58E743-49；或者具有SED. ID No.8所示氨基酸序列，记为HPV58E794-98。
本发明提供的分别含有上述最小表位基序肽的短肽，具有SEQ. ID No.9所示氨基酸序列，记为HPV58E7-1，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ. ID No.10所示氨基酸序列，记为HPV58E7-2，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代C端X残基；
具有SEQ. ID No.11所示氨基酸序列，记为HPV58E7-3，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ. ID No.12所示氨基酸序列，记为HPV58E7-4，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ. ID No.13所示氨基酸序列，记为HPV58E7-5，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ. ID No.14所示氨基酸序列，记为HPV58E7-6，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ. ID No.15所示氨基酸序列，记为HPV58E7-7，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ. ID No.16所示氨基酸序列，记为HPV58E7-8，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基。
本发明提供的人乳头瘤病毒（HPV）58型E7蛋白上申请人第一次鉴定的八个BCE肽的最小基序，以及它们可化学合成或与GST载体蛋白融合表达的含各BCE最小基序8肽或长于8肽抗原。前者可单个或组合用作设计研制治疗性HPV多表位疫苗的抗原肽，后者8肽或其融合蛋白可用于普查正常妇女或子宫颈癌患者血清中是否存在抗HPV58E7抗体的检测抗原。特别是，HPV58E7-5表位最小基序31-35（SSDED）和E7-7表位最小基序43-49 (DGQAQPA)与高危型HPV33E7蛋白中的氨基酸31-35和42-48l两段序列100％保守，因此含这二个最小基序肽的HPV58多表位肽疫苗对HPV33病毒感染也将产生交叉免疫保护作用，也可用作检测HPV33感染的标志性抗原肽（同时并用HPV58E7其他6个表位肽，以感染血清不识别为依据）。
本发明的内容进一步具体描述如下：
1、 HPV58型病毒基因组克隆（Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427, 1991）购自日本Matsukura T博士。用常规PCR方法从购得的HPV58型病毒基因组中扩增出编码HPV58型E7的全长cDNA,然后重组插入pRSET C融合表达质粒，进而纯化在大肠杆菌中热诱导表达的重组E7蛋白，最后主动免疫新西兰白兔获得兔抗HPV58E7蛋白抗血清。
2、先前申请人已构建了专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的pXXGST-1融合表达质粒（Xu et al. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009），其大分子蛋白载体是截断的由188个氨基酸残基组成的谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferases,GST，GST188）。因此，首先运用DNA重组技术（经化学合成编码DNA正负链片段，退火重组插入表达质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌，重组克隆测序验证插入片段DNA序列，以及热诱导表达目的GST-15肽融合蛋白等步骤），表达了跨越E7蛋白1-98序列相互重叠9个氨基酸残基的系列15肽(P1-P14)-GST和1个14肽(P15)-GST融合蛋白。结果在表达短肽融合蛋白(P1-P15)转印硝酸纤维素膜上后，用兔抗HPV58E7蛋白多抗进行全表位扫描作图，分别鉴定出E7蛋白上不包括免疫前正兔对照血清也识别的一个P13表位肽的九个印迹反应阳性BCE表位肽(P1-P8和P15)（图1）。
3、进一步构建表达了以GST188为载体的跨越E7的P11-15、P27-21、P313-27、P419-33、P525-39、P631-45、P737-51和P1585-98序列相互重叠7个残基的系列融合表达8肽（编号P16 ～ P66），继而用兔抗E7多抗对上述八个表位肽进行最小基序鉴定（P7表位肽最小基序鉴定后表明P8表位肽共享此基序，故不再合成它的系列八肽），结果根据各表位肽印迹反应阳性的8肽之间共同的氨基酸序列，确定P1、P2、P3、P3-P4(共享)和P7-P8(共享)的BCE最小基序分别是NPTL5-8、ILDLH12-15、EPTDLF18-23、DLFCYEQ21-27和DGQAQPA43-49，P5-P6表位肽的系列8肽中共产生9个连续的阳性印迹反应带（P43-P51），提示它们代表的肽段25-45中存在2个BCE，但无法确定它们的最小基序。为此反过来依据前（P43-P47）和后(P46-P51)6个印迹阳性肽段合成可能的最小基序肽,如与GST188融合表达的短肽DSSDED、SSDED、SDED和DED（在它们的N端前连接3个丙氨酸残基AAA，编号P72-P75），结果抗重组E7抗血清识别P72和P73短肽，由此确定它们的第一个最小基序被确定为SSDED31-35（P5-P6共享），用同样的策略合成P76-P80最小基序短肽，最终第二个最小基序被确定为EIGLD36-40（P6）。P15系列8肽的P66印迹阳性肽的最小基序鉴定，则通过在P66肽N端开始逐一删除1个残基合成与GST188融合的5个短肽（P67-P71，P71的3肽N端连接3个AAA），用抗重组E7多抗的印迹鉴定表明其最小基序为SCAQQ94-98（图2）。
以上HPV58型E7蛋白八个BCE肽最小基序的鉴定表明，本发明所述的HPV58型E7蛋白八个抗原表位最小基序和/或扩展的8肽可作为制备包含B细胞抗原表位肽的治疗性多价HPV58肽疫苗候选肽段，它们与GST188等载体融合表达的单独或组合表位肽可用作HPV58型病毒感染检测试剂盒中的标志性抗原肽段。
附图说明
图1 HPV58/E7线性抗原表位扫描定位的SDS-PAGE分析(A)和免疫印迹(B-C)图。其中：1,预染蛋白分子量标准；2-16, 诱导的跨越E7蛋白全序列相互重叠9 aa的系列GST-15肽(P1-P15)融合蛋白（A）；用1：500稀释度兔抗重组E7抗血清的免疫印迹结果,箭头分别指示印迹阳性15肽融合蛋白（B）；用1:500稀释度免疫前兔血清作为对照的免疫印迹结果，箭头指示印迹阳性15肽融合蛋白（C）。
