CN103342738B - 人乳头瘤病毒e6蛋白可诱发同源蛋白间交叉反应性抗体的精细表位肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白可诱发同源蛋白间交叉反应性抗体的精细表位肽。本发明人首次定位到一种特定的抗原性表位,所述的抗原性表位在多种HPV亚型(包括:HPV16、18、33、52或58型)病毒的E6蛋白中保守地存在。因此,利用含有该表位肽,可以制备抗HPV E6蛋白的免疫原或血清学检测抗原,或制备特异性的多种高危致癌性HPV通用型抗体。
Description
技术领域
本发明属于免疫学和生物医药技术领域,具体涉及一种人乳头瘤病毒E6蛋白中能被单克隆抗体C1P5识别的最小基序肽及其应用。
背景技术
宫颈癌是目前世界上导致女性死亡的第二大癌症,其威胁仅次于乳腺癌。全球每年约有50万人被诊断为宫颈癌,约有30万人死于此癌症,而中国的每年发病率则估计在13.5万,死亡人数5万。上世纪80年代初就确定了人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)与宫颈癌的相关性。最新资料表明99.8%子宫颈癌活检标本中可检出HPV。因此,关注妇女生殖健康,各国科研人员长期以来一直就HPV的诊断、预防和治疗的方法途径展开研究。令人兴奋的是,2006和2007年首先已由美国默克(Merck)和英国葛兰素史克(GSK)制药公司研制成功二种预防性四价和二价HPV疫苗。
但是,就HPV预防和治疗而言,目前这方面需要人类攻克的课题依然很多。例如,现已清楚感染女性生殖道等上皮组织的HPV型有120种之多,其中可经持续感染导致子宫颈癌的高危型HPV则存在20种左右[de Villiers EM,FauquetC,Broker TR,et al.Classification of papillomaviruses.Virol 2004,324:17–27;Parkin DM.The global health burden of infection-associated cancers in the year2002.Int J Cancer,118:3030-3044,2006;de Sanjose S,Quint WG,AlemanyL,et al.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer:aretrospective cross-sectional worldwide study.Lancet Oncol 2010,11(11):1048-1056],而目前已被许多国家批准临床应用的以上Gardasil和Cervarix预防性HPV疫苗主要是针对流行率最广的HPV16和18型的,虽然它们对其他一些高危型HPV也显示出一定程度的保护作用[Wheeler CM,Castellsague X,Garland SM,et al.Cross-protective efficacy of HPV16/18 ASO4-adjuvantedvaccine against cervical infection and precancer caused by non-vaccine oncogenicHPV types:4-year end-of-study analysis of the randomized,double-blindPATRICIA trial.Lancet Oncol,13(1):100-110,2012]。因此,下一个已受到普遍关注的课题无疑是研发“通用”HPV疫苗,这对中国和亚洲妇女尤为重要,因为在这一地区妇女感染高危HPV型的流行率排序,在HPV16之后主要是HPV58和HPV52,而非通常排第二的HPV18[Huang S,Afonina I,Miller BA,Beckmann AM.Human papillomavirus type 52 and 58 are prevalent in cervicalcancers from Chinese woman.Int J Cancer,70(4):408-411,1997等]。
此外,由于默克和葛兰素史克制药公司HPV四价和二价疫苗生产工艺复杂和综合成本高,其疫苗价格显然不适合在发展中国家推广应用,因而研制易制备储存价格低等突出优点的重组多表位肽疫苗,也是一个当前疫苗发展的重要方向。虽然目前的HPV治疗性多肽疫苗多选择HPV16或18型E6和E7蛋白上的细胞毒性T细胞表位(TCL/TcCE)肽,但也有研制靶向早期致癌性E6和E7蛋白,同时诱发CD4+、CD8+和抗体应答的治疗性HPV融合蛋白疫苗报道,提示也可研制组合它们B-和T-细胞表位的预防性HPV多表位肽疫苗,即通过产生抗体的体液应答,以及在癌前病变或宫颈恶性病变前排除它们对肿瘤特异性免疫应答而达到完全或部分清除HPV效果。
