CN105177047A - 携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种携带HPV-16?E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法,是将具有致瘤性的HPV-16的E7抗原基因突变为无致瘤性的E7抗原基因,再将该突变后基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。本发明的重组腺相关病毒可将其携带的突变型抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中,被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明,被本发明重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL可有效地抑制HPV-16E7阳性细胞的生长或者杀灭HPV-16E7阳性的细胞。该重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗HPV-16感染及其相关的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域中的载体及其应用,特别是涉及一种携带人乳头瘤病毒16型(HumanPapillomavirusType16,HPV-16)突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其在制备抗HPV-16感染及其相关疾病治疗药物中的应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年,Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段,下游3’端片段)(SamulskiRJ,SrivastavaA,BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno-associatedvirusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年,Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(Lip)基因和包膜(Cap)基因(HermonatPL,LabowMA,WrightR,BernsKI,MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年,Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和复制蛋白(Rep)基因之间的p5启动子(LabowMA,HermonatPL,BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirustype2genome.JVirol.160:251-258.)。
AAV是一种非致病性的缺陷性病毒,需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助,才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp),两端为重复末端片段(TR),中间为病毒的结构基因,包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒包膜(Cap)基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面的缺陷,因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)。现有大量研究表明,将AAV基因组中的结构基因删除,可明显增加外源性基因的容量。此外,将具有治疗作用的外源性基因插入rAAV中,可制备成具有感染性的rAAV病毒颗粒。
1984年,美国PaulL.Hermonat率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗(Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。目前,主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计,现有10余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行,主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内,使其在体内表达治疗基因,从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用,这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物,它是利用腺相关病毒I型(AAV-1)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。
人乳头瘤病毒(HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属。目前至少分离出130多种亚型。根据不同亚型,可分为高危型和低危型。其中对人类危害最大的是高危型,包括HPV-16、18、30、31、33、35、39与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等恶性肿瘤密切相关。其中99%以上的宫颈癌是由高危型HPV引起的,而半数以上的宫颈癌是HPV-16所致。
HPV属双链闭环的小DNA病毒,包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中,具有致癌作用的E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要,E6、E7编码的癌蛋白E6、E7蛋白分别与抑癌基因p53和Rb结合,引起细胞增殖失控,抑癌基因对DNA的损伤修复功能丧失,导致癌前病变及癌症的发生。
据2003-2004年来自美国的国家健康和营养研究课题的一个调查结果显示,14-59岁女性的HPV总感染率为26.8%。中国的HPV感染的流行情况尚未有正式报道,每年约有20万以上的宫颈癌新发现病例,发病率和死亡率有增加趋势,且宫颈癌发病年龄年轻化,可以推测HPV感染率不乐观。但目前尚无确切治愈HPV感染的方法,而现阶段的HPV疫苗有可能预防HPV-16和HPV-18感染,但对于已经感染的人群无效。为达到治愈目的,最理想的治疗是彻底清除受感染的细胞。而受感染的细胞均存在HPV-16E7抗原。因此,HPV-16E7抗原是细胞免疫治疗非常理想的靶子。但是,HPV-16E7抗原是一种致癌蛋白,在宫颈癌等恶性肿瘤的发生中发挥最主要作用之一。因此,在体内和体外用野生型HPV-16E7抗原刺激免疫反应的发生,在安全性方面存在一定风险。因此,必须除去野生HPV-16E7抗原的致瘤性,消除该风险。
