CN101696231A - 人乳头瘤病毒58型e6蛋白的抗原表位最小基序肽 - Google Patents

人乳头瘤病毒58型e6蛋白的抗原表位最小基序肽 Download PDF

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孙志达
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Abstract

本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体为一种人乳头瘤病毒(HPV)58型E6蛋白的抗原表位最小基序肽及其用途。本发明提供了四个可作为抗原单独或组合用于特异检测HPV58型病毒感染的含最小基序的表位肽(包括可与截短GST188等载体蛋白融合表达的含表位最小基序的8肽序列)，以及一个可用于特异区别检测低危型HPV和中高危型HPV病毒感染的标志性最小基序肽氨基酸序列。这些最小表位基序肽和短肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.9所示。

Description

人乳头瘤病毒58型E6蛋白的抗原表位最小基序肽
技术领域
本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体涉及与妇女宫颈癌发生密切相关的中高危型人乳头瘤病毒(HPV)58型E6致癌蛋白的全部线性B细胞表位(B cell epitope，BCE，或称抗原决定簇)最小基序肽及其扩展的8肽，以及这些基序肽和短肽的应用。
背景技术
人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一组病毒的总称。目前发现HPV型别已超过100多种，其中约35种型别可感染女性生殖道上皮，而与宫颈癌以及宫颈上皮内高度病变发生密切相关的中高危型HPV涉及HPV16、18、31、33、45、52、56和58等20多种型别(Munoz N.human papillomavirus and cancer：the epidemiological evidence.J Clin Virol，19：1-5，2000)。已清楚HPV病毒都很小，其长度约8kb的基因组通常编码6个E1、E2、E4～E7早期蛋白和2个L1和L2后期蛋白(Stanley MA.Human papillomavirusvaccines.Rev Med Virol，16：139-149，2006)。
鉴于HPV感染对妇女生殖健康的严重危害，以及研制组合BCE和T细胞表位(T cellepitope，TCE)的HPV治疗性嵌合肽疫苗和早期感染HPV诊断试剂盒的需要，早期表达的E6和E7非结构致癌蛋白一直是线性表位作图定位研究的靶蛋白。但是，由于国外HPV16和18型感染率最高且危害性最大，所以E6和E7抗原表位鉴定多集中上述HPV两个型别(DillnerJ.Mapping of linear epitopes of human papillomavirus type 16：the E1，E2，E4，E5，E6and E7open reading frames.Int J Cancer，46：703-711，1990；Bleul C，etal.Human papillomavirus type 18E6and E7antibodies in human sera：increasedanti-E7prevalence in cervical cancer patients.J Clin Microbiol，29：1579-1588，1991；Meschede W，et al.Antibodies against early protein of human papillomavirusesas diagnostic markers for invasive cervical cancer.J Clin Microbiol，36：475-480，1998)。包括澳门和台湾在内的我国许多省市的HPV58高危型病毒也显现较高的感染率(刘宝印等.我国人乳头瘤病毒58型感染与宫颈癌的关系.中华实验和临床病毒学杂志，10：118-121，1996；高艳娥等.宫颈癌组织HPV58的检测及其E7基因的克隆和表达.中华肿瘤杂志，9：543-546，2004)，而且感染率次序紧随HPV16和18型之后(Bao YP，et al.Humanpapillomavirus type-distribution in the cervix of Chinese women：a meta-analysis.Internat J STD AIDS，19：106-111，2008)。但是，HPV58型E6蛋白表位鉴定研究至今未见报道。
因此，为了研制具我国自主知识产权的HPV治疗性嵌合肽疫苗和可特异检测HPV58型病毒的诊断试剂盒，我们用大肠杆菌表达了HPV58型E6蛋白并制备了兔抗重组E6蛋白抗血清，结合采用改良的生物合成肽策略(Xu，et al.Minimal motif mapping of a known epitopeon human zona pellucida protein-4using peptide biosynthesis strategy.J ReprodImmunol，81：9-16，2009)，对HPV58型E6蛋白进行了完整的线性表位扫描作图。
发明内容
本发明的目的在于提供人乳头瘤病毒58型E6蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小表位基序肽的短肽，同时提供所述基序肽和所述短肽可能的应用。
本发明提供的人乳头瘤病毒58型E6蛋白上最小表位基序肽，具有SEQ.ID No.1所示氨基酸序列，记为HPV58E65-8；或者具有SEQ.ID No.2所示氨基酸序列，记为HPV58E684-88；或者具有SEQ.ID No.3所示氨基酸序列，记为HPV58E6122-126；或者具有SEQ.ID No.4所示氨基酸序列，记为HPV58E6142-148。
本发明提供的分别含有上述最小表位基序肽的短肽，具有SEQ.ID No.5所示氨基酸序列，记为HPV58E6-1，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ.ID No.6所示氨基酸序列，记为HPV58E6-2，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代C端X残基；
具有SEQ.ID No.7所示氨基酸序列，记为HPV58E6-3，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；
具有SEQ.ID No.8所示氨基酸序列，记为HPV58E6-4，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基。
具有SEQ.ID No.9所示氨基酸序列，记为HPV58E6-2-1，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基。
