CN1403574A - 修饰的eb病毒lmp1编码序列,其制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供基于Epstein－Barr病毒(EBV)DNA的序列，特别是经修饰的编码EBV潜伏膜蛋白1抗原基因的DNA序列，其制备方法及其在生产用于控制EBV感染相关疾病的药物和DNA疫苗中的应用。

Description

修饰的EB病毒LMP1编码序列，其制备及应用

本发明涉及基于Epstein-Barr病毒(EBV)DNA的序列，特别是涉及经修饰的编码EBV潜伏膜蛋白1抗原(LMP1)基因的DNA序列，其制备方法及其在生产用于控制EBV感染相关疾病的药物和DNA疫苗中的应用。

EBV是引起常见于儿童和年青人的传染性单核细胞增多症的病原体。人群中，平均约有90％以上的成年人遭受过EBV的感染。该病毒终生在口咽部产生并通过唾液途径传播。其中青年人的感染则常常发生病症，表现有高烧、白细胞计数增加、咽喉疼痛及肝脾肿大等症状。儿童期被感染者一般没有任何临床症状或仅表现轻微的上呼吸道感染症状(参见EP-A0726315)。有些个体，由于宿主免疫反应与带毒细胞持续存在这两种因素的相互作用，可能导致EBV相关肿瘤的发生。其中伯基特氏淋巴瘤的发生与发展与染色体重排有关。尽管并不是所有病例的肿瘤细胞中都含有EBV基因组，但在某些高发地区，有97％的伯氏淋巴瘤与EBV相关，而且控制EBV很可能减少伯氏淋巴瘤的发生。特别值得注意的是，就与EBV相关的其他肿瘤而言，差不多100％的人鼻咽癌(NPC)与EBV感染有关。大多数鼻咽癌都首先发生在鼻后区的咽隐窝部，并随着病情恶化而很快发生转移。目前临床上常常通过检测VCA/IgA和EA/IgA等抗体来早期诊断鼻咽癌并以其作为二级预防手段。

鉴于EBV与某此肿瘤的关系，人们一直在研究并试图制备EBV特异性相关抗原、其突变蛋白及它们的抗体和核苷酸编码序列，以其作为早期诊断EBV相关肿瘤的工具，特别是用于制备可控制肿瘤发生与发展的一个或多个因素的药物或疫苗。例如，国际专利申请97/45444号公开了可用于制备亚单位疫苗或核酸疫苗的细胞毒性EBV病毒T细胞抗原决定簇。国际专利申请WO95/24925号描述了用作亚单位疫苗以诱导CD8⁺CTL反应的EBV细胞毒性T细胞抗原决定簇。国际专利申请WO94/25599公开了稳定地表达EBV抗原性糖蛋白gp250和gp350或其混合物的仓鼠细胞系及制备和培养方法。

已有越来越多的证据表明，EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对细胞生长和分化有重要作用，与几种人类恶性疾病如鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病及免疫母细胞淋巴癌的发生与发展密切相关(Rickinson AB etal.，Virology，3nd ed.，NY，Raven Press，2397-446，1996)。Wang等人(WangD et al，An EBV membranee proteim expressed in immortalized lymphocytestransforms established rodent cells，cell 43：831-40，1995)早期研究证明了EBV-LMP1基因有致癌活性，并阐明了潜伏性EBV感染与某此肿瘤发生的直接关联。B淋巴细胞可长期携带EB病毒，而且LMP1在B淋巴细胞内的瞬时过表达可诱导DNA合成。在表皮细胞中，LMP1可诱导已知能够刺激细胞生长的表皮生长因子受体(EGFR)的表达。另外，已发现LMP1蛋白的活性区域特别是胞浆内羧基末端与EBV致癌活性有关。

我们首先证明`EB病毒感染人胚鼻咽上皮细胞移植于裸鼠，在TPA和丁酸的协同作用下能诱发人鼻咽癌。

目前，虽然已对LMP1的结构与功能进行了较深入的研究，但迄今尚未见有关修饰的LMP1基因及其相关疫苗的报道。

本发明的一个目的是提供EB病毒潜伏膜蛋白基因衍生的DNA序列，该序列基本上是由缺失了致癌相关区域的部分潜伏膜蛋白基因序列组成的。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的序列具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供生产携带如上限定的基因片段的重组DNA序列的方法，该方法包括：