另外,在HPV感染临床门诊方面,建立介于细胞学观察和DNA诊断之间简便易行灵敏准确的血清学检测方法,也始终是一项重要的课题。即,作为这一方法学的核心内容或技术,就是鉴定HPV感染者血清中存在的抗体及其线性抗原表位[Dillner J.Mapping of linear epitopes of human papillomavirus type 16:the E1,E2,E4,E5,E6 and E7 open reading frames.Int J Cancer,46:703-711,1990等],然后以合成表位肽为ELISA包被抗原建立ELISA检测方法。但现实是,至今未见血清学检测方法或Kit在临床检验中的实际应用,原因就在于难以排除ELISA检测中常见但医患双方都不希望出现的高比例假阳性结果。可以想见,假阳性结果由是以下三个因素合并形成,即:1)一般患者体内应答HPV感染的抗体滴度通常不高,因而血清样品稀释度不可能高(常见用1:2-1:10血清稀释度);2)因抵御病毒等微生物感染和自身免疫等因素,人体内往往存在成千上万难以计数的抗不明抗原抗体;3)以使用检测单一抗体的18-20个组成单表位肽作为检测抗原为例[Dillner J,Dillner L,Cheng HM.Synthetic peptides inhuman papillomavirus 1,5,6,8,11,16,18,31,33 and 56,useful in immunoassayfor diagnostic purposes.United States Patent Number:5932412,1999],已知线性B细胞表位通常由3-8残基组成,因此大于8个残基的表位肽上显然潜在能被体内不明抗原抗体识别的N个表位,就存在低血清稀释度情况下被体内某一或若干抗体识别的几率。基于以上认知,今后研制高特异性高灵敏度合成肽检测用抗原,需要创新突破的方向应该是:1)检测抗原最好使用表位最小基序或扩展八肽,以使与体内抗不明抗原抗体的交叉反应性降到最低,从而提高检测的特异性;2)构建基于最小基序的多表位肽抗原,以测定靶蛋白表面多个表位抗体,通过富集它们的低滴度抗体以及偶联二抗的放大效应扩大待测血清样品的稀释度,提高目标抗体的检测灵敏度。而体内的同样低滴度非目标抗体,则随着血清稀释度的扩大而下降至检测灵敏度以下,从而减少可能的交叉反应性,避免假阳性结果。很显然,以上检测抗原Kit研制目标的实现有赖于靶抗原更多线性表位及其最小基序的鉴定。
基于以上HPV疫苗和诊断试剂研发的实际需求背景,本发明人先前已完成HPV58型E6蛋白的全部四个线性表位及其精细基序鉴定[徐万祥等;人乳头瘤病毒58型E6蛋白的抗原表位最小基序肽;中国专利申请号:200910196693.5],并发现了其中HPV58型E6-2表位YGDTL84-88基序在高危型HPV同源蛋白之间具有高度保守性(图1),且与被鉴定的HPV18型显示为22肽的E6/2表位C端末的5个残基序列完全相同[Bleul C,Muller M,Frank R,et al.humanPapillomavirus type 18 E6 and E7 antibodies in human sera:increased anti-E7prevalence in cervical cancer patients.J Clin Microbiol,29(8):1579-1588,1991]。
众所周知,一个抗原表位代表一种抗体,一个抗体对应一个表位,特别是表位和抗体在抗病毒抗肿瘤药物(疫苗)以及诊断试剂等方面的可能应用,因而无容置疑表位的鉴定或制备都具有发明和制备的知识产权。当然,作为这方面知识产权的形成还在于鉴定或制备技术的难度。例如,Banks L等用重组HPV18型E6蛋白制备了包括C1P5在内六株单抗[Banks L,Spence P,Androphy E,et al.Identification of human papillomavirus type 18 E6 polypeptide in cellsderived from human cervical carcinomas.J Gen Virol,68(Pt 5):1351-1359,1987],但都未进行各株单抗识别表位基序的鉴定,从而未能发现C1P5单抗除HPV16-E6蛋白以外与其他更多高危型HPV同源蛋白之间的交叉性反应(因此失去其更多的应用范围),以及确定另外五株命名为D2A6、C1N1、C1X1、B1B3和B1A2单抗识别的表位。