人树突状细胞(DedriticCells,DC)是人体最重要、也是最主要的抗原提呈细胞。大量的研究已经证明无论在体内还是体外,DC细胞均可诱导或刺激产生具有抗感染和抗肿瘤的细胞免疫反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种携带无致病性(即无致瘤性)的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)突变型E7抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体。
本发明所提供的rAAV载体,是将剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap并带有AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子中的任意一个启动子的AAV载体作为出发载体,将突变型HPV-16E7m94抗原基因插入出发载体中,获得一种全新的rAAV载体,即携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7m94)。
所述AAV载体由本专利申请的发明人成功构建,构建方法参见中国专利ZL201110125683.X。
这里,突变型HPV-16E7m94抗原基因是通过分子生物学技术,将野生型HPV-16E7抗原基因进行突变,具体是将HPV-16(美国NCI基因库:KC935953)的E7抗原蛋白第94位的半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C),通过将HPV-16E7基因开放读码框nt280(序列表中位置,对应图3中nt841)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G),即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt,获得可以表达无致瘤性的突变型HPV-16E7抗原基因,命名为HPV-16E7m94基因,所述HPV-16E7m94基因的核苷酸序列如图3和序列表中序列1所示。
由于HPV-16E7m94免疫原性未受影响,可将其插入以上所述腺相关病毒载体中,该AAV载体带有AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子四种启动子的一种,将获得的全新携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体统称为“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7m94。
利用以上设计,也可将野生型HPV-16E7抗原基因插入上述腺相关病毒载体中,获得携带野生型HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体,统称为“E7重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7,HPV-16E7基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。但由于野生型HPV-16E7抗原具有致瘤性,故本发明不推荐用于临床实践,仅用于研究。
本发明的第二个目的是提供上述AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94重组腺相关病毒载体的构建方法。
本发明所提供的构建方法,包括以下步骤:
1)使用常规的分子生物学技术方法,先获得HPV-16E7抗原基因,再将其进行突变,即将E7抗原蛋白的第94位半胱氨酸改变为甘氨酸,详细过程为将HPV-16E7基因开放读码框(nt271)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G),即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt,即获得无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因;
2)将HPV-16E7m94抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入已将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中,得到携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7m94)或携带HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7)。
上述载体中E7m94或E7抗原基因转录的启动子可以选用AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子中的任意一个。
本发明还一目的是提供与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7m94和重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7相关的产品,包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被本发明重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系,所述细胞系包括单核细胞(Monocytes,Mo)和树突状细胞系(Dendriticcells,DC)。所述重组腺相关病毒载体中的相关基因—HPV-16E7m94抗原基因或HPV-16E7抗原基因可在单核细胞或树突状细胞中在上述转录启动子的作用下获得表达。
所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94相关的产品的制备方法,分别为:
重组腺相关病毒载体质粒的制备:将重组腺相关病毒载体DNA-AAV/HPV-16E7或AAV/HPV-16E7m94分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选,挑取白色单菌落,提取质粒并纯化,得到AAV/HPV-16E7质粒和AAV/HPV-16E7m94质粒。
重组腺相关病毒的制备:以所述重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16E7质粒或AAV/HPV-16E7m94和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到AAV病毒,分别命名为AAV/HPV-16E7病毒和AAV/HPV-16E7m94病毒。
重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备:用所述重组腺相关病毒rAAV/HPV-16E7病毒或rAAV/HPV-16E7m94病毒分别或依次感染或转染单核细胞(Mo)、或树突状细胞(DC)得到。
实际用途方面,本发明的另一个目的是提供一种抗HPV-16感染以及由HPV-16感染导致的恶性肿瘤的细胞免疫治疗的药物及其相关技术。
