CN106957361A - Hpv的e6蛋白的特异性抗体及其应用 - Google Patents

Hpv的e6蛋白的特异性抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测样品中的至少一种HPV毒株的E6蛋白的抗体组合物。主题抗体可用于检测样品中的致癌HPV E6蛋白，并且该抗体在各种诊断和治疗应用、包括癌症的诊断和治疗方法中发现用途。还提供了用于执行主题方法并含有主题抗体的试剂盒。在本发明中还公开了与至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端特异性结合的抗体的产生方法。

Description

HPV的E6蛋白的特异性抗体及其应用
本申请是2010年04月20日提交的发明名称为“HPV的E6蛋白的特异性抗体及其应用”的第201080026191.9号(国际申请号PCT/US2010/001189)中国专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2009年4月20日提交的美国临时申请No.61/171,025、2009年4月20日提交的美国临时申请No.61/171,032、2009年4月20日提交的美国临时申请No.61/171,039、2009年5月4日提交的美国临时申请No.61/175,362和2009年5月4日提交的美国临时申请No.61/175,365的权益，上述每个临时申请在此以其全文引为参考。
发明背景
宫颈癌是在女性中第二常见的癌症诊断，并且在99.7％的情况下与高危人乳头瘤病毒感染相关。目前，每年在美国女性中诊断出12,000例新发扩散性宫颈癌，每年引起5,000人死亡。此外，全世界每年有约400,000例宫颈癌，近200,000人死亡。人乳头瘤病毒(HPV)是世界上性传播疾病的最常见病因之一。总的来说，50-75％的性行为活跃的男性和女性在其生命中的某些时间获得生殖器HPV感染。据估计，每年仅在美国就有估计550万人被HPV感染，至少2千万人目前已被感染。HPV有超过100种不同的分离株，已根据它们与宫颈癌或与良性宫颈病变或非典型增生的关联性被宽泛地再分成高危和低危亚型。
多条证据指出HPV感染是宫颈癌的病因。在1980年代进行的多个研究报告了在宫颈非典型增生、宫颈癌和源自宫颈癌的细胞系中存在HPV变体。进一步的研究证明来自致癌HPV 18的基因组的E6-E7区域选择性保留在宫颈癌细胞中，表明HPV感染可能是病因，并且E6-E7区域的持续表达是维持永生化或癌性状态所需要的。进一步研究证实，来自HPV 16的E6-E7基因足以使培养物中的人类角质细胞永生化。还证实了尽管来自高危HPV的E6-E7基因能够转化细胞系，但来自低危或非致癌变体例如HPV6和HPV 11的E6-E7区域不能转化人类角质细胞。在处于肿瘤发展各种阶段的623个宫颈组织样品中，通过原位杂交检查HPV 16和18感染并通过免疫细胞化学检测E6蛋白表达，在组织学异常与HPV感染之间发现了显著关联性。
对于致癌HPV感染的早期和准确诊断，以及针对病因性HPV感染的治疗、通过在疾病发展期间尽早干预来阻止宫颈癌发生，存在着明显未满足的需求。到目前为止已表征的人乳头瘤病毒所涉及的病变，局限于皮肤的上皮层或口腔、咽、呼吸系统以及最重要的肛殖黏膜上。特定类型的人乳头瘤病毒包括HPV 6和11，常常引起良性黏膜病变，而其他类型例如HPV 16、18以及许多其他毒株，主要在高等级病变和癌症中发现。感染黏膜表面的各种类型的人乳头瘤病毒(HPV)，已被暗示是宫颈、乳腺(Yu等，(1999)Anticancer Res.19：55555057-5061；Liu等，(2001)J.Hum.Virol.44：329-334)、肛门、阴茎、前列腺(DeVilliers等，(1989)Virology171：248：253)、喉和口腔、扁桃体(Snijders等，(1994)J.Gen.Virol.75(Pt10)：2769-2775)、鼻通道(Trujillo等，(1996)Virus Genes 12：165-178；Wu等，(1993)Lancet 341：522-524)、皮肤(Trenfield等，(1993)Australas.J.Dermatol.34：71-78)、膀胱(Baithun等，(1998)Cancer Surv.31：17-27)的癌症、头颈部鳞状细胞癌(Braakhuis等，(2004)J.Natl.Cancer Inst.96：978-980)、偶发性甲周癌以及良性肛门和生殖器疣的病原体。特定HPV类型的鉴定，被用于鉴定存在发展成恶性肿瘤的风险的具有恶变前病变的对象。尽管在被人乳头瘤病毒感染的一些人中存在可见的肛门生殖器病变，但大部分具有HPV生殖道感染的个体没有临床明显的疾病，但宫颈涂片中呈现的细胞形态学特征分析可用于检测HPV感染。帕帕尼科拉乌(Papanicolaou)试验是有价值的筛选工具，但是由于遗憾的假阳性和假阴性试验结果，它们会错过大比例的HPV感染的人。此外，它们不适合世界范围的测试，因为结果的解读需要训练有素的病理学家。
HPV感染也与Netherton综合征(Weber等，(2001)Br.J.Dermatol.144：1044-1049)和疣状表皮发育不良(Rubaie等，(1998)Int.J.Dermatol.37：766-771)相关。HPV也能由母亲传播到胎儿(Smith等，(2004)Sex.Transm.Dis.31：57-62；Xu等，(1998)Chin.Med.Sci.J.13：29-31；Cason等，(1998)Intervirology 41：213-218)。
疾病的检测和诊断是疾病治疗的先决条件。已经鉴定到大量疾病标志物和特征，许多被用于疾病诊断。许多疾病以受影响细胞的状态变化为先导或为特征。变化可以包括被感染细胞中病原体或蛋白的表达、受影响细胞中基因或蛋白的表达模式变化以及细胞形态的变化。通过准确评估这些变化，可以协助疾病的检测、诊断和监测。廉价、快速、早期和准确检测病原体，允许对效应范围从使人不适到致死的疾病进行治疗和预防。
文献
重要文献包括下列参考文献：Zozulya等，(Genome Biology2：0018.1-0018.12，2001)；Mombairts(Annu.Rev.Neurosci 22：487-509，1999)；Raming等，(Nature 361：353-356，1993)；Belluscio等，(Neuron20：69-81，1988)；Ronnet等，(Annu.Rev.Physiol.64：189-222，2002)；Lu等，(Traffic 4：416-533，2003)；Buck(Cell 100：611-618，2000)；Malnic等，(Cell 96：713-723，1999)；Firestein(Nature 413：211-218，2001)；Zhao等，(Science 279：237-242，1998)；Touhara等，(Proc.Natl.Acad.Sci.96：4040-4045，1999)；Sklar等，(J.Biol.Chem261：15538-15543，1986)；Dryer等，(TiPS 20∶413-417，1999)；Ivic等，(J Neurobiol.50：56-68，2002)；Munger(2002)Front.Biosci.7：d641-9；Glaunsinger(2000)Oncogene 19：5270-80；Gardiol(1999)Oncogene 18：5487-96；Pim(1999)Oncogene18：7403-8；Meschede(1998)J.Clin.Microbiol.36：475-80；Kiyono(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：11612-6；和Lee(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：6670-5；Banks(1987)J.Gen.Virol.68：1351-1359；Fuchs等，(Hum.Genet.108：1-13，2001)；和Giovane等，(1999)Journal of Molecular Recognition 12：141-152，和已公布的美国专利申请20030143679和20030105285；以及美国专利6,610,511、6,492,143、6,410,249、6,322,794、6,344,314、5,415,995、5753233、5,876,723、5,648,459、6,391,539、5,665,535和4,777,239。
发明概述
一方面，本发明提供了与至少两种人乳头瘤病毒(HPV)毒株的致癌E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合的抗体，其具有检测至少两种HPV毒株的E6蛋白的增强的结合亲和性和灵敏度。在一些实施方案中，抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。抗体也能与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73或82或其组合的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体与样品中的E6蛋白特异性结合。样品可以是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。样品也可以是组织学样品。在一些实施方案中，抗体结合E6蛋白的结合亲和性小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M或小于10-12M。在一些实施方案中，抗体检测E6蛋白的灵敏度增加。在一些实施方案中，抗体是单克隆的。抗体也可以被标记。在一些实施方案中，抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。在一些实施方案中，抗体被用作宫颈癌检验的一部分。本发明还提供了用于检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的试剂盒，其包含本文公开的主题抗体。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于检测抗体的试剂。检测可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行。
另一方面，本发明提供了检测样品中至少两种HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含：将与至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合的抗体与样品相接触；以及检测抗体与样品中的E6蛋白的任何结合；其中抗体与样品中E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株；并且其中抗体与E6蛋白的结合亲和性被增加。在主题方法的一些实施方案中，抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。抗体可以与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73或82或其组合的E6蛋白特异性结合。在主题方法的一些实施方案中，样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。样品可以是组织学样品。在一些实施方案中，样品来自人类。在一些实施方案中，抗体结合E6蛋白的结合亲和性小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M或小于10-12M。在主题方法的一些实施方案中，抗体检测E6蛋白的灵敏度增加。抗体可以是单克隆的或被标记。在一些实施方案中，抗体被用作宫颈癌检验的一部分。在一些实施方案中，抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。在一些实施方案中，抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作捕获抗体，以捕获E6蛋白。
在一些实施方案中，主题方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其包含：将所述抗体与样品相接触；将结合于主题抗体的E6蛋白与另一种E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于主题抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；以及检测E6结合配偶体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。在一些实施方案中，抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作检测抗体，以检测与特异性针对E6蛋白的E6结合配偶体结合的E6蛋白。在一些实施方案中，方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其包含：将样品与E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于主题抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；将结合于E6结合配偶体的E6蛋白与主题抗体相接触；以及检测主题抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。在一些实施方案中，E6蛋白的检测通过选自酶免疫测定法(EIA)、拉曼(Ramon)光谱术、侧向流、和流式微球阵列(CBA)的基于免疫学的测定法进行。在一些实施方案中，抗体被固定化。在一些实施方案中，E6结合配偶体被固定化。在一些实施方案中，E6结合配偶体是含PDZ结构域的多肽。E6结合配偶体可以是特异性针对E6蛋白的抗体。在一些实施方案中，该抗体与特异性结合E6蛋白的C-端区域的抗体组合使用，用于检测E6蛋白。在一些实施方案中，该抗体与结合E6蛋白的C-端区域的含PDZ结构域的多肽组合使用，用于检测E6蛋白。
另一方面，本发明提供了与样品中至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)结合的抗体的产生方法，所述方法包含：(a)用具有与E6蛋白的N-端序列融合的T细胞表位序列的肽免疫接种动物；(b)从被免疫动物获得B淋巴细胞；(c)将从被免疫动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；以及(d)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种HPV毒株的E6蛋白的N-端特异性结合的抗体。在一些实施方案中，T细胞表位氨基酸序列是F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R。在一些实施方案中，免疫接种肽是HPV-16 E6蛋白中存在的共有肽。在一些实施方案中，免疫接种肽是HPV-18 E6蛋白中存在的共有肽。在一些实施方案中，免疫接种肽含有氨基酸序列F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L或F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L。在一些实施方案中，方法还包含对分泌致癌E6蛋白N-端的特异性抗体的杂交瘤细胞进行克隆。在一些实施方案中，方法还包含对与致癌E6蛋白的N-端特异性结合的抗体进行纯化。在主题方法的一些实施方案中，所述抗体是单克隆的。在一些实施方案中，所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73或82或其组合的E6蛋白特异性结合。在主题方法的一些实施方案中，样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液或组织学样品。在一些实施方案中，抗体被用作宫颈癌的诊断或治疗药剂。在一些实施方案中，抗体结合E6蛋白的结合亲和性小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M或小于10-12M。在一些实施方案中，抗体检测E6蛋白灵敏度提高。
具体而言，本发明涉及：
1.一种抗体，所述抗体与至少两种人乳头瘤病毒(HPV)株的致癌E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合，对于至少两种HPV毒株的E6蛋白具有增强的结合亲和性和检测灵敏度。
2.段1的抗体，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
3.段1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
4.段1的抗体，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
5.段1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
6.段1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
7.段1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
8.段1的抗体，其中所述抗体与样品中的E6蛋白特异性结合。
9.段8的抗体，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
10.段8的抗体，其中样品是组织学样品。
11.段1的抗体，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
12.段1的抗体，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
13.段1的抗体，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
14.段1的抗体，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和性结合E6蛋白。
15.段1的抗体，其中所述抗体以小于10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
16.段1的抗体，其中所述抗体以增加的灵敏度检测E6蛋白。
17.段1的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
18.段1的抗体，其中所述抗体被标记。
19.段1的抗体，其中所述抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
20.段1的抗体，其中所述抗体被用作宫颈癌检验的一部分。
21.一种用于检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含段1的抗体。
22.段21的试剂盒，其还包含用于检测所述抗体的试剂。
23.段21的试剂盒，其中检测通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行。
24.一种检测样品中至少两种HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含
(a)将与至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合的抗体与样品相接触；以及
(b)检测抗体与样品中E6蛋白的任何结合；
其中抗体与样品中E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株；并且其中抗体与E6蛋白的结合亲和性增加。
25.段24的方法，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
26.段24的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
27.段24的方法，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
28.段24的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
29.段24的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
30.段24的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
31.段24的方法，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
32.段24的方法，其中样品是组织学样品。
33.段24的方法，其中样品来自于人类。
34.段24的方法，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
35.段24的方法，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
36.段24的方法，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
37.段24的方法，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和性结合E6蛋白。
38.段24的方法，其中所述抗体以小于10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
39.段24的方法，其中所述抗体以增加的灵敏度检测E6蛋白。
40.段24的方法，其中所述抗体是单克隆的。
41.段24的方法，其中所述抗体被标记。
42.段24的方法，其中所述抗体被用作宫颈癌检验的一部分。
43.段24的方法，其中所述抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
44.段24的方法，其中所述抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作捕获抗体，以捕获E6蛋白。
45.段24的方法，其中所述方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，所述方法包含：
(a)将段1的抗体与样品相接触；
(b)将结合于段1的抗体的E6蛋白与另一种E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于段1的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；以及
(c)检测E6结合配偶体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。
46.段24的方法，其中所述抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作检测抗体，以检测与对E6蛋白特异性的E6结合配偶体结合的E6蛋白。
47.段24的方法，其中所述方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，所述方法包含：
(a)将样品与E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于段1的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；
(b)将结合于E6结合配偶体的E6蛋白与段1的抗体相接触；以及
(c)检测段1的抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。
48.段24的方法，其中E6蛋白的检测通过选自酶免疫测定法(EIA)、拉曼光谱术、侧向流、和流式微球阵列(CBA)的基于免疫学的测定法来进行。
49.段24的方法，其中所述抗体被固定化。
50.段45或47的方法，其中E6结合配偶体被固定化。
51.段45或47的方法，其中E6结合配偶体是含PDZ结构域的多肽。
52.段45或47的方法，其中E6结合配偶体是特异性针对E6蛋白的抗体。
53.段24的方法，其中所述抗体与特异性结合E6蛋白的C-端区域的抗体组合使用，用于检测E6蛋白。
54.段24的方法，其中所述抗体与结合E6蛋白的C-端区域的含PDZ结构域的多肽组合使用，用于检测E6蛋白。
55.一种产生与样品中至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)结合的抗体的方法，所述方法包含：
(a)用具有与E6蛋白的N-端序列融合的T细胞表位序列的肽免疫接种动物；
(b)从被免疫的动物获得B淋巴细胞；
(c)将从被免疫的动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；
(d)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种HPV毒株的E6蛋白的N-端特异性结合的抗体。
56.段55的方法，其中T细胞表位的氨基酸序列是F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R。
57.段55的方法，其中免疫接种肽是HPV-16 E6蛋白中存在的共有肽。
58.段55的方法，其中免疫接种肽是HPV-18 E6蛋白中存在的共有肽。
59.段55的方法，其中免疫接种肽步骤含有氨基酸序列F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L。
60.段55的方法，其中免疫接种肽步骤含有氨基酸序列F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L。
61.段55的方法，其还包含克隆分泌特异性针对致癌E6蛋白的N-端的抗体的杂交瘤细胞。
62.段55的方法，其还包含对与致癌E6蛋白的N-端特异性结合的抗体进行纯化。
63.段55的方法，其中所述抗体是单克隆的。
64.段55的方法，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
65.段55的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
66.段55的方法，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
67.段55的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
68.段55的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
69.段55的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
70.段55的方法，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
71.段55的方法，其中样品是组织学样品。
72.段55的方法，其中所述抗体被用作宫颈癌的诊断或治疗药剂。
73.段55的方法，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
74.段55的方法，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
75.段55的方法，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
76.段55的方法，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和性结合E6蛋白。
77段55的方法，其中所述抗体以小于10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
78.段55的方法，其中所述抗体以更高的灵敏度检测E6蛋白。
79.一种抗体，所述抗体与至少两种人乳头瘤病毒(HPV)株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合。
80.段79的抗体，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
81.段79的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
82.段79的抗体，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
83.段79的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
84.段79的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
85.段79的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
86.段79的抗体，其中所述抗体与样品中的E6蛋白特异性结合。
87.段86的抗体，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
88.段86的抗体，其中样品是组织学样品。
89.段79的抗体，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
90.段79的抗体，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
91.段79的抗体，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
92.段79的抗体，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和结合E6蛋白性。
93.段79的抗体，其中所述抗体以小于10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
94.段79的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
95.段79的抗体，其中所述抗体被标记。
96.段79的抗体，其中所述抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
97.段79的抗体，其中所述抗体被用作宫颈癌检验的一部分。
98.一种用于检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含段79的抗体。
99.段98的试剂盒，其还包含用于检测所述抗体的试剂。
100.段98的试剂盒，其中检测通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来进行。
101.一种检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含：
(a)将与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合的抗体与样品相接触；以及
(b)检测所述抗体与样品中E6蛋白的任何结合；
其中所述抗体与样品中E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种致癌HPV毒株。
102.段101的方法，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
103.段101的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
104.段101的方法，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
105.段101的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
106.段101的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
107.段101的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
108.段101的方法，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
109.段101的方法，其中样品是组织学样品。
110.段101的方法，其中样品来自于人类。
111.段101的方法，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
112.段101的方法，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
113.段101的方法，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
114.段101的方法，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和性结合E6蛋白。
115.段101的方法，其中所述抗体以小于10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
116.段101的方法，其中所述抗体是单克隆的。
117.段101的方法，其中所述抗体被标记。
118.段101的方法，其中所述抗体被用作宫颈癌检验的一部分。
119.段101的方法，其中所述抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
120.段101的方法，其中所述抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作捕获E6蛋白的抗体。
121.段101的方法，其中所述方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，所述方法包含：
(e)将段1的抗体与样品相接触；
(f)将结合于段1的抗体的E6蛋白与第二抗体相接触，所述第二抗体在不同于段1的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；以及
(g)检测第二抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。
122.段101的方法，其中所述抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作检测抗体，以检测结合于另一种抗E6结合配偶体的E6蛋白。
123.段101的方法，其中所述方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，所述方法包含：
(h)将样品与抗体相接触，所述抗体在不同于段1的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；
(i)将结合于所述抗体的E6蛋白与段1的抗体相接触；以及
(j)检测段1的抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。
124.段101的方法，其中E6蛋白的检测通过选自酶免疫测定法(EIA)、拉曼光谱术、侧向流、和流式微球阵列(CBA)的基于免疫学的测定法来进行。
125.一种产生与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)结合的抗体的方法，所述方法包含：
(k)用与致癌E6蛋白的C-端序列融合的T细胞表位序列免疫接种动物；
(1)从被免疫的动物获得B淋巴细胞；
(m)将从被免疫的动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；
(n)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种致癌HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性结合的抗体。
126.段125的方法，其中T细胞表位氨基酸序列是F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R。
127.段125的方法，其中在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有PDZ结构域结合基序。
128.段125的方法，其中在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有保守氨基酸基序E-(T/S)-x-(V/L)。
129.段125的方法，其中在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有氨基酸序列E-T-Q-L。
130.段125的方法，其中在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有氨基酸序列E-T-Q-V。
131.段125的方法，其还包含克隆分泌特异性针对致癌E6蛋白的C-端的抗体的杂交瘤细胞。
132.段125的方法，其还包含对特异性结合致癌E6蛋白的C-端的抗体进行纯化。
133.段125的方法，其中所述抗体是单克隆的。
134.段125的方法，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
135.段125的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
136.段125的方法，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
137.段125的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
138.段125的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
139.段125的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
140.段125的方法，其中所述抗体检测样品中的E6蛋白。
141.段140的方法，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
142.段140的方法，其中样品是组织学样品。
143.段125的方法，其中所述抗体被用作宫颈癌的诊断或治疗药剂。
144.段125的方法，其中所述抗体以小于10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
145.一种阻断致癌E6蛋白与E6蛋白结合配偶体的结合的方法，所述方法包含：
(o)将E6蛋白与特异性结合至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)的抗体相接触；
(p)将E6蛋白与E6结合配偶体相接触；
(q)检测E6蛋白与E6蛋白结合配偶体之间结合的抑制。
146.段145的方法，其中E6结合配偶体是含PDZ结构域的多肽。
147.段145的方法，其中E6结合配偶体是MAGI-1。
148.段145的方法，其中E6结合配偶体是p53、E6-AP或E6-BP。
149.段145的方法，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
150.段145的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
151.段145的方法，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