关于后者其他5个单抗识别表位基序的鉴定也很重要,因为尽管五株单抗亚型不同,也存在2株或更多不同亚型单抗识别同一个表位基序的可能性。例如,在另一项研究中,两株抗HPV18-E6不同亚型(G3和G1)单抗都同时识别PTRR7-10四个残基基序[Bleul C,Muller M,Frank R,et al.human Papillomavirus type 18 E6 and E7 antibodies in human sera:increasedanti-E7 prevalence in cervical cancer patients.J Clin Microbiol,29(8):1579-1588,1991]。但是受表位鉴定方法学的限制,以往这方面研究报道并不多。原因在于即便相对单抗而言,应用包括化学合成肽法在内的表位鉴定技术操作非易事。
因此,应用改良生物合成肽法来鉴定新的单抗识别表位基序HPV精细表位肽在本领域中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人乳头瘤病毒E6蛋白中能被单克隆抗体C1P5识别的最小基序及其应用。
在本发明的第一方面,提供一种分离的多肽,所述的多肽由式(I)所示的氨基酸序列组成;
EXRHY (I);
其中,X选自氨基酸L或Y;
并且,所述的多肽来源于人乳头瘤病毒(HPV)的E6蛋白。
在一个优选例中,所述的多肽具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述的多肽来源于人乳头瘤病毒18型(X为L)、16型(X为Y)、52型(X为Y)、33型(X为Y)或58型(X为Y)的E6蛋白。
在本发明的另一方面,提供前面所述的多肽的用途,用于制备抗人乳头瘤病毒E6蛋白的免疫原。
在一个优选例中,所述的人乳头瘤病毒是18、16、33、52或58型。
在本发明的另一方面,提供前面所述的多肽的用途,用于制备可特异性结合人乳头瘤病毒的E6蛋白的抗体;较佳地,所述的人乳头瘤病毒是18、16、33、52或58型。
在本发明的另一方面,提供所述的多肽的用途,用于制备单独或组合构建血清学诊断HPV18感染的多表位肽检测抗原。
在本发明的另一方面,提供前面所述的多肽的用途,用作在PCR扩增E6基因后依据它们的编码氨基酸序列用作判别HPV18、16、33、52或58型感染的表位标志物或参照物。
在本发明的另一方面,提供单克隆抗体C1P5的用途,用于制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒,其中,所述的人乳头瘤病毒是33型、52型或58型的病毒。
在本发明的另一方面,提供一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒,所述的人乳头瘤病毒是33型、52型或58型的病毒,所述试剂盒中包括单克隆抗体C1P5。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、HPV58-E6蛋白E6-2表位基序在高危型HPV同源蛋白中的保守性分析。方框中的HPH58型E6-2基序YGDTL,与HPV18-E6蛋白中相应序列具100%保守性。其他高危型HPV同源蛋白序列与之比对,存在同一位置的1个残基差异,但它们与截短GST188融合表达的八肽都能被抗重组HPV58-E6蛋白多抗识别。表位基序相似率依据方框内5个残基计算。
图2、HPV18-E6单抗C1P5可能识别表位基序的HPV同源蛋白序列比较确定。图中高危型HPV同源蛋白相似序列比对依据C1P5单抗识别HPV58-E6蛋白9个残基免疫印迹结果。方框内以HPV18序列为基准,仅1个残基差异的5个残基序列代表C1P5单抗可能识别的表位最大基序。
图3、短肽融合表达的SDS-PAGE分析(A)、用C1P5单抗的印迹鉴定(B)和反应性最小基序肽的列表图示(C)。其中,Lane 1为GST188蛋白阴性对照,Lanes 2~6,GST188-P2~P6融合蛋白(A)。印迹膜上箭头指示反应性短肽融合蛋白(B)。图C中各短肽前添加3个AAA残基,一是以方便合成短肽编码DNA片段的重组克隆,二是以排除GST188载体蛋白C端末BamH I限制酶位点产生两个残基对表位鉴定可能的干扰。
具体实施方式
本发明人经过广泛地研究,首次用市售C1P5单抗定位到了HPVE6蛋白序列上一特定的精细表位基序,所述的抗原表位在多种HPV亚型(包括:16、18、33、52或58型)病毒的E6蛋白中高保守性地存在。因此,利用含有该表位的多肽(本发明中还称为短肽或基序肽),可以制备抗HPV E6蛋白的免疫原(与其他表位组合构建多表位肽免疫原),或制备特异性抗HPV E6蛋白的抗体,所获得的免疫原或抗体可用于多种HPV亚型的防治和诊断。
