CN101993478B - Eb病毒潜伏膜蛋白2多表位重组蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及EB病毒潜伏膜蛋白2多表位重组蛋白的制备及应用。本发明公开了一种以全长的EB病毒潜伏膜蛋白2为基础筛选获得的富含多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的多表位重组蛋白。本发明还公开了所述蛋白的编码核酸，包含所述核酸重组载体和宿主细胞。本发明还公开了所述蛋白在预防、治疗和诊断EB病毒感染及其相关疾病方面的用途。本发明所述的蛋白具有很强的免疫原性和抗原性，应用前景良好。

Description

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位重组蛋白及应用

技术领域

本发明属于生物制药及诊断领域，更具体地，本发明涉及来自于EB病毒潜伏膜蛋白2上的多个CTL、Th和B细胞表位组成的多表位重组蛋白，其编码核酸，其制备方法及其在预防、治疗和诊断EB病毒感染及其相关疾病方面的应用。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是传染性单核细胞增多症的病原，由Epstein和Barr于1964年首先从非洲Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现。EBV感染普遍，约90％以上的人建立了终身潜伏感染(参见Maeda A，Sato T，Wakiguchi H.[Epidemiology of Epstein-Barr virus(EBV)infection andEBV-associated diseases][J].Nippon Rinsho，2006，64 Suppl 3：609-612)，但没有明显的临床症状。EBV具有嗜B淋巴细胞的特征，能够刺激B细胞增生和转化，因而属于肿瘤原性病毒，与何杰金病、Burkitt’s淋巴瘤以及中国南方高发的鼻咽癌(Nasopharyngenl Carcinoma，NPC)等肿瘤密切相关，近来报道尚与宫颈癌(Sasagawa T等，Epstein-Barr virus(EBV)genes expression in cervicalintraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer：a comparative study withhuman papillomavirus(HPV)infection[J].Hum Pathol，2000，31(3)：318-326)、胃癌(Sairenji T.Epstein-Barr virus(EBV)infection and gastric carcinoma：theapproach through EBV infected epithelial cell lines[J].Jpn J Infect Dis，1999，52(3)：110-112)、肺癌(Verschuuren E等，Quantitative Epstein-Barr virus(EBV)serology in lung transplant recipients with primary EBV infection and/orpost-transplant lymphoproliferative disease[J].J Med Virol，2003，69(2)：258-266)和乳腺癌(Yasui Y等，Breast cancer risk and″delayed″primary Epstein-Barrvirus infection[J] Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001，10(1)：9-16)相关。其中EBV与NPC的关系研究较为深入。据估计全世界鼻咽癌病例中80％发生于中国，血清学普查及分子流行病学研究表明，几乎100％未分化和低分化NPC患者可在血清中检测到特异性的EBV抗体，并在鼻咽癌组织中检测到EB病毒的基因组及其表达产物(Davis JE等，Determining virological，serological and immunological parameters of EBV infection in the developmentof PTLD[J].Int Immunol，2004，16(7)：983-989)。目前，早期鼻咽癌的5年生存率平均在50％左右，而中晚期者仅为20％～30％。EBV引起的感染及其相关肿瘤已对人类健康构成了极大危害，因而寻求有效的疫苗是防治其感染及其相关肿瘤的主要途径。

EBV主要有2种感染方式：潜伏感染和裂解性感染。潜伏感染时主要表达8种蛋白(6种核蛋白EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNALP和2种膜蛋白LMP1与LMP2)，其作用主要是维持病毒处于潜伏感染状态，并且促使原来处于静止状态的B淋巴细胞维持增生。研究表明，LMP1为肿瘤原性蛋白，而LMP2则不具细胞转化作用。LMP2由LMP2A和LMP2B组成，可通过脂质筏和src家族的syk、lyn蛋白酪氨酸激酶的调节作用来阻止由BCR引起的酪氨酸磷酸化，阻止EBV进入病毒增殖期，从而维持EBV潜伏感染。因此，LMP2是研究防治EBV感染及其相关肿瘤的理想靶抗原之一，其中富含的CTL、Th和B细胞表位，在诱导机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫方面具有非常重要的意义。

目前EBV疫苗的研究主要包括：①重组疫苗：通过基因工程将LMP2基因、或其CTL表位基因、或结构蛋白gp340基因克隆到痘苗病毒或是腺病毒载体，使之高效表达后作为疫苗，其免疫保护作用正在观察中。②合成多肽疫苗：研究证明LMP2是机体产生CTL反应和抗肿瘤作用的主要靶抗原，选择其CTL表位，人工合成肽链，可产生一定的保护性细胞免疫，但免疫原性较弱。③DNA疫苗：选用EBV糖蛋白gp350基因或LMP2基因克隆到质粒载体后作为疫苗，可有效地刺激小鼠产生特异性的CTL免疫效应和中和抗体反应。④EBV抗原负载的树突状细胞(DC)疫苗：将EBV的LMP2基因克隆的腺病毒载体转染DC，或提取EBV感染的B细胞蛋白，诱导DC作为疫苗，其诱导产生的免疫保护效应尚在研究之中。总之，以CTL为基础的疫苗研究显示了其治疗EBV感染及其相关肿瘤的诱人前景，但免疫原性弱的问题尚待解决，同时由于其存在HLA的限制性，难以达到覆盖较大的敏感人群的目的。

表位是抗原分子中可与CTL、Th和B细胞表面受体结合，诱导特异性细胞免疫和体液免疫，从而产生免疫保护作用的一段氨基酸序列。基于抗原表位的表位疫苗(Epitope vaccine)是新近发展起来，具有独特设计思路，以抗原表位为基础制备的疫苗。由于表位疫苗设计的独特性，与减毒活疫苗、灭活苗及其他几种新型的疫苗相比，表位疫苗，尤其是由多个抗原表位组合形成的多表位疫苗具有：①安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应，其分子结构小而简单，不会引起自身免疫反应或免疫抑制；②可对抗原表位进行精确的定位，并可对T、B细胞抗原表位进行不同组合，制成针对多种病原体的疫苗；③选用具有多种HLA限制性的CTL表位组合，可解决单一的CTL表位存在的难以覆盖多数人群的问题。因而，通过筛选富含多个CTL、Th和B细胞优势表位的氨基酸序列为抗原，可达到既能诱导免疫应答又可减少免疫病理反应的目的；能够有效增强表位提呈的效率，解决表位疫苗的免疫原性弱目的；同时可保持B细胞表位的天然构象等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EB病毒潜伏膜蛋白2多表位重组蛋白，其编码核酸、其制备方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种多表位蛋白，所述蛋白的氨基酸序列含有：

(a)EB病毒潜伏膜蛋白2上第195-232位氨基酸序列；和

(b)EB病毒潜伏膜蛋白2上第419-436位氨基酸序列。

在一个优选例中，所述的蛋白不包括全长的EB病毒潜伏膜蛋白2(SEQ IDNO：4)。

在另一优选例中，(a)和(b)中的氨基酸序列直接连接或通过连接序列连接。所述的连接序列包括0-30个氨基酸；较佳地为0-15个氨基酸；更佳地为0-5个氨基酸。

在另一优选例中，所述蛋白含有多个CTL表位、Th表位和B细胞表位。

在另一优选例中，所述多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列是串联排列的。

在另一优选例中，(a)序列连接于(b)序列的氨基端或羧基端；更佳地，(a)序列连接于(b)序列的氨基端。

在另一优选例中，所述的蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的第二方面，提供一种核酸(多表位核酸)，所述核酸编码所述的蛋白。

在一个优选例中，所述核酸的核苷酸序列经人源密码子优化修饰。

在另一优选例中，所述的核酸的核苷酸序列选自：

(1)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列(即经人源密码子优化的序列)；或

(2)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列(即未经人源密码子优化的序列)。

在本发明的第三方面，提供一种重组载体，所述载体包含所述的核酸。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(i)含有所述的载体；或

(ii)基因组中整合有所述的核酸。

在本发明的第五方面，提供一种制备所述的蛋白的方法，所述方法包括：培养所述的细胞，使所述细胞产生所述的蛋白。

在本发明的第六方面，提供所述的蛋白、所述的核酸、所述的重组载体或所述的宿主细胞在制备用于预防、治疗或诊断EB病毒感染或相关疾病的组合物中的用途。

在一个优选例中，所述的EB病毒感染相关疾病包括(但不限于)：传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、何杰金病、Burkitt’s淋巴瘤、宫颈癌、胃癌、乳腺癌或肺癌等。

在本发明的第七方面，提供一种组合物，其包含有效量的所述的蛋白和药学上或免疫学上可接受的载体或佐剂。

在一个优选例中，所述的组合物是疫苗。

在本发明的第八方面，提供一种药盒，所述的药盒中包含至少一个容器，所述容器中含有所述的蛋白或所述的组合物；或者所述的药盒中含有一固相载体，所述的固相载体上包被有所述的蛋白。

另一方面，提供一种制备检测EB病毒感染相关疾病的药盒(试剂盒)的方法，所述方法包括：

(1)将所述的多表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板)，获得包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体；和

(2)将(1)获得的包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测EB病毒感染相关疾病的药盒。

另一方面，提供一种检测EB病毒感染相关疾病的方法，所述方法包括：

(1)将所述的多表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板)，获得包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体；和

(2)将待测样本(如血清)加样于(1)获得的包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体上；从而使固相载体中的多表位重组蛋白与待测样本中的特异性IgG或IgA结合，形成带有“多表位重组蛋白-IgG或IgA”二元复合物的固相载体；

(3)将抗特异性IgG或IgA的抗体加样于(2)获得的固相载体，从而形成带有“抗特异性IgG或IgA的抗体-特异性IgG或IgA-多表位重组蛋白”三元复合物的固相载体；且所述的抗特异性IgG或IgA的抗体携带一可检测信号(标记物)；

(4)检测(3)获得的三元复合物中的可检测信号，从而确定待测样本中特异性IgG或IgA的存在与否以及存在的量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒酶切鉴定。

M1：λDNA/HindIII Marker-ready-to-use^TM；M2：DL2000 DNA Marker；1：pET32a(+)空质粒；2：pET32a(+)/EBV-LMP2多表位质粒；3：pET32a(+)/EBV-LMP2多表位质粒双酶切(BamHI+HindIII)；4：EBV-LMP2多表位PCR产物。

图2.EBV-LMP2多表位重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析。

图2左为SDS-PAGE分析：1：标准分子量蛋白Marker；2：pET32a(+)/EBV-LMP2重组菌诱导4hr后；3：pET32a(+)空载体重组菌诱导4hr后；4：未转化质粒的BL21菌。

图2右为Western blot分析：1：标准分子量蛋白Marker；2：pET32a(+)/EBV-LMP2重组菌诱导4hr后；3：pET32a(+)空载体重组菌诱导4hr后；4：未转化质粒的BL21菌。

图3.ELISA检测小鼠免疫血清中针对EBV-LMP2多表位蛋白特异性IgG抗体水平时间变化趋势。

图4.ELISA检测小鼠免疫血清中针对EBV抗原(B95-8细胞制备)特异性IgG抗体水平时间变化趋势。

图5.ELISA检测免疫小鼠阴道分泌物中针对EBV-LMP2多表位蛋白特异性sIgA抗体水平时间变化趋势。

图6.ELISA检测免疫小鼠阴道分泌物中针对EBV抗原特异性sIgA抗体水平的时间变化趋势。

图7.免疫小鼠脾细胞EBV-LMP2多表位蛋白特异性CTL杀伤活性分析。

图8.EBV-LMP2多表位蛋白Western Blot分析。

1：标准分子量蛋白Marker；2：pET32a(+)/EBV-LMP2重组菌诱导4hr后；3：pET32a(+)空载体重组菌诱导4hr后；4：未转化质粒的BL21菌。

图9.三种ELISA包被抗原检测临床患者血清特异性IgG水平。

图10.pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒构建图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，以全长的EB病毒潜伏膜蛋白2(EBV-LMP2，更特别地为EBV-LMP2A)为基础，预测并筛选了富含多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列。并且，本发明人还对所述的多表位重组蛋白的编码基因进行了人源密码子优化，实现了重组蛋白的良好表达。本发明所获得的多表位重组蛋白具有很强的免疫原性和抗原性。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的疫苗诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所述的“多表位重组蛋白”是指含有多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列的蛋白；该蛋白或含有该蛋白的组合物可引发哺乳动物免疫应答。

如本文所用，“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由EB病毒所导致的疾病。

如本文所用，“对象”、“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受或已受EB病毒感染的对象。

如本文所用，“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。

如本文所用，“有效量”或“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

如本文所用，“待测样本(样品)”包括但不限于：血液、血清、唾液。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，除非另外说明，所述的“本发明的多表位重组蛋白”、“多表位重组蛋白”、“EBV-LMP2多表位重组蛋白”、“EBV-LMP2多表位”、“EBV-LMP2多表位蛋白”、“多表位蛋白”可互换使用。

多表位重组蛋白及其编码基因

目前现有技术中，针对EB病毒感染相关疾病的疫苗普遍存在免疫效果较差等特点。因此，本发明人以全长的EBV-LMP2为基础，预测并筛选富含多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列，经过反复研究比较，从而获得了本发明的多表位重组蛋白序列。所述蛋白的氨基酸序列含有：(a)EB病毒潜伏膜蛋白2上第195-232位氨基酸序列；和(b)EB病毒潜伏膜蛋白2上第419-436位氨基酸序列。所述的多表位重组蛋白可诱导产生高效价的抗体，且可长期保持高的抗体效价。

上述的(a)和(b)之间可以直接相连接，或者通过连接序列(连接肽)连接。所述的连接肽例如可包括0-30个氨基酸；较佳地为0-15个氨基酸；更佳地为0-5个氨基酸。任何连接肽都是可用的，只要该连接肽不影响(a)和(b)中各表位的免疫原性或抗原性。当连接肽的长度为0时，表示(a)和(b)之间直接相连。

作为本发明的优选方式，所述的多表位重组蛋白具有56-120个氨基酸，较佳地具有56-100个氨基酸，更佳地具有56-80个氨基酸。

本发明人通过免疫小鼠来检测所述的多表位重组蛋白的免疫原性，即通过LDH释放法检测免疫后小鼠脾淋巴细胞CTL特异性杀伤活性、ELISA方法检测小鼠血清IgG和阴道分泌物sIgA抗体滴度及维持时间进行评价。通过基于EBV-LMP2多表位的ELISA方法检测EBV感染及其相关肿瘤患者血清特异性抗体，及利用该特异性血清抗体进行Western blot检测，以评价EBV-LMP2多表位蛋白的抗原性。结果证实，本发明的多表位重组蛋白具有较强的免疫原性和抗原性，既能刺激机体产生较强的特异性细胞免疫和体液免疫效应，又能作为ELISA抗原检测EBV感染及其相关肿瘤患者的血清特异性抗体，且以鼻咽癌患者血清作为所述的多表位重组蛋白的一抗，经Western blot检测可出现特异性目的条带。因此，所述的多表位重组蛋白可应用于防治EB病毒感染及其相关肿瘤的多表位疫苗研究，也可应用于EB病毒感染及其相关肿瘤患者特异性血清抗体检测诊断试剂的研究。

本发明还提供了编码所述的多表位重组蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的多表位重组蛋白的核酸都适用于本发明，碱基密码子的简并性是本领域人员所了解的。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。

优选地，所述的核酸具有SEQ ID NO：5中第583-696位以及第1255-1308位所示的核苷酸序列。更优选的，所述的核酸具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述的核酸经过人源密码子优化，能够有效表达所述的多表位重组蛋白，并且表达获得的蛋白免疫原性和抗原性强。

本发明多表位重组蛋白的编码序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得SEQ ID NO：5中第583-696位以及第1255-1308位所示的核苷酸序列，然后将其拼接起来(两者之间可含有连接序列或不含有连接序列)，形成编码本发明多表位重组蛋白的核苷酸序列；或者可采用例如重叠PCR的方式合成。

载体及宿主细胞

在获得了编码本发明的核酸序列之后，可将其连接入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。

本发明中，术语“载体”与“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。本发明中可使用选自下组的载体：真核表达载体或原核表达载体，优选细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，更优选pcDNA3.1(+)、pSIREN-NEO、pET32a、pQE30、pGEX-4T-1或pPICZA。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞、动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用E.coli细胞、COS-7细胞、COS-1细胞、GS115细胞。

本发明还提供了利用所述重组载体和宿主细胞来制备所述的多表位重组蛋白的方法，所述方法包括：培养所述的宿主细胞，使所述细胞产生所述的蛋白。一种优选的方法是：将本发明的多表位重组蛋白的编码序列(优选经过人源密码子优化的序列)克隆至pET32a(+)载体质粒中，构建重组表达质粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位，并转化E.coli BL21菌株中表达所述的多表位重组蛋白，经镍螯合亲和层析胶体纯化获得纯化的蛋白。

含有编码所述的多表位重组蛋白的核酸序列的重组载体也可作为一种DNA疫苗，可将其免疫个体以产生免疫应答。

含有所述的重组载体的宿主细胞也可作为一种细胞疫苗，可将其免疫个体以产生免疫应答。

组合物

本发明还提供了包含本发明的多表位重组蛋白的各种组合物，特别是药物组合物，所述的组合物也包括疫苗。该组合物可用于预防或治疗EB病毒感染及EB病毒感染相关疾病，所述疾病包括(但不限于)：传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、何杰金病、Burkitt’s淋巴瘤、宫颈癌、胃癌、乳腺癌或肺癌。

包含本发明的多表位重组蛋白的各种组合物可以包含按多表位重组蛋白的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择合适的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack Publishing Co.)。

可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。

当用作疫苗时，所述的疫苗可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。

另外，本发明的疫苗的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRxCorp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分(IL-12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)等)。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的多表位重组蛋白施用于对象。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。

给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予本发明的多表位重组蛋白，即多表位重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗EB病毒感染或因感染导致的并发症。

在各疫苗剂份中所选用的多表位重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，给予约0.01μg-10mg多表位重组蛋白/kg体重，优选0.1μg-1mg多表位重组蛋白/kg体重，更优选0.1μg-100μg多表位重组蛋白/kg体重。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的多表位重组蛋白的免疫应答。

药盒或试剂盒

本发明还提供了一种防治EB病毒感染或因感染导致的并发症的药盒，其中含有本发明的多表位重组蛋白或含有该蛋白的组合物。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。

本发明还提供了一种检测EB病毒感染相关疾病的药盒(试剂盒)，所述的药盒中含有：一固相载体，所述的固相载体上包被有所述的多表位重组蛋白。所述的药盒(试剂盒)的制备方法包括：(1)将所述的多表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板)，获得包被了所述的多表位重组蛋白的固相截体；和(2)将(1)获得的包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测EB病毒感染相关疾病的药盒。所述药盒中还可包括装在适当容器中的、用于检测抗原-抗体反应的试剂(如酶联免疫试剂)，或用于基因扩增的试剂(如PCR试剂)，和/或还包括使用说明(书)。

检测用途

本发明所述多表位重组蛋白，可用于制备检测EB病毒感染及其相关肿瘤性疾病的血清抗体或粘膜分泌物抗体的ELISA检测试剂。

因此，本发明还提供一种检测EB病毒感染相关疾病的方法，所述方法包括：(1)将所述的多表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板)，获得包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体；(2)将待测样本(如血清或粘膜分泌物)加样于(1)获得的包被了所述的多表位重组蛋白的固相载体上；从而使固相载体中的多表位重组蛋白与待测样本中的特异性IgG或IgA结合，形成带有“多表位重组蛋白-IgG或IgA”二元复合物的固相载体；(3)将抗特异性IgG或IgA的抗体加样于(2)获得的固相载体，从而形成带有“抗特异性IgG的抗体-特异性IgG或IgA-多表位重组蛋白”三元复合物的固相载体；且所述的抗特异性IgG或IgA的抗体携带一可检测信号(标记物)；(4)检测(3)获得的三元复合物中的可检测信号，从而确定待测样本中特异性IgG或IgA的存在与否以及存在的量。

在确定了所采用的包被抗原和检测抗体后，可以采用本领域常规可用的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待测样本中特异性IgG或IgA的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如(但不限于)：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的EBV-LMP2多表位蛋白具有很强的免疫原性和抗原性，为EBV-LMP2多表位的深入研究和应用奠定基础，具有重要的科研价值。

(2)本发明人对所述多表位重组蛋白的编码序列进行了优化修饰，构成了强大的免疫原，且对动物无毒副作用，具有广阔的应用前景。

(3)本发明的EBV-LMP2多表位蛋白作为检测试剂，在检测EB病毒感染、EB病毒感染相关疾病及相关肿瘤的诊断方面具有重要的应用价值，其检测方法简单易行、成本低廉，而且具有较强的特异性和较高的敏感性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、EBV-LMP2多表位重组蛋白的制备与鉴定

1.EBV-LMP2多表位重组蛋白基因的设计

应用网络资源数据库(Genbank，Swiss-Prot)EBV潜伏膜蛋白2(LMP2)基因和氨基酸序列；根据中国汉族人群最常见的HLA基因为HLA-A*02、HLA-A*24、HLA-B*58和HLA-DRB1*15、HLA-DRB1*03基因(曾学辉，肖露露，李疆等；HLA-A、B、DRB1等位基因多态性与中国南方鼻咽癌的相关性研究[J].细胞与分子免疫学杂志，2007(9)：819-821；宋永红，马春红，吕红娟等；中国北方汉族人群HLA基因多态性研究[J].山东大学学报(医学版)，2007(6)：546-553.)的特点，利用在线软件(SYFPEITHI，EXPASY)及生物软件DNASTAR对EBV-LMP2氨基酸序列分别进行上述HLA基因限制性CTL和Th表位预测，同时进行B细胞表位预测，选择分值高的优势表位。

经过上述表位预测，结合本发明人的反复试验和选择，结果获得了来源于EBV潜伏膜蛋白2的两段氨基酸序列，它们富含较多优势表位，长度共56个氨基酸，包括HLA-A*02限制性CTL表位(14-22aa，17-25aa，20-28aa，24-32aa，27-35aa，30-38aa，46-54aa)、HLA-A*24限制性CTL表位(7-15aa，10-18aa，28-36aa，30-38aa，39-47aa，43-51aa)、HLA-B*58限制性CTL表位(12aa-20aa、20aa-28aa、21aa-29aa、38-46aa)；HLA-DRB1*0301(DR17)限制性Th表位(40aa-54aa、3aa-17aa、8aa-22aa、33aa-47aa、29aa-43aa)、HLA-DRB1*1501(DR2b)限制性Th表位(34aa-48aa、16aa-30aa、41aa-55aa)和B细胞表位(5-15aa)，其中包括H2-Kd限制性的CTL表位(6-14aa，10-18aa，17-25aa，29-37aa，28-36aa，39-47aa，43-51aa，46-54aa)。

根据上述的表位信息，得到EB病毒潜伏膜蛋白2(EBV-LMP2)多表位蛋白氨基酸序列表如下(SEQ ID NO：1)：

Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu Leu

                  5                  10                   15

Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val

                20                  25                   30

Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met

                 35                  40                   45

Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly

                50                  55

获得SEQ ID NO：2(即未经人源化密码子优化的序列)的EBV-LMP2多表位目的基因。

之后，本发明人还进行了人源密码子优化修饰(参照PanW，RavotE，TolleR等，NucleicAcidsRes.1999年2月，15；27(4)：1094-103的方法)，经过反复试验和改造，获得了优化表达的EBV-LMP2多表位目的基因。结果设计的EBV-LMP2多表位基因含有多个CTL、Th表位和B细胞表位。

优化的EB病毒潜伏膜蛋白2(EBV-LMP2)多表位蛋白基因核苷酸序列表如下(SEQ ID NO：3)：

TGCCTGACATGGCGGATCGAAGACCCTCCTTTCAATTCCCTGTTGTTCGCACTGCTCGCC    60

GCCGCGGGTGGCCTCCAAGGTATCTATGTGCTCGTTATGCTGGTACTCCTGATTACCTAT    120

GGACCTGTTTTTATGTGCCTGGGCGGCCTCTTGACCATGGTTGCCGGC                168

2.EBV-LMP2多表位基因的修饰、合成及重组表达质粒的构建

由北京三博远志生物技术有限公司合成具有所述序列的含有多个CTL、Th表位和B细胞表位的EBV-LMP2多表位基因(SEQ ID NO：3)，并克隆到pET32a(+)(Novagen)中HindIII/BamHI位点，经酶切和测序鉴定证实(图1)，成功构建了pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒。

3.EBV-LMP2多表位重组蛋白的原核表达、纯化和鉴定

将pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经37℃震荡培养过夜。取过夜菌1∶100稀释后接种于3ml含Amp的LB培养液中，37℃震荡培养至A₆₀₀＝0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)37℃诱导4小时，离心收集细菌，经PBS洗涤、离心、超声破菌，收集上清，并经镍螯合亲和层析胶体纯化，进行SDS-PAGE分析多表位蛋白的分子量大小，见图2(左图)。进一步以小鼠抗His抗体(购自MBI公司)为一抗，HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购自MBI公司)作为二抗，用Western blot方法检测多表位蛋白的抗原特异性，见图2(右图)。结果成功制备了EBV-LMP2多表位融合蛋白，并在原核表达系统中得到成功表达。

实施例2、EBV-LMP2多表位重组蛋白的免疫原性研究

选择6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组9只：第1组为EBV-LMP2多表位蛋白免疫组，第2组为pET32a(+)空载体对照组；第3组为PBS空白对照组。多表位蛋白与弗氏佐剂(FCA)1∶1(W/W)充分乳化均匀，分别于0、2、4周，每只小鼠50μg多表位蛋白或空载体蛋白，背部皮下多点免疫小鼠。对免疫小鼠分别进行体液免疫和细胞免疫效应的检测，即特异性的血清IgG和阴道分泌物sIgA的效价和维持时间，细胞免疫则采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL特异性杀伤活性。

在0、1、3、5、7周每组小鼠通过断尾取血用ELISA方法检测血清IgG抗体；同时取阴道分泌物检测sIgA抗体；第5周取脾脏制备脾细胞悬液，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL特异性杀伤活性。

1.免疫小鼠血清特异性IgG抗体的测定结果

以纯化的EBV-LMP2多表位蛋白包被ELISA反应板，加入1∶100稀释的血清样品，二抗为山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP(购自MBI公司)，底物是邻苯二胺(OPD)，反应结果置酶标仪测A490值。结果显示，多表位蛋白组产生了高水平的针对EBV-LMP2的特异性IgG抗体(图3)，至第7周达到高峰，免疫组动物血清OD值(1.178±0.130)显著高于pET32a(+)(0.468±0.121)和PBS对照组(0.016±0.008)(P＜0.05)。

同时，以灭活B95-8细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)包被ELISA反应板检测小鼠血清特异性IgG抗体，加入稀释的血清样品，二抗为山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP，反应结果置酶标仪测A490值。结果显示，EBV-LMP2多表位组产生了较高水平的针对EBV天然抗原的特异性IgG抗体(图4)，至第7周达到高峰，EBV-LMP2多表位免疫组动物血清OD值(0.258±0.040)显著高于pET32a(+)蛋白组(0.095±0.011)和PBS对照组(0.073±0.042)(P＜0.05)。

以EBV-LMP2多表位诱导小鼠血清抗体可同时识别EBV天然抗原(B95-8细胞)，B95-8细胞作为EBV-LMP2多表位的对照，其抗体滴度随免疫时间的增加而升高，自第3周起，至少可以维持到第7周。

2.免疫小鼠阴道分泌物特异性抗体sIgA水平测定结果

以纯化的EBV-LMP2多表位蛋白包被ELISA反应板，加入经处理的阴道分泌物原液，二抗为山羊抗小鼠sIgA-HRP(购自MBI公司)，反应结果置酶标仪测A490值。结果显示EBV-LMP2多表位蛋白组产生了较高水平的抗EBV特异性sIgA抗体(图5)，自第3周开始上升，至第5周达到高峰，然后下降。第5周的多表位蛋白组阴道分泌物EBV-LMP2特异性sIgA检测OD值为(0.754±0.064)，明显高于pET32a(+)蛋白组(0.455±0.038)和PBS组(0.171±0.018)，(P＜0.05)。

同时，以灭活B95-8细胞包被ELISA反应板，加入采集的阴道分泌物，二抗为山羊抗小鼠sIgA-HRP，反应结果置酶标仪测A490值。结果显示，EBV-LMP2多表位蛋白组产生了较高水平的EBV特异性sIgA抗体(图6)，自第3周开始上升，至第5周达到高峰，然后下降。第5周的EBV-LMP2多表位蛋白组针对EBV天然抗原的特异性sIgA检测OD值为(0.165±0.011)明显高于pET32a(+)蛋白组(0.106±0.015)和PBS组(0.072±0.004)，(P＜0.05)。

EBV-LMP2多表位皮下免疫BALB/c小鼠，不仅可在局部产生分泌型sIgA，同时可以识别天然EBV抗原(B95-8细胞)，阴道分泌物sIgA滴度随免疫时间增加而升高，至第5周达到高峰，然后下降。

3.免疫小鼠脾淋巴细胞CTL杀伤活性检测结果

无菌取脾脏制成脾细胞悬液，计数细胞并将浓度调至2×10⁶/ml，作为效应细胞。以P815细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)为靶细胞，与EBV-LMP2多表位融合蛋白共孵育后，使效应细胞与靶细胞的比例(Effectorcells∶Target cells，E∶T)分别为25∶1、10∶1、5∶1作为实验孔，按实验说明设好各组对照孔并均设4个复孔。细胞培养板置37℃、5％CO₂孵箱，4h后靶细胞最大释放孔加10×Lysis裂解液10μl，250×g再次离心4min，收集上清液测A490值，并按标准公式计算细胞细胞特异性杀伤率。

结果显示(图7)，效靶比在25∶1、10∶1、5∶1时，EBV-LMP2多表位蛋白免疫组(23.68±3.74％、21.80±1.080％、12.52±2.59％)小鼠脾细胞中CTL杀伤活性均显著高于pET32a(+)蛋白组(7.15±2.09％、4.35±0.85％、3.72±1.18％)和PBS组(4.93±0.10％、4.12±0.42％、2.29±1.05％)(P＜0.05)。

实施例3、EBV-LMP2多表位重组蛋白的抗原性研究

1.Western blot检测

将诱导表达的EBV-LMP2多表位菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳，转膜后，以1∶100稀释的NPC患者血清(获自温州医学院附属第一医院，均经临床诊断和组织病理学检查证实为NPC的患者)为一抗，HRP标记抗人IgG(H+L)(购自eBioscience)作为二抗，用Western blot方法检测多表位蛋白的抗原特异性。

结果显示(图8)，EBV-LMP2多表位蛋白可与NPC患者血清发生特异性的结合，在分子量约27KD出现一条特异性条带。

2.EB病毒感染及其相关肿瘤患者血清特异性抗体的ELISA检测

(1)以纯化的EBV-LMP2多表位蛋白为抗原，检测临床患者特异性IgG血清

以1μg/ml的EBV-LMP2多表位蛋白包被ELISA反应板，加入按照1∶100稀释的患者血清标本，包括：202例NPC患者、36例EBV感染相关非NPC患者(其中何杰金病12例、恶性淋巴瘤18例、传染性单核细胞增多症6例)、172例尖锐湿疣(Condyloma Acuminatum，CA)患者及112例健康对照者。每个标本重复三个复孔，并设标准阳性(B95-8细胞)对照和阴性(pET32a(+)蛋白)对照。二抗为HRP标记抗人IgG(H+L)(购自eBioscience)，反应结果置酶标仪测A490值。

以EBV-LMP2多表位蛋白为抗原检测各组患者血清特异性IgG(图9)，结果显示，NPC组血清与EBV感染相关非NPC组、CA组和健康人对照组相比，均有显著性差异(F＝110.306，P＜0.01)；以天然EBV抗原(B95-8细胞)为抗原检测标本，结果显示NPC组与EBV感染相关非NPC组、CA组和健康人对照组相比，均有显著性差异(F＝77.754，P＜0.01)；而以His蛋白为抗原检测结果显示，NPC组分别与EBV感染相关非NPC组和健康人对照组相比，均无显著性差异(t₁＝0.537，t₂＝0.283，P＞0.05)，NPC组与CA组相比，有显著性差异(t＝3.996，P＜0.05)。

NPC组患者血清EBV-LMP2多表位蛋白特异性IgG的均值与B95-8细胞特异性抗体相比，无显著性差异(t＝0.038，P＞0.05)；而与His蛋白相比，有显著性差异(t＝8.932，P＜0.01)；B95-8细胞与His蛋白相比，也有显著性差异(t＝10.000，P＜0.01)。

(2)ELISA检测鼻咽癌患者血清抗体的敏感性和特异性分析

目前，临床上通常采用检测鼻咽癌患者血清EB病毒衣壳抗原IgA抗体(VCA-IgA)作为鼻咽癌筛查、辅助诊断的主要生物学方法。以VCA-IgAELISA作为EBV感染的标准对照，对152例鼻咽癌患者和87例健康对照组患者同时分别进行EBV-LMP2多表位-IgG和VCA-IgA的血清抗体检测，以分析EBV-LMP2多表位-IgG血清抗体检测用于检测鼻咽癌的敏感性和特异性。

血清抗体阳性临界值(cut off)计算参见文献Heim k等；Serum IgG，IgM，and IgA reactivity to human papillomavirus types 11 and 6 virus-like particlesindifferent gynecologic patient groups.J Infect Dise，1995，172：395-402；Carter JJ等；Use of human papillomavirus type 6 capsids to detect antibodies inpeople with genital warts.J Infec Dise，1995，172：11-18；Marais DJ等；Seroresponses to human papillomavirus types 16，18，31，33，and 45 virus-likeparticles in South African women with cervical cancer and cervicalintraepithelial neoplasia.J Med Virol，2000，60：403-430，即为健康对照的平均A值+2SD(剔除大于或等于平均值±3SD的数据)。据此，EBV-LMP2多表位-IgG用于诊断EB病毒感染的cut off值为0.387(即≥0.387判断为阳性，否则为阴性，cut off＝0.205+2×0.091)，NPC和健康对照组阳性率分别为44.74％(68/152)和4.60％(4/87)。EB病毒衣壳抗原IgA(VCA-IgA)检测则按试剂盒(Zeus Scientific，Inc.)说明书操作进行，NPC和健康对照组阳性率分别为92/152＝60.53％和21/87＝24.14％；以VCA-IgA检测作为诊断EBV感染的标准指标，结果显示基于EBV-LMP2多表位蛋白抗原的ELISA检测NPC患者，其敏感性为50.00％(46/92)，特异性为95.46％(63/66)。

综上，本发明基于现有技术的研究基础：

(1)预测和筛选了EBV-LMP2多表位基因、构建了EBV-LMP2多表位重组质粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位和纯化并制备了EBV-LMP2多表位蛋白。

(2)通过动物实验充分地证实了本发明的多表位蛋白具有较强的免疫原性，能诱导机体产生特异的体液免疫和细胞免疫。小鼠经背部皮下注射的方式免疫，能够有效激发体液免疫、细胞免疫，具有免疫过程简单、接种安全、效果明显、可重复性强等优点。

(3)通过ELISA检测EBV感染及其相关肿瘤患者的血清特异性抗体及Western blot检测，证实本发明的多表位蛋白具有较强的抗原性，即EBV-LMP2多表位蛋白作为ELISA抗原，检测EBV感染及其相关肿瘤患者的血清特异性抗体水平，并以鼻咽癌患者特异性抗体血清作为一抗，经Western blot检测可出现EBV-LMP2多表位蛋白特异性条带。以EBV-LMP2多表位蛋白作为ELISA诊断抗原，在检测由EBV感染引起的疾病及相关肿瘤，尤其鼻咽癌的诊断方面具有重要的应用价值，该检测方法不仅简单易行、成本低廉，而且具有较强的特异性和较高的敏感性等特点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>温州医学院

<120>EB病毒潜伏膜蛋白2多表位重组蛋白及应用

<130>092522

<160>5

<170>PatentIn version                                                3.3

<210>1

<211>56

<212>PRT

<213>人工序列

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>1

Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu Leu Phe

1                5                    10                  15

Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val

             20                  25                   30

Met Leu Val Leu Leu Ile Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly

        35                   40                   45

Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly

    50                   55

<210>2

<211>168

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>多核苷酸

<400>2

tgcctaacat ggaggattga ggacccacct tttaattctc ttctgtttgc attgctggcc    60

gcagctggcg gactacaagg catttacgtt ctggtgatgc ttgtgctcct gataacatac    120

ggtccagttt ttatgtgcct cggtggcctg ctcaccatgg tagccggc                 168

<210>3

<211>168

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>多核苷酸

<400>3

tgcctgacat ggcggatcga agaccctcct ttcaattccc tgttgttcgc actgctcgcc    60

gccgcgggtg gcctccaagg tatctatgtg ctcgttatgc tggtactcct gattacctat    120

ggacctgttt ttatgtgcct gggcggcctc ttgaccatgg ttgccggc                 168

<210>4

<211>497

<212>PRT

<213>Epstein-Barr Virus

<400>4

Met Gly Ser Leu Glu Met Val Pro Met Gly Ala Gly Pro Pro Ser Pro

1                5                    10                  15

Gly Gly Asp Pro Asp Gly Tyr Asp Gly Gly Asn Asn Ser Gln Tyr Pro

             20                  25                   30

Ser Ala Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Pro Thr Pro Pro Asn Asp Glu

        35                   40                   45

Glu Arg Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr

    50                   55                   60

Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln

65                   70                   75                  80

Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

                 85                   90                  95

Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

             100                  105                 110

Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile

        115                  120                  125

Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe

    130                  135                  140

Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser

145                  150                  155                 160

Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg

                 165                  170                 175

Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val Leu Thr Ala Val Val Thr Phe Phe

             180                  185                 190

Ala Ile Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu

        195                  200                  205

Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val

    210                  215                  220

Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg

225                  230                  235                 240

Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val

                 245                  250                 255

Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala Val

            260                  265                  270

Thr Val Val Ser Met Thr Leu Leu Leu Leu Ala Phe Val Leu Trp Leu

        275                   280                 285

Ser Ser Pro Gly Gly Leu Gly Thr Leu Gly Ala Ala Leu Leu Thr Leu

    290                  295                  300

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Ile Leu Gly Thr Leu Asn

305                  310                 315                  320

Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu

                 325                 330                  335

Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

             340                 345                  350

Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

         355                 360                  365

Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser

    370                  375                  380

Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn Leu Phe Cys Met Leu Leu Leu Ile Val

385                  390                  395                 400

Ala Gly Ile Leu Phe Ile Leu Ala Ile Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly

                 405                 410                  415

Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr

             420                  425                 430

Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu

        435                  440                  445

Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe

    450                  455                  460

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys

465                  470                  475                 480

Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn Thr

                 485                  490                 495

Val

<210>5

<211>1494

<212>DNA

<213>Epstein-Barr Virus

<400>5

atggggtccc tagaaatggt gccaatgggc gcgggtcccc ctagccccgg cggggatccg    60

gatgggtacg atggcggaaa caactcccaa tatccatctg cttctggctc ttctgggaac    120

acccccaccc caccgaacga tgaggaacgt gaatctaatg aagagccccc accgccttat    180

gaggacccat attggggcaa tggcgaccgt cactcggact atcaaccact aggaacccaa    240

gatcaaagtc tgtacttggg attgcaacac gacgggaatg acgggctccc tccccctccc    300

tactctccac gggatgactc atctcaacac atatacgaag aagcgggcag aggaagtatg    360

aatccagtat gcctgcctgt aattgttgcg ccctacctct tttggctggc ggctattgcc    420

gcctcgtgtt tcacggcctc agttagtacc gttgtgaccg ccaccggctt ggccctctca    480

cttctactct tggcagcagt ggccagctca tatgccgctg cacaaaggaa actgctgaca    540

ccggtgacag tgcttactgc ggttgtcact ttctttgcaa tttgcctaac atggaggatt    600

gaggacccac cttttaattc tcttctgttt gcattgctgg ccgcagctgg cggactacaa    660

ggcatttacg ttctggtgat gcttgtgctc ctgatactag cgtacagaag gagatggcgc    720

cgtttgactg tttgtggcgg catcatgttt ttggcatgtg tacttgtcct catcgtcgac    780

gctgttttgc agctgagtcc cctccttgga gctgtaactg tggtttccat gacgctgctg    840

ctactggctt tcgtcctctg gctctcttcg ccagggggcc taggtactct tggtgcagcc    900

cttttaacat tggcagcagc tctggcactg ctagcgtcac tgattttggg cacacttaac    960

ttgactacaa tgttccttct catgctccta tggacacttg tggttctcct gatttgctct    1020

tcgtgctctt catgtccact gagcaagatc cttctggcac gactgttcct atatgctctc    1080

gcactcttgt tgctagcctc cgcgctaatc gctggtggca gtattttgca aacaaacttc    1140

aagagtttaa gcagcactga atttataccc aatttgttct gcatgttatt actgattgtc    1200

gctggcatac tcttcattct tgctatcctg accgaatggg gcagtggaaa tagaacatac    1260

ggtccagttt ttatgtgcct cggtggcctg ctcaccatgg tagccggcgc tgtgtggctg    1320

acggtgatgt ctaacacgct tttgtctgcc tggattctta cagcaggatt cctgattttc    1380

ctcattggct ttgccctctt tggggtcatt agatgctgcc gctactgctg ctactactgc    1440

cttacactgg aaagtgagga gcgcccaccg accccatatc gcaacactgt ataa          1494

Claims (9)

1.一种EB病毒多表位蛋白，其特征在于，所述的多表位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述的多表位蛋白的核酸。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的核苷酸序列选自：

(1)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或

(2)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.一种重组载体，所述的重组载体包含权利要求2或3所述的核酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(i)含有权利要求4所述的重组载体；或

(ii)基因组中整合有权利要求2或3所述的核酸。

6.一种制备权利要求1所述的多表位蛋白的方法，所述方法包括：

培养权利要求5所述的宿主细胞，使所述的宿主细胞产生所述的多表位蛋白。

7.如权利要求1所述的多表位蛋白、权利要求2或3所述的核酸、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备用于诊断EB病毒潜伏感染或鼻咽癌的组合物中的用途。

8.一种组合物，其包含有效量的权利要求1所述的多表位蛋白和药学上可接受的载体或佐剂。

9.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中包含至少一个容器，所述容器中含有权利要求1所述的多表位蛋白或权利要求8所述的组合物；或者所述的药盒中含有一固相载体，所述的固相载体上包被有权利要求1所述的多表位蛋白。