所述药物的活性成分为上述携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7m94)或与本发明携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品(由于野生型HPV-16E7抗原存在致瘤性,故不考虑其药用)。
以本发明的E7m94重组腺相关病毒为载体,将HPV-16突变型E7m94抗原基因导入单核细胞,并诱导产生树突状细胞,亦可直接导入树突状细胞,表达E7m94抗原蛋白,以达到患者体外和体内免疫刺激的目的,用以治疗HPV-16感染以及相关恶性肿瘤,或以该树突状细胞刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocytes,CTL)治疗HPV-16感染以及相关恶性肿瘤。
所述由HPV-16感染导致的恶性肿瘤包括HPV-16E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、男性生殖器Bowen’s病、巨大尖锐湿疣、阴茎癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。
本发明所提供的药物可采用溶剂或粉剂等剂型。
所述溶剂的选择是多种多样的,如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。
需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为先分离出患者体内的单核细胞(Mo),再将此药感染或转染Mo后,体外诱导Mo成为具有抗原提呈功能的树突状细胞(DC)。此药亦可感染或转染DC,但有可能导致DC对抗原的摄取或加工能力较差,从而导致疗效不佳。所获得的DC可回输患者体内,达到治疗目的。或将表达HPV-16突变型E7m94抗原的成熟的DC所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输患者,以取得更佳的疗效。
上述药物的用量一般为DC:1-5×106/每次,CTL:1-5×108/每次,每月2次,疗程通常为3个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
为提高疗效,本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂、靶向和化疗药物等进行组合治疗。
本发明还提供了一种杀灭HPV-16感染细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞的方法。
该方法可包括以下步骤:
1)将从患者体内分离的单核细胞(Mo),或分离出的Mo被诱导成为的树突状细胞(DC),被携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7m94)感染或转染,或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理,各自得到处理后的细胞;
2)将步骤1)中处理后的DC输入患者体内中,以激活患者体内的免疫反应,达到杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞的目的;或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的DC混合培养,刺激产生HPV-16E7抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),再将该抗原特异性CTL输入患者体内,杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞;或将被处理的CTL和被处理的DC输入患者体内中,杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞。
所述杀灭恶性肿瘤的方法可具体应用到临床治疗中,包括给予一个患者回输HPV-16E7抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞,该细胞由来源于患者自然产生的T淋巴细胞与来源于该患者的单核细胞-树突状细胞混合培养产生的。在混合培养之前,这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染,或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理;
或者,给予一个肿瘤患者回输来源于患者的单核细胞-树突状细胞。在回输之前,这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染,或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理;
再或者,给予一个恶性肿瘤患者回输上述来源于患者的T淋巴细胞和来源于该患者的自然产生的单核细胞-树突状细胞。在回输之前,这些T淋巴细胞已经被本发明携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染的单核细胞-树突状细胞相关的产品处理。这些单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染。
本发明的重组腺相关病毒(rAAV)载体可将其携带的HPV-16E7m94抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中,携带带有HPV-16E7m94抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明,被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地杀灭HPV-16E7抗原阳性的肿瘤细胞或HPV-16感染的细胞。因而,本发明的rAAV载体或与本发明rAAV载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物。本发明在肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义,应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1.携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7m94基因的重组腺相关病毒载体的结构示意图。
图2.通过多聚酶链反应(PCR)获得长度为297bp的目的基因HPV-16E7DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3.HPV-16E7m94基因序列与野生型HPV-16E7基因序列比对结果。
图4.构建的AAV/HPV-16E7m94载体的酶切分析结果。
图5.重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法流程图。
图6.重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察结果。
图7.AAV/HPV-16E7m94病毒感染肿瘤患者树突状细胞为基础的杀灭HPV-16E7抗原阳性细胞的实验流程。