术语
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“E6蛋白”是指存在于HPV的一种蛋白,本发明中,HPV16、HPV18、HPV33、HPV52和HPV58型的E6蛋白编码基因序列和蛋白质一级结构序列分别依据它们的标准株,它们的GenBank登录号依次分别为:NC_001526、NC_001357、EU918766、X74481和D90400。
如本文所用,所述的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用,抗体的“特异性”是指抗体能结合于特定亚型的HPV E6蛋白或片段。特别指那些能与特定亚型的HPV E6蛋白结合的抗体。
抗原表位及其用途
本发明人在研究过程中,分析了一株商品化的HPV18/E6单抗(C1P5单抗),以确定它是否识别HPV58/E6-2表位,进而确定此鼠单抗C1P5识别HPV18型E6/2表位的精细基序。分析过程中,本发明人出乎意料地发现,C1P5单抗能与重组HPV58型E6蛋白产生免疫印迹反应,但并不识别含YGDTL基序八肽。继而,采用独特策略开展相关表位鉴定研究,最终形成本发明的技术方案。
本发明人的预实验结果表明,HPV18-E6蛋白C1P5单抗可与重组HPV58-E6蛋白发生免疫印迹交叉反应,但不识别在同源蛋白具高度保守性的含HPV58型E6-2最小基序YGDTL(在同源蛋白中具高度保守性,图1))八肽融合蛋白。于是,用相互重叠的系列HPV58-E6蛋白15聚肽融合蛋白进行免疫印迹鉴定,结果表明C1P5单抗识别LRLLSKISEYRHYNY和ISEYRHYNYSLYGDT两个相互重叠9个残基的15聚肽,也就是说,该单抗识别基序落在9个残基的重叠区(ISEYRHYNY))内。再进一步比对HPV16、18和58型E6蛋白序列,如图2所示,C1P5单抗识别的最小基序又进一步被缩减至相互间仅1个残基差异的ELRHY五肽基序,因为若再向左或向左右延伸1个残基形成六肽基序,那么三个蛋白序列都显示2个残基差异,就不可能被C1P5单抗识别。最后,为了鉴定C1P5单抗可识别的表位最小基序,如图3所示,重新构建表达了HPV18型P2-P5四个和HPV16/18型P6一个短肽融合蛋白(图3A)),在免疫印迹试验中仅P5和P6短肽产生印反应性条带(图3B)),因此确定C1P5单抗识别HPV18-E6蛋白的表位最小基序为ELRHY五肽,而且是HPV18型特异的表位基序(图2),并证实了与HPV16/58型发生交叉反应的一个保守性EYRHY五肽序列(图3B和3C)。另外,通过同源蛋白序列比较,除了高危型HPV16和58型,发现HPV18型C1P5单抗还可与高危型HPV33和和HPV52型E6蛋白发生交叉反应,其序列中也存在与HPV16/58反应性五肽完全相同的保守性序列(图2)。
基于本发明人的新发现,提供了一个线性表位的最小基序肽,具有EXRHY所示的氨基酸序列;其中,X选自氨基酸L或Y;并且,所述的多肽来源于五种高危型HPV的E6蛋白。作为本发明的优选方式,所述的多肽具有SEQ ID NO:1(ELRHY)或SEQ ID NO:2(EYRHY)所示的氨基酸序列。
一旦获得了所述多肽的序列,就可以用重组法来大批量地获得该多肽融合蛋白。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列的融合蛋白。此外,对比本发明的短肽而言,优选的是采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列,人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的多肽。
本发明同时提供所鉴定的表位最小基序肽和其扩展肽在制备“通用”预防性/治疗性HPV重组多表位肽疫苗中的应用。
本发明所述的最小基序肽可作为E6蛋白的一种有效的抗原性的片段,用于制备特异性结合E6蛋白的通用型抗体,包括单克隆抗体或多克隆抗体。本发明所述的最小基序肽还可与其它肽或免疫学上可接受的载体(最好其本身没有免疫原性)连接,以用于作为免疫原制备抗体。
抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的本发明的多肽(或与其它肽或免疫学上可棘手的载体连接后)可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达本发明的多肽的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还提供了所述的最小基序肽的用途,用于鉴定样品中是否存在HPV18、16、33、52和58型的病毒。在获得了本发明的最小基序肽后,本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中最小基序肽序列的存在与否,采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术如PCR方法。
本发明也提供所述的表位最小基序肽和扩展短肽单独(如与GST188蛋白融合表达)或通过组合(构建重组多表位肽),制备用于血清学诊断高危型HPV18以及HPV16、33、52和58病毒感染抗体的检测抗原。
本发明还提供了可用于PCR扩增HPV-E6基因后,依据翻译蛋白质序列特异性地判别HPV16、33、52和58型四个高危型HPV病毒感染的表位标志物五肽氨基酸序列。
单克隆抗体C1P5的新用途
已有技术中,仅发现C1P5单抗能够识别HPV18-E6蛋白和HPV16-E6蛋白,而并不清楚C1P5单抗是否针对其它病毒亚型的E6蛋白也具有识别作用。而本发明意外地开拓了单克隆抗体C1P5的新用途。
因此,本发明进一步还提供了单克隆抗体C1P5的用途,用于制备检测HPV感染的试剂盒,其中,所述的新发现高危型HPV是33、52或58型的HPV病毒。
本发明可进一步通过下列实例描述。列举实例并不意味限制本发明所涉及的范围,该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著、黄培堂等翻译的第三版“分子克隆:实验室手册”(科学出版社,2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社,2002)中所述的步骤,或按照生产销售商建议的条件进行。
实施例1、用重组HPV18-E6蛋白C1P5株单抗的精细表位鉴定
一、材料
1.鼠抗重组HPV18-E6蛋白C1P5单抗[Banks L,Spence P,Androphy E,et al.Identification of human papillomavirus type 18 E6 polypeptide in cellsderived from human cervical carcinomas.J Gen Virol,68(Pt 5):1351-1359,1987]购自American Research Products(ARP)公司(商品号为12-6080A)。在免疫印迹实验中,其单抗使用浓度参照说明书中建议浓度。
2.HPV58-E6蛋白工程菌、跨越HPV58-E6蛋白全长序列相互重叠9个残基的系列15肽融合蛋白重组克隆获自上海市计划生育科学研究所(徐万祥等;人乳头瘤病毒58型E6蛋白的抗原表位最小基序肽;中国专利号:ZL 2009 10196693.5)。含E6-2表位YGDTL基序的8肽融合蛋白的构建见发明专利(徐万祥等.人乳头瘤病毒58-E6蛋白的抗原表位最小基序肽.中国专利号:ZL 2009 10196693.5)
3.大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌和专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的pXXGST-1和仅表达作为阴性对照截断GST188蛋白的pXXGST-2质粒,获自上海市计划生育科学研究所[Xu WX,et al.Minimal motif mapping of aknown epitope on human zona pellucida protein-4 using a peptide biosynthesisstrategy.J Reprod Immunol,81:9-16,2009]。
4.限制性内切酶BamH I、Sal I和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRaBiotechnology公司,氨苄青霉素(Amp)、预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗(IgG/HRP)和0.2μm硝酸纤维素膜购自上海生工生物技术服务公司。免疫印迹化学发光ECL检测试剂盒购自GE公司。
5.两端分别为BamH I和Sal I粘性末端,中间为P2~P6短肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段(依据HPV18基因组序列,GenBank登录号:NC_001357)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