本发明提供的人乳头瘤病毒(HPV)58型E6蛋白上申请人第一次鉴定的四个BCE肽的最小基序，以及它们可化学合成或与GST载体蛋白融合表达的含各BCE最小基序8肽或长于8肽抗原。前者可单个或组合用作设计研制治疗性HPV多表位疫苗的抗原肽，后者8肽或其融合蛋白可用于普查正常妇女或子宫颈癌患者血清中是否存在抗HPV58E6抗体的检测抗原。特别是，HPV58E6-2表位最小基序84-88(YGDLE)与高危型HPV18E6蛋白86-90序列100％保守，与HPV16E691-95、HPV31E684-88、HPV33E684-88、HPV45E688-90、HPV52E684-88和HPV56E687-91等序列也仅存在1个残基差异，但免疫印迹鉴定中都能被抗HPV58E6蛋白血清识别，而低危型HPV6b、11、42、43和44型E6蛋白中不存在这一HPV58E6表位序列。因此该最小基序化学合成肽或其融合蛋白也可用作鉴别低危型或中高危型HPV感染的检测生物标志性抗原。
本发明的内容进一步具体描述如下：
1，HPV58型病毒基因组克隆(Kirii Y，et al.Human papillomavirus type 58DNAsequence.Virol，185：424-427，1991)购自日本Matsukura T博士。用常规PCR方法从购得的HPV58型病毒基因组中扩增出编码HPV58型E6的全长cDNA，然后重组插入申请人构建的pSY621表达质粒[沈芸，应康，徐万祥，谢毅：大肠杆菌高效表达载体pSY621的构建.复旦学报(自然科学版)，39(3)：313-317，2000]，进而纯化在大肠杆菌中热诱导表达的重组E6蛋白，最后主动免疫新西兰白兔获得兔抗HPV58E6蛋白抗血清。
2，先前申请人已构建了专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的pXXGST-1融合表达载体(Xu et al.Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucidaprotein-4using a peptide biosynthesis strategy.J Reprod Immunol，81：9-16，2009)。因此，首先运用DNA重组技术(经化学合成编码DNA正负链片段，退火重组插入表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，重组克隆测序验证插入片段DNA序列，以及热诱导表达目的GST-15肽融合蛋白等步骤)，表达了跨越E6蛋白1-149序列相互重叠9个氨基酸残基的系列15肽(P1-P22)-GST和1个17肽(P23)-GST融合蛋白。结果在表达短肽融合蛋白(P1-P24)转印硝酸纤维素膜上后，用兔抗HPV58E6蛋白多抗进行完整表位扫描作图，分别鉴定出E6蛋白上四个印迹反应阳性的BCE表位肽(P1、P14和P23以及P20和P21共享1个BCE 9肽121-126)，不包括也能被正兔血清识别的P13肽(图1)。
3，进一步构建表达了以GST188为载体的跨越E6的P11-15、P1479-94、P20115-129(C端延伸2个残基)和P23133-149序列相互重叠7个残基的系列融合表达8肽(编号P24～P59)，继而用兔抗E6多抗对上述四个表位肽进行最小基序鉴定，结果根据各表位肽印迹反应阳性的8肽之间共同的氨基酸序列，确定P1、P14、P20/21和P23的BCE最小基序分别是AEEK5-8、YGDTL84-88、NKRFH122-126和PRRRQTQ142-148(图2和图3)。
4，将HPV58型E6蛋白上四个表位最小基序与低危型HPV(6b、11、42、43和44型)和高危型HPV(16、18、31、33、45、52和56型)E6进行氨基酸水平比较，发现：HPV58/E6-2表位最小基序84-88与代表性的低危型HPV6b和11等型E6之间不存在对应序列；与HPV18/E686-90序列100％保守；与HPV16、31、33、45、52和56型E6蛋白对应序列也仅存在1个残基差异(位于HPV58型E6-2的D残基86)，而且抗HPV58E6多抗能识别上述高危型HPV对应E6蛋白8肽(印迹反应显色强弱略有不同)，表明此表位是高危型HPV病毒E6蛋白中高度保守且相互有广泛交叉反应的表位。
以上HPV58型E6蛋白4个BCE肽最小基序的鉴定表明，本发明所述的HPV58型E6蛋白四个抗原表位最小基序和扩展的8肽可作为制备宫颈癌治疗性多价HPV疫苗的B细胞抗原表位肽，它们单独或组合与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferases，GST)等载体融合表达蛋白可用作HPV58型病毒感染检测试剂盒的抗原，其中E6表位肽-2(X1X2YGDTLX3，氨基酸序列单字母简写)可用作鉴别低危型和中高危型HPV病毒感染的生物标志性抗原。
附图说明
图1HPV58/E6线性抗原表位扫描定位的SDS-PAGE分析(A)和免疫印迹(B-C)图。
1，预染蛋白分子量标准；2-24，诱导的跨越E6蛋白全序列相互重叠9aa系列GST-15肽(P1-P23)融合蛋白融合。箭头分别指示表达的15肽融合蛋白(A)以及被1∶500稀释的兔抗重组E6蛋白抗血清(B)或正兔血清(C)识别的15肽融合蛋白条带。
图2HPV58/E6四个表位肽最小基序鉴定的印迹图。
1，预染蛋白分子量标准；2-9(A)，表达的P24-P31融合蛋白；2-9(B)，表达的P32-P39融合蛋白；2-11(C)，表达的P40-P49融合蛋白；2-11(D)，表达的P50-P59融合蛋白。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生印迹反应的条带。
图3HPV58E6蛋白四个BCE最小基序的氨基酸序列分析图。其中，阴影部分为印迹阳性的P34-P37肽的共有氨基酸序列。
具体实施方式
本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。
实施例1：人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6蛋白线性BCE扫描作图
材料和方法：
1.HPV58基因克隆(pLink322/HPV58质粒)购自日本Matsukura T博士。pRSET C质粒购自美国Invitrogen公司。热诱导表达质粒pXXGST-1由本专利发明人构建(专利申请号：200710173305.2)。大肠杆菌BL21(DE3)菌株由复旦大学遗传工程国家重点实验室保藏。
2.限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sal I、Taq酶和T4DNA连接酶购自日本TaKaRaBiotechnology公司，预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(IgG/HRP)、二氨基联苯胺(DAB)和0.2μm硝酸纤维素膜购自上海生工生物技术服务公司。6×His单抗购自上海睿星生物技术有限公司。
3.QIAprep spin miniprep Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。
4.新西兰白兔购自上海BK实验动物有限公司。
5.两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为各8-15/17肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
6.抗HPV58E6蛋白抗血清制备依据HPV58病毒E6基因序列公开信息(KiriiY，et al.Human papillomavirus type 58DNA sequence.Virol，185：424-427，1991)和参照文献方法(宋力雯等.人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合.生理学报，57：682-688，2005)。制备过程摘要如下：从pLink322/HPV58质粒中PCR扩增出两端为BamH I和EcoR I的全长E6编码基因；双酶切后重组插入pRSET C质粒，重组质粒经DNA测序验证后转化大肠杆菌宿主菌；诱导表达的重组含6×His标签E6蛋白用6×His单抗鉴定后，用纯化的重组E6蛋白免疫新西兰白兔，加强免疫二次后抽取血清备用。