152.段145的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
153.段145的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
154.段145的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
155.段145的方法，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
156.段145的方法，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
157.段145的方法，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
158.段145的方法，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和性结合E6蛋白。
159.段145的方法，其中所述抗体以小于10-12M的结合亲和性结合E6蛋白。
160.段145的方法，其中所述抗体是单克隆的。
161.段145的方法，其中所述抗体被标记。
162.段145的方法，其中E6蛋白同时与E6蛋白结合配偶体和特异性针对E6的C-端的抗体相接触。
段145的方法，其中E6蛋白在与特异性针对E6的C-端的抗体接触后，与E6蛋白结合配偶体相接触。
163.一种用于检测样品中至少一种HPV毒株的E6蛋白的抗体组合物，所述组合物包含第一抗体和第二抗体，其中第一抗体与样品中HPV毒株的E6蛋白结合，并且第二抗体特异性结合被第一抗体结合的E6蛋白，并且其中第二抗体是用于检测样品中E6蛋白的信号产生系统的一部分。
164.段163的抗体组合物，其中HPV毒株是致癌HPV毒株。
165.段163的抗体组合物，其中HPV毒株是非致癌HPV毒株。
166.段163的抗体组合物，其中HPV毒株选自HPV毒株16、18、26、30、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、73和82。
167.段163的抗体组合物，其中HPV毒株是HPV-6或HPV-11。
168.段163的抗体组合物，其中第一抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52或58的E6蛋白特异性结合。
169.段163的抗体组合物，其中第二抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52或58的E6蛋白特异性结合。
170.段163的抗体组合物，其中第一和第二抗体与一种以上HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
171.段163的抗体组合物，其中第一和第二抗体与HPV-16、HPV-18、HPV-45或其组合的E6蛋白结合。
172.段163的抗体组合物，其中所述抗体检测样品中至少一种致癌HPV毒株的存在。
173.段163的抗体组合物，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
174.段163的抗体组合物，其中第一和第二抗体检测一种以上致癌HPV毒株的存在，所述致癌HPV毒株选自HPV毒株16、18、31、33、45、52和58。
175.段163的抗体组合物，其中第一和第二抗体是单克隆的。
176.段163的抗体组合物，其中第一抗体与E6蛋白的N-端结合，和第二抗体与E6蛋白的C-端结合。
177.段163的抗体组合物，其中第一抗体与E6蛋白的C-端结合，和第二抗体与E6蛋白的N-端结合。
178.段163的抗体组合物，其中第二抗体被标记。
179.段163的抗体组合物，其中第二抗体与酶偶联。
180.段163的抗体组合物，其还包含第三抗体，所述第三抗体与结合于E6蛋白的第二抗体结合，用于检测E6蛋白。
181.段180的抗体组合物，其中第三抗体与产生信号的分子偶联，所述信号指示抗体与样品中的E6蛋白结合。
182.段180的抗体组合物，其中第三抗体与酶偶联。
183.段163的抗体组合物，其中所述组合物被用作宫颈癌检验的一部分。
184.段163的抗体组合物，其中检测通过夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)来进行。
185.段163的抗体组合物，其中与使用含PDZ结构域的多肽检测样品中的致癌E6蛋白相比，所述抗体组合物提高检测致癌E6蛋白的信噪比。
186.段163的抗体组合物，其中抗体组合物能以低假阳性率检测样品中的致癌E6蛋白。
187.段186的抗体组合物，其中假阳性率低于1.7％。
188.段163的抗体组合物，其中E6蛋白或E6蛋白的一部分在与捕获抗体接触之前与检测抗体结合。
189.段163的抗体组合物，其中识别E6蛋白不同表位的两种或更多种抗体被用于E6蛋白的捕获和/或检测。
190.一种用于检测样品中的至少一种HPV毒株的诊断试剂盒，所述试剂盒包含段163的抗体组合物。
191.段190的诊断试剂盒，其中所述试剂盒检测一种致癌HPV毒株的E6蛋白。
192.段190的诊断试剂盒，其中所述试剂盒检测一种以上致癌HPV毒株的E6蛋白。
193.段190的诊断试剂盒，其中所述试剂盒检测HPV-16、HPV-18、HPV-45或其组合的E6蛋白。
194.段190的诊断试剂盒，其还包含测试条，在该测试条上第一和第二抗体与至少一种致癌HPV毒株的E6蛋白结合。
195.段190的诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测与E6蛋白结合的第二抗体的试剂。
196.一种用于检测样品中至少一种HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含：
(a)将与至少一种HPV毒株的E6蛋白特异性结合的第一抗体与样品相接触；
(b)将结合于第一抗体的E6蛋白与特异性结合至少一种HPV毒株的E6蛋白的第二抗体相接触；以及
(c)检测第二抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中的E6蛋白；
其中第二抗体与E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株。
197.段196的方法，其中所述HPV毒株是致癌HPV毒株。
198.段196的方法，其中所述HPV毒株是非致癌HPV毒株。
199.段196的方法，其中所述HPV毒株选自HPV毒株16、18、26、30、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、73和82。
200.段196的方法，其中所述HPV毒株是HPV-6或HPV-11。
201.段196的方法，其中第一抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52或58的E6蛋白特异性结合。
202.段196的方法，其中第二抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52或58的E6蛋白特异性结合。
203.段196的方法，其中第一和第二抗体与一种以上HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
204.段196的方法，其中第一和第二抗体与HPV-16、HPV-18、HPV-45或其组合的E6蛋白结合。
205.段196的方法，其中所述抗体检测样品中至少一种HPV毒株的存在。
206.段196的方法，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
207.段196的方法，其中第一和第二抗体检测选自HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的一种以上HPV毒株的存在。
208.段196的方法，其中第一和第二抗体是单克隆的。
209.段196的方法，其中第一抗体与E6蛋白的N-端结合，和第二抗体与E6蛋白的C-端结合。
210.段196的方法，其中第一抗体与E6蛋白的C-端结合，和第二抗体与E6蛋白的N-端结合。
211.段196的方法，其中第二抗体被标记。
212.段196的方法，其中第二抗体与酶偶联。
213.段196的方法，其还包含将结合于E6蛋白的第二抗体与第三抗体相接触，所述第三抗体与第二抗体结合，用于检测被结合的E6蛋白。
214.段213的方法，其中第三抗体与产生信号的分子偶联，所述信号指示抗体与样品中E6蛋白的结合。
215.段213的方法，其中第三抗体与酶偶联。
216.段196的方法，其中所述方法被用作宫颈癌检验的一部分。
217.段196的方法，其中检测通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行。
218.段196的方法，其中与使用含PDZ结构域的多肽检测样品中致癌E6蛋白相比，所述方法提高检测致癌E6蛋白的信噪比。
219.段196的方法，其中与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，所述方法具有检测致癌HPV E6蛋白的更高特异性。
220.段196的方法，其中与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，所述方法具有检测致癌HPV E6蛋白的更高灵敏度。
221.段196的方法，其中与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，所述方法错误地检出致癌HPV E6蛋白的假阳性率更低。
222.段221的方法，其中假阳性率低于1.7％。
223.段196的方法，其中E6蛋白或E6蛋白的一部分在与捕获抗体接触之前与检测抗体结合。
224.段196的方法，其中识别E6蛋白不同表位的两种或更多种抗体被用于E6蛋白的捕获和/或检测。
225.段196的方法，其中特异性针对不同HPV毒株的E6蛋白的抗体位于基材上的相同物理位置中，用于捕获样品中的E6蛋白。
226.一种用于改善HPV疾病的方法，所述方法包含向需要的对象给药有效量的与HPV E6蛋白特异性结合的抗体。
227.段226的方法，其中所述抗体与E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合。
228.段227的方法，其中所述抗体与样品中至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合。
229.段227的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
230.段227的方法，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
231.段227的方法，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
232.段227的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
233.段227的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
234.段227的方法，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
235.段227的方法，其中所述抗体以小于10-8M的结合亲和性结合E6蛋白。
236.段227的方法，其中所述抗体以小于10-9M的结合亲和性结合E6蛋白。
237.段227的方法，其中所述抗体以小于10-10M的结合亲和性结合E6蛋白。
238.段227的方法，其中所述抗体以小于10-11M的结合亲和性结合E6蛋白。
239.段227的方法，其中所述以小于10-12M的结合亲和性抗体结合E6蛋白。
240.段227的方法，其中所述抗体是单克隆的。
参考引用
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利中清在此引为参考，其程度等同于各个出版物、专利或专利申请被具体和各被指明引为参考。
附图简述
在随附的权利要求书中详细说明了本发明的新特点。通过参考下面阐述的利用了本发明的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，可以获得对本发明的特点和优点的更好理解，在附图中：
图1a和1b显示了紧密模拟高危HPV序列的肽抗原，其用于产生针对至少两种高危HPV毒株的E6蛋白的N-端区域的抗体。黑点表示所有致癌毒株中的残基，灰点表示仅具有保守差异的位置。在图1a和1b中显示的两个共有肽序列之间的差异用条带突出。
图2显示了在ELISA中共有肽抗体对HPV E6类型的交叉反应性。将重组HPV E6蛋白纯化并直接包被到微量滴定板上(灰色条)，或用含PDZ结构域的蛋白捕获(黑色条)。将针对共有肽的第一抗体稀释至1μg/ml并加到孔中。通过加入山羊抗小鼠IgG：HRP第二抗体然后加入底物TMB来检测结合。通过用测试孔的OD450除以不含共有肽抗体的孔的OD450来计算信噪(S/N)比。在抗体之间交叉反应性情况变化极大。克隆6H5.3表现出单特异性结合，而克隆4E9.7在直接ELISA格式中具有结合8种HPV E6类型的能力。
图3显示了在Western印迹中共有肽抗体对HPV E6类型的交叉反应性。将重组HPVE6蛋白通过SDS-PAGE分离。将Western斑点用在阻断缓冲液中稀释至1μg/ml的共有肽抗体探测。使用山羊抗小鼠IgG：AP来检测结合。抗体交叉反应性情况的范围从单一类型特异性至5种或更多HPV类型。没有观察到对低危HPV类型6b和11的交叉反应性。
图4显示了重组HPV16 E6被共有肽抗体免疫沉淀。将抗体与蛋白-G Dynabead相连，并与1μg带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组HPV-16E6(～60kDa)温育。在清洗后，通过SDS-PAGE分离免疫复合物，然后用HPV-16 E6特异性小鼠抗体进行Western印迹。使用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠轻链特异性抗体检测免疫沉淀的HPV16 E6：MBP。小鼠Ig轻链被标为“LC”。克隆4E9.7能够免疫沉淀可检测水平的HPV16 E6：MBP。
图5显示了使用共有肽捕获抗体通过夹心ELISA检测来自SiHa细胞裂解液的HPV-16 E6。将HPV-16阳性SiHa细胞在RIPA缓冲液中裂解，并按照细胞当量施加到微量滴定板(黑色圆圈)。使用共有肽抗体4E9.7作为捕获抗体和HPV-16 E6特异性单克隆检测抗体。HPV阴性C33A-细胞系裂解液(灰色正方形)的制备同样。从少于5,000个SiHa细胞当量检测到HPV-16 E6。
图6显示了用HPV肿瘤肽和抗HIS单克隆抗体探测的Western印迹，证实了本发明的抗体对HPV E6肿瘤肽的特异性。
图7显示了通过ELISA和Western印迹进行的抗HPV 16和18 E6单克隆抗体的表征。使用T细胞表位-6聚体肽进行脾内免疫接种和CD40激动剂处理，产生了5聚体(RRETQ)-特异性Mab。该Mab(2H9.15)被高度特异性地表位作图于来自HPV 16和HPV 18的致癌E6蛋白的C-端。2H9.15具有作为检测HPV类型16和18两者的泛抗体的潜在用途。
图8显示了通过用C-端HPV E6肿瘤肽抗体竞争性阻断来抑制HPV E6与MAGI-1PDZ结合结构域的结合。
图9显示了夹心ELISA配对。使用各种抗HPV E6捕获抗体来开发检测HPV16 E6蛋白的夹心ELISA测定法。将抗体文库(捕获C1、C2和C3MAb)与HPV肿瘤肽PDZ抗体相组合，鉴定到捕获/检测抗体对。
图10显示了用于在癌细胞系中检测HPV E6的免疫细胞化学(ICC)。在ICC中，MAb对表达HPV E6的SiHa和HeLa细胞染色，但是不染色HPV阴性细胞系C-33A。显示的是用MAb1A9.1进行的染色。
图11是示意图，显示了通过抗E6抗体夹心测定法检测E6蛋白与使用PDZ肽捕获E6的比较。
图12显示了HPV16单重检测。对于HPV16-E6来说，与E6的PDZ肽捕获相比，抗E6抗体夹心测定法产生了提高的信号与背景比和使用单个宫颈拭子样品时降低的衰减。
图13显示了在阴性宫颈拭子样品(NCLS)中的HPV16单重检测：抗E6mAb夹心检测与E6的PDZ肽捕获的比较。
图14显示了使用抗E6mAb夹心测定法与E6的PDZ肽捕获相比的HPV18举重检测。结果显示，对于HPV18-E6来说，抗体捕获产生了明显提高的信号与背景比。
图15显示了在存在宫颈拭子材料的情况下进行的HPV45单重检测。与E6的PDZ肽捕获相比，抗E6抗体夹心测定法产生了提高的信号与背景比。没有观察到NCLS特异性的衰减。
图16是示意图，显示了在测试条上检测来自多种HPV毒株的E6。通过HPV类型特异性抗E6mAb夹心检测捕获E6允许对E6进行分型。
图17显示了通过双线测试条进行的HPV16+HPV18多路检测。通过HPV毒株特异性mAb进行的E6捕获允许对E6进行分型，并且HPV16/18抗体检测混合物与单重检测相比没有产生更高背景或信号降低。
图18显示了在阴性宫颈拭子样品(NCLS)中通过双线测试条进行的HPV16+HPV18多路检测。
图19显示了使用双线测试条进行的HPV16/18-E6检测。结果显示，在60位个体的HPV阴性宫颈拭子样品(NCLS)上没有HPV16/18假阳性，表明使用抗E6抗体夹心条测试法的假阳性率低。
图20显示了使用三线测试条进行的HPV16/18/45-E6检测。结果显示，来自三种不同HPV毒株的E6蛋白可以作为三条不同的线在一个测试条上同时检测。
发明详述
在整个本申请中，引用了各种出版物、专利和已公开的专利申请。这些在本申请中引用的出版物、专利和已公开的专利申请的公开内容，在本公开中以其全文引为参考。在本文中由本申请人对出版物、专利和已公开的专利申请做出的引用，并不表示本申请人承认所述出版物、专利或已公开的专利申请是现有技术。
一方面，本发明提供了与至少两种人乳头瘤病毒(HPV)毒株的致癌E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株、例如HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株、例如HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与至少一种HPV毒株、优选2、3、4、5、6、7、8、9、10种或以上HPV毒株的E6蛋白结合，其结合亲和性小于10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆的。所述抗体也可以被标记。在一些实施方案中，所述抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
另一方面，本发明提供了检测样品中至少两种HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含：将与至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合的抗体与样品相接触；以及检测所述抗体与样品中的E6蛋白的任何结合。在大多数实施方案中，抗体与样品中E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株。样品可以是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。样品也可以是组织学样品。在一些实施方案中，抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作捕获抗体，以捕获E6蛋白。在这种情况下，本发明的方法可以是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其包含：将本发明的抗体与样品相接触；将结合于主题抗体的E6蛋白与另一种E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于本发明的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；以及检测E6结合配偶体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。在其他实施方案中，所述抗体在ELISA中用作检测抗体，以检测与特异性针对E6蛋白的固定化E6结合配偶体结合的E6蛋白。例如，本发明的方法可以是ELISA，其包含：将样品与固定化的E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于本发明的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；将结合于固定化E6结合配偶体的E6蛋白与本发明的抗体相接触；以及检测主题抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。
另一方面，本发明提供了与样品中至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)结合的抗体的产生方法，所述方法包含：(a)用具有与致癌E6蛋白的C-端序列融合的T细胞表位序列的肽免疫接种动物；(b)从被免疫动物获得B淋巴细胞；(c)将从被免疫动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；以及(d)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的N-端特异性结合的抗体。在一些实施方案中，T细胞表位氨基酸序列是F-J-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R。
在一些实施方案中，使用共有肽来免疫接种用于生产本发明抗体的动物。本文公开的共有肽可用于产生可以与来自一种以上HPV毒株的E6蛋白以高亲和性交叉反应的抗体。基于氨基酸序列产生共有肽的方法在本技术领域中是已知的，并可以包括比较并取代极性和/或非极性残基。本发明的免疫接种肽可以是基于HPV E6蛋白的N-端区域内任何部分的任何长度的共有肽。所述共有肽可以基于2、3、4、5、6、7、8、9、10种或以上HPV毒株、优选为致癌HPV毒株的N-端区域。在一些实施方案中，共有肽基于HPV-16的E6N-端区域。在其他实施方案中，所述共有肽基于HPV-18的E6N-端区域。免疫接种肽的实例包括氨基酸序列F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L和F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L。本发明所产生的抗体可以与至少三种不同致癌HPV毒株、例如HPV毒株16、18和45的E6蛋白结合。在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的抗体与至少六种不同致癌HPV毒株、包括但不限于HPV 16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。在主题抗体对E6蛋白的结合亲和性方面，所述抗体与E6蛋白结合的结合亲和性可以小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M或小于10-12M。
一方面，本发明提供了与至少两种人乳头瘤病毒(HPV)高危毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株例如HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株例如HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体结合E6蛋白的结合亲和性小于10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆的。所述抗体也可以被标记。在一些实施方案中，所述抗体是特异性针对致癌E6蛋白的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
另一方面，本发明提供了检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含：将与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合的抗体与样品相接触；以及检测所述抗体与样品中的E6蛋白的任何结合。在大多数实施方案中，抗体与样品中E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种致癌HPV毒株。样品可以是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。样品也可以是组织学样品。在一些实施方案中，所述抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作捕获E6蛋白的抗体。在这种情况下，本发明的方法可以是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其包含：将本发明的抗体与样品相接触；将结合于主题抗体的E6蛋白与第二抗体相接触，所述第二抗体在不同于本发明的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；以及检测第二抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。在其他实施方案中，所述抗体在ELISA中用作检测抗体，以检测结合于另一种E6结合配偶体的E6蛋白。“E6蛋白结合配偶体”可以是与致癌E6蛋白特异性结合的任何分子。适合的致癌E6蛋白结合配偶体包括PDZ结构域多肽(如下所述)、针对致癌E6蛋白的其他抗体(例如下文中所述的)、识别致癌E6蛋白的其他蛋白(例如p53、E6-AP或E6-BP)、DNA(即十字形DNA)和其他结合配偶体例如适配体。在一些实施方案中，希望检测一种以上致癌E6蛋白(例如所有致癌E6蛋白、来自于HPV毒株16和18的E6蛋白、或来自于HPV毒株16和45的E6蛋白等)，这样，致癌E6蛋白结合配偶体可以是如下所述的与这些蛋白结合的抗体，或各自与不同致癌HPV E6蛋白结合的抗体的混合物。正如本技术领域中公知的，可以对这样的结合配偶体进行标记以便于它们的检测。一般来说，结合配偶体结合E6的结合亲和性小于10-5M，例如小于10-6、小于10-7、小于10-8M(例如小于10-9M、10-10、10-11、10-12等)。
在一些实例中，本发明的方法可以是ELISA，其包含：将样品与结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于本发明的抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；将结合于抗体的E6蛋白与本发明的抗体相接触；以及检测本发明的抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。在实践主题方法时，主题抗体可以固定化或可以不固定化到基材上。
另一方面，本发明提供了与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)结合的抗体的产生方法，所述方法包含：(a)用含有与致癌E6蛋白的C-端序列融合的T细胞表位序列的嵌合肽免疫接种动物；(b)从被免疫动物获得B淋巴细胞；(c)将从被免疫动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；以及(d)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种致癌HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性结合的抗体。T细胞表位氨基酸序列的实例是F-J-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R。在一些实施方案中，在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有PDZ结构域结合基序。在一些实施方案中，在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有保守氨基酸基序E-(T/S)-X-(V/L)，即C-端共有序列。在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的共有C-端序列的实例包括氨基酸序列E-T-Q-L和E-T-Q-V。本发明产生的抗体可以与至少三种不同致癌HPV毒株、例如HPV毒株16、18和45的E6蛋白结合。在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的抗体与至少六种不同致癌HPV毒株、包括但不限于HPV 16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
一方面，本发明提供了用于检测样品中至少一种HPV毒株的E6蛋白的抗体组合物，所述组合物包含第一抗体和第二抗体，其中第一抗体与样品中的致癌HPV毒株的E6蛋白结合，第二抗体与被第一抗体结合的E6蛋白特异性结合，并且其中第二抗体是用于检测样品中的E6蛋白的信号产生系统的一部分。在一些实施方案中，第一抗体被固定化到基材上。在其他实施方案中，第一抗体可以与固定化到基材上的另一种分子融合或结合。在一些实施方案中，抗体、包括多克隆和单克隆抗体，与来自至少一株HPV的E6蛋白结合。在一些实施方案中，HPV毒株是致癌HPV毒株。在一些实施方案中，HPV毒株是非致癌HPV毒株。在其他实施方案中，抗体与来自一种以上HPV致癌毒株的E6蛋白结合。在一些实施方案中，特异性针对E6蛋白的抗体与不同HPV毒株、特别是HPV毒株16和18的E6蛋白之间保守的氨基酸基序结合。在另一方面中，主题抗体可以用在本文所述的方法例如抗体夹心结合测定法中，以检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白。
因此，本发明的抗体在各种诊断应用、包括诊断癌症特别是宫颈癌的方法中发现用途。在本发明的另一方面，还提供了用于执行主题方法并含有主题抗体的试剂盒。
人乳头瘤病毒(HPV)和E6肿瘤蛋白
人乳头瘤病毒(HPV)是小的双链DNA病毒，其在上皮组织中引起过度增殖性病变。在乳头瘤病毒中基因组的组织具有非常保守的特点。在HPV基因组中存在三个主要区域——早期、晚期和长控制区。在早期区(E)中存在着HPV的转化和永生化潜力，并由用于病毒转录和复制以及细胞周期控制的许多调控基因构成。晚期区(L)编码两个衣壳基因，长控制区(LCR)包含HPV转录必需的所有顺式调控元件，包括早期启动子和复制原点(ori)。HPV基因组编码6个早期(E)和2个晚期(L)蛋白。
E1和E2是与宿主细胞的DNA复制机制一起为病毒DNA复制所需的两种病毒蛋白。E4和E5为病毒基因组在上皮的上层中扩增所需。高危HPV类型的E6和E7蛋白是致癌的。它们协作使细胞永生并且还诱导基因组不稳定性。E6和E7分别废除细胞肿瘤抑制蛋白p53和Rb的活性。E6还增加端粒酶活性。L1和L2蛋白形成病毒衣壳，并在上皮的上层的感染中晚期表达。长控制区(LCR)含有病毒基因组正确复制(DNA复制原点)和病毒基因表达(增强子和启动子区)所需的大多数调控DNA序列。
存在超过100种不同类型的HPV，这些HPV类型、即毒株，被分成更可能发展成癌症和不太可能发展成癌症的类型。所谓的“高危”HPV类型更可能导致癌症发生，而“低危”HPV病毒很少发展成癌症。某些“高危”HPV毒株感染肛殖区域中的上皮，并且是宫颈癌的病原体。这些高危HPV毒株包括但不限于HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-30、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV53、HPV54、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-69、HPV-73和HPV-82。“低危”HPV毒株包括但不限于HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81。来自各种HPV毒株的HPV E6蛋白在E6蛋白的致癌潜力方面的序列分析，显示在美国专利No.7,312,041和7,399,467中，二者在此以其全文引为参考。
“致癌HPV毒株”是由国立癌症研究院(National Cancer Institute)(NCI，2001)确定的已知引起宫颈癌的HPV毒株。“致癌E6蛋白”是由上述致癌HPV毒株编码的E6蛋白。重要的示例性致癌E6蛋白的序列公开在美国专利No.7,399,467中，在此以其全文引为参考。各种HPV蛋白的序列也见于NCBI的Genbank数据库中，作为下列数据库登录：HPV16-E6：GI：9627100；HPV18-E6：GI：9626069；HPV31-E6：GI：9627109；HPV35-E6：GI：9627127；HPV30-E6：GI：9627320；HPV39-E6：GI：9627165；HPV45-E6：GI：9627356；HPV51-E6：GI：9627155；HPV52-E6：GI：9627370；HPV56-E6：GI：9627383；HPV59-E6：GI：9627962；HPV58-E6：GI：9626489；HPV33-E6：GI：9627118；HPV66-E6：GI：9628582；HPV68b-E6：GI：184383；HPV69-E6：GI：9634605；HPV26-E6：GI：396956；HPV53-E6：GI：9627377；HPV73：GI：1491692；HPV82：GI：9634614；HPV34GI：396989；HPV67GI：3228267和HPV70GI：1173493。
这些高危HPV毒株的致癌潜力取决于两种早期病毒基因产物E6和E7的协同作用，这两种产物结合并改变细胞周期调控蛋白的活性。E6基因编码约16-19kD的小核蛋白产物(Greenfield，I.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，11217-11221)。E6见于所有含HPV的细胞并在其中表达(Smotkin，D.&Wettstein，F.O.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，4680-4684)。E6蛋白对宫颈上皮基底层的恶性转变的贡献最显著。来自高危HPV-16和18的E6产物与抗癌基因调节物p53和遍在蛋白降解途径蛋白E6AP相互作用，引起p53蛋白的降解(Wemess，B.A.等，(1990)Science 248，76-79)。简单来说，E6形成由肿瘤抑制蛋白p53和E3遍在蛋白连接酶蛋白家族的成员E6AP(E6相关蛋白)构成的三元复合物，引起p53的遍在蛋白化和随后的降解(Huibregtse，J.M.等，1991.EMBOJ.10：4129-4135)。低危HPV类型6和11的E6蛋白不诱导p53降解，这与它们的弱转化能力相关。缺乏有功能的p53蛋白使细胞对DNA损伤高度易感，并阻止激活p53介导的凋亡。大多数HPV阳性肿瘤具有野生型p53，而HPV阴性肿瘤含有突变的p53(Crook，T.等，(1991)Oncogene6，873-875)。作为E6蛋白活性的结果，角质细胞重新激活DNA合成，这进而改变基底上皮肛殖黏膜的生长和分化，导致它们永生化。
E6形成由肿瘤抑制蛋白p53和E3遍在蛋白连接酶蛋白家族的成员E6AP(E6相关蛋白)构成的三元复合物，引起p53的遍在蛋白化和随后的降解(Huibregtse，J.M.等，1991.EMBO J.10：4129-4135)。E7结合并失活视网膜母细胞瘤(pRb)蛋白家族，从而减弱了E2F转录因子的pRb介导的阻遏，所述E2F转录因子负责参与前进到S期的许多基因的反式激活(Cheng，S.等，1995.Genes Dev.9：2335-2349)。这两种病毒肿瘤蛋白的选择性保留和表达，对于HPV诱导的肿瘤发生来说是必需的(Androphy，E.J.等，1987.EMBO J.6：989-992)。
HPV-16 E6基因具有两个可变拼接位点，导致产生两种名为E6*I和E6*II的其他蛋白产物。然而，只有全长E6具有与p53相互作用的能力，因此是唯一与临床相关的E6。E6蛋白含有四个Cys-X-X-Cys基序，形成类似于几种转录因子中存在的锌结合结构(Grossman，S.R.和Laimins，L.A.(1989)Oncogene 4，1089-1093)。
示例性的含PDZ结构域的蛋白和PDZ结构域序列可以在美国专利No.7,312,041和7,399,467中发现，在此以其全文引为参考。术语“PDZ结构域”还涵盖来自可选物种(例如小鼠、大鼠)的序列(例如多态性变体、具有保守取代的变体等)和结构域的变体(例如天然存在的变体)。典型地，PDZ结构域与美国专利申请09/724553和10/938,249中所显示的基本上一致，例如当进行最大对应性比较和比对时，至少约70％、至少约80％或至少约90％的氨基酸残基同一性。在本技术领域中应该认识到，可以对PDZ结构域进行突变以提供能够加强或减弱结合并改变特异性的氨基酸变化，但它们仍保留PDZ结构域(Schneider等，1998，Nat.Biotech.17：170-5)。除非另外指明，否则对特定PDZ结构域(例如MAGI-1结构域2)的指称打算涵盖所述特定PDZ结构域及其HPV E6结合性变体。换句话说，如果对特定PDZ结构域进行指称，同时也指称了如下所述的该PDZ结构域与HPV的致癌E6蛋白结合的变体。就此而言，应该指出蛋白中PDZ结构域的编号可能变化。例如在本文中指称的MAGI-1结构域2其他文献中可以被称为MAGI-1结构域1。因此，当在本申请中指称蛋白的特定PDZ结构域时，该指称应该被理解为是相对于本文中所述的、特别是在序列表中所述的该结构域的序列。美国专利No.7,312,041和7,399,467显示了在适当情况下的各种PDZ结构域的序列、名称和Genbank登记号。PDZ蛋白的其他描述、特别是MAGI-1结构域2蛋白的描述，可以在2003年7月29日提交的并作为US20040018487公布的专利申请No.10/630,590中发现。该公布在此为所有目的以其全文引为参考。
在本文描述的PDZ结构域的情况下，特定PDZ结构域的“HPV E6结合性变体”是保留了HPV E6PDZ配体结合活性的PDZ结构域变体。用于确定PDZ结构域变体是否与HPV E6结合的测定法在下文中非常详细地描述，用于鉴定特定PDZ结构域中哪些氨基酸改变使其成为变体的指导方法可以在各种来源中找到。在一个实例中，可以将PDZ结构域与本文中描述的其他PDZ结构域进行比较，并可以例如取代相应位置处的氨基酸。在另一个实例中，可以将特定PDZ蛋白的PDZ结构域序列与来自另一个物种的等效PDZ蛋白的等效PDZ结构域的序列进行比较。例如，可以将来自于人类PDZ蛋白的PDZ结构域的序列与来自其他物种(例如小鼠、大鼠等)的其他已知的等效PDZ结构域的序列进行比较，并可以将两个序列之间不同的任何氨基酸取代到人类PDZ结构域中，以制造PDZ结构域的变体。在一些实施方案中，用于捕获样品中的E6蛋白的PDZ结构域多肽是MAGI-1。例如，可以将人类MAGI-1PDZ结构域2的序列与来自其他物种的等效MAGI-1PDZ结构域(例如小鼠Genbank GI编号7513782和28526157或其他同源序列)进行比较，以鉴定可以取代到人类MAGI-1-PDZ结构域中来制造其变体的氨基酸。这样的方法可以应用于本文中描述的任何MAGI-1PDZ结构域。具体变体与序列表中显示的序列相比，可以具有1个、多达约5个、多达约10个、多达约15个、多达约20个或多达约30个或以上、通常多达约50个氨基酸变化。在变体制造中，如果在PDZ结构域中存在GFG基序，一般来说在序列中不应该改变它。示例性PDZ结构域肽公开在美国专利No.7,312,041和7,399,467中，在此以其全文引为参考。