图8.分别为四种不同启动子(p5、CMVp、SV40p和β-actinp)的重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒感染单核细胞(Mo)的效率检测结果。
图9.重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的流式细胞技术检测结果。
图10.重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒分别感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平的流式细胞技术检测结果。
图11.重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤HPV-16E7阳性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果。
图12.5例经重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒感染的DC所诱导的CTL治疗的晚期宫颈癌患者血清角质蛋白19抗原(CK19)和鳞状细胞癌抗原(SCC)水平的变化情况。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见:《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W,单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V,单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V,单位mL/100mL)百分比浓度。
所用引物合成及DNA序列测定均由美国LifeTechnology公司完成。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的,不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上,所用到的生物材料的来源是广泛的,任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,实施例将有助于理解本发明,但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94
一、材料:
A.四种腺相关病毒(AAV)载体:即分别为具有AAVp5启动子的pAAV/p5、具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子的pAAV/CMVp、具有SV40病毒早期启动子的pAAV/SV40p和具有人β-肌动蛋白(β-actin)启动子的pAAV/β-actinp。已知的腺相关病毒载体具有p5启动子,为提高目的基因的转录水平,可将重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个,该四种AAV载体仅启动子不同,其余的基因结构完全相同,即具有AAV2型两端完整的重复末端片段(TR)序列,并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入有9个核苷酸片段(CTGCGCTGG,目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率)、且无任何AAV结构基因(Rep和Cap)。该四种AAV载体由本专利申请的发明人成功构建(构建方法参见中国专利ZL201110125683.X)。
B.人宫颈癌组织:来源于手术切除的宫颈癌癌组织,免疫组化证实HPV-16E7抗原阳性。
C.基因扩增核苷酸引物:根据美国基因库中公开发表的HPV-16E7基因序列(美国NCI基因库:KC935953)设计,上游引物:5’-ATGCATGGAGATACA-3’,下游引物:5’-TTATTGTTTCTGAGAA-3’。
二、构建携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7m94基因的重组腺相关病毒载体
用下述方法分别构建本发明携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7m94基因的重组腺相关病毒载体,其结构示意图如图1(图中“插入的外源性基因”为人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7m94基因,启动子分别为AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子中的任意一个)所示,具体过程包括以下步骤:
A.获取HPV-16E7DNA,具体方法为:采用DNAzol试剂(美国LifeTechnology公司生产)并按说明书进行操作:首先将HPV-16E7抗原阳性的宫颈癌组织反复碾磨后,加入10mLDNAzol,离心获取上清液后,用75%乙醇洗涤2次,再加入无水乙醇,离心,将沉淀物用去离子水溶解,将DNA浓度调至100ng/μL。以2μLDNA溶液为模板,在上游引物5’-ATGCATGGAGATACA-3’和下游引物5’-TTATTGTTTCTGAGAA-3’的引导下PCR扩增HPV-16E7DNA。PCR扩增条件为:先94℃4分钟;再94℃30秒,60℃35秒,72℃50秒,共30个循环;最后72℃8分钟。反应结束后,对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图2所示,出现一条长度为297bp与预期结果一致的特异性条带。将该目的条带回收并纯化后得到长度为297bpHPV-16E7DNA。
B.获取HPV-16E7m94DNA,具体方法为:采用基因点突变试剂盒(美国Strategeng公司),按照其试剂盒说明书进行操作:将HPV-16E7基因(美国NCI基因库:KC935953)开放读码框(nt280)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G),即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt,即获得无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因。完成后,进行DNA序列测定,HPV-16E7m94基因序列如序列表中序列1和图3所示,HPV-16E7m94基因序列与HPV-16E7基因序列的比对结果如图3所示(图3中,在nt841位的胸腺嘧啶(T)被替换为鸟嘌呤(G),编码半胱氨酸的TGT(nt841-843)改变为编码甘氨酸的GGT),即获得无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因,证明基因突变成功,获得HPV-16E7m94抗原基因。