图2 HPV58/E7表位肽P15/P66最小基序鉴定的印迹图。其中,1,预染蛋白分子量标准；2-12 表达的P61-P71融合蛋白(A)，箭头分别指示与兔抗重组E7蛋白抗血清产生印迹反应的条带；图表中阴影部分显示印迹阳性肽（P66-P69）共有最小基序氨基酸序列（B）。
具体实施方式
本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J. 萨姆布鲁克和D.W. 拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”（科学出版社，2002）和[美]E. 哈洛和D. 莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南” （科学出版社，2002）中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。
实施例1： 人乳头瘤病毒58型（HPV58）E7蛋白线性BCE扫描作图
材料和方法：
1. HPV58基因克隆（pLink322/HPV58质粒）购自日本Matsukura T博士。pRSET C质粒购自美国Invitrogen 公司。热诱导表达质粒pXXGST-1由本专利发明人构建(专利申请号： 200710173305.2)。大肠杆菌BL21（DE3）菌株由复旦大学遗传工程国家重点实验室保藏。
2. 限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sal I、Taq酶和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa Biotechnology 公司，预染蛋白分子量标准和辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（IgG /HRP）上海生工生物技术服务公司。ECL化学发光显色试剂盒购自GE Healthcare UK公司。0.2μm硝酸纤维素膜购自Whatman Gmbh Hahnestr公司。6 × His单抗购自上海睿星生物技术有限公司。
3. QIAprep spin miniprep Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。
4. 新西兰白兔购自上海BK实验动物有限公司。
5. 两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为各6/8-15肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
6. 抗HPV58E7蛋白抗血清制备依据HPV58病毒E6基因序列公开信息（Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427, 1991）和参照文献方法（宋力雯等. 人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合. 生理学报，57： 682-688, 2005）。制备过程摘要如下：从pLink322/HPV58质粒中PCR扩增出两端为BamH I和EcoR I的全长E7编码基因；双酶切后重组插入pRSET C质粒，重组质粒经DNA测序验证后转化大肠杆菌宿主菌；诱导表达的重组含6 × His标签E7蛋白用6 × His单抗鉴定后，用纯化的重组E7蛋白免疫新西兰白兔，加强免疫二次后抽取血清备用。
人乳头瘤病毒58型（HPV58）E7蛋白线性抗原表位扫描作图的具体步骤如下：
1. 依据HPV58型E7基因序列公开信息，设计跨越E71－98全序列的系列相互重叠9个氨基酸残基的15肽(P1-P15)编码DNA正负链片段（正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’），外送DNA合成。
2. 将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20 mmol/ml储存液（根据DNA合成报告单数据）；各取10 ml储存液和20 ddH2O于1.5 ml Eppendorf管中，94℃水浴加热5 min,自然降至室温后，在15 ml反应体积中吸入2 ml退火片段、1 ml 约200 ng/ml经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒、1 ml T4 DNA连接酶和其1.5 ml缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21（DE3）宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3 ml LB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-15肽（P1-P15）融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认（与对照蛋白电泳迁移率相差约2个kDa），挑取各重组克隆外送进行DNA测序；
3．将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3 ml LB 培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2 ～ 3 h 至菌体浓度达到0.6 ～ 0.8 OD后，调高温度至42℃热诱导4 h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min备用；
4. 将诱导的细菌总蛋白样品同时走15％SDS-PAGE，电泳结束后，一块凝胶用考马斯亮蓝染色，二块凝胶进行硝酸纤维素膜电(100 mA)转移2 h，用丽春红染色转印迹膜2 min，在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记，用水冲洗掉丽春红染色；
5. 印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8 ～ 10 ml 反应液中加入30 ml一抗兔抗重组E7血清或正兔血清，室温反应2 h，PBS缓冲液洗涤后加入5 ml二抗羊抗兔IgG /HRP（1: 2000稀释），室温反应1 h， 用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色后曝光于X光胶片（图1B-C）。
6. 依据用抗E7血清（图1B）和正兔血清（图1C）印迹结果，排除正兔血清也能识别的P13，确定HPV58型E7蛋白上存在P1-P8和P15共九个线性BCE肽。
实施例2： 人乳头瘤病毒58型（HPV58）E7蛋白P15表位肽最小基序鉴定
材料和方法：
见实施例1相应部分。
P15表位肽最小基序鉴定的具体步骤如下：