一般来说，变体DZ结构域多肽所具有的PDZ结构域，当通过BLAST2.0使用缺省参数进行测量时，在扩展到整个PDZ结构域的区域上，与本文中描述的变体PDZ结构域多肽具有至少约70或80％、通常至少约90％、更通常至少约98％的序列同一性。
当在本文中使用时，术语“PDZ蛋白”是指天然存在的含有PDZ结构域的蛋白。示例性的PDZ蛋白包括CASK、MPP1、DLG1、DLG2、PSD95、NeDLG、TIP-33、SYN1a、TIP-43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、NOS1、AF6、PTN-4、prIL16、41.8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVL1、TIP-40、TIAM1、MINT1、MAGI-1、MAGI-2、MAGI-3、KIAA0303、CBP、MINT3、TIP-2、KIAA0561和TIP-1。
当在本文中使用时，术语“PL蛋白”或“PDZ配体蛋白”是指与PDZ结构域形成分子复合物的蛋白，或其羧基端当与全长蛋白分开表达时(例如作为4-25个残基、例如8、10、12、14或16个残基的肽片段)形成这样的分子复合物的蛋白。所述分子复合物可以使用下面描述的各种测定法在体外观察。当在本文中使用时，“PL序列”是指PL蛋白的C-端的氨基酸序列(例如C-端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20或25个残基)(“C-端PL序列”)或已知与PDZ结构域结合的内部序列(“内部PL序列”)。
所有高危致癌HPV E6蛋白的表型特征是存在常规的PDZ结合基序其中X是任何氨基酸，表示疏水氨基酸。这种PDZ结构域结合基序位于高危HPV毒株的致癌E6蛋白的最后四个羧基端(C-端)氨基酸处。相反，所有低危HPV毒株不含该PDZ结构域结合基序。当在本文中使用时，术语“PDZ结构域”是指少于约90个氨基酸(即约80-90、约70-80、约60-70或约50-60个氨基酸)的蛋白序列，其特征在于与脑突触蛋白PSD-95、果蝇分隔连接蛋白Discs-Large(DLG)和上皮紧密连接蛋白ZO1(ZO1)同源。PDZ结构域也被称为Discs-Large同源重复序列(“DHR”)和GLGF重复序列。PDZ结构域一般表现出维持核心共有序列(Doyle，D.A.，1996，Cell 85：1067-76)。PDZ结构域在多种多样的膜结合蛋白中发现，这些蛋白包括鸟苷酸激酶同系物的MAGUK家族成员、几种蛋白质磷酸酶和激酶、神经元一氧化氮合酶、肿瘤抑制蛋白和合称为肌养蛋白结合蛋白(syntrophins)的几种与肌养蛋白相结合的蛋白。根据PDZ配体结合，可以将所有高危HPV类型分类为I类PDZ结合蛋白。已知HPV E6与6种不同的含PDZ结构域蛋白相互作用，这些蛋白包括但不限于discs large(Dlg)、MAGI-1、MAGI-2、MAGI-3、MUPP1和Scribble(hScrib)。这些含PDZ结构域的蛋白的特征在于具有多个蛋白-蛋白相互作用基序，并经常表达在细胞与细胞接触的位点处。它们主要通过其PDZ结构域的相互作用在这些位点处调节多组分蛋白质复合物的形成来发挥作用。通过PDZ结构域结合序列，E6蛋白能够与每种靶蛋白上的单个PDZ结构域结合，然后通过26S蛋白体指导靶蛋白的去调控。在宫颈肿瘤模型中，已证实高危HPV毒株的致癌E6蛋白的表达靶向hDLg、MAGI-1和MUPP1。所有这三种蛋白都抑制E6诱导的细胞转化，表明在HPV诱导的转化的情况下，hDLg、MAGI-1和MUPP1可以起到肿瘤阻抑基因的作用。此外，就致癌E6蛋白的C-端处的PDZ结构域结合基序而言，在发展成宫颈癌所需的最流行的高危HPV类型中超过87％编码E-T-Q-L(HPV16样)或E-T-Q-V(HPV198样)。在某些方面中，本发明涉及产生针对氨基酸序列E-T-Q-L或E-T-Q-V的特异性抗体、优选为单克隆抗体(mAb)，用作癌症例如宫颈癌的诊断或治疗性免疫试剂。
当在本文中使用时，“羧基端序列”或“C-端序列”是指E6蛋白的C-端的氨基酸序列，例如致癌E6蛋白的C-端2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20或25个残基。高危与低危HPV毒株之间的E6蛋白PDZ结合结构域的比较显示在表1中。
表1
抗体组合物
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，是指至少具有抗体的表位结合结构域的一类捕获剂。这些术语为本技术领域的专业人员所公知，是指含有与抗原特异性结合的一个或多个多肽的蛋白。一种抗体形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体，并由两对同样的抗体链组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对链中，轻链和重链可变区一起负责与抗原的结合，而恒定区负责抗体的效应功能。
公认的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链以及α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链，或在其他物种中的等价物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包含NH2-端的约110个氨基酸的可变区和COOH-端的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)同样包含可变区(约116个氨基酸)和上面提到的重链恒定区之一，例如γ(约330个氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白(IgM、IgG、IgD、IgE或IgA)、保留了与抗原的特异性结合的抗体片段包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、肽、肽模拟物、拟肽(peptoid)、肽体(peptibody)以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以是任何适合的形式，例如单克隆、多克隆或合成的。抗体可以用例如放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等进行可检测标记。抗体可以与其他部分例如特异性结合对的成员如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等进一步偶联。抗体也可以结合于固相支持物，包括但不限于聚苯乙烯板或珠子等。术语还涵盖了Fab′、Fv、F(ab′)2和/或保留了与抗原的特异性结合的其他抗体片段。
抗体可以存在各种其他形式，包括例如Fv、Fab和F(ab′)2以及双功能(即双特异性)杂合抗体(例如Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17，105(1987))，和单链形式(例如Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等，Science，242，423-426(1988)，其在此引为参考)。(总的来说，参见Hood等，《免疫学》(Immunology)，Benjamin，N.Y.，第二版，(1984)，以及Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986))。单克隆抗体、多克隆抗体和“噬菌体展示库”抗体在本技术领域中是公知的，并被术语“抗体”所涵盖。
一方面，本发明提供了抗体组合物、特别是单克隆抗体，其与至少两种HPV毒株、在一些实施方案中至少两种致癌HPV毒株或至少三种致癌HPV毒株、并且在其他实施方案中至少六种致癌HPV毒株的E6蛋白的N-末端结合。换句话说，本发明提供了“识别”、即以10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更低的KD特异性结合多种E6蛋白的N-端的抗体。换句话说，主题抗体每个与来自HPV致癌毒株的多种不同E6蛋白(即至少2、至少3、至少4、至少5、至少6或至少10种，通常高达约12、15或20种以上的不同E6蛋白)结合(即交叉反应)。一般来说，主题抗体与不同高危HPV毒株的致癌E6蛋白之间保守的氨基酸基序结合，因此与具有该基序的E6蛋白结合。在一些实施方案中，致癌E6蛋白的N-端氨基酸序列基序是HPV-16样的。这样的氨基酸序列的一个实例是F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L。在其他实施方案中，致癌E6蛋白的N-端氨基酸序列基序是HPV-18样的。这样的氨基酸序列的一个实例是F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L。在某些实施方案中，抗体至少结合HPV毒株16和18的E6蛋白(例如HPV毒株16、18、31、33和45的E6，16、18和45的E6；或在其他实施方案中，HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白)。在其他实施方案中，抗体至少与来自HPV毒株16和45的E6蛋白结合。在其他实施方案中，抗体与来自两种以上的HPV毒株的E6蛋白结合，所述毒株包括但不限于HPV16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72和81。
主题抗体可以与在致癌HPV E6蛋白的N-末端中发现的序列基序特异性结合。E6是151个氨基酸的肽，其包含共有序列为-(T/S)-(x)-(V/I)-COOH的1型基序。当在本文中使用时，“氨基端序列”或“N-端序列”是指E6蛋白N-端的氨基酸序列，例如致癌E6蛋白N-端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个残基。
为了产生特异性针对高危HPV毒株组的抗体，将编码T细胞表位的合成肽例如F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R与本文公开的致癌E6的N-端肽融合。不希望受到任何理论的束缚，在免疫原中具有T细胞表位可以增加免疫原的免疫原性，并引起更大的T细胞和B细胞应答。本发明的免疫原、即与致癌E6的N-端肽融合的T细胞表位，在免疫接种后可以引起抗体生产量的增加。致癌E6的N-端肽可以包含氨基酸序列F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L或F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L。这些融合肽被用作抗原，以刺激产生特异性针对至少两种高危HPV毒株的致癌E6蛋白的N-端的抗体。许多能够刺激抗体产生的T细胞表位在本技术领域中是已知的，并处于本发明的范围之内。
与以前可用的抗体相比，本发明的抗体结合E6蛋白的结合亲和性增加，并且检测E6蛋白的灵敏度增加。在一些实施方案中，抗体以低于10-8M的结合亲和性与来自一种或多种HPV毒株的E6蛋白结合。在一些实施方案中，抗体以低于10-9M的结合亲和性与来自一种或多种HPV毒株的E6蛋白结合。在一些实施方案中，抗体以低于10-10M的结合亲和性与来自一种或多种HPV毒株的E6蛋白结合。在一些实施方案中，抗体以低于10-11M的结合亲和性与来自一种或多种HPV毒株的E6蛋白结合。在一些实施方案中，抗体以低于10-12M的结合亲和性与来自一种或多种HPV毒株的E6蛋白结合。
对至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的N-端特异性的纯化的单克隆抗体的实例包括但不限于杂交瘤细胞系4E9.7(ATCC#PTA-9679)、4E910.2(ATCC#PTA-9680)、6H5.3(ATCC#PTA-9681)、2H9.15(ATCC#PTA-9871)、7E7.7(ATCC#PTA-9691)、PAEP 8G83(ATCC#PTA-9685)、PAEP 3A10.25(ATCC#PTA-9686)、MMP7-5G11.9(ATCC#PTA-9682)、MMP7-15H8.12(ATCC#PTA-9683)和PAEP 2G7.1(ATCC#PTA-9684)，它们已被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。主题抗体可以用作捕获抗体，其可以固定化到基材上以捕获样品中的E6蛋白，或者可以用作检测抗体，其与结合于另一个E6结合配偶体上的E6蛋白结合，所述结合配偶体识别E6蛋白上的不同结合位点。
一方面，本发明提供了抗体组合物、特别是单克隆抗体，其与至少两种HPV毒株、在一些实施方案中至少三种致癌HPV毒株、并且在其他实施方案中至少六种致癌HPV毒株的致癌E6蛋白的C-末端结合。换句话说，本发明提供了“识别”、即以10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更低的KD特异性结合多种E6蛋白的C-端的抗体。换句话说，主题抗体每个与来自HPV致癌毒株的多种不同E6蛋白(即至少2、至少3、至少4、至少5、至少6或至少10种，通常高达约12、15或20种以上的不同E6蛋白)结合(即交叉反应)。一般来说，主题抗体与不同高危HPV毒株的致癌E6蛋白之间保守的氨基酸基序结合，因此与具有该基序的E6蛋白结合。在一些实施方案中，致癌E6蛋白的C-端氨基酸序列基序是E-(T/S)-X-(V/L)。所述基序可以是HPV16 E6样序列E-T-Q-L或HPV18 E6样序列E-T-Q-V。在某些实施方案中，所述抗体至少结合HPV毒株16和18的E6蛋白(例如HPV毒株16、18、31、33和45的E6；16、18和45的E6；或在其他实施方案中，HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白)。在其他实施方案中，所述抗体至少与来自HPV毒株16和45的E6蛋白结合。
主题抗体可以与在致癌HPV E6蛋白的C-末端中发现的序列基序特异性结合。为了产生特异性针对高危HPV毒株组的抗体，将编码T细胞表位的合成肽例如F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R与致癌E6蛋白的PDZ结合基序融合。不希望受到任何理论的束缚，在免疫原中具有T细胞表位可以增加免疫原的免疫原性，并引起更大的T细胞和B细胞应答。本发明的免疫原、即与致癌E6蛋白的PDZ结合基序融合的T细胞表位，在免疫接种后可以引起抗体生产量的增加。致癌E6蛋白的PDZ结合基序可以包含氨基酸序E-(T/S)-X-(V/L)，例如E-T-Q-L或E-T-Q-V。这些融合肽被用作抗原，以刺激产生对至少两种高危HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性的抗体。表2中显示了由与致癌E6蛋白的C-端PDZ结合基序融合的T细胞表位构成的嵌合肽序列。
表2
在一个实例中，对至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性的纯化单克隆抗体是6D9.3。在另一个实例中，对至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性的纯化单克隆抗体是1A9.1。在另一个实例中，对至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性的纯化单克隆抗体是2H9.15。这些抗体可以用作捕获抗体，其可以固定化到基材上以捕获样品中的E6蛋白，或者可以用作检测抗体，其与结合于另一种捕获抗体上的E6蛋白结合，所述捕获抗体识别E6蛋白上的不同结合位点。如图9中所示，各种抗HPV E6捕获抗体被用于开发检测HPV16 E6蛋白的夹心ELISA测定法。将抗体文库(捕获C1、C2和C3MAb)与HPV肿瘤肽PDZ抗体进行组合鉴定捕获/检测对。
一方面，本发明提供了用于检测样品中至少一种HPV毒株的E6蛋白的抗体组合物，所述组合物包含第一抗体和第二抗体，其中第一抗体被固定化并与样品中的致癌HPV毒株的E6蛋白结合，而第二抗体与被第一抗体结合的E6蛋白特异性结合，并且其中第二抗体是用于检测样品中的E6蛋白的信号产生系统的一部分。另一方面，本发明提供了检测样品中的至少一种HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含：(a)将与至少一种HPV毒株的E6蛋白特异性结合的固定化第一抗体与样品相接触，(b)将结合于固定化第一抗体的E6蛋白与第二抗体相接触，所述第二抗体与至少一种HPV毒株的E6蛋白特异性结合；以及(c)检测第二抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中的E6蛋白；其中第二抗体与E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株。
在一些实施方案中，希望检测一种以上致癌E6蛋白(例如所有致癌E6蛋白、来自HPV毒株16和18的E6蛋白或来自HPV毒株16和45的E6蛋白等)，在这种情况下，致癌E6蛋白结合配偶体可以是如下所述的与这些蛋白结合的抗体，或者是各与不同蛋白结合的抗体的混合物。正如本技术领域中公知的，这样的结合配偶体可以被标记以便于它们的检测。一般来说，抗体结合E6的结合亲和性小于10-5M，例如小于10-6、小于10-7、小于10-8M(例如小于10- 9M、10-10、10-11等)。
在一个实例中，可以将PDZ结构域多肽与对本文描述的至少一种致癌HPV毒株的E6蛋白特异性的抗体，在它们与E6蛋白结合的结合亲和性、特异性、灵敏度以及检测E6的假阳性率方面进行比较，所述假阳性率是指当样品中事实上不存在E6蛋白或HPV毒株时错误地检测到致癌HPV毒株的E6蛋白的比率。在一些实施方案中，与使用含PDZ结构域的多肽检测样品中的E6蛋白相比，本发明的方法增加了检测致癌E6蛋白的信噪比。使用本发明的组合物和方法检测致癌E6蛋白的信噪比，与使用PDZ结构域多肽检测E6蛋白相比，可以增加约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100倍或以上。在一些实施方案中，与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，所述方法具有检测致癌HPV E6蛋白的更高特异性。与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，所述方法还可以具有检测致癌HPV E6蛋白的更高灵敏度。在其他实施方案中，与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，所述方法产生了更低的错误地检测致癌HPV E6蛋白的假阳性率。使用本发明的组合物和方法检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的假阳性率，可以低于10％、9％、8％、7、％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更低。
主题抗体可以与HPV E6蛋白的任何部分或区域结合。在一些实施方案中，主题抗体可以与在HPV E6蛋白中发现的三个序列基序之一结合。这些基序详细公开在美国专利No.7,399,467的图1中，该专利在此以其全文引为参考，并且这些基序一般来说对应于来自不同HPV毒株的E6蛋白之间序列相似的区域。因此，一般来说，主题抗体与具有下列序列的肽结合：分别对应于HPV毒株16和18的E6蛋白中的第一个共同序列基序的FQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDI(SEQ ID NO：1)和FEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDI(SEQ ID NO：2)，分别对应于HPV毒株16和18的E6蛋白中的第二个共同序列基序的LLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDK(SEQ ID NO：3)和LLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNE(SEQ ID NO：4)，或分别对应于HPV毒株16和18的E6蛋白中的第三个共同序列基序的RHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCC(SEQ ID NO：5)和RHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCC(SEQ ID NO：6)。如果主题抗体与其他E6蛋白结合，那么它通常在等价于上面讨论的或在美国专利No.7,399,467中公开的位置处与其他E6蛋白结合，其中“等价于......的位置”一般是指当将其他E6蛋白的序列与美国专利No.7,399,467的图1中的序列比对时，对应于加框氨基酸、即与其对齐的一段连续氨基酸。
因此，由于抗体一般识别比上面所列出小的基序，因此主题抗体可以识别比上面所述的基序小并包含在所述基序中的肽。例如，主题抗体可以与具有SEQ NO：1-6中提出的任何9个连续氨基酸的肽结合。具体来说，主题抗体可以识别对应于上述HPV毒株16和18的E6蛋白的第一个共同序列的子序列的序列RPRKLPQLCTEL(SEQ ID NO：7)和RPYKLPDLCTEL(SEQ ID NO：8)，对应于上述HPV毒株16和18的E6蛋白的第二个共同序列的子序列的LLIRCINCQKPL(SEQ ID NO：9)和LLIRCLRCQKPL(SEQ ID NO：10)，或对应于上述HPV毒株16和18的E6蛋白的第三个共同序列的子序列的RHLDKKQRFHNI(SEQ ID NO：11)和RHLNEKRRFHNI(SEQ ID NO：12)。因为这些子序列正如上面讨论的，在不同E6蛋白之间一般是保守的，因此与上述序列结合的抗体一般与来自其他HPV毒株的E6蛋白结合。
在某些备选实施方案中，主题抗体将与来自HPV毒株16和45的E6蛋白结合。因此，一般来说，主题抗体与具有下列序列的肽结合：分别对应于HPV毒株16和45的E6蛋白中的第一个共同序列基序的FQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDI(SEQ ID NO：1)和FDDPKQRPYKLPDLCTELNTSLQDV(SEQ ID NO：57)，分别对应于HPV毒株16和45的E6蛋白中的第二个共同序列基序的LLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDK(SEQ ID NO：3)和LLIRCLRCQKPLNPAEKRRHLKD(SEQ ID NO：58)，或分别对应于HPV毒株16和45的E6蛋白中的第三个共同序列基序的RHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCC(SEQ ID NO：5)和RHLKDKRRFHSIAGQYRGQCNTCC(SEQ ID NO：59)。如果主题抗体与其他E6蛋白结合，那么它通常在等价于上面所讨论的位置处与其他E6蛋白结合。
因此，由于抗体一般识别比上面所列出小的基序，因此主题抗体可以识别比上面所述的基序更小并包含所述基序内的肽。例如，主题抗体可以与具有SEQ NO：1、3、5、57、58和59任一个中提出的任何9个连续氨基酸的肽结合。具体来说，主题抗体可以识别对应于上述HPV毒株16和45的E6蛋白的第一个共同序列的子序列的序列RPRKLPQLCTEL(SEQ IDNO：7)和RPYKLPDLCTEL(SEQ ID NO：60)，对应于上述HPV毒株16和45的E6蛋白的第二个共同序列的子序列的LLIRCINCQKPL(SEQ ID NO：9)和LLIRCLRCQKPL(SEQ ID NO：61)，或对应于上述HPV毒株16和45的E6蛋白的第三个共同序列的子序列的RHLDKKQRFHNI(SEQID NO：11)和RHLKDKRRFHSI(SEQ ID NO：62)。因为这些子序列正如上面讨论的在不同E6蛋白之间一般是保守的，因此与上述序列结合的抗体一般与来自其他HPV毒株的E6蛋白结合。在某些实施方案中，半胱氨酸残基可以被丝氨酸残基代替，以避免二硫桥形成。
在一些实施方案中，主题抗体可以与HPV蛋白的羧基或C-端、例如E6蛋白的C-端结合。对HPV C-端PDZ配体(PL)基序特异性的抗体，可用于捕获和检测至少一种致癌HPV毒株的E6蛋白，并用于HPV感染的治疗。第一抗体可以与E6蛋白的N-端结合，第二抗体可以与E6蛋白的C-端结合。或者，第一抗体可以与E6蛋白的C-端结合，第二抗体可以与E6蛋白的N-端结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体与至少一种致癌HPV毒株的E6蛋白结合，所述毒株选自HPV毒株16、18、26、30、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、73和82。所述主题抗体可以与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或以上高危HPV毒株的E6蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二抗体与HPV16、18、31、33、45、52或58的E6结合。本发明的抗体组合物可以与一种以上HPV毒株的E6蛋白特异性结合，从而检测样品中一种以上致癌HPV毒株的存在。样品中的致癌HPV毒株可以是HPV毒株16、18、31、33、45、52、58或其组合。在其他实施方案中，本发明的抗体与低危HPV毒株例如HPV6和HPV11的E6蛋白结合。在具有引起疾病例如呼吸道乳头状瘤病的低危HPV类型的妊娠女性中，存在着胎儿围产期感染的风险。
在一些实施方案中，标记第二抗体以检测与第二抗体结合的E6蛋白。第二抗体可以与酶、例如辣根过氧化物酶偶联。在一些实施方案中，抗体组合物还包含与结合E6蛋白的第二抗体结合的第三抗体，用于检测E6蛋白。第三抗体可以与产生信号的分子偶联，所述信号指示了抗体与样品中的E6蛋白的结合。在一个实例中，第三抗体与酶、例如辣根过氧化物酶偶联。被第一和第二抗体结合的E6的存在，可以使用本技术领域中公知的各种技术来检测。在一些实施方案中，结合型E6蛋白的检测通过夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)来进行，其在下文中非常详细地描述。本发明的抗体组合物可以用作宫颈癌检验的一部分。
在一些实施方案中，与使用含PDZ结构域的多肽检测样品中的致癌E6蛋白相比，所述抗体组合物增强了检测致癌E6蛋白的信噪比。本发明的抗体组合物可用于以低的假阳性率检测样品中的致癌E6蛋白。使用本发明的组合物和方法检测致癌HPV毒株的E6蛋白的假阳性率，可以低于10％、9％、8％、7、％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更低。在一个实例中，假阳性率低于1.7％。
E6结合配偶体
一方面，主题抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作捕获抗体来捕获E6蛋白。在一些实施方案中，方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其包含：(a)将主题抗体与样品相接触；(b)将结合于主题抗体的E6蛋白与另一种E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于主题抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；以及(c)检测E6结合配偶体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。另一方面，抗体在ELISA中用作检测抗体，以检测与E6蛋白特异性的固定化E6结合配偶体结合的E6蛋白。在一些实施方案中，方法是ELISA，其包含：(a)将样品与E6结合配偶体相接触，所述结合配偶体在不同于主题抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合；(b)将结合于E6结合配偶体的E6蛋白与主题抗体相接触；以及(c)检测主题抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。
“E6蛋白结合配偶体”可以是与致癌E6蛋白特异性结合的任何分子。适合的致癌E6蛋白结合配偶体包括PDZ结构域(如下所述)、针对致癌E6蛋白的抗体(例如下面所述的)、识别致癌E6蛋白的其他蛋白(例如p53、E6-AP或E6-BP)、DNA(即十字形DNA)和其他配偶体例如适配体。在一些实施方案中，希望检测一种以上致癌E6蛋白(例如所有致癌E6蛋白、来自HPV毒株16和18的E6蛋白、或来自HPV毒株16和45的E6蛋白等)，在这种情况下，致癌E6蛋白结合配偶体可以是如下所述的与这些蛋白结合的抗体，或各与不同蛋白结合的抗体的混合物。正如本技术领域中已知的，这样的结合配偶体可以被标记以便于它们的检测。一般来说，结合配偶体结合E6的结合亲和性小于10-5M，例如小于10-6、小于10-7、小于10-8M(例如小于10- 9M、10-10、10-11、10-12等)。
在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的E6结合配偶体可以包括但不限于p53、E6-AP、E6-BP或与E6肿瘤蛋白结合的工程化改造的化合物。或者，人们也可以使用DNA结合或Zn2+结合来测试被捕获的E6蛋白的存在，因为已知致癌E6蛋白通过使用二价阳离子结合某些DNA结构。此外，人们可以在活性测定中使用PDZ捕获的E6蛋白，因为已知E6在存在网织红细胞裂解物的情况下降解DNA和某些蛋白，包括p53。在大多数实施方案中，捕获样品中的E6蛋白的第一E6结合配偶体，在E6蛋白上不降低E6蛋白与主题抗体对结合的可利用性的位置处与E6蛋白结合。
在一些实施方案中，在动物免疫接种中使用的E6肽含有载体，例如在抗体生产中广泛用作载体蛋白的匙孔血蓝蛋白(KLH)(E6-KLH)，或与卵清蛋白融合的E6(E6-OVA)。E6肽或相关部分可以使用本技术领域公知的常规生物化学方法来合成。例如，所述肽可以使用常规溶液或固相肽合成方法以线性形式制备，随后通过纯化程序从树脂上切下(Creighton，1983，Protein Structures And Molecular Principles，W.H.Freeman andCo.，N.Y.)。适合用于合成本文所述肽的程序在本技术领域中是公知的。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解方法和质谱术)来验证。在一些实施方案中，限定序列的合成肽(例如对应于E6蛋白的氨基端)可以通过任何标准的基于树脂的方法来合成(参见例如美国专利No.4，108,846；也参见Caruthers等，1980，Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.，215-223；Horn等，1980，Nucleic Acids Res.Symp.Ser.，225-232；Roberge，等，1995，Science 269：202)。在本文描述的测定法中使用的肽可以通过FMOC来制备(参见例如Guy和Fields，1997，Meth.Enz.289：67-83；Wellings和Atherton，1997，Meth.Enz.289：44-67)。在某些情况下(例如在本发明的A和G测定法中使用时)，通过将肽与四倍过量的生物素甲酯在二甲基亚砜中使用催化量的碱进行反应，用生物素在氨基端对肽进行标记。使用含卤的酸(例如三氟乙酸)在适合的抗氧化剂(例如乙二硫醇)存在下将肽从树脂上切下，并将过量溶剂冷冻干燥。
在冷冻干燥后，可以将肽重新溶解并通过反相高效液相色谱(HPLC)进行纯化。一种适合的HPLC溶剂系统包括Vydac C-18半制备柱，运行速度为每分钟5mL，在水加0.1％三氟乙酸的基本溶剂中乙腈加0.1％三氟乙酸的量逐渐增加。在HPLC纯化后，使用MALDI阳离子方式质谱术证实肽的身份。
此外，可以化学合成免疫接种肽的类似物和衍生物。本发明的肽的每个氨基酸之间的连键可以是酰胺、取代的酰胺或酰胺的等构体。非典型氨基酸或氨基酸的化学类似物可以作为替代物或附加物引入到序列中。非典型氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计的氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和总的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)的。
在本发明的方法中使用的E6免疫接种肽也可以使用常规重组遗传工程技术合成。对于重组生产来说，将编码线性形式肽的多核苷酸序列插入到适合的表达载体中，即含有所插入的编码序列的转录和翻译所需元件的载体，或者在RNA病毒载体的情况下，是含有复制和翻译所需元件的载体。然后将表达载体转染到适合的表达肽的靶细胞中。然后根据所使用的表达系统，通过本技术领域中已确立的程序分离表达的肽。用于重组蛋白和肽生产的方法在本技术领域中是公知的(参见例如Maniatis等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory，N.Y.；和Ausubel等，1989，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience，N.Y.)。将含有E6蛋白或其一部分的PCR产物亚克隆到表达载体中，以允许表达含有E6蛋白或其一部分与异源结构域(即KLH或OVA)的融合蛋白。
可以利用各种宿主-表达载体系统来表达本文所述的重组E6肽。这些系统包括但不限于用含有适合的编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌；用含有适合的编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用含有适合的编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有适合编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染或用含有适合的编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
产生E6特异性抗体的方法
一方面，本发明提供了与样品中的至少两种HPV毒株的E6蛋白的氨基端(N-端)结合的抗体的产生方法，所述方法包含：(a)用与致癌E6蛋白的N-端序列融合的T细胞表位序列免疫接种动物；(b)从免疫接种的动物获得B淋巴细胞；(c)将从免疫接种的动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；以及(d)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种HPV毒株的E6蛋白的N-端特异性结合的抗体。
一方面，本发明提供了与样品中的至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)结合的抗体的产生方法，所述方法包含：(a)用与致癌E6蛋白的C-端序列融合的T细胞表位序列免疫接种动物；(b)从免疫接种的动物获得B淋巴细胞；(c)将从免疫接种的动物获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂交瘤细胞；以及(d)筛选杂交瘤细胞以获得与至少两种致癌HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端特异性结合的抗体。
为了生产抗体，可以通过用肽进行注射来免疫接种各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。肽可以利用侧链官能团或连接于侧链官能团的接头连接到适合的载体例如BSA或KLH上。可以根据宿主物种使用各种佐剂来增强免疫应答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢诺尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽类、油乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
可以使用通过连续培养细胞系提供抗体分子生产的任何技术来制备针对肽的单克隆抗体。这些技术包括但不限于最初由Koehler和Milstein，1975，Nature 256：495-497所描述的杂交瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today 4：72；Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，《单克隆抗体和癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。此外，可以使用通过将来自于抗原特异性适合的小鼠抗体分子的基因与来自于生物活性适合的人类抗体分子的基因剪接在一起产生的用于生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454)。或者，可以对所描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)进行改编，以生产肽特异性单链抗体。
可以通过已知技术来产生含有特异性结合位点的缺失的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限于可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段，和可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science 246：1275-1281)，以允许快速和容易地鉴定对目标肽具有所需特异性的单克隆Fab片段。
特异性针对目标肽的抗体或抗体片段可以连接于例如琼脂糖，并将抗体-琼脂糖复合物用于免疫层析中以纯化本发明的肽。参见Scopes，1984，《蛋白质纯化：原理和实践》(Protein Purification：Principles and Practice)，Springer-Verlag New York，Inc.，NY；Livingstone，1974，《酶学方法：蛋白质的免疫亲和层析》(Methods Enzymology：Imnmunoaffinity Chromatography of Proteins)34：723-731。抗体也可以连接到其他固相支持物上供诊断应用，或者用检测手段例如可以切开比色底物的酶、荧光团、磁珠或其他可测量的物质组合物来标记。
与上面描述的方法相结合，人们可以使用许多技术来增加生产或筛选高亲和性抗体的可能性。实例是以与制备用于测试的组织或细胞样品相同的方式制备E6抗原(以引起针对它的抗体)。或者，人们可以用以一种方式制备的E6融合蛋白进行免疫接种，并使用以不同方式制备的第二种E6蛋白筛选特异性E6抗体。这将筛选到识别在不同样品收集和制备程序下保守的E6表位的抗体。在另一个实例中，人们可以用已被快速变性和复性的E6抗原免疫接种动物，以便筛选到对制备条件不敏感的表位。可以使用的另一种方法是使用通过主要组织相容性复合物(MHC)和T细胞受体(TCR)共有结合预测的与E6蛋白的抗原性区域相对应的肽。