6.高危型HPV16(GenBank登录号:NC_001526)、HPV18(GenBank登录号:NC_001357)、HPV33(GenBank登录号:EU918766)、HPV52(GenBank登录号:X74481)和HPV58型(GenBank登录号:D90400)E6蛋白序列信息均出自GenBank数据库。
二、用C1P5单抗的HPV18/E6蛋白精细表位鉴定
1、C1P5单抗识别的表位基序并非HPV58型E6-2表位
如图1所示,之前用兔抗重组HPV58-E6多抗鉴定的E6-2精细表位基序YGDLE,在用兔抗重组HPV18-E6多抗鉴定的长22个残基的E6/2表位肽(序列为:IDFYSRIRELRHYSDSVYGDTL(SEQ ID NO:3))末尾也存在(100%相同),在用鼠抗重组HPV16-E6多抗鉴定的长10个残基的E6/1表位肽末尾则显示D→T的1个残基差异(80%相似。见文献:Gao L,et al.Immune response to humanpapillomavirus type 16 E6 gene in a live vaccinia vector.J Gen Virol,75:157-164,1994),但其8肽序列也能被HPV58-E6多抗识别。因此最初推断同时能识别HPV16-E6的HPV18-E6单抗(C1P5株)或许也能识别HPV58/E6-2表位。因此,本发明人利用C1P5单抗以证实这一推断,并通过其识别最小基序鉴定探讨兔多抗和鼠单抗识别表位基序长短是否存在变化。于是,诱导表达HPV58-E6蛋白和含YGDTL基序8肽融合蛋白,完成SDS-PAGE后转硝酸纤维素膜,用C1P5单抗进行免疫印迹鉴定。
HPV58-E6蛋白和含YGDTL基序8肽融合蛋白序列为SLYGDTLE(SEQ IDNO:4)。
免疫印迹鉴定结果,C1P5单抗能识别HPV58-E6蛋白,但与含E6-2表位基序短肽无反应性。
2、C1P5单抗识别位点筛选
既然C1P5单抗可识别HPV58/E6蛋白,于是诱导表达跨越HPV58-E6蛋白全长(149aa)序列相互重叠9个残基的系列15聚肽(共23个,编号No.1~No.23,其中No.23为17聚肽)(融合蛋白)。完成SDS-PAGE后转硝酸纤维素膜,再次用C1P5单抗进行免疫印迹鉴定。
结果,C1P5单抗同时识别LRLLSKISEYRHYNY(SEQ ID NO:5)和ISEYRHYNYSLYGDT(SEQ ID NO:6)两个相邻互有9个残基重叠的15聚肽(融合蛋白),因此可确定该单抗识别的表位基序位于两个相邻15聚肽的9个残基的重叠区(ISEYRHYNY(SEQ ID NO:7))内。
3、序列分析以缩减C1P5单抗识别表位基序
为了简化鉴别C1P5单抗识别表位最小基序而需进行短肽生物合成的工作量,以上述免疫鉴定获知的9肽基序为基准,依据HPV16、18和58型E6蛋白序列公开信息进行同源蛋白序列比对。
结果如图2所示,C1P5单抗识别表位基序被缩减至EY(L)RHY 5肽,因为向其N端或C端延伸1个残基,都将出现两个残基差异。
4、免疫印迹验证5肽最小基序
因为单抗识别的表位基序往往比多抗识别的表位基序短1~2个残基,因此如图3C所示,以HPV18/E6蛋白序列ELRHY为基准,设计从其N端起逐一减去1个残基的4个短肽(N端分别增加3个丙氨酸残基,编号P2-P5),以及1个与HPV16/HPV58同源蛋白序列对应的P5短肽,和一个AAA-EYRHY短肽(P6)(SEQ ID NO:8)。基于所设计的短肽,分别依据如上所述公开HPV基因组信息设计它们的编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’;负链5’-端加5’-tcgactta,3’-端加g-3’),外送DNA化学合成。
将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20μmol/μl储存液(根据DNA合成报告单数据);各取10μl储存液和20 ddH2O于1.5 ml Eppendorf管中,94℃水浴加热5 min,自然降至室温后,在15μl反应体积中吸入2μl退火片段、1μl约200 ng/μl经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒(自带GST188编码序列)、1μl T4 DNA连接酶和其1.5μl缓冲液,连接过夜;连接液转化感受态BL21(DE3)宿主菌,涂布含Amp的LB平板上,于37℃培养过夜;第二天挑取在添加Amp的LB平板上长出的单克隆转接3 ml LB培养液诱导表达,以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照,各表达的GST188-短肽(P2-P6)融合蛋白经15%SDS-PAGE分析确认(与对照蛋白电泳迁移率相差约1个kDa),挑取各重组克隆外送进行DNA测序验证。