人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6蛋白线性抗原表位扫描作图的具体步骤如下：
1.依据HPV58型E6基因序列公开信息，设计跨越E61-149全序列的系列相互重叠9个氨基酸残基的15/17肽编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc，3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’)，外送DNA合成。
2.将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20μmol/μl储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10μl储存液和20ddH2O于1.5ml Eppendorf管中，94℃水浴加热5min，自然降至室温后，在15μl反应体积中吸入2μl退火片段、1μl约200ng/μl经BamH I和Sal I双酶切的pXXStv-1质粒、1μlT4DNA连接酶和其1.5μl缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21(DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3ml LB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-15肽(P1-P23)融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认(与对照蛋白电泳迁移率相差约2个kDa)，挑取各重组克隆外送进行DNA测序；
3.将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3ml LB培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2～3h至菌体浓度达到0.6～0.8OD后，调高温度至42℃热诱导4h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5min备用；
4.将诱导的细菌总蛋白样品同时走15％SDS-PAGE，电泳结束后，一块凝胶用考马斯亮蓝染色，另一块凝胶进行硝酸纤维素膜电(100mA)转移2h，用丽春红染色转印迹膜2min，在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记，用水冲洗掉丽春红染色；
5.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8～10ml反应液中加入30μl一抗兔抗重组E6血清或正兔血清，室温反应2h，PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗兔IgG/HRP(1∶2000稀释)，室温反应1h，用PBS缓冲液洗涤后进行DAB显色(图1B-C)。
6.依据用抗E6血清(图1B)和正兔血清(图1C)印迹结果，排除正兔血清也能识别的P13，确定HPV58型E6蛋白上存在P11-15(E6-1)、P1479-94(E6-2)、E6121-126(P20和P21共有序列，E6-3)和P23142-148(E6-4)共四个线性BCE肽。其后的P14最小基序鉴定结果(图2B和图3B)也提供了P13不能被抗E6血清识别的证据，即，P13肽73-87中不存在完整的E6-3表位肽最小基序YGDTL84-88(缺最后1个残基L88)。
实施例2：人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6蛋白P14表位肽最小基序鉴定
材料和方法：
见实施例1相应部分。
P14表位肽最小基序鉴定的具体步骤如下：
1.依据实施例1中E6蛋白抗原表位扫描定位结果，以E6-2表位肽P14为例实施其最小基序鉴定。设计跨越E6-2的15肽序列相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc，3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’)，外送DNA合成。
2-4操作步骤同实施例1中的2-4步骤。
5.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8～10ml反应液中加入30μl一抗兔抗人重组E6血清(1∶200稀释)，室温反应2h，PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗人IgG/HRP(1∶2000稀释)，室温反应1h，用PBS缓冲液洗涤后进行DAB显色(图2B)。
6.依据4个印迹阳性连续片段(P34～P37)共有残基序列(图2B，Lane 4-7和图3)，确定其表位最小基序为YGDTL。
尽管本发明描述了人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6致癌性蛋白共4个抗原表位最小基序，以及可单独和/或组合用含最小基序的8肽或8肽融合蛋白研制治疗性HPV多表位疫苗，或可单独和/或组合用作检测人HPV58型感染的抗原(或化学合成或融合表达)，或将HPV58/E6-2表位肽用于快速筛查低危型或中高危型HPV病毒感染的生物标志性肽，但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序8肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
本发明涉及表位最小基序和扩展8肽的序列
SEQ ID No.1：人乳头瘤病毒HPV58/E6-11-15(P1)表位肽最小基序一字简写的氨基酸序列
AEEK
SEQ ID No.2：人乳头瘤病毒HPV58/E6-279-93(P14)表位肽最小基序
YGDTL
SEQ ID No.3：人乳头瘤病毒/HPV58E6-3121-129(P20和P21)表位肽最小基序
NKRFH
SEQ ID No.4：人乳头瘤病毒HPV58/E6-4133-149(P23)表位肽最小基序
PRRRQTQ
SEQ ID No.5：人乳头瘤病毒(HPV58)E6-1表位最小基序扩展8肽
X1X2AEEKX3X4
其中X1是Q，X2是D，X3是P，X4是R。
SEQ ID No.6：人乳头瘤病毒(HPV58)E6-2表位最小基序扩展8肽
X1X2YGDTLX3X4
其中X1是S，X2是L，X3是E，X4是Q。
SEQ ID No.7：人乳头瘤病毒(HPV58)E6-3表位最小基序扩展8肽
X1X2NKRFHX3X4
其中X1是D，X2是L，X3是N，X4是I。
SEQ ID No.8：人乳头瘤病毒(HPV58)E6-4表位最小基序扩展8肽
X1PRRRQTQX2
其中X1是R，X2是V。
SEQ ID No.9：人乳头瘤病毒(HPV58)E6-2-1表位扩展肽
X1X2YGX3TLX4X5
其中X1是S，X2是L，X3是D，X4是E，X5是Q。