在一些实施方案中，抗原与T细胞表位、例如具有氨基酸序列F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R的T细胞表位融合。在一些实施方案中，在免疫接种步骤中使用的致癌E6蛋白的C-端序列含有PDZ结构域结合基序，例如保守氨基酸基序E-(T/S)-X-(V/L)。保守氨基酸基序可以是E-T-Q-L或E-T-Q-V。免疫接种肽的实例包括但不限于肽F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-L和F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-V，如表2中所示。
在由T细胞表位与HPV致癌PDZ共有结合基序融合而构成的嵌合肽合成后，在雌性Balb/c小鼠中进行脾内免疫接种，以刺激本发明的抗体的生产。因此，可以使用具有上述任何肽的9、10、11、12、13、14、15个或以上、通常多达约20个或以上连续氨基酸的肽来免疫接种。在一些实施方案中，所述肽序列可以包含在较大的肽中，其大小可以比所述多肽大1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或以上、有时多达约15或20个或更多氨基酸。因此，所述肽的长度可以是约8至约30个氨基酸。在某些实施方案中，所述肽的长度约为9-20个氨基酸，并通常含有如上所述的氨基酸序列。
为了生产特异性针对高危HPV组的抗体，设计了具有与几种高危组相关的人工序列的合成肽作为抗原。用作免疫原以产生本发明的抗体的肽序列，从在最高危HPV毒株中发现的保守氨基酸的共有序列来设计。相反，低危HPV毒株保留了与共有肽序列非常低的同源性。适合用于动物的免疫接种中以生产本发明的HPV E6抗体的肽的设计，显示在图1中。设计是基于下述前提，即由此得到的诊断应该具有非常高的灵敏度以避免假阴性，同时使特异性最大化。为此，目标是在致癌毒株内高度同源并与低危HPV毒株低同源。处于E6蛋白的N-端的位置是理想的。与被IP阻碍的序列(即HPV33)的差异是想要的。此外，二级结构预测并不明确，但是相同或相似残基的分布使得它们可能在α-螺旋构象中面朝蛋白的同一侧，这将有希望产生交叉反应性抗体，即与至少两种HPV毒株的E6蛋白结合的抗体。
在一些实施方案中，使用的肽是KLH-和卵清蛋白偶联物以及游离肽。此外，采取了基于多抗原性肽(MAP)的策略，其中在本文公开的E6-肽序列之前带有下列T-细胞表位，即FISEAIIHVLHSR。
多抗原性肽系统(MAPS)是用于生产高滴度抗肽抗体(1，2)和合成肽疫苗(3)的方法。该系统利用赖氨酸的α-和ε-氨基官能团来形成连接了多个肽链的骨架。取决于赖氨酸列的数量(2、4、8等)，可以合成不同数量的肽支链。使用这种新技术，可以生产高滴度抗体(Posnett，D.等，J.Biol.Chem.263，1719-17251988；Tam，J.P.PNAS USA 85，5409-5413，1988)。用化学上确定的合成聚合物免疫接种，含有各种蛋白的T和B细胞表位的多抗原性肽(MAP)系统在加强接种后诱导了可以在几个月后检测到的高水平的循环抗体。抗MAP第二抗体应答的特征在于循环IgG水平的增加和相伴的IgM水平的降低。体外和体内实验表明，包含在MAP中的Th表位被用天然蛋白免疫接种后诱导的T细胞识别，并且MAP诱导的T细胞也能识别该天然蛋白。除了高水平的抗B表位抗体之外，MAP免疫接种还诱导针对T表位的抗体。这种抗T表位免疫应答不影响抗B表位抗体的产生。对不同种系小鼠的免疫接种显示，抗体应答与T表位识别的遗传限制模式一致。该研究的发现表明MAP是能够诱导免疫记忆的强免疫原，并且因此是用于开发被设计来诱导高水平循环抗体的亚基疫苗的良好候选物。因为半胱氨酸可能对MAP方法引起潜在问题，因此可以考虑不含Cys残基的较短版本的MAP，作为替代方案也可以像在HPV毒株31和56中那样用Ser代替Cys的修改序列。
在一些实施方案中，将包括来自高危和低危HPV毒株两者的E6蛋白的一组所选E6蛋白进行比对，以推断基于HPV16的E6肽序列的共有肽序列。共有肽序列的一个实例是F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L。表3中显示了在每种HPV E6蛋白序列内不与共有肽序列F-Q-D-P-A-E-R-P-R-K-L-H-D-L-C-T-E-L匹配的氨基酸数量的列表。在其他实施方案中，将包括来自高危和低危HPV毒株两者的E6蛋白的一组所选E6蛋白进行比对，以推断基于HPV18的E6肽序列的共有肽序列。共有肽序列的一个实例是F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L。表4中显示了在每种HPV E6蛋白序列内不与共有肽F-Q-D-P-A-E-R-P-Y-K-L-P-D-L-C-T-E-L匹配的氨基酸数量的列表。在一些实施方案中，然后将肽共有序列与上文中公开的T细胞表位序列融合，并将融合肽用作免疫原，在本发明的方法中刺激抗体产生。
表3
HPV毒株 不匹配AA的数量
16 3
18 5
31 6
33 6
35 3
39 5
45 5
52 6
56 8
58 6
59 7
68 6
6b 16
11 15
表4
HPV毒株 不匹配AA的数量
16 3
18 3
31 8
33 8
35 3
39 3
45 3
52 8
56 10
58 8
59 5
68 5
6b 16
11 15
在一些实施方案中，作为肽或作为重组蛋白合成了来自HPV-16和HPV-18的E6的精确匹配物，并将其用作筛选试剂，因为在可以着手研究抗体的交叉毒株特异性之前，这两种HPV毒株典型地包含在检测测定体系中。在一些实施方案中，可以基于任何HPV E6蛋白产生共有肽，并可以使用任何E6蛋白筛选所述抗体。
在一些实施方案中，在包含T细胞表位与HPV E6蛋白的N-端共有序列融合的融合肽合成后，将所述E6融合肽/蛋白与KLH或卵清蛋白偶联，在动物中进行免疫接种以产生特异性针对共有肽内的表位的免疫应答。免疫接种可以在小鼠、例如雌性Balb/c小鼠中通过重复免疫接种多位点(RIMMS)免疫接种策略、常规免疫接种或脾内手段来进行，以刺激本发明的抗体的产生。因此，可以使用具有上面描述的任何肽的9、10、11、12、13、14、15个或更多、通常多达约20个或以上连续氨基酸的肽来免疫接种。在一些实施方案中，所述肽序列可以包含在较大的肽内，肽的大小可以比所述多肽大l、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或以上、有时多达约15或20个或更多氨基酸。因此，所述肽的长度可以是约8至约30个氨基酸。在某些实施方案中，所述肽的长度约为9-20个氨基酸，并通常含有如上所述的氨基酸序列。
使用从免疫接种的动物例如小鼠获得的含有B-淋巴细胞的脾细胞来产生分泌抗体的杂交瘤。在一个实例中，将从免疫接种的动物获得的含有B-淋巴细胞的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞例如P3X63-Ag-653/Bcl-2细胞融合，来产生分泌抗体的杂交瘤细胞培养物。然后可以从这些杂交瘤培养物筛选具有针对高危HPV毒株的E6蛋白的特异性免疫反应性、例如针对高危HPV毒株的致癌E6蛋白的N-端的免疫反应性的抗体(表5和6)。杂交瘤筛选可以通过本技术领域中公知的各种方法和技术来进行，包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫组织化学(IHC)和Western印迹法。本发明的方法还包含对分泌对致癌E6蛋白N-端特异性的抗体的杂交瘤细胞进行克隆。杂交瘤细胞的克隆可以通过不同方法例如有限稀释技术来实现，以产生本发明的单克隆抗体。例如，将表现出对E6蛋白高亲和性的多克隆抗体进行一轮有限稀释以产生单克隆杂交瘤细胞系。本发明的方法还包含对与致癌E6蛋白的N-端特异性结合的抗体进行纯化。许多标准技术可用于纯化抗体，例如蛋白A、蛋白G或蛋白L琼脂糖方案可用于单克隆抗体纯化。
也可以从这些杂交瘤培养物筛选对高危HPV毒株的致癌E6蛋白的C-端具有特异性免疫反应性的抗体。杂交瘤筛选可以通过本技术领域中公知的各种方法和技术来进行，包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫组织化学(IHC)和Western印迹法。本发明的方法还包含对分泌对致癌E6蛋白C-端特异性的抗体的杂交瘤细胞进行克隆。杂交瘤细胞的克隆可以通过不同方法例如有限稀释技术来实现，以产生本发明的单克隆抗体。本发明的方法还包含对与致癌E6蛋白的C-端特异性结合的抗体进行纯化。许多标准技术可用于纯化抗体，例如蛋白A、蛋白G或蛋白L琼脂糖方案可用于单克隆抗体纯化。通过本发明的方法产生的对致癌E6蛋白的C-端特异性的纯化抗体，在体外抗体-抗原、例如抗体-E6结合测定法中进一步表征，以评估它们结合并检测高危HPV毒株的致癌E6蛋白的能力。本发明的纯化抗体的实例包括mAb 6D9.3和mAb 1A9.1。某些杂交瘤克隆已保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。这些克隆包括4E9.7(ATCC#PTA-9679)、4E910.2(ATCC#PTA-9680)、6H5.3(ATCC#PTA-9681)、2H9.15(ATCC#PTA-9871)、7E7.7(ATCC#PTA-9691)、PAEP 8G83(ATCC#PTA-9685)、PAEP3A10.25(ATCC#PTA-9686)、MMP7-5G11.9(ATCC#PTA-9682)、MMP7-15H8.12(ATCC#PTA-9683)和PAEP 2G7.1(ATCC#PTA-9684)。这些抗体可以用作捕获抗体或检测抗体，用于在任何基于免疫学的测定格式、包括但不限于基于载片的测定法、直接酶免疫测定法(EIA)、拉曼光谱纳米技术、免疫侧向流测定法、ELISA和基于珠子的流式微球阵列中检测样品中E6蛋白的存在。在一些实施方案中，在本文所述的夹心ELISA中，使用生物素化的抗E6抗体作为检测抗体，这两种抗体作为捕获抗体进行了测试。测定法的设计和结果详细公开在实施例4和表4中。
表5
737BLT HPV1Ova HPV1Map 35pmal 52pmal 56pmal
1B2 3.236 3.478 0.310 1.983 0.295
1C8 3.018 3.199 0.199 3.104 0.211
1E2 2.777 3.000 2.432 0.288 0.231
4B3 2.614 2.729 0.090 1.728 0.120
4C3 2.848 2.825 0.108 2.554 0.154
4E9 3.169 2.728 0.288 2.665 0.329
5D8 3.126 2.548 0.138 0.183 0.144
5D9 0.775 0.434 0.018 0.026 0.018
5G3 3.202 2.564 0.242 0.377 0.246
6F2 3.277 2.457 2.376 0.185 0.141
6G8 2.875 2.673 2.749 0.271 0.273
7F10 3.409 3.199 0.810 2.410 0.268
7G10 3.340 2.723 0.024 0.055 0.078
8C1 超范围 3.083 0.270 3.016 0.251
8C2 超范围 2.482 0.150 1.128 0.236
8E8 超范围 2.822 0.305 2.686 0.376
8E9 超范围 2.800 0.153 1.537 0.232
8H6 3.003 2.207 2.633 0.463 0.482
9A10 3.277 2.345 2.238 0.205 0.086
9C9 3.152 2.722 0.110 0.551 0.184
9D6 超范围 2.900 1.374 1.331 0.989
10E9 3.352 3.021 0.178 3.324 0.154
介质 0.026 0.012 0.020 0.024 0.022
抗-Ova 2.806 不可用 不可用 不可用 不可用
抗-MBP 不可用 不可用 2.424 2.901 2.847
抗-His 不可用 不可用 不可用 不可用 不可用
表6
738BLT HPV2Ova HPV2MAP 35pmal 52pmal 56pmal
1H1 3.283 超范围 2.735 0.108 0.074
1G11 3.418 超范围 3.121 0.107 0.075
2B1 2.537 2.38 2.276 0.061 0.066
4E9 2.807 1.911 0.054 0.167 0.060
4E10 3.146 超范围 3.133 0.127 0.095
4H5 超范围 3.258 2.922 0.128 0.099
6A7 3.191 3.321 3.140 0.183 0.072
6C3 3.142 3.388 3.240 0.167 0.098
6 E6 3.117 3.486 3.353 0.179 0.122
6F11 超范围 3.382 3.302 0.152 0.186
6H5 3.171 2.853 2.467 0.389 0.316
7E7 3.21 3.472 2.963 0.125 0.105
7H12 超范围 3.288 2.916 0.106 0.100
8E8 1.852 0.993 1.334 1.257 0.727
8F9 3.176 3.34 3.069 0.203 0.161
8G10 3.075 3.397 2.910 0.139 0.075
8H5 1.343 0.034 0.139 0.202 0.110
8H6 超范围 0.034 2.990 0.241 0.156
8H9 超范围 0.034 3.111 0.141 0.094
9D7 1.965 0.034 0.356 0.066 0.092
9G6 3.33 0.034 3.210 0.142 0.087
9H10 3.175 0.034 2.952 0.243 0.194
10G10 3.275 0.034 2.952 0.243 0.194
介质 0.026 0.034 0.020 0.024 0.022
抗-Ova 2.806 0.034 不可用 不可用 不可用
抗-MBP 不可用 0.034 2.424 2.901 2.847
抗-His 不可用 0.034 不可用 不可用 不可用
通过本发明的方法产生的对致癌E6蛋白的N-端特异性的纯化抗体，在体外抗体-抗原、例如抗体-E6结合测定法中进一步表征，以评估它们结合并检测高危HPV毒株的致癌E6蛋白的能力。在一些实施方案中，在Western印迹法中测试了本发明的每种单克隆抗体针对来自多种HPV毒株包括HPV16、18、31、33、35、45、52、56、58、69、11和6b的纯化E6蛋白的交叉反应性(表7)。
表7
737BLT 16 18 33 31 35 45 52 56 58 69 11 6b
1B2.2 2 2 3 4 3 0 3 1 3 0 0 0
1B2.27 2 3 3 4 3 0 3 1 3 0 0 0
7F10.3 2 4 4 4 4 0 4 1 4 0 0 0
7F10.29 ＜1 2 4 4 4 ＜1 4 2 4 0 0 0
738BLT 16 18 33 31 35 45 52 56 58 69 11 6b
4E9.7 ＜1 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0
4E9.10 ＜1 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0
6H5.3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0
6H5.8 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0
4E10.2 0 4 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0
4E10.13 0 4 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0
介质 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 0 0
AVC 16 18 33 31 35 45 52 56 58 69 11 6b
3D5AV NT 4 NT NT NT 4 NT NT NT NT NT NA
4C6AV NT 4 NT NT 3 NT NT NT NT NT NT NA
4H1AV NT NT 4 NT NT NT 3 NT 4 NT 3 NA
7F10AV NT NT NT 4 NT NT NT NT NT NT NT NA
6F4AV 3 4 NT NT NT NT NT NT NT 2 NT NA
在体外抗体对夹心测定法中对这些抗体进行了进一步表征，以确定高危HPV毒株的E6肿瘤蛋白上的互补性表位(表8)。本发明的纯化抗体的实例包括但不限于4E9.7、4E10.2、6H5.3、2H9.15、7F10.3、4E9.7、1B2.27以及在表5和6中列出的。这些抗体可以用作捕获抗体或检测抗体，用于在任何基于免疫学的测定格式、包括但不限于基于载片的测定法、直接酶免疫测定法(EIA)、拉曼光谱纳米技术、免疫侧向流测定法、ELISA和基于珠子的流式微球阵列中检测样品中E6蛋白的存在。在一些实施方案中，在本文所述的夹心ELISA中，使用另一种E6结合配偶体例如另一种抗E6抗体或含PDZ结构域的多肽作为检测剂，将所述抗体作为捕获抗体进行测试。在其他实施方案中，在本文所述的夹心ELISA中，使用另一种E6结合配偶体例如另一种抗E6抗体或含PDZ结构域的多肽作为捕获试剂，将主题抗体作为检测抗体进行测试。在这些实例中，所述另一种抗E6抗体可以结合到E6蛋白的C-端或E6上主题抗体结合的N-端结合位点以外的区域。PDZ结构域多肽例如MAGI-1和MUPP1，典型地与致癌E6蛋白的C-端区域中的PDZ结构域基序结合。
表8
总的来说，用于制造抗体、特别是单克隆抗体的方法在本技术领域中是公知的，并描述在各种公知的实验室手册中(例如Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies：ALaboratory Manual)第一版(1988)Cold spring Harbor，N.Y.；Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies：ALaboratory Manual)，CSHL Press(1999)，以及Ausubel等，《分子生物学简明方案》(Short Protocols in Molecular Biology)，第三版，Wiley&Sons，(1995))。因此，对于给定的肽序列来说，用于制造主题抗体的方法在本文中不需很详细地描述。可以使用较长的含有所述共同基序的全长E6蛋白(例如全长蛋白)的任何片段、全长E6蛋白或其融合蛋白来制造主题抗体。在某些实施方案中，可以使用全长E6蛋白、含有所述序列的肽、或其化学修饰(例如偶联的)衍生物或融合体(例如MBP或GST融合体)作为抗原。在某些实施方案中，可以使用编码多肽的核酸或者使用不同多肽的混合物(例如E6多肽的混合物，每种多肽来自于不同HPV毒株)作为抗原(Michel(2002)Vaccine 20：A83-A88)。因此，将抗原与佐剂混合，并使用标准的免疫接种技术(例如肌肉内注射)免疫接种适合的非人类动物(例如小鼠、鸡、山羊、兔、仓鼠、马、大鼠或豚鼠等)，并在建立起特异性免疫应答后，可以从动物收集血液，并可以分离与所述肽特异性结合的抗血清。在许多情况下，将来自免疫接种的动物脾脏的细胞与骨髓瘤细胞系融合，并在融合后将细胞在含有例如次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT)的选择培养基上生长来筛选杂交瘤生长，杂交瘤集落在2-3周后出现。从来自这些培养的杂交瘤细胞的上清液筛选抗体分泌，通常是通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)等，并可以按照标准程序筛选分泌抗原特异性单克隆抗体的阳性克隆并对其进行扩增。
因此，取决于所需抗体，使用所述肽或所述肽的混合物(例如2、3、4、5或约6种以上、约10种以上或约15种以上、通常多达约20或30种以上的上述肽的混合物)免疫接种适合的动物。抗体通常从动物分离，并使用标准方法(例如ELISA、Western印迹等)测试其与不同HPV E6蛋白的结合。因此，在许多实施方案中，筛选抗体与来自HPV毒株16和18、HPV毒株16、18、31、33和45、或在某些实施方案中来自HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82以及可能其他毒株的E6蛋白的结合。因此，可以鉴定与来自一种以上HPV毒株的E6蛋白结合、即交叉反应的抗体，并且可以使用已知方法建立产生那些抗体的永久细胞系。换句话说，通常测试抗体与一种以上抗原的结合，并且那些抗原通常是来自各种HPV毒株的E6蛋白或其片段。在大多数实施方案中，将测试抗体与天然和变性状态下的抗原的结合。与多种E6蛋白结合的抗体具有所需结合性质，因此可用于本发明的方法。
在一个实例中，上文中列出的高危HPV类型的E6蛋白的N-端区域的编码多核苷酸可以化学合成或通过RT-PCR从宫颈癌细胞系克隆。KLH-E6和卵清蛋白-E6(OVA-E6)两种融合蛋白类型都可以使用。KLH-E6和OVA-E6蛋白可以通过本技术领域中的标准方案来生产。蛋白可以使用IPTG驱动的诱导在大肠杆菌DH5α中表达。在37℃下诱导2小时可以产生约1mg/L的KLH-E6或OVA-E6肽，而在20℃下诱导过夜并纯化、包括将蛋白重新结合于凝胶基质，可以产生2-10mg/L的最终产率。此外，在低于37℃的温度下进行蛋白表达可以使蛋白更好地折叠，从而使天然表位得到更好保护，增加了产生对多种致癌HPV毒株的E6的N-端特异性的抗体、即针对致癌E6蛋白的泛特异性抗体的可能性。根据PAGE分析估计，KLH-E6或OVA-E6蛋白的纯度＞90％。E6融合蛋白可以用作免疫原。
然后可以用每种致癌HPV E6蛋白、例如N-端序列免疫接种小鼠。试验了各种免疫接种方案，包括不同的抗原剂量(100μg-10μg)、佐剂(CFA/IFA、poly(I)-poly(C)、CpG+明矾)和途径(皮下、腹膜内)。与进行动物护理、免疫接种操作和血清收集的服务机构签订了合同(Josman，Napa，CA)。使用5-15只小鼠建立每个免疫接种计划。将免疫接种的小鼠的血清在ELISA中针对重组E6蛋白进行测试。选择在其血清中显示出足够高的针对E6的滴度(以1∶1000稀释时OD高于1)的小鼠用于融合。为了增加分泌抗E6抗体的杂交瘤的频率，在最终加强免疫中使用的E6蛋白含有与免疫接种期间使用的不同的标签，例如，当使用麦芽糖结合蛋白(MBP)-E6免疫接种肽进行免疫接种时，在加强免疫中使用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-E6免疫接种肽，反之亦然。用于产生抗E6抗体的详细的免疫接种方法公开在美国专利No.7,399,467中，在此以其全文引为参考。
在一个实例中，上文中列出的高危HPV类型的E6蛋白的C-端区域的编码多核苷酸可以化学合成或通过RT-PCR从宫颈癌细胞系克隆。麦芽糖结合蛋白-E6(MBP-E6)和谷胱甘肽-S-转移酶-E6(GST-E6)两种融合蛋白类型都可以使用。GST-E6和MBP-E6蛋白可以通过供应商(分别为Amersham和New England Biolabs)推荐的标准方案来生产。蛋白可以使用IPTG驱动的诱导在大肠杆菌DH5α中表达。在37℃下诱导2小时产生约1mg/L的GST-E6或MBP-E6重组蛋白，而在20℃下诱导过夜并纯化、包括将蛋白重新结合于凝胶基质，可以产生2-10mg/L的最终产率。此外，在低于37℃的温度下进行蛋白表达可以使蛋白更好地折叠，从而使天然表位得到更好保护，增加了产生对多种致癌HPV毒株的E6的C-端特异性的抗体、即针对致癌E6蛋白的泛特异性抗体的可能性。根据PAGE分析估计，MBP-E6蛋白的纯度＞90％。重组E6融合蛋白可以用作免疫原。
然后可以用各种致癌HPV E6蛋白的C-端序列免疫接种小鼠。试验了各种免疫接种方案，包括不同的抗原剂量(100μg-10μg)、佐剂(CFA/IFA、poly(I)-poly(C)、CpG+明矾)和途径(皮下、腹膜内)。与进行动物护理、免疫接种操作和血清收集的服务机构签订了合同(Josman，Napa，CA)。使用2-15只小鼠建立每个免疫接种计划。将免疫接种的小鼠的血清在ELISA中针对重组E6蛋白进行测试。选择在其血清中显示出足够高的针对E6的滴度(以1∶1000稀释时OD高于1)的小鼠用于融合。为了增加分泌抗E6抗体的杂交瘤的频率，在最终加强免疫中使用的重组E6蛋白含有与免疫接种期间使用的不同的标签，例如，当用MBP-E6免疫接种肽进行免疫接种时，在加强免疫中使用GST-E6免疫接种肽，反之亦然。在一些实施方案中，含有T细胞表位的免疫接种肽不含标签。
适合用于免疫接种的示例性E6肽描述在表1中。肽被显示为“共有”序列(即其中在一个或多个位置处可以存在几种氨基酸中的一种的肽)，以便表明由共有序列所描述的任一种肽或不同肽的混合物可用于制造主题抗体。因此，当描述共有序列时，应该认为明确地描述了属于共有序列中的每个单独肽。在特定实施方案中，共有序列所涵盖的示例性肽种类具有在天然存在的HPV E6蛋白中所发现的序列。这样的示例性序列可以被鉴定为在由表1的第三列、特定HPV类型“HPV类型”的“起始AA”所定义的氨基酸位置以及其他HPV E6蛋白的相应位置(即与表1中指示的位置对齐的那些位置)处开始。
在一个实例中，上文中列出的高危HPV类型的E6蛋白的编码多核苷酸可以化学合成(DNA 2.0，Menlo Park，California)或通过RT-PCR从宫颈癌细胞系克隆。麦芽糖结合蛋白-E6(MBP-E6)和谷胱甘肽-S-转移酶-E6(GST-E6)两种融合蛋白类型都可以使用。GST-E6和MBP-E6蛋白可以通过供应商(分别为Amersham和New England Biolabs)推荐的标准方案来生产。使用IPTG驱动的诱导将蛋白在大肠杆菌DH5α中表达。在37℃下诱导2小时可以产生约1mg/L的GST-E6或MBP-E6重组蛋白，而在20℃下诱导过夜并纯化、包括将蛋白重新结合于凝胶基质，可以产生2-10mg/L的最终产率。根据PAGE分析估计，MBP-E6蛋白的纯度＞90％。重组E6融合蛋白可以用作免疫原。
正如本技术领域中公知的，如上所述，主题抗体可以与可检测标记物偶联，或者可以是信号产生系统的一部分。产生针对HPV E6蛋白的抗体的详细公开内容，包括动物的免疫接种、分泌针对E6蛋白的单克隆抗体的杂交瘤的融合、筛选和克隆，可以在美国专利No.7,399,467中看到，在此以其全文引为参考。
因此，使用上面提出的方法，提供了用于检测多种HPV E6蛋白的抗体组合物。在某些实施方案中，可以使用识别至少5、7、9、12、15、20或24种不同HPV毒株的不同抗体的混合物。该组合物可以含有识别至少3种不同致癌E6蛋白的抗体的组合。该组合物可以含有1、2、3、4或5种以上不同抗体，组合物的每种抗体识别至少一种(例如2、3、约5种、约10种等)E6蛋白。合在一起，抗体结合全部或一部分本文中公开的多种HPV毒株的E6蛋白。抗体可以混合，或可以彼此分开，即在不同容器中。
上面所述的任何抗体可以与表9中显示的表位结合。
表9：表位
可以通过本技术领域已知的任何方法筛选本发明的抗体与致癌E6蛋白的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，所述系统使用技术例如Westem印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和细胞免疫染色(固定或天然的)测定法，略举数例。这样的测定法是常规的并且在本技术领域中是公知的(参见例如Ausubel等主编，1994，《分子生物学现代方法》(Current Protocols加MolecularBiology)，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York，在此以其全文引为参考)。
生产上述和下述单克隆抗体的某些杂交瘤可以保藏在ATCC，例如杂交瘤细胞系4E9.7(PTA-9679)、4E10.2(PTA-9680)和6H5.3(PTA-9681)。任何所保藏的杂交瘤、由那些杂交瘤产生的抗体、以及与那些杂交瘤所产生的抗体结合的表位相同的其他抗体，也是本发明的实施方案，并可以在本文中进行权力要求。这样的抗体可用于本文所述的任何方法中。
为了对主题抗体的特异性进行进一步表征或验证，可以使用免疫细胞化学方法，使用本技术领域公知的技术，在用能够表达抗原的载体或仅仅是载体转染的细胞(例如哺乳动物细胞、例如CHO细胞)上对本发明的抗体进行筛选。结合抗原转染的细胞、但是不结合只用载体转染的细胞的抗体，是抗原特异性的。在某些实施方案中，测定法是抗原捕获测定法，并且抗体阵列或微阵列可用于此目的。制造和使用多肽微阵列的方法在本技术领域中是已知的(参见例如美国专利6,372,483、6,352,842、6,346,416和6,242,266)。
可用于筛选本发明的特异性抗体的肽的实例包括但不限于表2中列出的那些肽。
任何所保藏的杂交瘤、由那些杂交瘤产生的抗体、以及与那些杂交瘤所产生的抗体结合的表位相同的其他抗体，也是本发明的实施方案，并可以在本文中进行权力要求。这样的抗体可用于本文所述的任何方法中。
检测样品中的HPV E6蛋白
一方面，本发明提供了检测样品中HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含将与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合的抗体与样品相接触，以及检测所述抗体与样品中的E6蛋白的任何结合的步骤；其中所述抗体与样品中的E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株。在一些实施方案中，HPV毒株是致癌毒株。当主题抗体靶向E6蛋白的N-端时，主题抗体可以与结合E6蛋白C-端区域中的PDZ结构域的抗体或含PDZ结构域的多肽组合使用。本发明的抗体可以避免屏蔽E6蛋白上的PDZ结合结构域。
一方面，本发明提供了检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的方法，所述方法包含将与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合的抗体与样品相接触，以及检测所述抗体与样品中的E6蛋白的任何结合的步骤；其中所述抗体与样品中的E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种致癌HPV毒株。
总的来说，主题方法包含将怀疑具有HPV的样品与特异性结合到致癌E6蛋白的N或C端的捕获抗体相接触，将样品与特异性针对相同E6蛋白的检测抗体相接触，以及评估抗体混合物与样品的任何结合。本发明的抗体可以用作检测E6蛋白的捕获或检测生物试剂。在大多数实施方案中，主题抗体与E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种高危HPV毒株。
本发明的抗体可用于通过本技术领域已知的任何方法，与至少两种高危HPV毒株的致癌E6蛋白的N-端或C-端进行免疫特异性结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，所述系统使用技术例如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法、免疫组织化学和细胞免疫染色(固定或天然的)测定法，略举数例。这样的测定法是常规的并且在本技术领域中是公知的(参见例如Ausubel等主编，1994，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York，在此以其全文引为参考)。示例性的免疫测定法在下文中简要描述(但是不打算作为限制)。
在一些实施方案中，本发明的方法利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、优选为夹心ELISA来检测与本发明的抗体组合物结合的致癌E6蛋白的存在。当在本文中使用时，术语“夹心”、“夹心ELISA”、“夹心诊断”和“捕获ELISA”都是指使用两种不同测剂检测生物多肽的概念。在一些实施方案中，夹心测定法包含与致癌E6蛋白、例如至少两种高危HPV毒株的E6蛋白特异性结合的两种抗体。在一些实施方案中，主题抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作固定化抗体以捕获E6蛋白。例如，这样的ELISA可以包含(a)将主题抗体与样品相接触；(b)将结合于主题抗体的E6蛋白与在不同于主题抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合的第二抗体或含PDZ结构域的多肽相接触；以及(c)检测第二抗体或PDZ结构域多肽与E6蛋白的结合，由此检测样品中E6蛋白的存在。在其他实施方案中，抗体在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中用作检测抗体，以检测与E6蛋白的特异性捕获抗体或含PDZ结构域的多肽结合的E6蛋白。例如，这样的ELISA可以包含(a)将样品与在不同于主题抗体的结合位点处与E6蛋白特异性结合的抗体或含PDZ结构域的多肽相接触；(b)将与该抗体或PDZ结构域多肽结合的E6蛋白与主题抗体相接触；以及(c)检测主题抗体与E6蛋白的结合，从而检测样品中E6蛋白的存在。捕获抗体或PDZ结构域多肽可以固定化或可以不固定化到基材上。
ELISA是本技术领域中公知的技术。简单来说，ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔多孔板的孔，向孔中加入与可检测化合物例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的目标抗体并温育一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，目标抗体不是必须与可检测化合物偶联；可以代之以向孔中加入与可检测化合物偶联的第二抗体(其识别目标抗体)。此外，代替用抗原包被孔，可以将抗体包被到孔上。在这种情况下，可以在向包被的孔中加入目标抗原后加入与可检测化合物偶联的第二抗体。本技术领域的专业人员将会了解可以被修改以增加被检测信号的参数以及本技术领域中已知的其他ELISA变化形式。
正如上文中所讨论的，应该认识到在上面描述的测定法中许多步骤可以被改变，例如，可以使用各种基材来结合抗体，可以使用识别不同E6表位的抗体，可以使用用于检测抗体-E6相互作用的不同标记物，以及可以使用不同检测方法。
抗体检测测定法可以利用各种表面来结合抗体或抗体片段。例如，表面可以是“测定板”，其对蛋白的附着最优的材料(例如聚苯乙烯)形成。总的来说，测定板的各个孔具有高的表面积与体积比，因此适合的形状是平底孔(测定法中的蛋白质附着的地方)。其他表面包括但不限于聚苯乙烯或玻璃珠、聚苯乙烯或玻璃载片、纤维素、硝酸纤维素、纸、浸棒、塑料、薄膜等。
例如，测定板可以是“微量滴定板”。当在本文中使用时，术语“微量滴定”板是指例如具有约30至200个独立的孔、通常为96个孔的多孔测定板。或者，可以使用高密度阵列。通常，微量滴定板的单个孔容纳约250μl的最大体积。便利地，测定板是96孔聚苯乙烯板(例如由Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，N.J.销售的)，其允许进行自动和高通量筛选。其他表面包括聚苯乙烯ELISA微量滴定板，例如由Nunc Maxisorp，Inter Med，Denmark销售的。通常，向测定板的每个孔加入约50μl至300μl、更优选100μl至200μl的其中悬浮有缓冲剂的水性样品。
本发明的可检测标记物可以是与分子例如本发明的抗E6第二抗体直接或间接偶联的任何可检测化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况下，能够催化底物化合物或组合物的可以被检测的化学变化。优选的标记物是催化非放射活性颜色试剂的颜色变化的酶标记物。
直接标记物包括但不限于放射性同位素(例如125I、35S等)；产物可检测的酶(例如萤光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶等)；荧光标记物(例如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白等)；通过金属螯合基团例如EDTA连接于抗体的发荧光金属，例如152Eu或其他镧系金属；化学发光化合物例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等；生物发光化合物例如萤光素；荧光蛋白等。荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于GFP的“人源化”版本，例如其中天然存在的核苷酸序列的密码子被改变成与人类密码子偏倚更紧密匹配；源自于维多利亚水母(Aequoria victoria)的GFP或其衍生物，例如“人源化”衍生物例如可商购的增强GFP；源自于其他物种例如海肾(Renilla reniformis)、Renilla mulleri或Ptilosarcus guernyi的GFP，如WO 99/49019和Peelle等，(2001)J.Protein Chem.20：507-519中所述；“人源化”重组GFP(hrGFP)(Stratagene)；来自珊瑚虫物种的多种荧光和有色蛋白的任一种，如Matz等，(1999)Nature Biotechnol.17：969-973中所述；等等。
有时，标记物与抗体间接偶联。专业技术人员了解用于直接和间接偶联的各种技术。例如，抗体可以与生物素偶联，并且上面提到的任何类型的标记物都可以与亲和素偶联，反之亦然(也参见上面的“A”和“G”测定法)。生物素与亲和素选择性结合，因此标记物能够通过这种间接方式与抗体偶联。对于涉及生物素-亲和素偶联和类似测定法的技术的综述，参见Ausubel，同上。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小的半抗原(例如地高辛)偶联，并将上面提到的不同类型标记物中的一种与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。由此可以实现标记物与抗体的间接偶联。
测定法的变化可以包括不同的清洗步骤。“清洗”是指将固相暴露于水性溶液(通常为缓冲液或细胞培养基)以便将未结合物质(例如非黏附性细胞、非黏附性捕获剂、未结合配体、受体、受体构建物、细胞裂解物或HRP抗体)从其上移除。为了降低背景噪音，便利的是在清洗溶液中包括去污剂(例如Triton X)。通常，在清洗后将水性清洗溶液从测定板的孔中倒出。可以使用自动化清洗装置方便地完成清洗。有时，可能需要几个清洗步骤(例如约1至10个清洗步骤)。
在本发明的夹心检测测定法中也可以使用各种缓冲液。例如，可以使用各种阻断缓冲液来降低测定法的背景。术语“阻断缓冲液”是指水性、pH缓冲的溶液，其含有至少一种能够与基材的没有被含PL或PDZ的蛋白包被的暴露表面结合的阻断化合物。阻断化合物一般是蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、明胶、酪蛋白或奶粉，并且不与测定中的任何试剂交叉反应。阻断缓冲液通常提供约7至7.5之间的pH，并且适合的缓冲剂包括磷酸盐和TRIS。
在检测第一抗体-E6-第二抗体的夹心相互作用中也可以使用各种酶-底物组合。酶-底物组合的实例包括但不限于例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP或HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺[OPD]或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐[TMB])(如上所述)。