(1)提供删除了潜伏膜蛋白1的部分致癌相关区域的DNA片段。

(2)使用适当的引物，以PCR方法扩增步骤(1)的DNA片段。

(3)将按照步骤(2)方法制得的DNA片段连接到适当的表达载体上，以得到携带缺失了EBV致癌区域之潜伏膜蛋白1基因的重组DNA。

本发明的再一个目的涉及上述重组DNA片段在制备用于诊断或治疗EBV相关疾病的药物或疫苗中的应用。

图1显示从已知携带LMP1基因的重组质粒pUC18-DhetI中获得缺失了致癌相关序列的LMP1基因大片段(LMP1Δ)的操作。

图2显示携带LMP1Δ大片段的重组质粒pcDNAIII-LMP1Δ的构建。

图3显示分别导入了LMP1、LMP1Δ的NIH3T3细胞及未导入任何外来DNA的正常NIH3T3细胞培养6天时间内的细胞增殖曲线。

图4显示在不同的效应细胞/靶细胞比例条件下测得的百分细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性。

本发明涉及基于EBV之潜伏膜蛋白1基因(LMP1)的修饰的DNA片段、其制备与扩增方法及其在生产用于诊断和治疗包括鼻咽癌在内的EBV相关疾病的药物或疫苗中的应用。

EBV是一种属于疱疹病毒科的嗜淋巴细胞病毒。在灵长类动物宿主中，其能够以整合状态潜伏于B细胞内，导致被转染的B细胞增殖和永生化。在EBV潜伏感染期间，潜伏基因对于细胞的转化和增殖各自发挥不同的功能，其中已知特别重要的是EB病毒核抗原2(EBNA2)和潜伏膜蛋白1(LMP1)。

已知潜伏膜蛋白1基因位于EBV基因组的BamHI-Nhet大片段上，其可读框(ORF)长约1311bp，相当于EBV全序列中的核苷酸序号169474至168163(左向)。LMP1是由386个氨基酸组成的磷酸化的完整跨膜蛋白。目前已知，LMP1是EBV基因编码的唯一具有转化淋巴细胞和上皮细胞活性的膜蛋白。LMP1基因表达阳性细胞显示有较高的增殖能力和低分化程度。LMP1蛋白在结构上与某此离子通道蛋白相似，其跨膜区参予配体结合，而游离于胞浆中的氨基和羧基末端则具有偶联功能，参予细胞内的信号传递。

另外，LMP1还通过调节一系列活性因子的活性阻止细胞凋亡，导致细胞恶性生长。例如，其可通过活化NFKb而参予细胞癌变过程，并诱导A20的表达。研究发现，LMP1基因序列的变异导致氨基酸序列特别是LMP1羧基末端序列的改变，进而改变其抗原性，并改变肿瘤细胞表面组织相容性抗原标志，使致癌基因活化的宿主细胞逃避宿主免疫系统的监视，致使细胞发生癌变。

更具体地说，在鼻咽癌发生与发展过程中，LMP1是目前已知的EBV基因编码的唯一具有转化上皮细胞活性的膜蛋白。另外LMP1也在MHC-1类限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫呈递、识别和加工中发挥重要作用。LMP1 N未端跨膜区域为EBV诱导的人特异性T细胞毒性杀伤提供了特异性靶抗原。在另一方面，在LMP1转染的细胞中，细胞内粘附分子(如LFA1、LFA3、ICAM等)的表达水平提高，从而在免疫识别期加强了效应分子与靶分子的结合。基于LMP1基因的这些功能特征，本发明人试图删除LMP1基因3′末端对细胞转化功能必不可少的部分序列，而保留其中具有免疫原活性和特异性杀伤活性的CTL表位部分，得到经过缺失修饰的突变体LMP1编码序列。可以使用基于已知的LMP1氨基酸序列设计的引物，从适当的DNA文库中筛选LMP1编码序列。另外，也可以从适当组织来源如人鼻咽组织中制备的RNA，然后以反转录方法制备LMP1基因。当然，为了方便起见，最好使用适当的核酸内切酶从携带LMP1基因的重组质粒中直接得到所需的DNA片段。

在前两种情况下，可以在对所说片段进行适当的修饰后，在F4 DNA连接酶存在下，将其连接到用同样确切的适当载体(如pcDNAIII)上，然后再用适当内切酶从携带LMP1的重组载体上切掉，不需要的片段，以得到包括对于表达产物特异性细胞毒杀伤活性及免疫原活性必不可少的DNA编码序列，同时缺失了C未湍的具有细胞转化和致癌能力的DNA片段(NcoI-NcoI片段)的重组表达载体。