1. 依据实施例1中E7蛋白抗原表位扫描定位结果，以E7-8表位肽P15为例实施其最小基序鉴定。设计跨越P15表位肽的14肽序列相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽编码DNA正负链片段（正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’），外送DNA合成。在鉴定出P60-P66系列8肽中唯一印迹阳性P66肽后，设计合成从其N端起逐一删除1个残基的短肽（3-7肽，编号P67-P71）编码DNA正负链片段。
2-4操作步骤同实施例1中的2-4步骤。
5．印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8 ～ 10 ml 反应液中加入30 ml一抗兔抗人重组E7血清(1:200稀释)，室温反应2 h，PBS缓冲液洗涤后加入5 ml二抗羊抗人IgG /HRP（1: 2000稀释），室温反应1 h， 用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色（图2A）。
6. 依据4个印迹阳性连续片段（P66～P69）共有残基序列（图2B, Lane 7-10），确定其表位最小基序为SCAQQ。
尽管本发明描述了HPV58/E7致癌性蛋白共8个抗原表位最小基序，以及可单独和/或组合用含最小基序的8肽或8肽融合蛋白研制治疗性HPV58多表位疫苗，或可单独和/或组合用作检测人HPV58型感染的抗原肽（或化学合成或融合表达），但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序8肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
SEQ ID No.1: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-11-15(P1)表位肽最小基序一字简写的氨基酸序列
NPTL
SEQ ID No.2: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-27-21(P2)表位肽最小基序
ILDLH
SEQ ID No.3: 人乳头瘤病毒/HPV58E7-313-27(P3)表位肽最小基序
EPTDLF
SEQ ID No.4: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-419-33(P4)表位肽最小基序
DLFCYEQ
SEQ ID No.5: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-525-39(P5-P6共享)表位肽最小基序
SSDED
SEQ ID No.6: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-631-45(P6)表位肽最小基序
EIGLD
SEQ ID No.7: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-737-51(P7)表位肽最小基序
DGQAQPA
SEQ ID No.8: 人乳头瘤病毒HPV58/E7-885-98(P15)表位肽最小基序
SCAQQ
SEQ ID No.9: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-1表位最小基序扩展8肽
X 1 X 2 NPTLX 3 X 4 ， 其中X1是G，X2是N，X3是R，X4是E。
SEQ ID No.10: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-2表位最小基序扩展8肽
X 1 X 2 ILDLX 3 X 4 ， 其中X1是E，X2是Y，X3是H，X4是P。
SEQ ID No.11: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-3表位最小基序扩展8肽
X 1 EPTDLFX 2 ， 其中X1是P，X2是C。
SEQ ID No.12: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-4表位最小基序扩展8肽
DLFCYEQX 1 ， 其中X1是L。
SEQ ID No.13: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-5表位最小基序扩展8肽
X 1 X 2 SSDEDX 3 ， 其中X1是C，X2是D，X3是E。
SEQ ID No.14: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-6表位最小基序扩展8肽
X 1 EIGLD X 2 X 3， 其中X1是D，X2是G，X3是P。
SEQ ID No.15: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-7表位最小基序扩展8肽
X 1 DGQAQPA， 其中X1是P。
SEQ ID No.16: 人乳头瘤病毒(HPV58)E7-8表位最小基序扩展8肽
X 1 X 2 X 3 SCAQQ， 其中X1是V，X2是C，X3是P。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市计划生育科学研究所,复旦大学
<120> 人乳头瘤58型病毒E7蛋白的线性抗原表位最小基序肽
<130> 001
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人乳头瘤病毒HPV58
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<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒HPV58
<400> 15
Pro Asp Gly Gln Ala Gln Pro Ala
1 5
Claims (4)
1.一种HPV58型E7蛋白上最小表位基序肽，其特征在于为SEQ. ID No.3所示氨基酸序列，记为HPV58E718-23 。
2.一种含如权利要求1所述的最小表位基序肽的短肽，其特征在于：
为SEQ. ID No.11所示氨基酸序列，记为HPV58E7-3 。
3.如权利要求1所述的HPV58型E7蛋白上最小表位基序肽与GST188载体融合表达的表位肽作为HPV58型病毒感染检测试剂盒中的标志性抗原肽段的应用。
4.如权利要求2所述的最小表位基序肽的短肽与GST188载体融合表达的表位肽作为HPV58型病毒感染检测试剂盒中的标志性抗原肽段的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010259028 CN101914134B (zh) | 2010-08-17 | 2010-08-17 | 人乳头瘤58型病毒e7蛋白的线性抗原表位最小基序肽 |
Applications Claiming Priority (1)
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