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的磷酸对硝基苯酯。
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或产荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶。
对于本技术领域的专业人员来说，有大量其他酶-底物组合可用。对于其一般性综述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980，二者在此以其全文引为参考。
在本文中详细描述了抗体ELISA的优选实施方案。然而，普通的专业从业人员将会认识到，这些测定法可以用许多方式进行修改，同时仍可用于本发明的目的。在一些实施方案中，捕获抗体被固定化在固体表面上。结合抗体的基材可以采取各种形式中的任一种，例如微量滴定板、试管、浸棒、微量离心管、珠子、可离心盘、透性或半透性膜等。适合的材料包括玻璃、塑料(例如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯等)、蛋白质、纸、糖类、脂质单层或承载的脂质双层、薄膜和其他固体支持物。可以使用的其他材料包括陶瓷、金属、类金属、半导体材料、水泥等。
在一些实施方案中，捕获抗体被组织成阵列。当在本文中使用时，术语“阵列”是指固定化蛋白质的有序排列，其中特定的不同蛋白质(即识别不同HPV毒株的不同E6蛋白或E6蛋白的不同表位)位于基材上的不同预定位点处。因为特定抗体在阵列上的位置是已知的，因此在该位置处的结合可以与位于该位置处的抗原的结合相关联。抗体在珠子上的固定化(单个或成组地)是另一种特别有用的方法。在一个实施方案中，单个抗体被固定化在珠子上。在一个实施方案中，使用了可辨别的珠子的混合物。可辨别的珠子是能够在性质例如大小、磁性质、颜色(例如使用流式细胞术)或亲和标签(例如可以使用IgG亲和方法，将用蛋白A包被的珠子与没有用蛋白A包被的珠子分离开)的基础上彼此分离开的珠子。可以测定与特定HPV蛋白的结合。
当使用抗体介导的固定化方法时，玻璃和塑料是特别有用的基材。基材可以用疏水性(例如特氟龙)掩膜印刷以形成孔。每14.5cm2载片“工作面积”具有3、10和21个孔的预先印好的玻璃载片可以从例如SPI Supplies，West Chester，Pa.获得，也参见美国专利No.4,011,350。在某些应用中，使用以96孔格式印刷的大格式(12.4cmx8.3cm)玻璃载片；这种格式便于使用自动化液体操作设备并利用各种类型(荧光、比色、闪烁)的96孔格式读板器。然而，可以使用更高的密度(例如每cm2超过10或100个多肽)。参见例如MacBeath等，2000，Science 289：1760-63。典型地，抗体通过吸附结合于基材(例如玻璃基材)。适合的吸附条件在本技术领域中是公知的，并包括将0.5-50μg/ml(例如10μg/m1)在缓冲液(例如PBS或50至300mM Tris、MOPS、HEPES、PIPES、乙酸盐缓冲液，在4℃下pH 6.5至8)中的mAb在37℃下温育1小时至24小时以上。蛋白可以共价结合或通过非特异性结合进行非共价连接。如果需要蛋白质与表面之间的共价键合，表面通常是多官能的或能够被多官能化。可以存在于表面上并用于连接的官能团可以包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基、巯基等。将广泛的各种化合物连接到各种表面的方式是公知的，并且在文献中有详尽说明。
用主题抗体结合和检测E6蛋白可以通过任何基于免疫学的测定法，例如免疫沉淀、Western印迹、酶免疫测定法(EIA)、拉曼光谱术、侧向流、细胞流式微球阵列(CBA)。这些测定法在本技术领域中是公知的，并且在下文中进行简要描述。
免疫沉淀方案一般包括将细胞群体在增补有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑酶肽、钒酸钠)的裂解缓冲液例如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01 M pH 7.2的磷酸钠，1％Trasylol)中裂解，向细胞裂解物加入目标抗体，在4℃下温育一段时间(例如1-4小时)，向细胞裂解物加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在4℃下温育约1小时以上，在裂解缓冲液中清洗珠子并将珠子重悬浮在SDS/样品缓冲液中。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如Western印迹分析来评估。本技术领域的专业人员将会了解可以被修改以增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如用琼脂糖珠预先清理细胞裂解物)。
Western印迹分析一般包括蛋白质样品的制备，然后将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶(例如取决于抗原的分子量，8％-20％的SDS-PAGE)中电泳，并将分离的蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜例如硝酸纤维素、PVDF或尼龙。在转移后，将膜在阻断溶液(例如含有3％BSA或脱脂奶的PBS)中阻断，在清洗缓冲液(例如PBS-Tween 20)中清洗，并与在阻断缓冲液中稀释的第一抗体(目标抗体)温育。在该温育之后，将膜在清洗缓冲液中清洗，与偶联有酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶底物)或放射活性分子(例如32P或125I)的第二抗体(其识别第一抗体，例如抗人类抗体)温育，在进一步清洗后，可以检测抗原的存在。本技术领域的专业人员将会了解可以被修改以增加检测信号并降低背景噪音的参数。
表面增强拉曼散射纳米技术是用于表面和界面研究的有价值工具。与这种方法相伴的增强克服了普通拉曼散射中传统的低灵敏度问题。具体应用之一是它使得对于生物检测和生物指纹分析而言在金属表面上检测微量生物化学物质例如DNA、RNA、蛋白质变得可行。在一些实施方案中，拉曼光谱纳米技术可用于检测主题抗体与致癌E6蛋白的结合。
在一些实施方案中，流式微球阵列(CBA)可用于检测主题抗体与致癌E6蛋白的结合。流式微球阵列(CBA)、通常被称为多路微球测定法，是可用于捕获和定量可溶性分析物例如E6蛋白的一系列光谱上不连续的粒子。然后通过基于荧光的发射检测和流式细胞分析来测量分析物。用于CBA的基本“夹心测定法”大纲和方案可以在BD Biosciences获得。CBA产生与基于ELISA的测定法相当的数据，但是以“多路”或同时的方式。流式微球阵列的未知物浓度计算与任何夹心格式测定法相同，即通过使用已知标准品并将未知物对标准曲线进行作图。
在一些实施方案中，可以使用免疫侧向流测定法来检测主题抗体与样品中致癌E6蛋白的结合。在一些实施方案中，致癌HPV E6被制备在测试条上。例如，可以使用与致癌HPVE6结合的本发明的可检测标记抗体来检测致癌HPV E6。致癌HPV E6可以例如使用反射分光光度计或通过肉眼定量。用于分析物检测的方法和组合物公开在美国专利申请公开号US20080199851中，在此以其全文引为参考。在一些实施方案中，本发明的捕获抗体可以融合或结合到另一个部分上，所述部分包括但不限于所有寡核苷酸、亲和素、链亲合素、吡喃糖基RNA(pRNA)、适配体或其组合。捕获抗体或PDZ结构域多肽可以固定化或可以不固定化到基材上。
在一些实施方案中，存在来自一种致癌HPV毒株的E6蛋白，并使用本发明的抗体组合物和方法在测试条上对其进行检测。在其他实施方案中，本发明的抗体组合物和方法允许检测样品中来自至少两种致癌HPV毒株例如HPV16和HPV18的E6蛋白。在一些实施方案中，抗体与至少3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的致癌HPV毒株、包括但不限于HPV16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。HPV毒株特异性的E6蛋白检测允许使用测试条检测E6蛋白的存在，其中不同HPV毒株可以在一个测试条上的不同测试线处检测。
在许多实施方案中，通过将样品施加到测试条的一端，并允许蛋白通过毛细作用或侧向流迁移，将致癌HPV E6与样品中的其他蛋白分离开。用于侧向流分离、检测和定量的方法和装置在本技术领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,569,608、6,297,020和6,403,383。在这些实施方案中，测试条以从近端到远端的次序包含用于上样的区域(载样区)和含有可以是本发明的抗体的捕获抗体的测试区域。将样品上到载样区上，并将测试条的近端置于缓冲液中。致癌E6蛋白被第一测试区中的结合抗体捕获。被捕获的致癌E6蛋白的检测如下所述进行。例如，被捕获E6蛋白的检测使用抗E6检测抗体来进行。主题抗体可以在侧向流测定法中用作检测抗体。抗E6检测抗体可以被可检测地标记。在一些实施方案中，检测抗体特异性针对所有致癌E6蛋白共有的E6蛋白表位，或能够一起与所有致癌E6蛋白结合的抗体的混合物。
在一些实施方案中，可以使用免疫组织化学测定法检测主题抗体与样品例如组织学样品中的致癌E6蛋白的结合。在一些实施方案中，测定法可以是基于载片的E6蛋白检测。免疫组织化学或IHC是指利用抗体与生物组织中的抗原特异性结合的原理，对组织切片的细胞中的蛋白进行定位的方法。抗体-抗原相互作用的可视化可以采取多种方式来实现。在最常见情况下，将抗体与能够催化产色反应的酶例如过氧化物酶偶联。或者，抗体也可以带有荧光团标签，例如FITC、罗丹明、德克萨斯红或Alexa Fluor。对于IHC来说，样品可以是从目标组织获得的薄(约4-40μm)切片，或者如果组织不是非常厚并且可穿透，可以是整个组织。在使用主题抗体检测致癌E6蛋白的IHC中使用的样品可以是宫颈刮片或宫颈活检组织。
通过抗体夹心测定法检测样品中的HPV E6蛋白的方法
一方面，本发明提供了使用抗体夹心检测方法检测样品中的HPV E6蛋白的方法。总体而言，所述方法包含(a)将与至少一种HPV毒株的E6蛋白特异性结合的第一捕获抗体与样品相接触；(b)将结合于固定化的第一抗体的E6蛋白与特异性结合至少一种HPV毒株的E6蛋白的第二抗体相接触；以及(c)检测第二抗体与E6蛋白的结合，由此检测样品中的E6蛋白；其中第二抗体与E6蛋白的结合表明样品中存在至少一种HPV毒株。
当在本文中使用时，术语“夹心”、“夹心ELISA”、“夹心诊断”和“捕获ELISA”都是指使用两种不同测试剂检测生物多肽的概念。在一些实施方案中，夹心测定法包含与HPV蛋白、例如至少一种HPV毒株的E6蛋白特异性结合的两种抗体。所述两种抗体可以与E6上的相同表位或E6蛋白的两个不同表位结合。例如，一种抗E6抗体可以附着于固相支持物。可以使测试样品在表面上通过，并且抗E6第一抗体能够结合其关联E6蛋白。然后可以使用带有检测试剂的抗体来确定特定HPV蛋白、例如E6蛋白是否已结合于抗E6第一抗体。术语“特异性结合”是指两个分子例如配体和受体之间的结合，其特征在于分子(配体)即使在存在许多其他各种各样分子的情况下也能与另一种特定分子(受体)缔合的能力，即在分子的异质混合物中一种分子显示出与另一种分子的优先结合。配体与受体的特异性结合，也通过在存在过量未标记配体的情况下，可检测标记配体与受体结合的减少来证实(即结合性竞争测定法)。
对于双阶段或夹心方法来说，第一抗体能够在E6蛋白上不降低第二抗体与同一E6蛋白结合的有效性的位置或表位处，与E6肿瘤蛋白结合。夹心方法能够通过降低背景信号和放大适合的信号来提高诊断的信噪比。可以产生特异性识别诊断蛋白的抗体。
在本文中详细描述了抗体夹心测定法的优选实施方案。然而，普通专业技术人员将会认识到，这些测定法可以用大量方式进行修改，同时仍可用于本发明的目的。在一些实施方案中，捕获抗体被固定化在固体表面上。用于结合抗体的基材可以采取各种形式中的任一种，例如微量滴定板、试管、浸棒、微量离心管、珠子、可旋转盘、可透性或半透性膜等。适合的材料包括玻璃、塑料(例如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、纤维素、硝酸纤维素等)、蛋白质、纸、糖类、脂质单层或承载的脂质双层、薄膜和其他固体支持物。可以使用的其他材料包括陶瓷、金属、类金属、半导体材料、水泥等。
在一些实施方案中，捕获抗体被组织成阵列。当在本文中使用时，术语“阵列”是指固定化蛋白质的有序排列，其中特定的不同蛋白质(即识别不同HPV蛋白或HPV蛋白例如E6蛋白的不同表位)位于基材上的不同预定位点处。因为特定抗体在阵列上的位置是已知的，因此在该位置处的结合可以与位于该位置处的抗原的结合相关联。抗体在珠子上的固定化(单个或成组地)是另一种特别有用的方法。在一个实施方案中，单个抗体被固定化在珠子上。在一个实施方案中，使用了可辨别的珠子的混合物。可辨别的珠子是能够在性质例如大小、磁性质、颜色(例如使用FACS)或亲和标签(例如可以使用IgG亲和方法将用蛋白A包被的珠子与没有用蛋白A包被的珠子分离开)的基础上彼此分离开的珠子。可以测定与特定HPV蛋白的结合。
当使用抗体介导的固定化方法时，玻璃和塑料是特别有用的基材。基材可以用疏水性(例如特氟龙)掩膜印刷以形成孔。每14.5cm2载片“工作面积”具有3、10和21个孔的预先印好的玻璃载片可以从例如SPI Supplies，West Chester，Pa.获得；也参见美国专利No.4,011,350。在某些应用中，使用以96孔格式印刷的大格式(12.4cmx8.3cm)玻璃载片；这种格式便于使用自动化液体操作设备并利用各种类型(荧光、比色、闪烁)的96孔格式读板器。然而，可以使用更高的密度(例如每cm2超过10或100个多肽)。参见例如MacBeath等，2000，Science 289：1760-63。典型地，抗体通过吸附结合于基材(例如玻璃基材)。适合的吸附条件在本技术领域中是公知的，并包括将0.5-50μg/ml(例如10μg/ml)在缓冲液(例如PBS或50至300mM Tris、MOPS、HEPES、PIPES、乙酸盐缓冲液，在4℃下pH 6.5至8)中的mAb在37℃下温育1小时至24小时以上。蛋白可以共价结合或通过非特异性结合进行非共价连接。如果需要融合蛋白与表面之间的共价结合，表面通常是多官能的或能够被多官能化。可以存在于表面上并用于连接的官能团可以包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基、巯基等。将广泛的各种化合物连接到各种表面的方式是公知的，并且在文献中有详尽说明。
致癌E6蛋白也可以通过它们与PDZ结构域结合的能力来检测。因此，在一些实施方案中，将本发明的方法、即使用抗E6抗体夹心测定法检测致癌E6蛋白的方法，与使用PDZ结构域多肽检测致癌E6蛋白的方法进行比较，后一种方法包含将含有或可能含有致癌HPV E6蛋白的样品与PDZ结构域多肽相接触，并检测样品中的致癌HPV E6蛋白与PDZ结构域多肽的任何结合，其中结合表明样品中存在致癌HPV E6蛋白，因此存在致癌HPV毒株。在一些实施方案中，本发明的方法与使用PDZ结构域多肽检测E6蛋白相比，将检测致癌E6蛋白的信噪比增加了约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100倍或以上。在一些实施方案中，所述方法与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，具有更高的检测致癌HPV E6蛋白的特异性。所述方法与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，还可以具有更高的检测致癌HPV E6蛋白的灵敏度。灵敏度可以通过在给定的样品体积中可以被主题抗体检测的E6分子的数量来度量。灵敏度也可以通过每份给定体积样品中HPV感染细胞的数量来度量。在其他实施方案中，所述方法与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，产生了更低的错误检测致癌HPV E6蛋白的假阳性率。使用本发明的方法检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的假阳性率，可以是约10％、9％、8％、7、％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或以下。
在一些实施方案中，本发明的方法利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来检测结合于本发明的抗体组合物的致癌E6蛋白的存在。ELISA是本技术领域中公知的技术。简单来说，ELISA包括制备抗原，用所述抗原包被96孔多孔板的孔，向孔中加入与可检测化合物例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的目标抗体并温育一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，目标抗体不是必须与可检测化合物偶联；可以代之以向孔中加入与可检测化合物偶联的第二抗体(其识别目标抗体)。此外，代替用抗原包被孔，可以将抗体包被到孔上。在这种情况下，可以在向包被的孔加入目标抗原后加入与可检测化合物偶联的第二抗体。本技术领域的专业人员将会了解可以被修改以增加被检测信号的参数以及本技术领域中已知的其他ELISA变化形式。
抗体与抗原例如E6蛋白的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离率(off-rate)可以通过竞争性结合测定法来测定。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，其包含将标记的抗原(例如3H或125I)与目标抗体在渐增量的未标记抗原存在下温育，以及检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性和结合解离率可以通过scatchard作图分析从数据来确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定法测定。在这种情况下，将抗原与偶联有标记化合物(例如3H或125I)的目标抗体，在渐增量的未标记的第二抗体存在下温育。
然而，在某些实施方案中，测定法是抗原捕获测定法，为此目的可以使用抗体的阵列或微阵列来捕获一种以上致癌HPV毒株的E6蛋白。制造和使用多肽微阵列的方法在本技术领域中是已知的(参见例如美国专利6,372,483、6,352,842、6,346,416和6,242,266)。
测定法变化形式
正如上面所讨论的，应该认识到在上面描述的测定法中许多步骤可以被改变，例如，可以使用各种基材来结合抗体；可以使用识别不同E6表位的抗体；可以使用用于检测抗体-E6相互作用的不同标记物；以及可以使用不同检测方式。
抗体夹心检测测定法可以利用各种表面来结合抗体或抗体片段。例如，表面可以是“测定板”，其由蛋白与其的附着最优的材料(例如聚苯乙烯)形成。总的来说，测定板的各个孔具有高的表面积与体积比，因此适合的形状是平底孔(测定法的蛋白质附着的地方)。其他表面包括但不限于聚苯乙烯或玻璃珠、聚苯乙烯或玻璃载片、纸、浸棒、塑料、薄膜等。
例如，测定板可以是“微量滴定板”。当在本文中使用时，术语“微量滴定”板是指例如具有约30至200个独立的孔、通常为96个孔的多孔测定板。或者，可以使用高密度阵列。通常，微量滴定板的单个孔容纳约250μl的最大体积。便利地，测定板是96孔聚苯乙烯板(例如由Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，N.J.销售的)，其允许进行自动和高通量筛选。其他表面包括聚苯乙烯ELISA微量滴定板，例如由Nunc Maxisorp，Inter Med，Denmark销售的。通常，向测定板的每个孔加入约50μl至300μl、更优选100μl至200μl的其中悬浮有缓冲剂的水性样品。
本发明的可检测标记物可以是与分子例如本发明的抗E6第二抗体直接或间接偶联的任何可检测化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况下，能够催化底物化合物或组合物的可以被检测的化学变化。优选的标记物是催化非放射活性颜色试剂的颜色变化的酶标记物。
直接标记物包括但不限于放射性同位素(例如125I、35S等)；产物可检测的酶(例如萤光素酶、B-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶等)；荧光标记物(例如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白等)；通过金属螯合基团例如EDTA连接于抗体的发荧光金属，例如152Eu或其他镧系金属；化学发光化合物例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等；生物发光化合物例如萤光素；荧光蛋白等。荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于GFP的“人源化”版本，例如其中天然存在的核苷酸序列被改变成与人类密码子偏倚更紧密匹配；源自于维多利亚水母(Aequoria victoria)的GFP或其衍生物，例如“人源化”衍生物例如可以从例如Clontech，Inc.商购的增强GFP；源自于其他物种例如海肾(Renilla reniformis)、Renillamulleri或Ptilosarcus guernyi的GFP，如WO 99/49019和Peelle等，(2001)J.ProteinChem.20：507-519中所描述的；“人源化”重组GFP(hrGFP)(Stratagene)；来自珊瑚虫物种的多种荧光和有色蛋白的任一种，如Matz等，(1999)Nature Biotechnol.17：969-973中所述；等等。
有时，标记物与抗体间接偶联。专业技术人员了解用于直接和间接偶联的各种技术。例如，抗体可以与生物素偶联，并且上面提到的任何类型的标记物都可以与亲和素偶联，反之亦然(也参见上面的“A”和“G”测定法)。生物素与亲和素选择性结合，因此标记物可以通过这种间接方式与抗体偶联。对于涉及生物素-亲和素偶联和类似测定法的技术的综述，参见Ausubel，同上。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小的半抗原(例如地高辛)偶联，并将上面提到的不同类型标记物中的一种与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。由此可以实现标记物与抗体的间接偶联。
测定法的变化可以包括不同的清洗步骤。“清洗”是指将固相暴露于水性溶液(通常为缓冲液或细胞培养基)以便将未结合物质(例如非黏附性细胞、非黏附性捕获剂、未结合配体、受体、受体构建物、细胞裂解物或HRP抗体)从其上移除。为了降低背景噪音，在清洗溶液中包括去污剂(例如Triton X)是方便的。通常，在清洗后将水性清洗溶液从测定板的孔中倒出。可以使用自动化清洗装置方便地完成清洗。有时，可能需要几个清洗步骤(例如约1至10个清洗步骤)。
在本发明的夹心检测测定法中也可以使用各种缓冲液。例如，可以使用各种阻断缓冲液来降低测定法的背景。术语“阻断缓冲液”是指水性、pH缓冲的溶液，其含有能够与基材上没有被含PL或PDZ的蛋白包被的暴露表面结合的至少一种阻断化合物。阻断化合物一般是蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、明胶、酪蛋白或奶粉，并且不与测定中的任何试剂交叉反应。阻断缓冲液通常以约7至7.5之间的pH提供，并且适合的缓冲剂包括磷酸盐和TRIS。
在检测第一抗体-E6-第二抗体的夹心相互作用中也可以使用各种酶-底物组合。酶-底物组合的实例包括但不限于例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP或HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺[OPD]或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐[TMB])(如上所述)。
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的磷酸对硝基苯酯。
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或产荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶。
对于本技术领域的专业人员来说，有大量其他酶-底物组合可用。对于这些的一般性综述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980，二者在此以其全文引为参考。
用于检测HPV E6蛋白的系统
本发明提供了用于检测样品中的HPV E6蛋白、在一个实施方案中是致癌HPV E6多肽的存在的系统。一般来说，该系统包含用于HPV E6多肽的第一和第二抗体，其中第一抗体是对至少一种HPV毒株的E6特异性的固定化的捕获抗体，第二抗体也与HPV毒株例如致癌HPV毒株的E6结合，并可以被标记或作为用于检测样品中的E6的信号产生系统的一部分。抗E6第二抗体可以与抗E6第一捕获抗体识别E6的相同表位或不同表位。
在某些实施方案中，一种结合配偶体附着于固相支持物，另一种结合配偶体可以被标记或作为信号产生系统的一部分。蛋白可以共价结合或通过非特异性键合进行非共价连接。如果需要融合蛋白与表面之间的共价键合，表面通常是多官能的或能够被多官能化。可以存在于表面上并用于连接的官能团可以包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基、巯基等。将广泛的各种化合物连接到各种表面的方式是公知的，并且在文献中有详尽说明。
在一些实施方案中，致癌HPV E6在测试条上分离。例如，可以使用与致癌HPV E6结合的本发明可检测标记的第二抗体来检测致癌HPV E6。致癌HPV E6可以是例如使用反射分光光度计或通过肉眼定量。用于分析物检测的方法和组合物公开在美国专利申请公布No.US20080199851中，在此以其全文引为参考。在一些实施方案中，本发明的捕获抗体可以融合或结合到另一个部分上，所述部分包括但不限于所有寡核苷酸、亲和素、链亲合素、吡喃糖基RNA(pRNA)、适配体或其组合。本发明的捕获抗体自身可以固定化或可以不固定化到基材上。
当在本文中使用时，测试条基材是指使用本技术领域的常规方法连接了捕获部分的材料。各种材料可以用作基材，包括能够对目标分子的附着起到支持作用的任何材料。这样的材料对于本技术领域的专业人员来说是已知的，并包括但不限于有机或无机聚合物、天然和合成聚合物，包括但不限于琼脂糖、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、其他纤维素衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物和葡聚糖共聚物、其他多糖、玻璃、硅胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、人造丝、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、与二乙烯苯等交联的聚苯乙烯、丙烯酸树脂、丙烯酸酯和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物、乙烯和丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸衍生物和共聚物、其他聚合物和与各种官能团的共聚物、胶乳、丁基橡胶和其他合成橡胶、有机硅、玻璃、纸、天然海绵、不溶性蛋白、表面活性剂、红细胞、金属、类金属、磁性材料或其他可商购的介质，或由用改进测试条基材的亲水性质的材料包被的固体或半固体基材构成的复合材料，例如聚苯乙烯、Mylar、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、金属例如铝、铜、锡或金属混合物，其用葡聚糖、去污剂、盐类、PVP包被或用静电或等离子体放电进行处理以向表面添加电荷，从而赋予表面亲水性质。
在一个实施方案中，侧向流膜由多孔材料、例如由Porex Technologies Corp.，Fairbum，Ga.，USA制造的高密度聚乙烯片材构成。该片材具有开孔结构和在40％孔隙容积下0.57gm/cc的典型密度，以及1至250微米的平均孔径，其平均值一般在3至100微米之间。在另一个实施方案中，标记物区由多孔材料如无纺水刺丙烯酸纤维(与样品接收区类似)、例如New Merge或HDK材料构成。通常，多孔材料可以衬有或层合在一般不透水的层例如Mylar上。当使用时，衬垫一般通过黏合剂(例如3M 444双面黏合胶带)固定在基质上。典型地，对于低厚度膜使用不透水的衬垫。可以使用各种不同聚合物，只要它们不与测定中的组分非特异性结合并且不干扰流体样品的流动即可。说明性的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等。有时，基质可以是自承式的。也可以使用适合于不吸湿流动的其他膜，例如聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。在另一个实施方案中，侧向流膜由材料例如未处理的纸、纤维素共混物、硝酸纤维素、聚酯、丙烯腈共聚物等构成。标记物区可以被构造成提供吸湿或不吸湿流动，流动类型通常与在样品接收区的至少一部分中提供的相似或一致。在常用实施方案中，标记物区由无纺织物例如人造丝或玻璃纤维构成。其他适合用于本发明的标记物区材料包括在美国专利No.5,075,078中公开的那些层析材料，该专利在此引为参考。
在常用实施方案中，将测试条基材用包括材料阻断和标记物稳定剂的溶液进行处理。阻断剂包括牛血清白蛋白(BSA)、甲基化BSA、酪蛋白、酸或碱水解的酪蛋白、无脂奶粉、鱼胶或类似物质。稳定剂是容易获得的并且在本技术领域中是公知的，并可用于例如稳定被标记的试剂。在一些实施方案中，含有溶液307的上游区室可以包含多个安瓿，其可以被选择性刺穿或打破以释放其内含物。因此，在一个实施方案中，阻断试剂包含在一个安瓿中，其被用于预处理(例如“阻断”)测试条(即侧向流膜)，而其他安瓿被保留用于将样品洗过测试条。
在一些实施方案中，存在来自一种致癌HPV毒株的E6蛋白，并使用本发明的抗体组合物和方法在测试条上对其进行检测。在其他实施方案中，本发明的抗体组合物和方法允许检测样品中来自一种以上致癌HPV毒株例如HPV16和HPV18的E6蛋白。HPV毒株特异性的E6蛋白检测允许测试条检测E6蛋白的存在，其中不同HPV毒株可以在一个测试条上的不同测试线处检测。例如。使用如图17和18中所示的本发明的抗E6HPV16+HPV18抗体检测混合物，可以将来自HPV16和HPV18的E6蛋白作为双线测试条上的两条不同的线进行检测。在另一个实例中，使用如图20中所示的本发明的抗E6HPV16+HPV18+HPV45抗体检测混合物，将来自HPV16、HPV18和HPV45的E6蛋白作为三线测试条上的三条不同的线进行检测。这样的利用本发明的抗体夹心检测方法的条测试方法，在检测样品中的致癌E6蛋白时产生低的假阳性率。在一些实施方案中，检测E6的假阳性率在60个被测试的生物样品中为0个(图19)。假阳性率可以低于约10％、9％、8％、7、％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更低。
在许多实施方案中，通过将样品施加到测试条的一端，并允许蛋白通过毛细作用或侧向流迁移，将致癌HPV E6与样品中的其他蛋白分离开。用于侧向流分离、检测和定量的方法和装置在本技术领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,569,608、6,297,020和6,403,383。在这些实施方案中，测试条以从近端到远端的次序包含用于上样的区域(载样区)和含有抗E6第一抗体、即本发明组合物的捕获抗体的测试区域。将样品上到载样区上，并将测试条的近端置于缓冲液中。致癌E6蛋白被第一测试区中的结合抗体捕获。被捕获的致癌E6蛋白的检测如下所述进行。例如，被捕获E6蛋白的检测使用本发明组合物的抗E6第二抗体来进行。抗E6第二抗体可以被可检测地标记。在一些实施方案中，第二抗体特异性针对所有致癌E6蛋白共有的E6蛋白表位，或在一起能够与所有致癌E6蛋白结合的抗体的混合物。
互补抗体对的鉴定
一方面，本发明提供了为结合HPV毒株的E6蛋白的抗体对筛选抗体的方法，所述抗体对与对E6蛋白特异性的单个抗体相比具有增高的灵敏度，所述方法包含：(a)将抗体对的第一抗体与E6蛋白相接触；(b)将结合于第一抗体的E6蛋白与抗体对的第二抗体相接触；(c)检测第二抗体与结合于抗体对的第一抗体的E6蛋白的结合；以及筛选与不成对的单个抗体相比信噪比更高的抗体对；其中信噪比更高表明E6蛋白检测的灵敏度增高。
在一个方面，本发明公开了检测以高亲和性与靶抗原例如E6蛋白结合的抗体对的免疫测定法的建立。一般来说，将一种抗体与靶抗原例如E6蛋白相接触，并测定第二抗体与结合于第一抗体的E6蛋白结合的能力。第一抗体本身可以固定化或者可以不固定化到基材上。在一个实例中，第一抗体被固定化到固体基材上。在另一个实例中，将第一抗体融合或结合到另一个部分上，所述部分包括但不限于所有寡核苷酸、亲和素、链亲合素、吡喃糖基RNA(pRNA)、适配体或其组合。用于分析物检测的方法和组合物公开在美国专利申请公布No.US20080199851中，在此以其全文引为参考。可以使用本技术领域中已知的各种测定法格式，使用本发明的方法鉴定与单独的单个抗体相比以更高亲和性和更高灵敏度结合E6蛋白的抗体对。这些测定法包括但不限于固相ELISA免疫测定法、免疫沉淀、Biacore和Western印迹测定法。在本文中公开的这些测定法，可以容易地用于在短时期内筛选数百至数千个潜在的抗体-E6相互作用。因此，这些测定法可用于鉴定以高亲和性与E6蛋白相互作用的更多的新的协同抗体。
在一个实例中，出于说明的目的，将ELISA板用绵羊抗小鼠IgG Fcγ包被、清洗并阻断；然后与第一抗体温育、清洗并阻断。将抗原例如E6蛋白导入到板中，温育并清洗。然后将第二抗体与碱性磷酸酶标记的F(ab’)2温育，随后用鼠IgG阻断，然后导入到含有结合于第一抗体的抗原例如E6的板中。使用PNPP，通过在405nm处读取吸光度，采用比色法检测免疫夹心物(抗体1结合于抗原；抗原结合于抗体2)的存在。计算信噪比(S/N)以鉴定产生最高信号的协同抗体，由此阐明抗体对。鉴定到的抗体对在各种免疫测定法格式例如侧向流格式中成功实施。
可以通过本技术领域已知的任何方法筛选本发明抗体的免疫特异性结合。可用于鉴定抗体对例如本发明的抗体对的免疫测定法，包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，所述系统使用技术例如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和细胞免疫染色(固定或天然的)测定法，略举数例。这样的测定法是常规的并且在本技术领域中是公知的(参见例如Ausubel等主编，1994，《分子生物学现代方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York，在此以其全文引为参考)。示例性的免疫测定法在下面简要描述(但是不打算作为限制)。
抗体与抗原的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离率可以通过竞争性结合测定法来测定。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，其包含将标记的抗原(例如3H或125I)与目标抗体在渐增量的未标记抗原存在下温育，以及检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性和结合解离率可以通过scatchard作图分析从数据来确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定法测定。在这种情况下，将抗原与偶联了标记化合物(例如3H或125I)的目标抗体，在渐增量的未标记的第二抗体存在下温育。
筛选本发明的抗体可以使用免疫细胞化学方法，使用本技术领域公知的技术，用能够表达抗原的载体或只用载体转染的细胞(例如哺乳动物细胞、例如CHO细胞)上进行。结合抗原转染的细胞、但是不结合只用载体转染的细胞的抗体，是抗原特异性的。
然而，在某些实施方案中，测定法是抗原捕获测定法，并且抗体阵列或微阵列可用于此目的。制造和使用多肽微阵列的方法在本技术领域中是已知的(参见例如美国专利6,372,483、6,352,842、6,346,416和6,242,266)。
可以使用各种已知方法来纯化鉴定到的抗体对。这些方法包括但不限于抗体的免疫过滤或亲和纯化。简单来说，免疫过滤是指通过与特异性抗原进行混合来纯化抗体。然后通过用可溶性载体进行处理将抗原从抗体移除。选择其上清液给出所需活性的杂交瘤细胞用于克隆。在一个实例中，细胞在96孔平底板中通过有限稀释法来克隆。从组织培养上清液纯化抗体可以通过蛋白G和A亲和层析(Amersham)来进行。抗体的同种型可以使用流式微球阵列来确定。抗体的纯化方法和方案在本技术领域中是沿用已久的，并在本技术领域的专业人员的知识范围之内。
样品收集
使用本发明的方法进行分析的生物样品可以从任何哺乳动物、例如人类或非人类HPV动物模型获得。在许多实施方案中，生物样品从活的对象获得。
在一些实施方案中，从其获得样品的对象表观健康，其中分析作为常规筛查的一部分来进行。在其他实施方案中，对象是对HPV易感的对象(例如通过家族史、暴露于某些环境因子等确定的)。在其他实施方案中，对象具有HPV症状(例如宫颈疣等)。在其他实施方案中，对象已被预先诊断为患有HPV(例如通过基于例如PCR的其他测试确定的)。
生物样品可以源自于对象的任何组织、器官或细胞团。在一些实施方案中，从对象获得宫颈刮片、活检样品或灌洗液。在其他实施方案中，样品是血液或尿液样品。在其他实施方案中，样品是组织学样品。
在一些实施方案中，使用本技术领域中的标准方法对生物样品进行处理，例如以除去某些可能干扰本发明的测定方法的组分。在一些实施方案中，通过例如盐沉淀等对生物样品进行处理，以富集蛋白。在某些实施方案中，样品在蛋白酶抑制剂存在下进行处理以抑制E6蛋白的降解。
在本发明的测定方法中，在一些实施方案中，可以对样品中E6蛋白的水平进行定量和/或与对照进行比较。适合的对照样品来自于已知健康的个体，例如已知没有HPV的个体。对照样品可以来自于与被测对象在遗传上有关的个体，但是也可以来自于遗传上无关的个体。适合的对照样品也包括个体在比获取测试样品的时间点更早的时间点获取的样品，例如在表现出HPV的可能症状之前从个体获取的生物样品。
在某些实施方案中，将样品与结合有抗体或PDZ结构域多肽的固体支持物、在适合于所述抗体或PDZ结构域多肽与样品中的E6蛋白结合的条件下相接触，并在将未结合的样品蛋白与结合的蛋白分离后，使用已知方法、使用主题抗体检测结合的蛋白。
诊断病原体的存在需要收集适合于生物体的样品。为了检测HPV E6蛋白，人们将使用刮削、拭子或活检技术从宫颈、阴茎、肛门或咽喉收集测试组织。为了诊断血液传播的病原体例如HIV，通过标准手段收集血液将是最适合的。可以引起皮肤病变的真菌或病毒感染的诊断需要从患病区域收集样品。
本发明不打算覆盖取样装置。然而，应该指出，因为本发明根据E6蛋白的检测进行预测，因此必须适当留意以收集足够用于检测病原体蛋白的样品量并维持样品中蛋白的完整性。对于每种诊断测试来说，收集的样品量应该凭经验确定。在决定中考虑的因素包括但不限于希望检测的阶段、每单位样品中病原体的量、每单位样品的诊断蛋白的量、诊断表位的可利用性和诊断表位的稳定性。
用于宫颈组织的示例性收集装置包括但不限于在美国专利No.6,241,687、6,352,513、6,336,905、6,115,990和6,346,086中所述的那些。这些收集装置将便于收集用来诊断致癌人乳头瘤病毒感染的宫颈组织。这些装置主要通过刮削收集宫颈细胞或组织；或者，人们可以使用标准的活检方法从任何待检查的组织收集样品。
尽管本申请中公开的诊断方法是针对E6蛋白的检测，但样品收集无须限于收集蛋白。人们可以代以从组织样品收集RNA，使用体外翻译试剂盒从收集的模板产生蛋白，然后使用本文公开的方法进行测定。采取类似的方式，可以从测试样品收集DNA，可以使用用于致癌E6和E7蛋白的特异性引物来扩增DNA内含物(使用DNA聚合酶)或将样品转录并翻译成可以用本文公开的方法测试的蛋白。
“对象”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，是指任何动物，例如哺乳动物、人类或非人类动物。一般来说，对象是哺乳动物对象。示例性对象包括但不是必须限于人类、非人灵长动物、小鼠、大鼠、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、鸟类、鹿、麋鹿、兔、驯鹿、鹿和马，其中人类尤其受关注。
特异性和灵敏度
在一些实施方案中，术语“特异性结合”或“特异性”是指抗体或抗体的组合优先结会合物样品中不同分析物或组分的均质混合物中存在的特定分析物或组分的能力。术语“分析物”在本文中可互换使用，并且是指样品的已知或未知组分。典型地，特异性结合相互作用将典型地以约10至100倍以上或更多(例如约1000或10,000倍以上)分辨样品中的所需和非所需分析物。典型地，当捕获试剂例如抗体或多肽与样品中的分析物在抗体/抗原复合物中特异性结合时，它们之间的亲和性为至少10-7、至少10-8M、至少10-9M、至少10-10M，通常高达约10-11M。在一些实施方案中，特异性是指没有HPV的人具有阴性测试结果的比例。
在一些实施方案中，使用主题抗体的本发明HPV E6蛋白检测方法具有检测致癌E6蛋白的高特异性。在一些实施方案中，本发明的HPV检测方法的特异性约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或高于99.9％。在一些实施方案中，当样品中事实上不存在高危HPV毒株时错误地检测到这些HPV毒株的E6蛋白的比率、即假阳性率，约为10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或低于0.1％。
在一些实施方案中，与使用结合E6蛋白的含PDZ结构域的多肽相比，使用本发明的方法检测E6蛋白的特异性增加。在本发明的一个实施方案中，测定E6与本发明的抗E6抗体或多种PDZ蛋白的结合。使用这种方法，能够对以特定特异性被E6蛋白结合的抗E6抗体和PDZ结构域多肽进行比较。在一些实施方案中，使用本发明的组合物和方法检测致癌E6蛋白的特异性增加至约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高。当与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比时，使用本发明的抗体夹心方法检测E6的特异性增加约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、500、1,000、10,000倍或以上。
主题抗体以高亲和性结合致癌E6蛋白的N-端。在一些实施方案中，所述抗体结合E6蛋白的结合亲和性小于10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，与以前可用的特异性针对E6蛋白的抗体相比，主题抗体与高危HPV毒株的E6蛋白的结合亲和性要高出至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.6、2.8、2.9、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或以上。抗体与抗原的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离率可以通过竞争性结合测定法来测定。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，其包含将标记的抗原(例如3H或125I)与目标抗体在渐增量的未标记抗原存在下温育，以及检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性和结合解离率可以通过scatchard作图分析从数据来确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定法测定。在这种情况下，将抗原与偶联了标记化合物(例如3H或125I)的目标抗体在渐增量的未标记第二抗体存在下温育。抗体与抗原的结合亲和性也可以通过本技术领域中已知的技术来测量，所述技术包括但不限于基于表面等离子体共振(SPR)的BiaCore分析，和ELISA。
主题抗体以高亲和性结合致癌E6蛋白的C-端。例如，所述抗体结合E6蛋白的结合亲和性可以小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M或小于10-12M。在一些实施方案中，与以前可用的特异性针对E6蛋白的抗体相比，主题抗体结合高危HPV毒株的E6蛋白的亲和性要高出至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.6、2.8、2.9、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或以上。抗体与抗原的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离率可以通过竞争性结合测定法来测定。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，其包含将标记的抗原(例如3H或125I)与目标抗体在渐增量的未标记抗原存在下温育，以及检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性和结合解离率可以通过scatchard作图分析从数据来确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定法测定。在这种情况下，将抗原与偶联了标记化合物(例如3H或125I)的目标抗体，在渐增量的未标记第二抗体存在下温育。抗体与抗原的结合亲和性也可以通过本技术领域中已知的技术来测量，所述技术包括但不限于基于表面等离子体共振(SPR)的BiaCore分析、和ELISA。
在一些实施方案中，灵敏度是指带有HPV的人具有阳性测试结果的比率。在其他实施方案中，灵敏度是指样品中诊断测试能够检测的物质例如蛋白的最小量。在一些实施方案中，正确检测至少两种高危HPV毒株的致癌E6蛋白的灵敏度约为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或99.9％以上。灵敏度可以用给定体积样品中能够被主题抗体检测的E6分子的数量来度量，例如E6分子数量/ml样品。例如，所述主题方法可以检测每ml样品约200-300pg的重组E6蛋白。在一些实施方案中，所述主题方法检测每个异常增殖细胞约1fg E6蛋白。灵敏度也可以通过每给定样品体积中HPV感染细胞的数量来度量。理解本发明的抗体的灵敏度是必需的，因为它帮助限定为获得确定性结果而必须测试的组织或细胞样品的量。
E6-抗体结合的灵敏度可以根据表观亲和性来测量，所述表观亲和性可以根据一种分子饱和结合第二种分子所需的浓度来确定，所述结合例如配体与受体的结合，在这种情况下是E6与主题抗E6抗体的结合。在一个实例中，将固定浓度的本发明的抗E6抗体与渐增浓度的标记E6肽(用例如生物素或荧光素标记)在溶液中混合在一起并允许其反应。代表性的HPV E6肽氨基酸序列公开在本文中以及美国专利No.7,312,041和7,399,467中，这两个美国专利以其全文引为参考。在一个实施方案中，优选的E6肽浓度是0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM。在各种实施方案中，在4℃至37℃的温度范围内，适合的反应时间可以在10分钟至2天的范围内。在一些实施方案中，也可以使用非特异性抗体作为对照来执行相同的反应。可以使用本技术领域中已知的各种方法将抗体-E6复合物与未结合的标记肽分离开。例如，可以使用高效孔径排阻层析(HPSEC，凝胶过滤)(Rabinowitz等，1998，Immunity 9：699)、亲和层析(例如使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠)和亲和吸附(例如上文所述通过与抗GST抗体包被的板结合)来分离复合物。使用本技术领域的专业人员已知的各种方法和检测器，根据E6肽配体上标记物的存在来检测抗体-E6复合物。例如，如果标记物是荧光素并且使用HPSEC来实现分离，可以使用联用的荧光检测器。将抗体-E6结合信号作为配体浓度的函数进行作图，并将图拟合(例如使用Kaleidagraph软件包曲线拟合算法)为下述方程，其中“信号[配体]”是PL肽浓度为“[配体]”时的结合信号，“Kd”是结合事件的表观亲和性，“饱和结合”是由曲线拟合算法确定的常数，以优化与实验数据的拟合：
信号[配体]＝饱和结合x([配体]/([配体+Kd])
结合亲和性本身的计算可以使用任何适合的方程(参见Cantor和Schimmel(1980)，《生物物理化学》(BIOPHYSICAL CHEMISTRY)，W H Freeman&Co.，San Francisco)或软件来确定。应该理解，结合测定法便于在多孔板(例如24孔、96孔板或384孔板)中进行。
应该认识到，E6结合配偶体与E6之间的高特异性和高灵敏性相互作用，表明了用于检测样品中致癌HPV毒株的潜在更有价值的系统。信噪比典型地将所需信号水平例如与E6蛋白的特异性结合与背景噪音水平例如任何不与E6蛋白的非特异性结合进行比较。比率越高，背景噪音的干扰越小。在一些实施方案中，与使用以前可用的抗E6抗体或PDZ结构域多肽检测E6蛋白相比，本发明的方法将检测至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的信噪比增加了约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100倍或以上。
在一些实施方案中，与使用含PDZ结构域的多肽检测E6蛋白相比，本发明的方法产生较低的错误检测致癌HPV E6蛋白的假阳性率。测试的假阳性率是假阳性测试结果除以没有患病的所有患者。在一个实例中，本发明的方法在60位HPV阴性个体的宫颈拭子样品上产生0个假阳性(图19)。使用本发明的方法检测样品中致癌HPV毒株的E6蛋白的假阳性率，可以是约10％、9％、8％、7、％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更低。在一个实施方案中，检测样品中的致癌E6蛋白的假阳性率低于1.7％。
试剂盒
本发明还包括用于执行本发明方法的试剂盒。在一些实施方案中，主题试剂盒包含与至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白特异性结合的主题抗体。在一些实施方案中，所述抗体是捕获抗体。在一些实施方案中，所述抗体是检测抗体。在一些实施方案中，所述抗体用可检测标记物标记。在其他实施方案中，包含第二种标记组分例如可检测标记的第二抗体。在一些实施方案中，主题试剂盒还包含含PDZ结构域的多肽例如MAGI-1。在一些实施方案中，主题试剂盒还包含用于从样品分离致癌HPV E6蛋白的手段，例如装置或系统。在一些实施方案中，主题试剂盒含有与HPV毒株的E6蛋白特异性结合的本发明的捕获抗体和检测抗体。在一些实施方案中，试剂盒还含有用于与第二抗体结合以检测E6蛋白的第三抗体。在一些实施方案中，第二抗体用可检测标记物标记。在其他实施方案中，包含第二种标记组分，例如可检测标记的第三抗体。在一些实施方案中，主题试剂盒还包含用于从样品分离HPV E6蛋白的手段，例如装置或系统。试剂盒可以任选含有蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，诊断试剂盒还含有用于执行本发明的方法的测试条，即本发明的抗体在其上与样品中的E6蛋白结合的测试条。诊断试剂盒可以检测一种HPV毒株或一种以上HPV毒株的E6蛋白。例如，诊断试剂盒可以检测HPV-16、HPV-18、HPV-45或其组合的致癌E6蛋白。在其他实施方案中，试剂盒含有与低危HPV毒株例如HPV6和HPV11的E6蛋白特异性结合的本发明的抗体。在一些实施方案中，试剂盒含有用于执行酶联免疫吸附测定法(ELISA)的试剂。
如果需要，主题试剂盒还可以包括各种常规组分中的一种或多种，例如具有一种或多种缓冲剂、检测试剂或抗体的容器。在试剂盒中也可以包括指示待使用组分的量以及它们的使用指南的作为插页或标签的印刷说明书。在本公开中，应该理解指定的材料和条件在实践本发明中是重要的，但是不排除未指定的材料和条件，只要它们不阻止本发明的益处得以实现即可。本发明的诊断方法的示例性实施方案在上面进行了详细描述。
在主题试剂盒中，可以使用水性或固体基材执行致癌E6蛋白检测反应，其中试剂盒可以包含与几种分离和检测平台例如测试条、夹心测定法等一起使用的试剂。试剂盒还可以包括用于执行Western印迹的组分(例如预制凝胶、膜、转移系统等)；用于执行ELISA的组分(例如96孔板)；用于执行免疫测定的组分(例如蛋白A)；柱子，特别是离心柱，用于从样品按亲和性或大小来分离致癌E6蛋白(例如凝胶过滤柱、PDZ结构域多肽柱、孔径排阻柱、膜式截留离心柱等)。
主题试剂盒还可以包含含有致癌或非致癌E6蛋白和/或致癌E6蛋白的连续稀释液的对照样品，其中连续稀释液代表了适合的标准品的一定范围，试剂盒的用户可以将他们的结果与该范围进行比较，并估算他们的样品中致癌E6蛋白的水平。这样的连续稀释液可以对患者中任何癌症的发展提供估算。也可以将荧光、颜色或放射自显影胶片显影结果与试剂盒所提供的荧光、颜色或胶片密度的标准曲线进行比较。
除了上面提到的组分之外，主题试剂盒典型地还包括使用试剂盒的组分实践主题方法的说明书。用于实践主题方法的说明书一般记录在适合的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材例如纸或塑料等上。如此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即与包装或子包装相伴)等。在其他实施方案中，说明书作为存在于适合的计算机可读存储介质例如CD-ROM、磁盘等上的电子储存数据文件而存在。在其他实施方案中，试剂盒中不存在实体说明书，而是提供了从远端源例如通过互联网获得说明书的手段。这种实施方案的实例是试剂盒包括可以浏览说明书和/或可以下载说明书的网站地址。与说明书相同，这种获得说明书的手段记录在适合的基材上。
用途
检测高危HPV感染的有效的诊断需要能够检测大多数临床相关的高危HPV类型的“泛”抗体。目前，HPV DNA测试缺少为了降低被称为“非癌症发展性”女性进行阴道镜检查的数量所需的特异性。相反，HPV RNA测试缺少用作初级筛查的临床灵敏度。因此，本发明中体现的基于蛋白的HPV E6测试可以具有拥有癌症筛查、优选为宫颈癌筛查所需的灵敏度和特异性的优点。
HPV E6经PDZ结合结构域结合到肿瘤阻抑基因和癌基因而启动肿瘤发生。它也允许特异性分离HPV毒株，可用于诊断和治疗开发。本发明的方法为抗体提供了与特异性针对E6抗体的羧基端(C-端)区域的抗体互补结合并避免屏蔽PDZ结合结构域的可能性。此外，本发明的抗体能够仅仅特异性识别HPV16和HPV18，这允许在个体接受加德西尔(Gardasil)或其他HPV相关疫苗的接种之前对其进行预先筛查，所述加德西尔是针对4种类型的HPV、即HPV6、11、16和18的宫颈癌疫苗。
开发针对在高危HPV毒株的致癌E6蛋白C-端区域处PDZ结合基序的抗体的一些优点，包括但不限于：首先，它通过与只在高危HPV类型中发现的PDZ结构域基序结合，提供了HPV检测的高特异性。因此，它可以允许捕获特定的HPV毒株例如HPV16和HPV18，并且也允许特异性分离致癌HPV毒株，可用于诊断和治疗开发。其次，本发明的方法为抗体提供了与对E6抗体的氨基端(N-端)区域特异性的抗体互补结合的可能性。第三，它允许提取在尿素中聚集并且不溶的HPV E6蛋白，具有在耐受高浓度尿素的测定法中获得分析灵敏度的潜力。第四，它避免了依赖于含PDZ结构域的多肽(即hD1g、MAGI-1、MUPP1)的特异性结合，并排除了需要在细胞裂解物中降低这些含PDZ结构域的多肽与其内源配体的结合，从而产生更低的背景噪音。最后，本发明的抗体能够仅仅特异性识别HPV16和HPV18，这允许在个体接受加德西尔或其他HPV相关疫苗的接种之前对其进行预先筛查，所述加德西尔是针对4种类型的HPV、即HPV6、11、16和18的宫颈癌疫苗。
此外，本发明的方法还可以用作在妊娠女性中检测低危HPV类型的测试的一部分，因为在低危HPV类型例如HPV6和HPV11的情况下，存在着胎儿发生围产期感染的风险。
本发明的抗体组合物和方法可用于各种诊断分析。本发明的抗体和方法可用于诊断由个体中的致癌HPV毒株引起的感染；用于确定患癌症的可能性；用于确定患者对HPV治疗的响应；用于确定个体中HPV感染的严重性；以及用于监测个体中HPV的发展。本发明的抗体和方法可用于诊断由致癌或非致癌HPV毒株引起的与癌症相关的感染，所述癌症包括宫颈、卵巢、乳腺、肛门、阴茎、前列腺、喉和口腔、扁桃体、鼻通道、皮肤、膀胱、头颈鳞状细胞的癌症、偶发性甲周癌以及良性肛门和生殖器疣。本发明的抗体和方法可用于诊断由致癌或非致癌HPV毒株引起的与Netherton综合征、疣状表皮发育不良、子宫内膜异位和其他病患相关的感染。本发明的抗体和方法可用于诊断在成年女性、成年男性、胎儿、婴儿、儿童和免疫受损个体中由致癌或非致癌HPV毒株引起的感染。
在一些实施方案中，本发明的抗体可用于改善HPV疾病，其包含向需要的对象给药有效量的与HPV E6蛋白特异性结合的抗体。改善HPV疾病意味着包括治疗、抑制或预防HPV疾病或HPV疾病的症状的方法。HPV疾病包括上面列出的那些，例如宫颈癌和疣。在一些实施方案中，所述抗体与E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与样品中的至少两种HPV毒株的致癌E6蛋白的羧基端(C-端)特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体与下列HPV毒株的E6蛋白特异性结合：HPV毒株16、18和45；毒株16、18、31、33、45、52和58；毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82；或毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82。在一些实施方案中，所述抗体与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25种不同HPV毒株结合。在一些实施方案中，所述抗体与致癌HPV毒株结合。在一些实施方案中，所述抗体与致癌HPV毒株和非致癌HPV毒株结合。在一些实施方案中，所述抗体结合E6蛋白的结合亲和性小于10-8M、10-9M、I0-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，使用如上所述的抗体的组合以便改善HPV疾病。在一些实施方案中，本发明的抗体可以与用于治疗HPV疾病的另一种治疗药物组合。例如，本发明的抗体可以与用于治疗宫颈癌的另一种抗癌药剂组合。对于任何上述共同给药的药剂来说，适合的剂量是目前使用的剂量，并且由于药剂与本发明的抗体的组合作用(协同作用)其剂量可以降低。
为了预防或治疗疾病，抗体的适合剂量取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重性和病程、抗体的给药是预防性还是治疗性目的、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的响应以及主治医师的判断。抗体一次性或在一系列治疗中适合地给药于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是向患者给药的最初候选剂量，不论是例如通过一次或多次分开的给药还是通过连续输注。取决于上面提到的因素，典型的每日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg的范围内或更高。对于在几天或更长时间内的重复给药来说，根据条件，治疗持续到发生期望的疾病症状抑制。
在一些实施方案中，抗体的剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此可以向对象给药一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。这样的剂量可以间歇地给药，例如每周或每三周(例如使患者接受约2至约20、例如约6剂抗体)。可以给药较高的初始负荷剂量，然后给药一剂或多剂较低剂量。示例性的给药方案包括给药约1-20mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、3-5mg/kg或4mg/kg的初始负荷剂量，然后给药约1-20mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、2-5mg/kg或2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，可以使用其他的剂量方案。这种治疗的进展容易通过常规技术和测定法监测。
在一些实施方案中，抗体的给药剂量范围为每个细胞(例如每个HPV感染的细胞)约1.0至5.0μmol或2.0至4.0μmol抗体。在某些情况下，对象每个细胞能够感染30,000至40,000个E6分子。因此，该剂量范围可用于有效治疗每个细胞具有这种E6载量水平的对象。
或者，抗体的给药适合与放射治疗-辐照或放射活性物质的导入相继或组合进行，所述放射活性物质例如在UICC(Ed.)，Klinische Onkologie，Springer-Verlag(1982)中提到的。
除了向对象给药抗体之外，本申请设想了通过基因治疗进行抗体给药。这种编码所述抗体的核酸的给药通过表述“给药治疗有效量的抗体”而被涵盖。关于使用基因治疗产生细胞内抗体，参见例如1996年3月14日公布的WO 1996/07321。
使核酸(任选包含在载体中)进入对象的细胞有两种主要途径，体内和离体。对于体内递送来说，将核酸直接注射到对象中，通常在需要抗体的位点处。对于离体治疗来说，取出对象的细胞，将核酸导入到这些分离的细胞中，并将修饰过的细胞直接给药到对象，或例如囊封在多孔膜内并植入到对象中(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有各种可用于将核酸导入活细胞内的技术。该技术根据核酸是在体外转移到培养细胞中还是在体内转移到目标宿主的细胞中而不同。适合用于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等。用于基因的离体递送的常用载体是反转录病毒。
所述主题方法一般可以在来自活对象的生物样品上进行。本发明的特别有利的特点是该方法可以在一个反应中同时检测几种已知的致癌HPV毒株。在具体实施方案中，本发明的抗体组合物可用于样品的免疫组织学检查。
实施例
为了向本技术领域的普通专业人员提供关于如何制造和运用本发明的完整公开和描述，提出了下面的实施例，并且这些实施例不打算限制本发明人为其发明所设想的范围，也不打算表示下面的实验是所有或唯一进行的实验。已努力确保所使用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该存在一定实验误差和偏差。除非另有指明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度以摄氏度为单位，压力是大气压或接近大气压。
实施例1
特异性针对E6蛋白N-端的抗体的产生
在本实施例中，产生了两种特异性针对E6蛋白N-端的mAb，即737BLT和738BLTmAb。
小鼠
获得6至8周龄雌性SJL小鼠(Taconic Hudson，NY)或Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories Raleigh，NC)用于抗体开发。小鼠按照批准的动物护理和使用管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)方案进行笼养和免疫接种。
肿瘤肽构建
使用抹香鲸肌红蛋白106-118位的氨基酸序列(FISEAIIHVLHSR)作为外来T细胞表位。B细胞表位RRETQL或RRETQV分别源自于人类HPV 16 E6和HPV 18 E6的C-端。单个肿瘤肽由New England Peptide(Gardner，MA)合成，通用格式为：H2N-FISEAIIHVLHSR RRETQL-OH或H2N-FISEAIIHVLHSR RRETQV-OH，并作为冷冻干燥产品提供。HPLC纯度＞85％。将肽以2.5mg/ml在DEPC水(Invitrogen，Carlsbad，CA)中水化，并储存在4℃。
共有肽构建
B细胞共有表位FQDPAERPRKLHDLCTEL(737BLT)和FQDPAERPYKLPDLCTEL(738BLT)源自于人类致癌HPV E6的N-端。肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)的化学偶联由Peptron(Santa Clara，CA)进行，并作为冷冻干燥产品提供。将载体/肽以1mg/ml在DEPC水(Invitrogen，Carlsbad，CA)中水化，并储存在4℃。
用肿瘤肽免疫接种小鼠
使用快速脾内免疫接种法(IS)，用T细胞表位-RRETQL或T细胞表位-RRETQV进行了两种不同的免疫接种。使用12周龄的Balb/c小鼠进行快速IS免疫接种。在免疫接种前，使用腹膜内注射1.2mg开他敏-HCL(Bioniche Animal Health，Athens，GA)和0.39mg甲苯噻嗪(Lloyd Laboratories，Shenandoah，IA)将小鼠麻醉。在第0日，用剪毛器为小鼠剃毛以便可以看见皮肤下的脾脏。在开始麻醉后30分钟，按照产品说明书用EZ麻醉汽化器(Palmer，PA)中的2％异氟烷气体(Butler Animal Health Supply，Dublin，OH)使小鼠不动。在第0、4和11日，使用BD超细II型胰岛素注射器(Franklin Lakes，NJ)，将与5μl Gerbu佐剂混合的100微克肿瘤肽直接注射到脾脏中的两个位点中，总体积为45μl。在第10日将50微克抗CD40激动剂Mab克隆1C10(R&D Systems，Minneapolis，MN)注射到尾根的皮下组织中，体积为25μl。27在第13日将小鼠处死并收集脾脏用于融合。
用共有肽免疫接种小鼠
在不同的小鼠中，使用每种KLH偶联的共有肽执行多位点重复免疫接种(RIMMS)方案。将12周龄的SJL小鼠用于RIMMS方案。在免疫接种前，按照制造商的说明书用EZ麻醉汽化器(Palmer，PA)中的2％异氟烷气体(Butler Animal Health Supply，Dublin，OH)将小鼠麻醉。将15毫克KLH偶联的共有肽在弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和RIBI佐剂(Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)中乳化，用于最初的第0日免疫接种。在第4和11日，分别将7毫克和5毫克共有肽在RIBI佐剂中乳化并注射。在皮下组织中以50μl/位点进行多次注射，以便将引流集中到胭、腹股沟、腋窝和臂淋巴结中。在第13日处死小鼠，收集8个两侧淋巴结并合并，用于融合。
细胞融合
将来自器官的淋巴细胞用10ml RPMI(Invitrogen，Carlsbad，CA)冲洗，通过离心沉淀，并且每107个淋巴细胞使用100μl聚乙二醇1500(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)将淋巴细胞与稳定表达Bcl-2的P3X63.Ag8.653骨髓瘤细胞系以1∶1融合。将细胞重悬浮在选择培养基中(50％Ex-CellTM 610-HSF[Lenexa，KS]，38％RPMI，10％FBS[Hyclone，Logan，UT]，1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸[Invitrogen，Carlsbad，CA]，5.7μM重氮丝氨酸，100μM次黄嘌呤[Sigma-Aldrich，St Louis，MO]，1μg/L人类IL-6)，并接种到96孔组织培养板中(Corning，Corning，NY)，接种量对于肿瘤肽来说为5.3x106个淋巴细胞/板，或者对于共有肽来说为7x106个淋巴细胞/板。通过在融合后第7-9日用饲养培养基(50％Ex-CellTM 610-HFS，33％RPMI，1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸和15％FBS)进行培养基更换，使源自于未融合B细胞的非杂交瘤免疫球蛋白降到最低。在第12日，使用用于肿瘤肽融合的免疫原和卵清蛋白偶联的RRETQL或卵清蛋白偶联的RRETQV，以及相应的免疫原和相应的卵清蛋白偶联的共有肽，通过ELISA筛选得到的杂交瘤的靶特异性。将阳性培养物在12孔组织培养板(Coming，Corning，NY)上扩增，在扩增培养基(50％Ex-CellTM 610-HSF，33％RPMI，10％FBS，1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/L人类IL-6，5％杂交瘤克隆因子[Bioveris，Gaithersburg，MD])中生长至会合，并冷冻。通过ELISA和Western印迹对含有抗体的上清液进行鉴定。
杂交瘤鉴定：ELISA、Western印迹
用在碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.6)中的1μg/ml重组蛋白、2μg/ml肿瘤肽免疫原和KLH偶联的共有肽免疫原、5μg/ml卵清蛋白偶联的RRETQL、卵清蛋白偶联的RRETQV和卵清蛋白偶联的共有肽，将高蛋白结合性聚苯乙烯96孔板(Corning，Coming，NY)包被过夜。在含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBST)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)中清洗后，将孔用含有5％山羊血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)的PBST在室温(RT)下阻断至少1小时。将未稀释的培养上清液在包被的板上以每个孔50μl在室温下温育1小时。针对带组氨酸标签的重组蛋白的小鼠抗His C-端抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)、针对卵清蛋白偶联物的抗卵清蛋白抗体(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)、针对KLH偶联物的小鼠抗KLH抗体(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和扩增培养基被用作阳性和阴性对照。将板用PBST清洗三次，并用在PBST和5％山羊血清中以1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在室温下探测1小时。将板用PBST清洗5次，并在室温下用TMB底物(Millipore，Temecula，CA)显色10分钟。通过加入等体积的2.0N硫酸(VWR，West Chester，PA)终止显色。使用自动分光光度计测量450nm处的吸光度。
对于Western印迹来说，将重组蛋白用LDS样品缓冲液和样品还原剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)还原和变性，然后在95℃下加热5分钟。将20微克蛋白在2D4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，使用MES SDS运行缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)在200伏下电泳30分钟进行分离。在30伏下使用添加10％甲醇的转移缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)90分钟，将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。将膜在4℃下用TBS-酪蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)阻断过夜。将印迹安装在28(Immunetics，Boston，MA)上。将未稀释的上清液上到各狭槽中，并在室温下温育1小时，然后用PBST彻底清洗。使用小鼠抗His C-端抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)或小鼠Penta-His(Qiagen，Valencia，CA)和扩增培养基作为阳性和阴性对照。然后将印迹与在TBS-酪蛋白中以1∶1000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL)在室温下温育1小时。将印迹彻底清洗，然后用Promega WesternAP底物(Promega，Madison，WI)在室温下显色。
单克隆抗体的纯化
将杂交瘤培养上清液用结合缓冲液(50mM硼酸，4M氯化钠，pH9.0)1∶1稀释，并使用AKTAxpress层析系统通过5ml HiTrap MabSelect SuReTM蛋白A柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。将柱用10倍柱体积的结合缓冲液清洗，然后用5倍柱体积的50mM柠檬酸钠(pH 3.0)、50mM磷酸钠、300mM氯化钠洗脱。将抗体洗脱物储存在样品环中，并立即使用HiPrep26/10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将缓冲液更换为50mM磷酸钠(pH7.4)、150mM氯化钠。将含抗体的级份合并，并通过0.2μm PES Supor膜注射器式滤器(PallLife Sciences，Ann Arbor，MI)进行过滤。使用A280对免疫球蛋白水平进行定量，并使用SDS-PAGE在还原和非还原条件下评估纯度。
有限稀释法克隆
通过有限稀释法将杂交瘤克隆到2x 96孔板中。将每个孔在显微镜下观察以证实单个细胞的存在。在温育12天后，通过ELISA对具有源自于单个细胞的生长的孔进行筛选。
杂交瘤扩增
将所选的单克隆杂交瘤在Lampire细胞培养袋(Lampire，Pipersville，PA)或T-225培养瓶(Coming，Coming NY)中扩增至500ml，并允许生长至衰竭(活细胞＜20％)。倾倒上清液并将细胞通过离心进行沉淀。在纯化之前，将澄清的上清液通过0.2μm PES过滤器(Nalge Nunc，Rochester，NY)。
实施例2
主题抗体对HPV E6肿瘤肽的特异性
通过ELISA和Western印迹来筛选通过实施例1中描述的方法产生的抗体对高危HPV E6肿瘤蛋白的特异性。对于使用杂交瘤上清液的夹心ELISA来说，将捕获mAb上清液在包被缓冲液中1∶7.5稀释，并使用50μl/孔在96孔ELISA板(Costar，Corning，NY)上4℃下包被过夜。将板用PBST清洗一次，并将孔用300μl 3％BSA/PBST在室温下阻断1小时。吸出阻断溶液，并向每个孔加入在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml的50μl抗原，室温温育1小时。将检测mAb上清液在1％BSA/PBST中1∶7.5稀释，并与终浓度为150ng/ml的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG-Fc抗体(Bethyl，Montgomery，TX)在室温下温育30分钟。将板用PBST清洗三次。向mAb-HRP检测复合物加入等体积3mg/ml小鼠IgG(透析过以除去叠氮钠，BioCheck，Foster City，CA)，然后将50μl转移到每个孔中，室温下温育1小时。将板用PBST清洗三次，然后每个孔加入50μl TMB底物溶液(Sigma，St.Louis，MO)。允许反应显色10-30分钟，并用2N硫酸(VWR)终止反应。使用SpectraMax M2读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm处读取吸光度。通过将含有抗原的孔的OD除以含有缓冲液的孔的OD确定各抗体对的信噪比。阳性抗体对被鉴定为信噪比＞2.0。
对于使用纯化的生物素化mAb的夹心ELISA来说，为了使用杂交瘤上清液，对上述方案进行下列修改。将纯化的捕获mAb以2μg/ml直接包被在ELISA板上。将纯化的生物素化检测mAb在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml，向每个孔添加50μl，然后在室温下温育1小时。在将板用PBST清洗三次后，向每个孔加入在1％BSA/PBST中1∶5000稀释的50μl HRP标记的链亲和素(Pierce，Rockford，IL)。测定法的其余部分按照前面的描述进行。
如表5和6中所示，通过主题方法产生的抗体对来自高危HPV毒株的E6蛋白的N-末端具有特异性。
实施例3
主题抗体对高危HPV E6蛋白的交叉反应性
将高亲和性多克隆抗体如实施例1中所述通过一轮有限稀释以产生单克隆杂交瘤细胞系。在Western印迹中，测试每种单克隆抗体针对来自多种HPV毒株例如表7中所示的HPV16、18、33、31、35、45、52、56、58、69、11和6b的纯化E6蛋白的交叉反应性。Western印迹按照实施例1中所述进行。简单来说，将重组蛋白用LDS样品缓冲液和样品还原剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)还原和变性，然后在95℃下加热5分钟。将20微克蛋白在2D4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上、使用MES SDS运行缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)在200伏下电泳30分钟进行分离。在30伏下使用添加10％甲醇的转移缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)90分钟，将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。将膜在4℃下用TBS-酪蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)阻断过夜。将印迹安装在28(Immunetics，Boston，MA)上。将未稀释的上清液上到各个狭槽中，并在室温下温育1小时，然后用PBST彻底清洗。使用小鼠抗His C-端抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)和扩增培养基作为阳性和阴性对照。然后将印迹与在TBS-酪蛋白中以1∶1000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠IgG或IgM抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在室温下温育1小时。将印迹彻底清洗，然后用Promega WesternAP底物(Promega，Madison，WI)在室温下显色20分钟。
表7显示了使用本发明的高危HPV共有肽mAb对来自多种高危HPV毒株的E6蛋白的“泛”结合和交叉反应性。
实施例4
使用夹心测定法确定主题抗体的互补表位
使用夹心测定法来确定用于检测来自HPV 16和HPV 18的致癌E6蛋白的互补抗体对，即捕获和检测抗体。夹心ELISA如实施例2中所详述的进行。具有E6蛋白上的互补表位的抗体对显示在表8中。
实施例5
在含有高危HPV的细胞系上通过免疫组织化学检测抗体-E6结合
在免疫组织化学(IHC)中，使用本发明的抗体检测来自组织载片上含高危HPV毒株的卵巢组织的E6蛋白。IHC是本技术领域中公知的技术，其步骤在本文中简要公开。将福尔马林固定的石蜡包埋的卵巢组织切成4μm切片并置于superfrost+载片上，在60℃烘烤20分钟。载片使用Benchmark XT染色平台和Ventana试剂进行染色。使用了下述染色参数：抗原修复使用细胞调制器1(标准)，HE4抗体温育在37℃下进行(1小时)，DAB检测使用I-VIEW检测试剂盒，苏木精II(复染)，以及蓝色染色试剂。在染色操作完成时，通过在1％Dawn餐具去污剂溶液中清洗，然后用自来水漂洗3分钟，对载片进行后处理。将载片通过一系列醇和二甲苯进行脱水、安放并加上盖玻片。IHC结果证实，特异性针对E6蛋白N-端的抗体结合并检测含HPV组织上来自高危HPV毒株的E6蛋白。
实施例6
在ELISA中共有肽抗体与HPV E6类型的交叉反应性
在本实施例中，采用ELISA格式，使用特异性针对E6蛋白N-端的5种mAb即1B2.27、7F10.3、4E9.7、4E10.2和6H5.3来检测来自各种HPV毒株HPV16、18、30、31、35、45、52、53、58、59、66、68、69、6b和11的E6蛋白。将重组HPV E6蛋白纯化，并直接包被到微量滴定板上或用含PDZ结构域蛋白捕获。将针对共有肽的第一抗体稀释至1μg/ml并加到孔中。通过添加山羊抗小鼠IgG第二抗体：HRP，然后添加底物TMB来检测结合。通过用测试孔的OD450除以不含共有肽抗体的孔的OD450，来计算信噪比(S/N)。执行夹心ELISA的更具体的方法如下文中所公开：
直度ELISA：用在碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.6)中的1μg/ml重组蛋白，将高蛋白结合性聚苯乙烯96孔板(Corning，Corning，NY)包被过夜。在含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBST)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)中清洗后，将孔用含3％BSA的PBST在室温(RT)下阻断至少1小时。将在PBST+1％BSA中稀释至1μg/ml的纯化的单克隆抗体在包被的板上以每个孔50μl在室温(RT)下温育1小时。将板用PBST清洗三次，并用在PBST和1％BSA中1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL)在室温下探测1小时。将板用PBST清洗5次，并在室温下用TMB底物(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)显色10分钟。通过加入等体积的2.0N硫酸(VWR，West Chester，PA)终止显色。使用自动分光光度计测量450nm处的吸光度。
PDZ捕获测定法：用在碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.6)中1∶1000稀释的山羊抗GST抗体，将高蛋白结合性聚苯乙烯96孔板(Corning，Corning，NY)包被过夜。在含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBST)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)中清洗后，将孔用含3％BSA的PBST在室温(RT)下阻断至少1小时。将在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml的GST-PDZ MAGI以50μl/孔添加到板中，在室温下温育1小时。将板用PBST清洗三次，然后以50μl/孔加入在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml的重组E6蛋白，在室温下温育1小时。将板用PBST清洗三次，然后以50μl/孔加入在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml的纯化的单克隆抗体，在室温(RT)下温育1小时。将板用PBST清洗三次，并用在1％BSA/PBST中以1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL)在室温下探测1小时。将板用PBST清洗三次，并在室温下用TMB底物(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)显色10至30分钟。通过加入等体积的2.0N硫酸(VWR，West Chester，PA)终止显色。使用自动分光光度计测量450nm处的吸光度。
如图2中所示，在5种抗体之间交叉反应性图谱变化极大。克隆6H5.3显示出单特异性结合，而克隆4E9.7在直接ELISA格式中具有结合8种HPV E6类型的能力。
实施例7
在Western印迹中共有肽抗体与HPV E6类型的交叉反应性
在本实施例中，在Western印迹中，使用特异性针对E6蛋白N-端的5个mAb克隆1B2.27、7F10.3、4E9.7、4E10.2和6H5.3来探测来自各种HPV毒株HPV16、18、30、31、35、45、52、53、58、59、66、68、69、6b和11的E6蛋白。简单来说，将重组HPV E6蛋白通过SDS-PAGE进行分离。使用本发明的共有肽抗体探测Western印迹。使用山羊抗小鼠IgG抗体：AP来检测抗体与E6的结合。
更具体来说，将重组蛋白用LDS样品缓冲液和样品还原剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)还原和变性，然后在100℃下加热8分钟。将1微克蛋白在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，使用MES SDS运行缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)在200伏下电泳30分钟进行分离。使用iBlot系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。将膜用TBS-酪蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)阻断。将共有肽第一抗体在TBS-酪蛋白中稀释至1μg/ml，并在膜上在室温下温育1小时。将山羊抗小鼠Penta-His抗体(Qiagen)在TBS-酪蛋白中以1∶1000稀释，用作载样对照。将印迹用TBST清洗3次，每次5分钟。然后将印迹与在TBS-酪蛋白中以1∶5000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的Fc特异性绵羊抗小鼠抗体(Jackson Immuno)在室温下温育1小时。将印迹用TBST清洗3次，每次5分钟，然后用NBT/BCIP底物(Promega，Madison，WI)在室温下显色10至20分钟。
如图3中所示，抗体交叉反应性图谱从对单一HPV类型特异到对5种以上HPV类型特异。然而，没有观察到本发明的抗体对低危HPV类型6b和11的交叉反应性，表明本发明的抗体对来自高危HPV毒株的致癌E6蛋白特异。
实施例8
用共有肽抗体对重组HPV-16 E6进行免疫沉淀
在本实施例中，使用特异性针对E6蛋白N-端的5个mAb克隆即1B2.27、7F10.3、4E9.7、4E10.2和6H5.3，对来自HPV16的E6蛋白进行免疫沉淀。简单来说，将抗体与蛋白-GDynabead相连，并与带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组HPV-16 E6进行温育。在清洗后，通过SDS-PAGE分离免疫复合物，然后使用HPV-16 E6特异性小鼠抗体进行Western印迹。使用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠轻链特异性抗体来检测免疫沉淀的HPV16E6：MBP。
更具体来说，通过涡旋振荡20秒将蛋白-G Dynabead(Invitrogen，Carlsbad，CA)重悬浮。将珠子转移到微量离心管，然后使用200ul RIPA缓冲液[50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.3％w/v脱氧胆酸，1％v/v Triton X-100，1mM EDTA，pH 7.4]通过磁性分离/重悬浮来清洗三次。每个免疫沉淀(IP)反应使用50μl珠子来建立。将5μg共有肽抗体制备在200μlRIPA缓冲液中并添加到珠子中，在室温下颠倒转动30分钟。将珠子用200μl RIPA清洗3次。将带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的HPV-16 E6在200μl RIPA中稀释至1μg，然后添加到珠子中。在与珠子温育30分钟后，通过用200μl RIPA清洗珠子3次，除去未结合的HPV-16 E6：MBP。在第三次清洗后，将珠子转移到新的微量离心管，然后重悬浮在15μl添加有DTT的NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将样品在100℃加热8分钟。加入1微克重组HPV-16 E6：MBP作为分子量和第一抗体结合的对照。将蛋白在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，使用MES SDS运行缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)在200伏下电泳30分钟进行分离。使用iBlot系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。将膜用TBS-酪蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)阻断。将小鼠抗HPV-16 E6第一抗体克隆2C4.12(内部开发)在TBS-酪蛋白中稀释至1μg/ml，并在膜上在室温下温育1小时。将印迹用TBST清洗3次，每次5分钟。然后将印迹与在TBS-酪蛋白中以1∶2500稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的轻链特异性山羊抗小鼠抗体(Jackson Immuno)在室温下温育1小时。将印迹用TBST清洗3次，每次5分钟，然后用NBT/BCIP底物(Promega，Madison，WI)在室温下显色10至20分钟。
如图4中所示，mAb克隆4E9.7能够免疫沉淀可检测水平的HPV16E6：MBP。
实施例9
使用共有肽捕获抗体通过夹心ELISA检测来自SiHa细胞裂解物的HPV-16 E6
将16μg/ml的纯化的共有肽抗体克隆4E9.7，以50μl/孔在ELISA板(Costar，Corning，NY)上在4℃直接包被过夜。将板用PBST清洗一次，并将孔用300μl 3％BSA/PBST在室温下阻断1小时。将HPV-16阳性SiHa细胞和HPV阴性C33A-细胞以每ml两千万个细胞在RIPA缓冲液中裂解。在另外的混合板中，制作裂解液在RIPA中的2倍连续稀释液。吸出阻断溶液，并向适合的孔加入100μl裂解液连续稀释液，使其在室温温育1小时。将板用PBST清洗三次。将生物素化小鼠抗HPV-16 E6检测抗体克隆6D3.5(内部开发)在1％BSA/PBST中稀释至0.25μg/ml，并向每个孔加入50μl，室温下温育1小时。将板用PBST清洗三次，然后以每孔50μl加入在1％BSA/PBST中1：5000稀释的链亲和素标记的辣根过氧化物酶(Pierce，Rockford，IL)。将板用PBST清洗三次，然后每个孔加入50μl TMB底物溶液(Sigma，St.Louis，MO)。允许反应显色30-60分钟，并用每孔50μl的2N硫酸(VWR)终止反应。使用SpectraMax M2读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm处读取吸光度。测定点运行三份平行样。
如图5中所示，使用本发明的mAb克隆4E9.7从少于5,000个SiHa细胞当量检测到HPV-16 E6。
用于实施例10-12的材料和方法
免疫接种方案：
使用了两种不同的免疫接种策略：多位点重复免疫接种(RIMMS)和快速脾内免疫接种(IS)。将12周龄的SJL小鼠用于RIMMS方案。在免疫接种前，按照制造商的说明书，将小鼠用EZ麻醉汽化器(Palmer，PA)中的2％异氟烷(Butler Animal Health Supply，Dublin，OH)麻醉。将50微克重组ETO B.003在弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和5μlGerbu佐剂MM(Gerbu Biotechnik GMbH，Gaiberg，德国)中乳化用于最初的第0日免疫接种，或在Titermax佐剂(Norcross，GA)和5μl Gerbu佐剂MM中乳化用于第4和11日免疫接种。在皮下组织中以50μl/位点的量进行多次注射，以便将引流集中到腘、腹股沟、腋窝和臂淋巴结中。在第13日处死小鼠，收集8个两侧淋巴结以及2个腰部淋巴结并合并，用于融合。
使用12周龄的Balb/c小鼠进行快速IS免疫接种。在免疫接种前，使用腹膜内注射1.2mg开他敏-HCL(Bioniche Animal Health，Athens，GA)和0.39mg甲苯噻嗪(LloydLaboratories，Shenandoah，IA)将小鼠麻醉。在第0日，用剪毛器为小鼠剃毛以便可以看见皮肤下的脾脏。在初始麻醉后30分钟，将小鼠置于2％异氟烷气体直至不动。在第0、4和11日，使用BD超细II型胰岛素注射器(Franklin Lakes，NJ)，将与5μl Gerbu佐剂混合的100微克ETO嵌合肽直接注射到脾脏中的两个位点中，总体积为150μl。在第10日将50微克抗CD40激动剂Mab克隆1C10(R&D Systems，Minneapolis，MN)注射到尾根的皮下组织中，体积为25μl。在第13日将小鼠处死并收集脾脏用于融合。
在本实施例中，在第0日将小鼠用20μg下列肽F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-L(在表2A中)和20μg polyI/polyC聚合物或弗氏完全佐剂进行免疫接种。动物用20μg E6蛋白和polyI/polyC或弗氏不完全佐剂进行加强。在最后一次加强后3天进行试验取血，并通过ELISA针对相应的E6肽F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-L或F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R进行筛选。免疫反应性小鼠在融合前三天接受最后一次加强。
试验了各种免疫接种方案，包括改变抗原剂量(100μg-10μg)、佐剂(CFA/IFA、poly(I)-poly(C)、CpG+明矾)和途径(皮下、腹膜内)。每种免疫接种计划使用5-15只小鼠来建立。在ELISA中针对重组E6肽对免疫接种小鼠的血清进行了测试。选择在其血清中显示出针对E6肽的足够高滴度的小鼠(以1∶1000稀释时OD高于1)用于融合。
血清抗体滴度和B细胞杂交瘤上清液的ELISA筛选：
将ELISA板用适合的融合蛋白包被，清洗，并用含有2％BSA(Sigma)的PBS阻断。然后加入测试样品(免疫血清或杂交瘤上清液)以及免疫前的或无关的上清液阴性对照。在温育后，将板清洗，并加入PBS/2％BSA中的抗小鼠IgG抗体-HRP偶联物(JacksonLaboratories)。在充分清洗后，加入TMB底物30分钟，然后使用0.18M H2SO4终止反应。然后使用Molecular Devices的THERMO Max微孔板读板器在450nm处读数。
细胞融合：
在融合当天，将动物处死并将来自器官的淋巴细胞用10ml RPMI(Invitrogen，Carlsbad，CA)冲洗，离心沉淀，并且每107个淋巴细胞使用100μl聚乙二醇1500(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)与稳定的表达Bcl-2的P3X63.Ag8.653骨髓瘤细胞系1∶1融合。将细胞重悬浮在选择培养基中(50％Ex-CellTM 610-HSF[Lenexa，KS]，38％RPMI，10％FBS[Hyclone，Logan，UT]，1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸[Invitrogen，Carlsbad，CA]，5.7μM重氮丝氨酸，100μM次黄嘌呤[Sigma-Aldrich，St Louis，MO]，1μg/L人类IL-6)，并接种到96孔组织培养板中(Corning，Coming，NY)，对于RIMMS来说为107个淋巴细胞/板，或者对于IS融合来说为2x106个淋巴细胞/板。通过在融合后第7-9日用饲养培养基(50％Ex-CellTM 610-HFS，33％RPMI，1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸和15％FBS)进行培养基更换，使源自于未融合B细胞的非杂交瘤免疫球蛋白降到最低。在第12日，使用免疫原和无关的带6x组氨酸标签的蛋白对照，通过ELISA筛选所得到的杂交瘤的靶特异性。将阳性培养物在12孔组织培养板(Coming，Coming，NY)上扩增，在扩增培养基(50％Ex-CellTM 610-HSF，33％RPMI，10％FBS，1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/L人类IL-6，5％杂交瘤克隆因子[Bioveris，Gaithersburg，MD])中生长至会合，并冷冻。通过ELISA和Western印迹对含有抗体的上清液进行鉴定。
单克隆抗体的纯化
将杂交瘤培养上清液用结合缓冲液(50mM硼酸，4M氯化钠，pH 9.0)1∶1稀释，并使用AKTAxpress层析系统通过5ml HiTrap MabSelect SuReTM蛋白A柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。将柱用10倍柱体积的结合缓冲液清洗，然后用5倍柱体积的50mM柠檬酸钠(pH 3.0)、50mM磷酸钠、300mM氯化钠洗脱。将抗体洗脱物储存在样品环中，并使用HiPrep26/10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)立即将缓冲液更换成50mM磷酸钠(pH7.4)、150mM氯化钠。将含抗体的级份合并，并通过0.2μm PES Supor膜注射器式滤器(PallLife Sciences，Ann Arbor，MI)进行过滤。使用A280对免疫球蛋白水平进行定量，并使用SDS-PAGE在还原和非还原条件下评估纯度。
有限稀释法克隆
通过有限稀释法将杂交瘤克隆到2x 96孔板中。将每个孔在显微镜下观察以证实单个细胞的存在。在温育12天后，通过ELISA对具有源自于单个细胞的生长的孔进行筛选。
杂交瘤扩增
将所选的单克隆杂交瘤在Lampire细胞培养袋(Lampire，Pipersville，PA)中扩增至500ml，并允许生长至衰竭(活细胞＜20％)。倾倒上清液并将细胞通过离心进行沉淀。在纯化之前，将澄清的上清液通过0.2μm PES过滤器(Nalge Nunc，Rochester，NY)。
实施例10
HPV-E6重组蛋白的表达和纯化
高危HPV毒株例如HPV16和HPV18的致癌E6蛋白C-端中的PDZ结构域结合基序的编码多核苷酸，通过化学法合成(DNA 2.0，Menlo Park，California)或通过RT-PCR从宫颈癌细胞系克隆。将肽C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-L和C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-V与T细胞表位F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R融合，以产生重组融合肽。使用重组E6融合蛋白作为免疫原。重组蛋白的产生在本技术领域中是沿用已久的，并可以通过标准方案来实现。使用IPTG驱动的诱导将蛋白表达在大肠杆菌DH5α中。37℃诱导2小时产生～1mg/L的免疫接种肽，而20℃诱导过夜和包括蛋白与凝胶基质的重新结合在内的纯化，得到2-10mg/L的最终产率。根据PAGE分析，免疫接种肽的纯度估计＞90％。
实施例11
分泌特异性针对E6蛋白C-端的抗体的杂交瘤的产生
通过直接抗原ELISA，将杂交瘤上清液针对筛选肽F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R-R-R-E-T-Q-V进行测试。使用非E6肽作为阴性对照。选择对免疫原但不对非E6肽显示出反应性的上清液用于进一步分析。通过狭线Western印迹将所选的上清液针对不同筛选肽F-I-S-E-A-I-I-H-V-L-H-S-R-C-R-Q-C-W-R-R-R或R-R-E-T-Q-V进行反应性的进一步测试以再次证实抗E6mAb的存在。在该阶段，通过有限稀释法克隆杂交瘤以分离分泌抗E6mAb的杂交瘤克隆。
为了对杂交瘤的反应性进行进一步鉴定，在ELISA中将所选上清液针对重组E6蛋白以及用作阴性对照的GST-INADL(PDZ)和GST-MAGI1-PDZ1进行测试。GST-INADL代表了当在原核表达系统中纯化时，倾向于与在用于免疫接种的MBP-/GST-E6蛋白制备物中同样存在的细菌污染物结合的一类蛋白。该对照确保在上清液中发现的反应性反映了与HPV-E6结合的mAb，而不是针对结合的污染物。
实施例12
主题抗体对HPV E6肿瘤肽的特异性
在本实施例中，通过ELISA和Western印迹测量了主题抗体6D9.3和1A9.1mAb对来自于HPV16和HPV18的致癌E6蛋白的特异性结合。主题抗体与来自于非致癌HPV毒株例如HPV11的E6蛋白的结合，被用作阴性对照。在本实施例中使用的E6蛋白是带有His标签的，并使用抗His mAb作为阳性对照。
对于ELISA来说，用碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.6)中的1μg/ml嵌合肽，将高蛋白结合性聚苯乙烯96孔板(Corning，Corning，NY)包被过夜。在含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBST)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)中清洗后，将孔用含有5％山羊血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)的PBST在室温(RT)下阻断至少1小时。将未稀释的培养上清液以每个孔50μl在包被的板上在室温下温育1小时。小鼠抗His C-端抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)和扩增培养基被用作阳性和阴性对照。将板用PBST清洗三次，并用在PBST和5％山羊血清中以1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL)在室温下探测1小时。嵌合肽来源的培养物的初始筛选另外用HRP标记的山羊抗小鼠IgM抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL)探测。嵌合肽抗体的后续筛选用同种型特异性HRP偶联物探测。将板用PBST清洗5次，并在室温下用TMB底物(Millipore，Temecula，CA)显色10分钟。通过加入等体积的2.0N硫酸(VWR，West Chester，PA)终止显色。使用自动分光光度计测量450nm处的吸光度。
对于Western印迹来说，将重组蛋白用LDS样品缓冲液和样品还原剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)还原和变性，然后在95℃下加热5分钟。将20微克蛋白在2D4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，使用MES SDS运行缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)在200伏下电泳30分钟进行分离。在30伏下使用添加10％甲醇的转移缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)90分钟，将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。将膜在4℃下用TBS-酪蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)阻断过夜。将印迹安装在28(Immunetics，Boston，MA)上。将未稀释的上清液上到各狭槽中，并在室温下温育1小时，然后用PBST彻底清洗。使用小鼠抗His C-端抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)和扩增培养基作为阳性和阴性对照。然后将印迹与在TBS-酪蛋白中以1∶1000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠IgG或IgM抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在室温下温育1小时。将彻底大量清洗，然后用Promega WesternAP底物(Promega，Madison，WI)在室温下显色20分钟。
Western结果显示，6D9.3mAb与来自于HPV18的E6蛋白结合，并以较低程度与来自于HPV16的E6蛋白结合。1A9.1mAb与来自于HPV 16的E6蛋白结合。这两种mAb都对来自于高危HPV毒株的致癌E6蛋白有特异性，因此不与来自低危HPV11毒株的E6蛋白结合(图6)。2H9.15是与来自于HPV16和HPV18两者、但是不与来自于HPV11的E6蛋白的C-端结合的另一种mAb，如图7中所示。结果表明所述主题抗体与来自于高危HPV毒株的一种以上致癌E6蛋白特异性结合。
ELISA结果显示在表10中。结果显示，6D9.3mAb与来自于HPV18的E6蛋白结合，并以较低程度与来自于HPV16的E6蛋白结合。1A9.1mAb与来自于HPV 16的E6蛋白结合。这两种mAb都对来自于高危HPV毒株的致癌E6蛋白有特异性，因此不与来自低危HPV11毒株的E6蛋白结合。2H9.15是与来自于HPV16和HPV18两者、但是不与来自于HPV11的E6蛋白的C-端结合的另一种mAb。结果表明所述主题抗体能够与来自于高危HPV毒株的一种以上致癌E6蛋白特异性结合。
表10
表10a：半抗原氨基酸序列加上位于参与PDZ结合的HPV类型的C-末端最远端处的氨基酸序列。b：HEK表达的带有N-端六个组氨酸标签的rHPV E6。C：杆状病毒表达的带有N-端六个组氨酸标签的重组HPV E6。d：杆状病毒表达的带有C-端六个组氨酸标签的重组HPVE6。e：HEK-293表达的带有C-端六个组氨酸标签的重组HPV E6。f：不可用。g：未测试。
实施例13
使用夹心ELISA通过主题抗体捕获致癌E6蛋白
通过从小鼠P3X63-Ag-653/Bcl-2骨髓瘤细胞与从免疫接种的小鼠获得的鼠类B细胞的体细胞融合产生的杂交瘤细胞系，生产两种纯化的单克隆抗体(mAb)6D9.3和1A9.1。6D9.3和1A9.1mAb特异性针对致癌E6蛋白C-端区域中的PDZ结构域结合基序。在本实施例中，在使用各种生物素化抗E6抗体作为检测抗体的夹心ELISA中，将6D9.3和1A9.1作为捕获抗体进行测试。在本实施例中使用的抗原是来自HPV16的肽913BLTHPV16HEK。将捕获mAb6D9.3和1A9.1与各种抗E6检测抗体在不同组合中使用(表11)。
如本文中所述执行夹心ELISA。对于使用上清液的夹心ELISA来说，将捕获mAb上清液在包被缓冲液中1：7.5稀释，并使用50μl/孔在96孔ELISA板(Costar，Coming，NY)上在4℃包被过夜。将板用PBST清洗一次，并将孔用300μl 3％BSA/PBST在室温下阻断1小时。吸出阻断溶液，并向每个孔加入在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml的50μl抗原，室温温育1小时。将检测mAb上清液在1％BSA/PBST中1∶7.5稀释，并与终浓度为150ng/ml的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG-Fc抗体(Bethyl，Montgomery，TX)在室温下温育30分钟。将板用PBST清洗三次。向mAb-HRP检测复合物加入等体积的3mg/ml小鼠IgG(透析过以除去叠氮钠，BioCheck，Foster City，CA)，然后将50μl转移到每个孔中，室温下温育1小时。将板用PBST清洗三次，然后每个孔加入50μl TMB底物溶液(Sigma，St.Louis，MO)。允许反应显色10-30分钟，并用2N硫酸(VWR)终止反应。使用SpectraMax M2读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm处读取吸光度。对于每种抗体对，通过将含有抗原的孔的OD除以含有缓冲液的孔的OD确定信噪比。通过信噪比＞2.0来鉴定阳性抗体对。
为了在夹心ELISA中测试纯化的mAb和纯化的生物素化mAb，对上述用于上清液的方案进行下列修改。将纯化的捕获mAb以2μg/ml直接包被在ELISA板上。将纯化的生物素化检测mAb在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml，向每个孔添加50μ1，然后在室温下温育1小时。在将板用PBST清洗三次后，向每个孔加入在1％BSA/PBST中1∶5000稀释的50μl HRP标记的链亲和素(Pierce，Rockford，IL)。测定法的其余部分按照前面的描述进行。
mAb-E6结合测定法、包括平均信噪比(S/N比)的结果概述在表11中。结果显示6D9.3和1A9.1mAb能够结合并捕获HPV16的E6蛋白。
表11
实施例14
用特异性针对E6C-端的抗体阻断HPV E6与PDZ结构域蛋白的结合
执行了竞争性测定法以评估特异性针对HPV E6蛋白C-末端的抗体、即肿瘤肽2H9.15和6D9.3，与含PDZ结构域蛋白MAGI-1竞争同HPV E6结合的能力。简单来说，测定法如下进行：将96孔板用在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中1：1000稀释的山羊抗GST mAb在-4℃下包被过夜。将板清洗一次，并用3％BSA/PBST在室温(RT)下阻断1小时。向板加入在1％BSA/PBST中稀释至1μg/ml的GST-PDZ MAGI蛋白，并在室温温育1小时。将抗原即HPV E6蛋白在稀释液(1％BSA/PBST)中稀释至2μg/ml，并与等体积的稀释液中的肿瘤肽即mAb 2H9.15或6D9.3混合，或与等体积的不含mAb 2H9.15的稀释液混合作为对照。将混合物在室温下温育30分钟。将板清洗3次，向每个孔加入50μl E6/mAb混合物或不含mAb的E6对照，并在室温温育1小时。将板清洗3次。将生物素化抗E6mAb在1％BSA/PBST中稀释至0.25μg/ml并加入到板中，室温温育1小时。将板清洗三次。将链亲和素-HRP在1％BSA/PBST中1：5000稀释并加入到板中，室温温育1小时。将板再次清洗3次，并用TMB在室温下显色10-30分钟。使用2N硫酸终止显色，并在450nm处读板。
阻断实验的结果显示在图8中。肿瘤肽2H9.15和6D9.3阻断HPVE6蛋白与MAGI-1PDZ结合结构域的结合，证实了这些抗体与HPV E6蛋白的C-端特异性结合。
实施例15
特异性针对致癌E6蛋白C-端的单克隆抗体的交叉反应性情况
测试了抗E6mAb针对用作免疫原之外的其他E6C-端的交叉反应性情况。对于该测试来说，使用了直接ELISA方法(将重组E6蛋白包被在板上)。
产生了针对引起宫颈癌的高危HPV类型(例如HPV 16、18、26、30、31、34、45、51、52、53、58、59、66、68b、69、70、73、82)的E6蛋白的单克隆抗体。一些抗体与来自至少两种HPV致癌毒株的E6蛋白特异性结合。在一些实施方案中，特异性针对致癌E6蛋白C-端的抗体，与不同HPV毒株、特别是HPV毒株16和18的E6蛋白之间保守的氨基酸基序结合。在一些实施方案中，特异性针对致癌E6蛋白C-端的抗体，与HPV毒株16和45的E6蛋白之间保守的氨基酸基序结合。
表12
免疫接种方法/MAb 16 18 6b 11 30 31 35 45 52 58 59 66 68 69
IS 6D9.3 X +/- +/-
IS 2H9.15 X X X X +/-
IS 1A9.1 X X X X X X
如表12中所示，在ELISA中测试了纯化的单克隆抗体与重组HPV E6蛋白的结合。没有检测到与低危类型HPV 6b和11的交叉反应性。
实施例16
在含有高危HPV的细胞系上通过免疫组织化学检测抗体-E6结合
在免疫组织化学(IHC)中，使用本发明的抗体检测来自组织载片上含高危HPV毒株的卵巢组织的E6蛋白。IHC是本技术领域中公知的技术，其程序在本文中简要公开。将福尔马林固定的石蜡包埋的卵巢组织切成4μm切片并置于superfrost+载片上，在60℃烘烤20分钟。载片使用Benchmark XT染色平台和Ventana试剂进行染色。使用了下述染色参数：抗原修复使用细胞调制器1(标准)，抗E6抗体温育在37℃下进行(1小时)，DAB检测使用I-VIEW检测试剂盒，苏木精II(复染)，以及蓝色染色试剂。在染色操作完成时，通过在1％Dawn餐具去污剂溶液中清洗，然后用自来水漂洗3分钟，对载片进行后处理。将载片通过一系列醇和二甲苯进行脱水、安放并加上盖玻片。IHC结果证实，特异性针对E6蛋白C-末端的抗体结合并检测含HPV组织上来自高危HPV毒株的E6蛋白。
IHC结果显示在图10中。细胞用蓝色试剂染色。使用抗E6mAb 1A9.1染色三种细胞系中的E6：HPV阳性的SiHa、Hela以及HPV阴性细胞系C-33A。与棕色染料DAB组合使用的mAb1A9.1能够染色表达HPV E6蛋白的SiHa和Hela两种细胞，但是不染色HPV阴性的C-33A细胞。
实施例17
在夹心ELISA中通过“mAb-E6-mAb”夹心方法能够检测致癌HPV16毒株的E6蛋白
(A)摘要：
在所描述的实验中，通过夹心ELISA，使用抗E6第一捕获抗体和抗E6第二检测抗体来选择性检测致癌HPV例如HPV16感染的细胞中E6蛋白的存在。在该测定法中，致癌HPV毒株的E6蛋白被抗HPV16 E6mAb即F126-6G6mAb捕获，该抗体包被在固体基材例如测试条上。然后通过抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)碱性磷酸酶(AP)偶联的mAb以及上文公开的检测系统，检测结合于第一捕获mAb的HPV E6蛋白。这种方法被称为“mAb-E6-mAb”夹心方法。将这种方法与“PDZ-E6-mAb”检测方法进行了比较，在后一种方法中，将上文中公开的PDZ结构域多肽包被在固体支持物上，以捕获样品中存在的E6蛋白。然后加入抗E6mAb以检测结合于PDZ结构域多肽的E6蛋白。这两种方法的方案显示在图11中。致癌E6蛋白的特异性捕获证明了本发明的抗体组合物能够应用于基于E6检测的HPV感染诊断测试和/或宫颈癌检验中。
B)方法：
夹心ELISA：将PBS中5μg/ml的抗E6捕获抗体(F126-6G6mAb)或PDZ结构域多肽(例如GST-MAGI1-PDZ1)，在测试条上在4℃下包被过夜(100μl/孔)。将测试条用PBS清洗并用200μl PBS/2％BSA在4℃阻断2小时。加入在PBS/2％BSA中稀释的细胞裂解物，并在室温下温育1小时。为了制备样品，将阴性宫颈拭子样品(NCLS)在0.6ml掺有7,500个CaSki(HPV16)细胞的B2B中添加0.4ml B2deltaT进行裂解。未掺有CaSki(HPV16)细胞的NCLS(OK)用作阴性对照。在用PBS清洗3次后，将0.15ml含有致癌E6的样品在含有2％BSA作为阻断剂的PBS中加到测试条上，并将测试条在室温温育45分钟。然后将测试条用PBS清洗三次，并与PBS/2％BSA中处于适合浓度下的抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)AP偶联的mAb在室温下温育45分钟，然后加入抗小鼠IgG抗体-HRP(Jackson Immuno Research)。在这种夹心测定法的修改形式中，使用生物素化试剂(例如生物素化抗E6抗体)作为检测抗体，然后加入链亲和素-HRP，以进一步减小背景和增加灵敏度。
对于其中包被有PDZ结构域多肽例如GST-MAGIl-PDZ1的测试条来说，可以加入抗GST抗体-HRP(Pharmacia)来检测E6与PDZ结构域多肽的结合。在用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次后，将测试条与100μl/孔的TMB底物(Dako Industries)温育。在适合的时间(通常在20分钟后)通过加入100μl 0.1M H2SO4来终止比色反应。通过目测检查和CAMAG读板器进行读出/定量。没有施加热处理。
在上文中公开的夹心ELISA的变化形式中，将细胞裂解物与终浓度为2.5-5μg/ml的抗E6第二检测抗体在4℃下预温育1-2小时，然后加到抗E6捕获抗体包被的测试条上。
C)结果：
从mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法获得的结果显示在图12和13中。对于HPV16-E6来说，与“PDZ-E6-mAb”检测方法相比，“mAb-E6-mAb”夹心方法产生了明显改进的信噪比。mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法能够从含有7,500个HPV16细胞的样品检测E6蛋白。此外，使用单个宫颈拭子样品，mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法致使衰减显著降低。“mAb-E6-mAb”夹心方法在HPV16单重检测中具有高灵敏度。
实施例18
在夹心ELISA中通过“mAb-E6-mAb”夹心方法能够检测致癌HPV18毒株的E6蛋白
(A)摘要：
描述了以下实验：其中通过夹心ELISA，使用抗E6第一捕获抗体和抗E6第二检测抗体来选择性检测致癌HPV18感染的细胞中E6蛋白的存在。在该测定法中，致癌HPV毒株的E6蛋白被抗HPV18 E6mAb即F82-3D4捕获，该抗体包被在固基材例如测试条上。然后通过抗E6检测抗体、即F82-5A2(HPV18)碱性磷酸酶(AP)偶联的mAb以及上文公开的检测系统，检测结合于第一捕获mAb的HPV E6蛋白。这种方法被称为“mAb-E6-mAb”夹心方法。将这种方法与“PDZ-E6-mAb”检测方法进行了比较，在后一种方法中，将上文中公开的PDZ结构域多肽包被在固体支持物上，以捕获样品中存在的E6蛋白。然后加入抗E6mAb以检测结合于PDZ结构域多肽的E6蛋白。这两种方法的方案显示在图12中。致癌E6蛋白的特异性捕获证明了本发明的抗体组合物能够应用于基于E6检测的HPV感染诊断测试和/或宫颈癌检验。
B)方法：