将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3 ml LB培养液中,于30℃振荡培养过夜,翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中,30℃振荡培养2~3 h至菌体浓度达到0.6~0.8 OD后,调高温度至42℃热诱导4 h,离心收集菌体,加上样裂解液煮沸5 min备用。
将诱导的细菌总蛋白样品同时走15%SDS-PAGE,电泳结束后,一块凝胶用考马斯亮蓝染色,二块凝胶进行硝酸纤维素膜电(100 mA)转移2 h,用丽春红染色转印迹膜2 min,在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记,用水冲洗掉丽春红染色。
印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次,用5%脱脂奶粉封闭过夜,PBS缓冲液洗涤四次,分别在8~10 ml反应液中加入1μl一抗C1P5单抗,室温反应2 h,PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗鼠IgG/HRP(1:2000稀释),室温反应1 h,用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色,依据免疫印迹结果确认P5和P6为反应性短肽(融合蛋白),确认C1P5单抗识别的最小基序为ELRHY,且与HPV16/HPV58同源蛋白保守性EYRHY 5肽存在交叉反应性。
5、分析C1P5单抗与其它HPV中同源蛋白的交叉反应性
最后以及GenBank信息库中高低危型HPV同源蛋白序列公开信息,经过序列比对(图2),确定C1P5单抗与高危型HPV33和HPV52同源蛋白也存在交叉反应性(因为它们的E6蛋白也存在EYRHY序列)。
本发明描述了HPV18-E6蛋白上一个可被C1P5单抗识别的线性抗原表位最小基序肽,它们既可以单独和/或被组合用作研制“通用”预防性/治疗性HPV多表位疫苗的候选B细胞表位,也能通过化学合成或融合表达或单独或被组合用作研制高危型HPV病毒感染血清抗体的多表位肽检测抗原的候选B细胞表位。此外,也描述了一个C1P5单抗交叉反应性五肽序列,它可单独或结合在高危型HPV-E6蛋白中都存在的HPV58型E6-2高保守性表位基序(YG-D/X-TL,其中X残基在HPV16中为T,33中为H,52中为K,和58中为D),用作PCR扩增HPV病毒E6蛋白基因或片段后判定感染高危HPV型(16,18,33,52和58)的参照肽序列。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。需要说明的是,有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的,即在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可对本发明的最小表位肽和其融合蛋白作各种变化改动。因此,所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
Claims (1)
1. 一种分离的多肽,其特征在于,所述的多肽由式(I)所示的氨基酸序列组成;
EXRHY (I);
其中,X选自氨基酸L或Y;
并且,所述的多肽来源于人乳头瘤病毒18型、16型、33型、52型或58型的E6蛋白。
2. 权利要求1所述的多肽的用途,用于制备抗人乳头瘤病毒E6蛋白的免疫原;所述的人乳头瘤病毒是18、16、33、52或58型。
3. 权利要求1所述的多肽的用途,用于制备可特异性结合人乳头瘤病毒的E6蛋白的抗体,所述的人乳头瘤病毒是18、16、33、52或58型。
4. 权利要求1所述的多肽的用途,用于制备单独或组合构建血清学诊断HPV18感染的多表位肽检测抗原。
5. 权利要求1所述的多肽的用途,用作在PCR扩增E6基因后依据它们的编码氨基酸序列用作判别HPV18、16、52、33或58型感染的表位标志物或参照物;所述的用途用于非诊断目的。
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