可以使用本领域已知的任何已知的方法瞬时转染适当的真核宿主细胞，如CHO、COS、BHK等哺乳动物细胞。可使用的转染方法包括，但不只限于颗粒轰击法、电穿孔法、直接微量注射法、借助脂转染试剂(如Lipofectarmine或Lipofectin试剂)的方法，以及病毒(如经过适当修饰的腺病毒或反转录病毒)介导的DNA定向送递或转移方法等。

根据本发明的一个优选实施方案，发明人首先从预制备的，携带LMP1全基因的EBV重组质粒pVC18-Dhet I中切出长约495bp的NcoI-NcoI片段，从而使所说的LMP1基因失去转化细胞和进一步的诱导细胞恶变的能力。

可使用EBV基因组中的LMP1基因(MtuI-MiuI片段)，经单一酶切后得到删除了LMP1部分序列的MS187片段(LMP1Δ-MS187片段)。以此片段为模板并使用适当的PCR引物对其进行PCR扩增，然后以琼脂糖电泳法分离并回收之。

然后在T4DNA连接酶存在下将缺失了致癌相关部分序列(NcoI-NcoI片段)的LMP1基因，即本文中所说的LMP1Δ大片段连接到适当的真核表达质粒如PCNAIII中。用如此得到的重组质粒转化适当的感受态大肠杆菌细胞(如大肠杆菌DH52细胞)，以扩增殖所需的重组质粒。经大量制备、纯化及定量分析后，用所得到的重组表达质粒(pcDNAIII-LMP1Δ)瞬时转化叙利亚地鼠肾成纤维细胞(BHK细胞)。最好使用本领域已知的Lipofectamine试剂转染法完成真核细胞转染步骤。

以上所述的所有DNA操作步骤，除特别指出者外均按照下Sanbrook等人(Molecular Cloning，Alaboraory Manual，2nd，ed.，Cold SpringHarbor laboretory Press，1989)所述的标准方法完成。

可将上述重组质粒(pcDNAIII-LMP1Δ)和空质粒载体(pcDNAIII)分别导入BHK靶细胞，用NPC阳性血清和LMP1特异性单克隆抗体(S12)，在间接免疫萤光法检测细胞中LMP1Δ的表达。另一方面，分别将携带未缺失所述片段之LMP1基因的重组质粒(pSG5-LMP1)和携带缺失了致癌相关序列之LMP1基因(LMP1Δ)的重组质粒(pcDNAIII-LMP1Δ)导入NHI3T3细胞，培养细胞后观察细胞形态及血清依赖性改变。另外，分别给裸鼠皮下接种导入了LMP1基因、LMP1Δ基因的3T3细胞和正常3T3细胞，4周后观察动物皮下接种部位的肿瘤生长。结果可见，接种含有LMP1基因之3T3细胞的动物局部皮下有瘤状肿块生长，而接种含有LMP1Δ基因和不含任何外来基因之3T3细胞的动物则未见有皮下瘤状肿块生长。

在上述体外和体内实验基础上，进一步使用分别接种不同剂量pcDNAIII-LMP1Δ和空质粒载体(100μg/动物)的Balb/c小鼠作为动物模型，观察免疫接种后动物的体内抗体生成和细胞毒性T淋巴细胞活性。

以重组DNA刺激的免疫动物的脾淋巴也细胞作为效应细胞，并以导入了重组质粒pcDNAIII-LMP1Δ的G418抗性细胞作为靶细胞，按适当的靶/效细胞比例混合并常规保温后，在相应底物存在下，以乳酸脱氢酶法检测效应细胞对靶细胞的杀伤水平，间接判定接受本发明的DNA免疫的动物体内CTL的活性水平(百分杀伤率)。、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、

综上所述，本发明人首先成功地构建了携带修饰的缺失了致癌相关序列之LMP1基因的重组表达载体。以该重质颗瞬时转染真核宿细胞(BHK细胞)后，可使用相应的特异性抗体(S12)检测到LMP1蛋白的表达。使用LMP1和LMP1Δ体外转化NIH3T3细胞的比较实验结果表明，LMP1基因能够明显地降低或排除细胞的血清依赖性、软琼脂集落形成及转化效应细胞等生物学行为能力。由于删去了LMP1中的部分致癌相关序列，所以当用LMP1Δ DNA序列接种裸鼠后18个月未见动物有肿瘤生长。特别是我们使用Ba1b/c小鼠模型进行的实验显示，当动物接受LMP1ΔDNA编码序列后2-8周不同时间均可见有特异性抗体反应。另一方面，用携带LMP1Δ编码序列的重组DNA免疫动物后，可在体内表达、加工和呈递细胞表示的特异性抗原决定簇，进而激活和诱导特导性细胞毒T细胞反应。