夹心ELISA：将PBS中5μg/ml的抗E6捕获抗体(F82-3D4mAb)或PDZ结构域多肽(例如GST-MAGI1-PDZ1)，在测试条上在4℃下包被过夜(100μl/孔)。将测试条用PBS清洗并用200μl PBS/2％BSA在4℃阻断2小时。加入在PBS/2％BSA中稀释的细胞裂解物，并在室温下温育1小时。为了制备样品，将阴性宫颈拭子样品(NCLS)在0.6ml掺有10,000HeLa(HPV18)细胞的B2B中添加0.4ml B2deltaT裂解。未掺有HeLa(HPV18)细胞的NCLS(0K)用作阴性对照。在用PBS清洗3次后，将0.15ml含有致癌E6的样品在含2％BSA作为阻断剂的PBS中加到测试条上，并将测试条在室温温育45分钟。然后将测试条用PBS清洗三次，并与PBS/2％BSA中处于适合浓度下的抗E6检测抗体、即F82-5A2(HPV18)AP偶联的mAb在室温下温育45分钟，然后加入抗小鼠IgG抗体-HRP(Jackson Immuno Research)。在这种夹心测定法的修改形式中，使用生物素化试剂(例如生物素化抗E6抗体)作为检测抗体，然后加入链亲和素-HRP，以进一步减小背景和增加灵敏度。
对于其中包被有PDZ结构域多肽例如GST-MAGI1-PDZ1的测试条来说，可以加入抗GST抗体-HRP(Pharmacia)来检测E6与PDZ结构域多肽的结合。在用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次后，将测试条与100μl/孔的TMB底物(Dako Industries)温育。在适合的时间(通常在20分钟后)通过加入100μl 0.1M H2SO4来终止比色反应。通过目测检查和CAMAG读板器进行读出/定量。没有施加热处理。
在上文中公开的夹心ELISA的变化形式中，将细胞裂解物与终浓度为2.5-5μg/ml的抗E6第二检测抗体在4℃下预温育1-2小时，然后加到抗E6捕获抗体包被的测试条上。
C)结果：
从mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法获得的结果显示在图14中。对于HPV18-E6来说，与“PDZ-E6-mAb”检测方法相比，“mAb-E6-mAb”夹心方法产生了明显改进的信噪比。mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法能够从含有10,000个HPV18细胞的样品检测E6蛋白。“mAb-E6-mAb”夹心方法在HPV18单重检测中具有增高的灵敏度。
实施例19
在夹心ELISA中能够通过“mAb-E6-mAb”夹心方法检测致癌HPV45毒株的E6蛋白
实验和方法如实施例1和2中所述，其中通过夹心ELISA，使用抗E6第一捕获抗体和抗E6第二检测抗体来选择性检测致癌HPV45感染的细胞中E6蛋白的存在。在该测定法中，致癌HPV毒株的E6蛋白被抗HPV45E6mAb即F154-4C5捕获，该抗体包被在固体基材例如测试条上。然后通过抗E6检测抗体、即F82-3F3(HPV45)碱性磷酸酶(AP)偶联的mAb以及上文公开的检测系统，检测结合于第一捕获mAb的HPV E6蛋白。
将在PBS中5μg/ml的抗E6捕获抗体(F154-4C5mAb)或PDZ结构域多肽(例如GST-MAGI1-PDZ1)，在测试条上在4℃下包被过夜(100μl/孔)。将测试条用PBS清洗并用200μlPBS/2％BSA在4℃阻断2小时。加入在PBS/2％BSA中稀释的细胞裂解物，并在室温下温育1小时。为了制备样品，将阴性宫颈拭子样品(NCLS)在0.6ml掺有20,000或5,000个MS751(HPV18和HPV45阳性)细胞的B2B中添加0.4ml B2deltaT进行裂解。未掺有MS751细胞的NCLS用作阴性对照。在用PBS清洗3次后，将0.15ml含有致癌E6的样品在含2％BSA作为阻断剂的PBS中加到测试条上，并将测试条在室温温育45分钟。然后将测试条用PBS清洗三次，并与PBS/2％BSA中处于适合浓度下的抗E6检测抗体、即F82-3F3(HPV45)AP偶联的mAb在室温下温育45分钟，然后加入抗小鼠IgG抗体-HRP(Jackson Immuno Research)。在这种夹心测定法的修改形式中，使用生物素化试剂(例如生物素化抗E6抗体)作为检测抗体，然后加入链亲和素-HRP，以进一步减小背景和增加灵敏度。
对于包被了PDZ结构域多肽例如GST-MAGI1-PDZ1的测试条来说，可以加入抗GST抗体-HRP(Pharmacia)来检测E6与PDZ结构域多肽的结合。在用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次后，将测试条与100μl/孔的TMB底物(Dako Industries)温育。在适合的时间(通常在20分钟后)通过加入100μl 0.1M H2SO4来终止比色反应。通过目测检查和CAMAG读板器进行读出/定量。没有施加热处理。
在上文中公开的夹心ELISA的变化形式中，将细胞裂解物与终浓度为2.5-5μg/ml的抗E6第二检测抗体在4℃下预温育1-2小时，然后加到抗E6捕获抗体包被的测试条上。
从mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法获得的结果显示在图15中。对于HPV45-E6来说，与“PDZ-E6-mAb”检测方法相比，“mAb-E6-mAb”夹心方法产生了明显改进的信噪比。mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法能够从含有20,000和5,000个HPV18和HPV45阳性细胞的样品检测E6蛋白。此外，没有观察到NCLS特异性的衰减。“mAb-E6-mAb”夹心方法在HPV45单重检测中具有增高的灵敏度。
实施例20
在多重夹心测定法中通过“mAb-E6-mAb”夹心方法能够检测致癌HPV16和HPV18的 E6蛋白
描述了以下实验：其中通过夹心ELISA，使用抗E6第一捕获抗体和抗E6第二检测抗体来选择性检测一种以上致癌HPV毒株例如HPV16和HPV18感染的细胞中E6蛋白的存在。在该测定法中，HPV16和HPV18的E6蛋白分别被抗HPV16 E6mAb即F126-6G6mAb和抗HPV18E6mAb即F82-3D4捕获。这两种捕获抗体包被在固体基材例如测试条上。然后通过抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)和F82-5A2(HPV18)碱性磷酸酶(AP)偶联的mAb混合物以及上文公开的检测系统，检测结合于第一捕获mAb的HPV E6蛋白。HPV类型特异性E6检测允许在E6测试条中，不同的HPV类型例如HPV16和HPV18作为一个测试条上两条不同的测试线被检测。相反，通过用PDZ结构域多肽进行E6检测，不容易实现这种HPV类型特异性的E6检测。使用本发明的方法的多重HPV类型特异性E6蛋白检测的方案显示在图16中。
在测试条上执行夹心ELISA的方法如本文实施例17-19中所述。将PBS中5μg/ml的抗E6捕获抗体(F127-6G6mAb和F82-3D4mAb)在测试条上在4℃下包被过夜(100μl/孔)。将测试条用PBS清洗并用200μl PBS/2％BSA在4℃阻断2小时。加入在PBS/2％BSA中稀释的细胞裂解物，并在室温下温育1小时。为了制备样品，将阴性宫颈拭子样品(NCLS)在0.6ml掺有5,000个HeLa(HPV18)或CaSki(HPV16)细胞或HeLa和CaSki两种细胞的B2B中添加0.4mlB2deltaT进行裂解。未掺有任何细胞的NCLS用作阴性对照。在用PBS清洗3次后，将0.15ml含有致癌E6的样品在含2％BSA作为阻断剂的PBS中加到测试条上，并将测试条在室温温育45分钟。然后将测试条用PBS清洗三次，并与PBS/2％BSA中处于适合浓度下的抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)和F82-5A2(HPV18)AP偶联的mAb混合物在室温下温育45分钟，然后加入抗小鼠IgG抗体-HRP(Jackson Immuno Research)。在这种夹心测定法的修改形式中，使用生物素化试剂(例如生物素化抗E6抗体)作为检测抗体，然后加入链亲和素-HRP，以进一步减小背景和增加灵敏度。在用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次后，将测试条与100μl/孔的TMB底物(Dako Industries)温育。在适合的时间(通常在20分钟后)通过加入100μl 0.1M H2SO4来终止比色反应。通过目测检查和CAMAG读板器进行读出/定量。没有施加热处理。
在上文中公开的夹心ELISA的变化形式中，将细胞裂解物与终浓度为2.5-5μg/ml的抗E6第二检测抗体在4℃下预温育1-2小时，然后加到抗E6捕获抗体包被的测试条上。
从多重mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法获得的结果显示在图17和18中。通过HPV类型特异性mAb捕获E6蛋白允许对不同HPV毒株(例如HPV16+HPV18)进行E6分型。此外，HPV16/HPV18mAb检测混合物与检测来自单一HPV毒株的E6蛋白的E6单重检测相比，不产生增加的背景或降低的信号。mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法能够从含有5,000个HPV18和/或HPV16阳性细胞的样品中检测E6蛋白。
实施例21
多重“mAb-E6-mAb”夹心方法具有检测E6蛋白的低的假阳性率
描述了以下实验：其中通过夹心ELISA，使用抗E6第一捕获抗体和抗E6第二检测抗体来选择性检测一种以上致癌HPV例如HPV16和HPV18感染的细胞中E6蛋白的存在。在该测定法中，HPV16和HPV18的E6蛋白分别被抗HPV16 E6mAb即F126-6G6和抗HPV18 E6mAb即F82-3D4捕获。这两种捕获抗体包被在固体基材例如测试条上。然后通过抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)和F82-5A2(HPV18)碱性磷酸酶(AP)偶联的mAb混合物以及上文公开的检测系统，检测结合于第一捕获mAb的HPV E6蛋白。HPV类型特异性E6检测允许在E6测试条检验中，不同的HPV类型例如HPV16和HPV18被检测为一个测试条上的两条不同测试线。
将PBS中5μg/ml的抗E6捕获抗体(F127-6G6mAb和F82-3D4mAb)在测试条上在4℃下包被过夜(100μl/孔)。将测试条用PBS清洗并用200μl PBS/2％BSA在4℃阻断2小时。加入在PBS/2％BSA中稀释的来自60位个体的HPV阴性宫颈拭子样品(NCLS)的细胞裂解物，并在室温下温育1小时。在用PBS清洗3次后，将0.15ml每种NCLS样品在含2％BSA作为阻断剂的PBS中加到测试条上，并将测试条在室温温育45分钟。然后将测试条用PBS清洗三次，并与在PBS/2％BSA中处于适合浓度下的抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)和F82-5A2(HPV18)AP偶联的mAb混合物在室温下温育45分钟，然后加入抗小鼠IgG抗体-HRP(Jackson ImmunoResearch)。在这种夹心测定法的修改形式中，使用生物素化试剂(例如生物素化抗E6抗体)作为检测抗体，然后加入链亲和素-HRP，以进一步减小背景和增加灵敏度。在用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次后，将测试条与100μl/孔的TMB底物(Dako Industries)温育。在适合的时间(通常在20分钟后)通过加入100μl 0.1M H2SO4来终止比色反应。通过目测检查和CAMAG读板器进行读出/定量。没有施加热处理。
在60个NCLS上从多重mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法获得的结果显示在图19中。对于所有60个阴性宫颈拭子样品来说，CAMAG装置上的信号低于肉眼可见的限度，表明在60个阴性宫颈拭子样品中存在0个阳性样品。该结果显示，在所测试的60个阴性样品上没有HPV16/HPV18假阳性。假阳性率低于1.7％。
实施例22
在多重夹心测定法中通过“mAb-E6-mAb”夹心方法能够检测致癌HPV16、HPV18和 HPV45的E6蛋白
描述了以下实验：其中通过夹心ELISA，使用抗E6第一捕获抗体和抗E6第二检测抗体来选择性检测一种以上致癌HPV例如HPV16、HPV18和HPV45感染的细胞中E6蛋白的存在。在该测定法中，HPV16、HPV18和HPV45的E6蛋白分别被抗HPV16 E6mAb即F126-6G6mAb、抗HPV18E6mAb即F82-3D4和抗HPV45 E6mAb即F82-3F3捕获。这三种捕获抗体包被在固体基材例如测试条上。然后通过抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)、F82-5A2(HPV18)和6F4(HPV45)碱性磷酸酶(AP)偶联的mAb混合物以及上文公开的检测系统，检测结合于第一捕获mAb的HPV E6蛋白。HPV类型特异性E6检测允许在E6测试条中，不同的HPV类型例如HPV16、HPV18和HPV45被检测为一个测试条上的三条不同测试线。
在测试条上执行多重夹心ELISA的方法如本文实施例4中所述。将在PBS中5μg/ml的抗E6捕获抗体(F127-6G6mAb、F82-3D4mAb和F82-3F3mAb)在测试条上在4℃下包被过夜。将测试条用PBS清洗并用200μl PBS/2％BSA在4℃阻断2小时。加入在PBS/2％BSA中稀释的细胞裂解物，并在室温下温育1小时。为了制备样品，将阴性宫颈拭子样品(NCLS)在0.6ml掺有5,000个HeLa(HPV18+)细胞、5,000个CaSki(HPV16+)细胞或5,000个MS751(HPV45+)细胞或所有三种细胞系的B2B中添加0.4ml B2deltaT进行裂解。未掺有任何细胞的NCLS用作阴性对照。在用PBS清洗3次后，将0.15ml含有致癌E6的样品在含2％BSA作为阻断剂的PBS中加到测试条上，并将测试条在室温温育45分钟。然后将测试条用PBS清洗三次，并与在PBS/2％BSA中处于适合浓度下的抗E6检测抗体、即4C6(HPV16)、F82-5A2(HPV18)和6F4(HPV45)AP偶联的mAb混合物在室温下温育45分钟，然后加入抗小鼠IgG抗体-HRP(Jackson ImmunoResearch)。在这种夹心测定法的修改形式中，使用生物素化试剂(例如生物素化抗E6抗体)作为检测抗体，然后加入链亲和素-HRP，以进一步减小背景和增加灵敏度。在用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次后，将测试条与100μl/孔的TMB底物(Dako Industries)温育。在适合的时间(通常在20分钟后)通过加入100μl 0.1M H2SO4来终止比色反应。通过目测检查和CAMAG读板器进行读出/定量。没有施加热处理。
在上文中公开的夹心ELISA的变化形式中，将细胞裂解物与终浓度为2.5-5μg/ml的抗E6第二检测抗体在4℃下预温育1-2小时，然后加到抗E6捕获抗体包被的测试条上。
从多重mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法获得的结果显示在图20中。来自HPV16、HPV18和HPV45的E6蛋白被检测为测试条上的三条不同线。通过HPV类型特异性mAb捕获E6蛋白允许对不同HPV毒株(例如HPV16、HPV18和HPV45)进行E6分型。此外，HPV16/HPV18/HPV45mAb检测混合物与检测来自单一HPV毒株的E6蛋白的E6单重检测相比，不产生增加的背景或降低的信号。mAb-E6-mAb夹心ELISA测定法能够从含有5,000个HPV16、HPV18和/或HPV45阳性细胞的样品中检测到E6蛋白。
尽管在本文中已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本技术领域的专业人员来说，显然这些实施方案仅仅作为实例提供。对于本技术领域的专业人员来说，现在可以在不背离本发明的情况下进行大量修改、改变和替换。应该理解，本文描述的本发明实施方案的替代方案可用于实践本发明。打算使用下面的权利要求书来定义本发明的范围，并由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等效物。
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<150> 61/175,365
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<151> 2009-04-20
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<151> 2009-04-20
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人乳头瘤病毒
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<223> 人工序列的描述: 合成的
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<223> 人工序列的描述: 合成的
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<400> 15
Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr
1 5 10 15
Glu Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
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<213> 人工序列
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<213> 人乳头瘤病毒
<400> 30
Pro Pro Arg Gln Arg Ser Glu Thr Gln Val
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 31
Lys Cys Ser Leu Cys Arg Leu Tyr Ala Ile
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 32
Trp Thr Thr Cys Met Glu Asp Met Leu Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 33
Trp Thr Thr Cys Met Glu Asp Leu Leu Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 34
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg Arg Arg Glu
1 5 10 15
Thr Gln Leu
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 35
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg Cys Arg Gln
1 5 10 15
Cys Trp Arg Arg Arg Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25
<210> 36
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 36
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg Cys Arg Gln
1 5 10 15
Cys Trp Arg Arg Arg
20
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 37
Arg Arg Glu Thr Gln Leu
1 5
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 38
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg Arg Arg Glu
1 5 10 15
Thr Gln Val
<210> 39
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 39
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg Cys Arg Gln
1 5 10 15
Cys Trp Arg Arg Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
20 25
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 40
Arg Arg Glu Thr Gln Val
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> Lys或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Asn, Lys, Ser, Glu或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ala或Ser
<400> 41
Xaa Xaa Arg Phe His Xaa Ile Xaa
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Leu或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ile, Tyr, His, Leu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Arg, Ile或Cys
<400> 42
Leu Xaa Ile Arg Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Arg, Ile或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gln或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Lys或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Cys, Thr, Gly或Asn
<400> 43
Xaa Cys Xaa Xaa Pro Leu Xaa Pro
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Lys或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Cys, Thr, Gly或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Glu, Ala或Gln
<400> 44
Xaa Pro Leu Xaa Pro Xaa Glu Lys
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
5xHis标签
<400> 45
His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
6xHis标签
<400> 46
His His His His His His
1 5
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 47
Cys Arg Gln Cys Trp Arg Arg Arg Arg Arg Glu Thr Gln Leu
1 5 10
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 48
Cys Arg Gln Cys Trp Arg Arg Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
1 5 10
<210> 49
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 49
Ala Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Arg Lys Leu His Asp Leu
1 5 10 15
Cys Thr Glu Leu Glu Thr Ser Leu
20
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 50
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
20 25 30
<210> 51
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 51
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu
20 25
<210> 52
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 52
Met Phe Lys Asn Pro Ala Glu Arg Pro Arg Lys Leu His Glu Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr
20
<210> 53
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 53
Met Phe Gln Asp Thr Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Thr Ile
20
<210> 54
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 54
Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Asn Glu Val Glu Glu Ser Ile
20
<210> 55
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 55
Met Ala Arg Phe His Asn Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Thr Leu Asp Thr Thr Leu
20 25
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 56
Met Ala Arg Phe Asp Asp Pro Lys Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu
20 25
<210> 57
<211> 25
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 57
Phe Asp Asp Pro Lys Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr
1 5 10 15
Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Val
20 25
<210> 58
<211> 23
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 58
Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu
1 5 10 15
Lys Arg Arg His Leu Lys Asp
20
<210> 59
<211> 24
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 59
Arg His Leu Lys Asp Lys Arg Arg Phe His Ser Ile Ala Gly Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Gly Gln Cys Asn Thr Cys Cys
20
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 60
Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 61
Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu
1 5 10
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 62
Arg His Leu Lys Asp Lys Arg Arg Phe His Ser Ile
1 5 10
<210> 63
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 63
Met Phe Glu Asp Pro Ala Thr Arg Pro Arg Thr Leu His Glu Leu Cys
1 5 10 15
Glu Val Leu Glu Glu Ser Val
20
<210> 64
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 64
Met Glu Pro Gln Phe Asn Asn Pro Gln Glu Arg Pro Arg Ser Leu His
1 5 10 15
His Leu Ser Glu Val Leu Glu Ile Pro Leu
20 25
<210> 65
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 65
Met Phe Gln Asp Ala Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val
20
<210> 66
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 66
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Ser Thr Thr Leu Asn Ile Pro Leu
20 25
<210> 67
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 67
Met Ala Leu Phe His Asn Pro Glu Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Arg Thr Leu Asp Thr Thr Leu
20 25
<210> 68
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 68
Met Glu Ser Ala Asn Ala Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ile Asp Gln Leu
1 5 10 15
Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Met
20
<210> 69
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 69
Met Glu Ser Lys Asp Ala Ser Thr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Gln Leu
1 5 10 15
Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Leu
20
<210> 70
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 70
Ala Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu
1 5 10 15
Cys Thr Glu Leu Glu Thr Ser Leu
20
<210> 71
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 71
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
20 25 30
<210> 72
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 72
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu
20 25
<210> 73
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 73
Met Phe Lys Asn Pro Ala Glu Arg Pro Arg Lys Leu His Glu Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr
20
<210> 74
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 74
Met Phe Gln Asp Thr Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Thr Ile
20
<210> 75
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 75
Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Asn Glu Val Glu Glu Ser Ile
20
<210> 76
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 76
Met Ala Arg Phe His Asn Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Thr Leu Asp Thr Thr Leu
20 25
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 77
Met Ala Arg Phe Asp Asp Pro Lys Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu
20 25
<210> 78
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 78
Met Phe Glu Asp Pro Ala Thr Arg Pro Arg Thr Leu His Glu Leu Cys
1 5 10 15
Glu Val Leu Glu Glu Ser Val
20
<210> 79
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 79
Met Glu Pro Gln Phe Asn Asn Pro Gln Glu Arg Pro Arg Ser Leu His
1 5 10 15
His Leu Ser Glu Val Leu Glu Ile Pro Leu
20 25
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 80
Met Phe Gln Asp Ala Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val
20
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 81
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Ser Thr Thr Leu Asn Ile Pro Leu
20 25
<210> 82
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 82
Met Ala Leu Phe His Asn Pro Glu Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Arg Thr Leu Asp Thr Thr Leu
20 25
<210> 83
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 83
Met Glu Ser Ala Asn Ala Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ile Asp Gln Leu
1 5 10 15
Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Met
20
<210> 84
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 84
Met Glu Ser Lys Asp Ala Ser Thr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Gln Leu
1 5 10 15
Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Leu
20
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 85
Ser Thr Glu Thr Ala Val
1 5
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 86
His Cys Trp Thr Thr Cys
1 5
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 87
Met Glu Asp Leu Leu Pro
1 5

Claims (10)

1.一种抗体，所述抗体与至少两种人乳头瘤病毒(HPV)株的致癌E6蛋白的氨基端(N-端)特异性结合，对于至少两种HPV毒株的E6蛋白具有增强的结合亲和性和检测灵敏度。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体与至少三种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18和45的E6蛋白特异性结合。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体与至少六种不同致癌HPV毒株的E6蛋白特异性结合。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、31、33、45、52和58的E6蛋白特异性结合。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、39、45、51、68、69和82的E6蛋白特异性结合。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体与HPV毒株16、18、26、30、31、34、39、45、51、52、53、58、59、66、68、69、70、73和82的E6蛋白特异性结合。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体与样品中的E6蛋白特异性结合。
9.权利要求8的抗体，其中样品是宫颈刮片、宫颈活检组织、宫颈灌洗液、血液或尿液。
10.权利要求8的抗体，其中样品是组织学样品。
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