Claims (4)

1.一种人乳头瘤病毒58型E6蛋白上最小表位基序肽，其特征在于具有SEQ.ID No.1所示氨基酸序列，记为HPV58E65-8；或者具有SEQ.ID No.2所示氨基酸序列，记为HPV58E684-88；或者具有SEQ.ID No.3所示氨基酸序列，记为HPV58E6122-126；或者具有SEQ.ID No.4所示氨基酸序列，记为HPV58E6142-148。
2.一种含如权利要求1所述的最小表位基序肽的短肽，其特征在于具有SEQ.ID No.5所示氨基酸序列，记为HPV58E6-1，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；或者
具有SEQ.ID No.6所示氨基酸序列，记为HPV58E6-2，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代C端X残基；或者
具有SEQ.ID No.7所示氨基酸序列，记为HPV58E6-3，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基；或者
具有SEQ.ID No.8所示氨基酸序列，记为HPV58E6-4，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基。
3.一种含如权利要求1所述的最小表位基序肽的短肽，其特征在于具有SEQ.ID No.9所示氨基酸序列，记为HPV58E6-2-1，其序列中带下标的X编号为特定氨基酸残基，在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序8肽的场合，可删除或不删除和用其他残基替代X编号残基。
4.如权利要求1～3之一所述基序肽或短肽在制备HPV58型病毒感染检测试剂盒中的应用。
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