C.获得重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94:采用DNA连接技术,分别将上述获得的HPV-16E7和E7m94DNA片段分别插入pAAV/p5、pAAV/CMVp、pAAV/SV40p和pAAV/β-actinp这四种rAAV载体中。为插入该基因片段,首先进行酶切反应,然后进行连接反应。其中,酶切反应体系为:100ng质粒和50ngHPV-16E7或E7m94DNA片段;10U限制性内切酶BamHI和SalI(购自美国Promega公司),2.5μl10×缓冲液C以及19.5μl去离子水;反应条件为:在37℃下水浴4小时。连接反应体系为:50ng酶切后的质粒,50ngHPV-16E7或HPV-16E7m94DNA片段,10IUT4DNA连接酶(购自美国Promega公司),1.5μl10×T4DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水;反应条件为:4℃8小时。最后分别得到携带有p5启动子、CMV启动子、SV40早期启动子或β蛋白启动子和HPV-16E7m94基因或HPV-16E7基因的重组腺相关病毒载体,分别对应四种启动子的四种携带HPV-16E7m94基因的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16E7m94,四种携带HPV-16E7基因的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16E7。
D.获得重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94:分别将连接后的AAV/HPV-16E7m94和AAV/HPV-16E7转化基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司),用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选,挑取白色单菌落,提取质粒并纯化,分别得到AAV/HPV-16E7m94质粒和AAV/HPV-16E7质粒。
F.质粒检测:将获得的AAV/HPV-16E7m94质粒以限制性内切酶BamHI和SalI(购自美国Promega公司)进行酶切分析,以鉴定是否构建成功。酶切反应条件和方法如上述(二.C)。构建的AAV/HPV-16E7m94载体的酶切分析结果如图4所示(泳道1-4分别为AAV/p5/HPV-16E7m94、AAV/CMVp/HPV-16E7m94、AAV/SV40p/HPV-16E7m94、AAV/β-actinp/HPV-16E7m94)。分析结果表明HPV-16E7m94基因分别插入携带不同启动子的AAV载体中,携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94基因的重组腺相关病毒载体构建成功。
实施例2、重组腺相关病毒(rAAV)的制备及病毒滴度测定
材料及其来源:
A.实施例1构建的携带HPV-16E7m94和HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7m94和AAV/HPV-16E7)。
B.含AAV的Rep基因和Cap基因的辅助质粒pHelper:由本专利申请的发明人构建成功(Liu,Y.,SantinAD.,ManeM.,Chiriva-Internati,M.,ParhamGP.,RavaggiA.,andHermonat,P.L.TransductionandUtilityoftheGranulocyte-MacrophageColony-StimulatingFactorGeneintoMonocytesandDendriticCellsbyAdeno-AssociatedVirus.JournalofInterferonandCytokineResearch.20:21–30.2000)。
C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293细胞:由本专利申请的发明人建立(Liu,Y.,SantinAD.,ManeM.,Chiriva-Internati,M.,ParhamGP.,RavaggiA.,andHermonat,P.L.TransductionandUtilityoftheGranulocyte-MacrophageColony-StimulatingFactorGeneintoMonocytesandDendriticCellsbyAdeno-AssociatedVirus.JournalofInterferonandCytokineResearch.20:21–30.2000)。
D.脂质体转染试剂Lipofectin:购自美国LifeTechnology公司。
E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清):购自美国Cellgro公司。
F.PCRDIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒:购自瑞士Roche公司。
G.DNA拷贝数标准:分别为1012拷贝数(copies)/μL至106(copies)/μL,购自美国Promega公司。
一、重组腺相关病毒(rAAV)的制备
图5显示携带HPV-16E7m94突变基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E7m94)以及携带HPV-E7基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E7)的制备方法流程图。如图5所示方法制备重组腺相关病毒(rAAV)。以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例,当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70%时,进行如下操作:
A.按照Lipofectin的使用说明进行操作:将1.0μgrAAV、1.0μgpHelper质粒、4.0μLLipofectin和50.0μL含5%胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀,室温静置20分钟。
B.将混合液加入细胞培养皿中,继续置于二氧化碳细胞培养箱中在37℃下培养。
C.72小时后,收获培养皿中的所有细胞和培养液。
D.剧烈振荡1分钟后,离心,保留上清,即rAAV病毒液。
E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌。
二、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒滴度测定
采用常规的斑点杂交法,对步骤一获得的rAAV病毒进行病毒滴度测定,具体方法包括以下步骤:。
A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法,提取rAAV病毒颗粒DNA。
B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中,加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA,并加入DNA拷贝数标准,抽真空。
C.取出尼龙膜干燥后,紫外线固定。