因此，我们的研究证明，可以使用删除了部分细胞结合与致癌相关序列(约495bp的NcoI-NcoI片段)的EBV潜伏膜蛋白1的DNA编码序列，以相对简单的方法制得可用于治疗和预防目的重组DNA序列。例如，可以将本发明的LMP1Δ，或携带所说的基因的重组DNA与已知EBV感染细胞中制得到相应序列进行必要的同源性比较和/或表达水平测定，以检测宿主体内是否存在EBV感染相关疾病的致病倾向。特别是，可以将本发明LMP1Δ与适当的辅助DNA混合，或连接到适当的表达载体上制成DNA疫苗，并使用适当的DNA导入方法，将本发明的DNA或核酸疫苗导入靶组织/细胞，作为一种有价值的治疗和预防性疫苗，用于治疗和预防某些EBV感染相关疾病，特别是鼻咽癌。

下例实施例旨在进一步举例描述而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。本领域技术人员可以理解到，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本说明所述技术实施方案的各种改动和修饰均将落入本发明待批权利要求的范围内。

实施例1：删除了致癌相关序列的LMP1Δ大片段的制备

首先用限制性内切酶NcoI消化携带LMP1基因的重组质粒Puc18-DhetI(由美国哈佛大学Kieff教授提供)，从中切掉下长约495bP的致癌相关片段。用Khenw酶补平所得大片段的两末端后，重新环化得到重组质粒pUC18-MS187。然后以此片段为模板，并使用上游引物：5′-GGGGCTAGATGGAACGCGACCTT-3′(SEQ ID NO：1)和下游引物：5′-GCCTTAAGTTAGTCATGTAGCTT-3′(SEQ ID NO：2)，按下述反应条件进行PCR扩增：94℃变性5分钟后，按照94℃变1分钟、55℃退火2分钟和72℃聚合(延伸反应)2分钟的程序共进行35次循环，最后72℃延伸15分钟。

经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离并回收所需的PCR产物。经测序分析证实得到了缺失改癌相关序列并具有SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列的修饰LMP1基因大片段，并将其定名为LMP1Δ(参见图1)。

实例施2：重组表达质粒pcDNAHI-LMP1Δ的构建

用单一限制性内切酶BamHI分别消化(37℃，1小时)真核表达质粒pcDNAIII(本室宝存)和按实施例1中所述方法制备的LMP1Δ基因片段。然后在上述反应条件下再次用EcoRI酶消失。

分别用1％和1.5％琼脂糖凝胶电游分离两酶切产物，并使用质粒快速回收试剂盒(Promaga)回收之。将回收得到的pcDNAIII质粒DNA和同处理的LMP1Δ DNA片段按1∶2比例混合，经连续的45℃水浴和冰水浴处理后向所得混合物中加入10XT₄ DNA连接酶缓冲液及T4DNA连接酶，以10ml总反应体积于16℃下保温过夜(参见图2)。

用如此得到连接反应混合物(5μl)转化并用0.1McaCl₂处理的感受态大肠杆菌DH52细胞，并在含有氨苄青霉素(1μg/ml)的LB琼脂平板上37℃保温过夜。

从琼脂平板上收集氨苄青霉素抗性菌落，并使用含氨苄青霉素的LB培养液将阳性转化菌株继续37℃培养过夜。培养后收集的菌细胞，经反复冻融破碎细胞后，用苯酚/氯仿从离心(12000rpm，5分钟)上清中提取，并用乙醇沉淀DNA。

分别用单一BamHI、BamHI+EooR和单一XhoI酶消化按上述方法得到的重组质粒，对其进行酶切鉴定。然后大量制备质粒DNA，并以分光光度法进行定量分析。

实施例3：重组质粒pcDNAIII-LMP1Δ在真核宿主细胞中的表达

(1)在含有10％胎牛血清的LB培养液中将叙利亚地鼠肾成纤维细胞(BHK细胞)培养(16-24小时)至生长对数期，洗细胞后以Lipofecfmine(20μl)转染法用实施例2中得到的重组DNA转染之(37℃，5％CO₂，5小时)。转染后换成合10％胎牛血清的1640培养液，并于37℃继续培养48小时。

培养完成后，用0.25％胰蛋白酶处理培养的细胞单层。用上述培养液洗细胞后涂布于微量滴定板上，4℃下用丙酮固定15分钟并用PBS洗两次。

向细胞孔内加入NPC阳性血清及特异性LMP1抗体(S12)后，37℃保温45分钟。使用萤光素标记的羊抗人IgG和羊抗小鼠IgG作为第二抗体，以本领域已知的间接免疫萤光法检测BHK细胞中LMP1Δ蛋白的表达。以空质粒转染的BHK细胞作为对照。结果可见，pcDNAIII-LMP1Δ瞬时转染的BHK细胞均呈现为免疫萤光阳性，而对照组BHK细胞则为阴性。

(2)在另一项比较实验中，分别用上述重组质粒pcDNAIII-LMP1Δ和携带完整LMP1基因的重组质粒pSG5-LMP1(由美国哈佛大学Kieff教授惠赠)转染NIH3T3细胞(Swiss小鼠胚胎永生化成纤维细胞系)，并以未导入任何外源DNA的正常NIH3T3细胞作为对照(均为1×10⁴细胞/孔)，加入含递减浓度的胎牛血清(5％、1％、0.5％)的Eagle氏培养液培养24小时后，观察细胞的增殖水平。结果可见，pSG5-LMP1转染的3T3细胞的生长状态明显好于pcDNAIII-LMP1Δ转染的和未经任何处源DNA转染的3T3细胞。这一结果表明，LMP1Δ基因在细胞内的表达产物可强有力地促进细胞生长与增殖(参见图3)。

(3)将上述实验(2)中所述的三组细胞在添加有2％胎牛血清的1640培养基中连续培养2周后，按常规方法从各组大约10⁷个细胞中提取DNA，然后分别以三组细胞的DNA为模板，使用上游引物5′-GCGCCTAGHATGGAACACGACCTT-3′(SEQ ID NO：4)，和下游引物5′-GCCTTAATTAGCATAGTAGCTT-3′(SEQ ID NO：5)，按前述PCR反应程序对所得的DNA进行PCR扩增。

PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后显示，以pSG5-LMP1转染的NIH3T3细胞DNA为模板得到的扩增产物中存在一条约1.1kb的条带，而以pcDNAIII-LMP1Δ转染的3T3细胞DNA为模板得到的扩增产物中存在一条约800bp的条带。相对地，对照组3T3细胞则未见任何来自外源DNA的电泳条带。

实施例4：以重组质粒pcDNAIII-LMP1Δ免疫动物后诱发的EBV-LMP1特异性体液和细胞免疫反应

(1)将5周龄Balb/c(H-2^d)小鼠随机分成4组，动物经用1％苯巴比妥(0.2ml)麻醉后，分别肌肉内注射(1)空质粒pcDNAIII(100μg/动物)，和(2)pcDNAIII-LMP1Δ。三个实验组动物经肌肉内注射途径投用重组DNA的剂量分别为100μg/动物、20μg/动物和100μg+200单位白介素2(IL-2)/动物。第一次免疫后，分别于第二周和第六周进行两次加强免疫。第8周时采血并分离动物脾脏，以常规间接免疫萤光法检测动物血清中的特异性抗体滴度，并以已知的乳酸脱氢酶法检测LMP1特异性CTL活性水平。

为了检测被免疫动物血清中的抗体水平，使用感染了LMP1基因的痘留病毒(Vac-LMP1)和在含有G418(Promega)的选择培养基中培养得到的P815抗性细胞作为阳性抗原材料，使用萤光素标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体，以间接免疫萤光法检测不同组DNA免疫之小鼠血清中LMP1特异性抗体的存在及其水平，结果如下列表1所示。

表1  DNA免疫小鼠血清特异性抗体生成及其滴度

   DNA免疫血清                        抗原

                     Vero/Vac-LMP1    Vero           抗性P815空质粒载体               -                  -            -100μg重组DNA            1∶10              -            1∶10200μg重组DNA            1∶10              -            1∶10100μg重组DNA            1∶10              -            1∶10+IL-2

另一方面，将被免疫动物的脾细胞与Vac-LMP1感染正常小鼠脾细胞(10∶1)混合，并以所得混合细胞作为效应细胞。使用在含有G418的培养基中培养的，pcDNAIII-LMP1Δ转染的P815细胞作为靶细胞。选择最适靶细胞浓度及不同的效/靶比例，以乳酸脱氢酶法检测被免疫动物的LMP1特异性CTL水平。结果如图4所示。

从图4所示的结果可以看出，经用本发明的重组DNA免疫后，动物体内LMP1特异性CTL活性随着效/靶细胞比例的增加而升高。而且在各免疫组中，高剂量(200μg)组动物的CTL水平稍高于低剂量组，但没有统计学上的显著差异。

                      序列表(1)一般信息(I)申请人：中国预防医学科学院病毒学研究所(II)发明名称：修饰的EB病毒LMP1编码序列，其制备及应用(III)序列：5(IV)通信地址(A)联系人：周玲(B)街道：宣武区迎新街100号(C)城市：北京(D)国家：中华人民共和国(E)邮编：10052(V)计算机可读形式：(A)介体类型：3。5寸软盘(B)计算机：IBM PC(C)操作系统：WIN98(D)软件：WORD2000(VI)电讯信息：电话：86-10-63578308(2)SEQ ID NO。1的信息：(i)序列特征：(A)长度：23bp(B)类型：核酸TTAACTGGCACACACTCCCTTAGCCACA(2)SEQ ID NO。4的信息：(i)序列特征：(A)长度：24bp(B)类型：核酸(C)连型：单链(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：基因组DNA(iii)序列描述：SEQ ID NO。4GCGCCTAGHATGGAACACGACCTT(2)SEQ ID NO。5的信息：(i)序列特征：(A)长度：22bp(B)类型：核酸(C)连型：单链(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：基因组DNA(iii)序列描述：SEQ ID NO。5GCCTTAATTAGCATAGTAGCTT  (C)连型：单链(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：基因组DNA(iii)序列描述：SEQ ID NO。1GGGGCTAGATGGAACGCGACCTT(2)SEQ ID NO。2的信息：(i)序列特征：(A)长度：23bp(B)类型：核酸(C)连型：单链(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：基因组DNA(iii)序列描述：SEQ ID NO。2GCCTTAAGTTAGTCATGTAGCTT(2)SEQ ID NO。3的信息：(i)序列特征：(A)长度：964bp(B)类型：核酸(C)连型：单链(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：基因组DNA(iii)序列描述：SEQ ID NO。3CTGCCTTGCTCCTGACACACTGCCCTGAGGATGGAACACGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCGACGGCCCCCTCGAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCCTAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTCCTCTTGGCGCTACTGTTTTGGCTGTACATCGTTATGAGTGACTGGACTGGAGGAGCCCTCCTTGTCCTCTATTCCTTTGCTCTCATGCTTATAATTATAATTTTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTTGGAGCCCTTTGTATACTCCTACTGATGAGTAAGTATTACACCCTTTGCCCCACACCCCCTTTCCCTTACTCTTCCTTCTCTAACGCACTTTCTCCTCTTTCCCCAGTCACCCTCCTGCTCATCGCTCTCTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTTCCTTGGAATTGTGCTGTTCATCTTCGGGTGCTTACTTGGTAAGATCTAACATTCCCTAGGAATTATTTACCACACCCCACTTTTCCAACCCTAACACTCTTTTTTCAACGCAGTCTTAGGTATCTGGATCTACTTATTGGAGATGCTCTGGCGACTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCTTCCTAGCCTTCTTCCTAGACCTCATCCTGCTCATTATTGCTCTCTATCTACAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCGATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGCGGCGGTGATCCACACCTTCCTACGCTGCTTTTGGGTTCTTCTGGTTCCGGTGGAGATGATGACGACCCCCACGGCCCAGTTCAGCTAAGCTACTATGACTAACCTTTCTTTACTTCTAGGCATTACCATGTCATAGGCTTGCCTGACTGACTCTCCCTCCATTTACTGGGAATGCCTTAGCTAATCACC

Claims (4)

1，EB病毒潜伏膜蛋白1基因衍生的重组DNA序列，该序列基本上是由缺失了致癌相关区域的部分潜伏膜蛋白1基因序列组成的。

2，根据权利要求1的重组DNA序列，其中所说的序列具有SEQID NO：3所示的核苷酸序列。

3，生产携带如权利要求1或2限定的重组DNA序列的方法，该方法包括：

(1)提供删除了潜伏膜蛋白1的部分致癌相关区域的DNA片段。

(2)使用适当的引物对，以PCR方法扩增步骤(1)的DNA片段。

(3)将按照步骤(2)方法制得的DNA片段连接到适当的表达载体上，以得到携带缺失了EBV致癌区域之潜伏膜蛋白1基因的重组DNA。

4，权利要求1或2限定的重组DNA序列在制备用于诊断或治疗EBV相关疾病的药物或疫苗中的应用。

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