D.用PCRDIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针,所用的DNA探针为针对HPV-16E7基因的特异性探针,探针为“实施例1步骤C中获得的HPV16-E7DNA。PCR扩增结束后,对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外线下检测PCR扩增产物,结果出现阳性条带,表明探针标记成功。
E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书,在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒DNA进行DNA杂交。
实验结果所有rAAV病毒滴度为1012-1014拷贝/mL,表明获得的rAAV病毒滴度较高,完全可用于科学研究和临床实践。
实施例3、重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒)感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察
材料及其来源:
A.rAAV病毒:实施例2获得的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒)。
B.Keratinocyte-SCF细胞培养基:购自美国LifeTechnology公司。
C.原代宫颈上皮细胞:用常规方法从正常的宫颈上皮组织中分离获得。
致瘤性观察实验
将原代宫颈上皮细胞在放入10.0cm细胞培养皿中,立即加入10mLKeratinocyte-SCF细胞培养基,置二氧化碳培养箱中在37℃下培养。待细胞完全贴壁后,取出培养皿,去除7mL培养液后,按照100MOI剂量分别加入重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒或AAV/HPV-16E7病毒,重置于二氧化碳培养箱。8小时后,取出培养皿,去除培养液,加入10mL新鲜的Keratinocyte-SCF细胞培养基,重置于二氧化碳培养箱中在37℃下培养。每2天更换培养基。每天定时观察细胞形态变化2次。直至细胞出现瘤变。
结果如图6所示,两种rAAV均在细胞中表达,但是,被AAV/HPV-16E7m94病毒感染的细胞未发生瘤变,表明无致瘤性(三个培养皿从上至下分别加入带CMV启动子、SV40早期启动子或β蛋白启动子的AAV/HPV-16E7m94病毒);而被AAV/HPV-16E7病毒感染的细胞发生明显瘤变,具有致瘤性(三个培养皿从上至下分别加入带CMV启动子、SV40早期启动子或β蛋白启动子的AAV/HPV-16E7病毒)。
实施例4、肿瘤抗原导入单核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验
材料及其来源:
A.rAAV病毒:实施例2得到的AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒。
B.AIM-V细胞培养基:购自美国LifeTechnology公司。
C.细胞因子:集落细胞刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素2、4购自美国R&D公司。
D.HPV-16E7阳性的细胞:从肿瘤组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心(ATCC)获得,恶性肿瘤包括宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细胞。
一、杀灭肿瘤实验
图7显示AAV/HPV-16E7m94感染肿瘤患者树突状细胞为基础的杀灭HPV-16E7抗原阳性细胞的实验流程。如图所示,将本发明携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的rAAV病毒(AAV/HPV-16E7m94病毒或AAV/HPV-16E7病毒)感染肿瘤患者单核细胞(Mo)为基础的杀灭HPV-16E7抗原阳性的细胞实验包括以下步骤:
A.取肿瘤患者50-150mL外周血,用血细胞分离仪(或淋巴细胞分离液)按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC),与AIM-V培养基混匀后,加入细胞培养瓶,置于恒温二氧化碳培养箱中在37℃下培养2小时。
B.除去悬浮细胞,保留贴壁细胞(单核细胞)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞,将其与AIM-V培养基混匀后,继续培养备用。
C.加入rAAV病毒,加入量约为100MOI,同时再加入GM-CSF(600IU/mL),继续培养4小时。
D.除去旧培养基,补充含GM-CSF和IL-4(600IU/mL)的AIM-V培养基,继续培养。
E.培养5天后,收获成熟的树突状细胞(DC),并与所培养的外周血淋巴细胞混合,在AIM-V培养基中加入IL-2(10IU/mL),继续培养。
F.培养至7-9天后,收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。
二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测
A.rAAV感染外周血单核细胞(Mo)的效率检测
采用常规的荧光抗体标记染色法,用针对HPV-16E7特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明rAAV感染的单核细胞(Mo)或未成熟的树突状细胞(DC),再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中,rAAV感染单核细胞(Mo)的效率检测结果如图8所示。携带四种不同启动子(p5、CMVp、SV40p和β-actinp)的AAV/HPV-16E7m94病毒和AAV/HPV-16E7病毒感染Mo的效率均约为90%,即约百分之九十的Mo可被rAAV病毒感染,证明本发明的rAAV具有较高的感染效率。
B.树突状细胞(DC)的CD分子水平的检测
DC表达CD80和CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法,即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的DC表达CD80和CD86的水平进行检测。AAV/HPV-16E7m94病毒或AAV/HPV-16E7病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的检测结果如图9所示(以带CMV启动子的rAAV为代表),该携带CMV启动子的重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94和AAV/HPV-16E7感染的DC表达CD80和CD86水平的流式细胞技术检测结果表明均可获得高水平表达的CD80和CD86,被感染的DC所表达的CD分子水平较高,证明本发明携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的rAAV感染的单核细胞所诱导的DC的激发细胞免疫反应的功能强大。
C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测
CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平。DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后,收获细胞,采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记,所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)。最后利用流式细胞仪检测结果。其中,被AAV/HPV-16E7m94病毒或AAV/HPV-16E7病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平如图10所示(以带AAVp5启动子的rAAV为代表)。该携带AAVp5启动子的重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94和AAV/HPV-16E7分别感染的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的的流式细胞技术检测其IFN-γ表达水平结果,为被rAAV感染的DC所刺激产生的CTL表达IFN-γ的水平较高,证明被本发明AAV/HPV-16E7m94病毒或AAV/HPV-16E7病毒感染的DC所诱导的CTL杀伤靶细胞的活性较强(功能强大)。
D.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞试验
混合培养结束后,将步骤一中被AAV/HPV-16E7m94病毒或AAV/HPV-16E7病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)按20:1(淋巴细胞:肿瘤细胞)分别与宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细胞混合后,采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验,检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性。
被rAAV感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16E7阳性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果如图11(以携带CMV启动子的AAV/HPV-16E7m94病毒为例,纵坐标表示杀伤率)所示。被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL能够更有效地裂解(杀伤)HPV-16E7抗原阳性的靶细胞,对各种HPV-16E7抗原阳性的肿瘤细胞的杀伤率为40%-67%左右,而对HPV-16E7阴性的肺(lung)、乳腺(breast)、肝(liver)、肾(k-cells)的细胞为对照,无杀伤作用,证明被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性(即靶向性),而对抗原阴性的细胞无杀伤作用。
上述检测结果表明,被本发明携带突变型HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E7m94病毒)感染的DC所诱导的CTL对HPV-16E7抗原阳性的细胞具有强大的杀伤(裂解)效果,具有较高的特异性(即靶向性杀伤作用),而对HPV-16E7抗原阴性的细胞无杀伤作用,与野生型HPV-16E7抗原诱导的CTL的杀伤功能无区别,而且无致瘤性,可用于制备抗肿瘤药物。
实施例5、HPV-16E7抗原阳性的肿瘤治疗的临床实验
应用重组腺相关病毒-树突状细胞技术,即实施例4中被本发明AAV/HPV-16E7m94病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输治疗5例宫颈癌患者。所有患者已经被证实其宫颈癌组织为HPV-16E7阳性。输注量为2×108-5×108。治疗疗程:通常为3个月为一个疗程,每月2次。治疗结果总结如表1所示(B:血清肿瘤标志物减少或消失。Q:病人生活质量改善。如疼痛减轻或消失,食欲增加等。C:CTorPET-CT显示癌症病灶或转移病灶明显减小或消失。),不良反应:1例治疗后短时间内会出现轻度流感样反应,但病人均能承受,且症状短期内消失,没有观察到严重不良反应及毒性反应。
5例经重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7m94病毒感染的DC所诱导的CTL治疗的宫颈癌患者血清角质蛋白19抗原(CK19)和鳞状细胞癌抗原(SCC)水平的变化情况如图12所示,经治疗后,3例患者的血清角蛋白19抗原(CK19,cyfra21-1)和鳞状细胞癌抗原(SSC)明显下降(CK19水平,正常值<3.3ng/mL;SCC水平,正常值<5.0ng/mL),甚至恢复正常。临床实验结果证明,被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内能够发挥一定的疗效,可有效地抑制HPV-16E7阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞,且安全性较高,可用于制备抗肿瘤药物。
表1用AAV/HPV-16E7m94-树突状细胞技术治疗5例宫颈癌癌患者的疗效的统计结果
工业应用性
实验证明,被本发明HPV-16E7m94重组腺相关病毒感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制HPV16感染的细胞以及与其相关的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭恶性肿瘤细胞,因而,本发明的HPV-16E7m94重组腺相关病毒载体或与本发明HPV-16E7m94重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗HPV16感染的细胞及其相关的抗恶性肿瘤药物,在临床治疗和应用中具有重要的意义。
Claims (10)
1.一种携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体,是将目的基因突变型HPV-16E7m94抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入腺相关病毒载体中,获得携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7m94)或携带HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7)。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于:所述突变型HPV-16E7m94抗原基因是将HPV-16E7抗原基因的E7抗原蛋白第94位的半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)对应的基因,即,将HPV-16E7基因开放读码框(nt280)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G),将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt,获得可以表达无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于:所述HPV-16E7m94基因的核苷酸序列如序列表中序列1或图3所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体,其特征在于:所述腺相关病毒载体为剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap的腺相关病毒载体,其携带的启动子为AAVp5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、人beta肌动蛋白启动子或SV40病毒早期启动子中的任意一个,所述携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体统称为“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7m94。
5.一种构建权利要求1-4任一所述重组腺相关病毒载体的方法,包括以下步骤:
1)将HPV-16E7抗原蛋白的第94位半胱氨酸突变为甘氨酸,即将HPV-16E7基因开放读码框(nt280)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G),即将编码半胱氨酸的tgt改变为编码甘氨酸的ggt,获得无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因;
2)将HPV-16E7m94抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入所述E7m94重组腺相关病毒载体中,得到携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(统称AAV/HPV-16E7m94)或携带HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(统称AAV/HPV-16E7)。
6.与权利要求1-4任一所述重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7m94和重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7相关的产品,包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被所述重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系,细胞系包括单核细胞(Monocyte,Mo)和树突状细胞(DendriticCells,DC)。
7.制备权利要求6所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94相关产品的方法,分别为:
携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体质粒的制备:将携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA-AAV/HPV-16E7或AAV/HPV-16E7m94导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选,挑取白色单菌落,提取质粒并纯化,得到AAV/HPV-16E7质粒或AAV/HPV-16E7m94质粒;
携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒的制备:以所述携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共同转染AAV-HEK293细胞得到rAAV病毒,分别命名为AAV/HPV-16E7病毒或AAV/HPV-16E7m94病毒;
携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备:用所述重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7病毒或AAV/HPV-16E7m94病毒分别或依次感染或转染单核细胞(Mo)或树突状细胞(DC)得到。
8.一种抗HPV-16感染以及由HPV-16感染导致的肿瘤的细胞免疫治疗药物,其活性成分为权利要求1-4之一所述携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7m94)或权利要求6所述与携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品,包括AAV/HPV-16E7m94质粒、AAV/HPV-16E7m94病毒、被HPV-16E7m94重组腺相关病毒分别或依次感染或转染得到的单核细胞(Mo)或树突状细胞(DC)。
9.根据权利要求8所述的药物,其特征在于:所述由HPV-16感染导致的肿瘤为HPV-16E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、男性生殖器Bowen’s病、巨大尖锐湿疣、阴茎癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。
10.一种杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞的方法,包括以下步骤:
1)将患者体内自然产生的单核细胞被权利要求1-4任一所述携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7m94)感染或转染,或被权利要求6所述与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理,各自得到处理后的细胞;
2)将步骤1)中处理后的单核细胞(Mo)诱导的树突状细胞(DC)输入患者体内中,激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL),该CTL杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞;或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的Mo-DC混合培养形成HPV-16E7抗原特异性的CTL,再将该CTL输入患者体内杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞;或将被处理的T淋巴细胞和被处理的Mo-DC输入患者体内中,杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞。
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CN105177047B (zh) | 2018-02-02 |
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |