CN104610448A

CN104610448A - Hpv58e6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104610448A
Application number: CN201510054024.XA
Authority: CN
Inventors: 吕卫国; 邹健; 程晓东; 李阳; 章鉴洋; 谢幸
Original assignee: Womens Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Current assignee: Womens Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: CN104610448B

Abstract

本发明制备了HPV58-E6特异性兔单克隆抗体，包括如下步骤：设计HPV58E6特异性多肽段,合成多肽段并交联到两种载体。将合成好的多肽抗原免疫新西兰大白兔，测定血清滴度，Western Blot检测抗体特异性，然后将脾细胞与融合伴侣细胞进行细胞融合培养后，取上清检测抗体滴度及特异性,筛选出特异度及效价最好的融合细胞,将融合细胞裂解提取RNA，做RT-PCR，获得抗体重轻链cDNA, 构建入pTT5质粒载体，将包含重轻链质粒共转染到HEK-293-6E细胞进行表达获得重组抗体，即为HPV58-E6单克隆抗体。此抗体可用于Western Blot检测HPV58型癌基因E6的表达。

Description

HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用，属于医药领域。

背景技术

目前，宫颈癌是发展中国家女性的主要死亡原因之一。人乳头瘤病毒HPV感染是导致宫颈癌的必要因素之一，依其致癌性分为高危型和低危型。人乳头状瘤病毒是高物种特异性的小的DNA肿瘤病毒，通过感染宫颈基底上皮进而引起宫颈病变。高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染已被认为是宫颈癌及其癌前病变的主要致病因素。已知的高危型别HPV有15种，HPV58属高危型HPV，较HPV16和HPV18少见，其感染例数占所有HPV感染总数的11.5％～28％，而在全世界范围内仅为0～3％。中国内地尤其是东南地区，是全球HPV58高发区之一，流行病学研究表明中国多个地区宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌患者中HPV58阳性率甚至高于HPV18，仅次于HPV16。HPV58E6、E7是主要的原癌蛋白，具有使宿主细胞转化功能。E6和E7这两个病毒蛋白总在HPV阳性的宫颈癌细胞中表达。E6结合细胞内的泛素连接酶E6-AP(E6-associatedprotein)，使p53泛素化降解，不能转位入核，从而抑制p53发挥细胞阻滞与诱导凋亡的作用。E6蛋白还可以激活端粒酶的表达并调节含盘状同源区域(PDZ)结构域蛋白的活性及肿瘤坏死因子受体，使细胞达到永生化。E6与p53的相互作用可能影响酪氨酸激酶家族(Src)的非受体酪氨酸激酶的调节或使其降解，能激发HPV感染细胞的有丝分裂。

HPV58属于HPVA9家族，其他还包括HPV16，31，33，35，52，67。其基因序列存在很大程度的相似性。目前市面上仅有HPV16-E6抗体，而没有HPV58-E6抗体。不同型别人乳头瘤病毒具有特异的基因序列，其致癌性也存在明显的差异。因此制备检测HPV58-E6的抗体对研究人乳头瘤病毒致宫颈癌机制具有重要的意义。将HPVA9家族的不同HPV型别的序列进行比对，比较HPV58与HPV16，31，33，52，67序列的相似度，找出差异序列，找到HPV58E6的特异性序列，针对该序列设计多肽，从而获得特异性HPV58E6多肽抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用，所述HPV58E6抗体可用于检测HPV58E6蛋白。

为实现上述目的，本发明采用以下方案进行实施：

一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体，该抗体的基因序列由SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链组成。

一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)比较HPV58E6与HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E6序列，找出HPV58E6的特异性序列，针对该特异性序列设计多肽ZJM-1b；ZJM-1b的序列SEQ ID NO.6所示；

(2)用ZJM-1b免疫新西兰大白兔，取免疫后的新西兰大白兔的血清，用ELISA检测血清的抗体滴度，筛选出滴度大于ELISA血清滴度判断标准的血清样本；

(3)将步骤2筛选出的血清样本进一步通过Western Blot检测血清的抗体特异性，筛选出抗体阳性的大白兔；

(4)将筛选出的大白兔的脾细胞与融合伴侣细胞240E-W2进行细胞融合，之后铺板到96孔培养板，在1640AB培养基(含有体积分数为9％的血清，体积分数为1％的GlutaMAX)中进行克隆培养，培养10天后换液，换液后继续培养5天，对上清进行ELISA筛选，找到阳性细胞克隆；

(5)将阳性细胞克隆转移至24孔板继续培养6天(1640AB培养基，含有体积分数为9％的血清，体积分数为1％的GlutaMAX)，取细胞上清液，用ELISA测定上清液的滴度；将上清液20倍稀释后，用ELISA测定稀释液的滴度，筛选出上清液和稀释液滴度OD值均大于0.3的细胞上清液样本；

(6)将步骤5筛选出的细胞上清液样本进行抗体Western Blot检测，进一步筛选出表达HPV58E6特异性抗体的克隆；

(7)针对每个克隆，提取RNA，用引物F1/R1进行RT-PCR扩增，得到多个重链cDNA和多个轻链cDNA；将cDNA分别构建到pTT5质粒表达载体中，将包含重链cDNA的pTT5质粒与包含轻链cDNA的pTT5质粒进行两两配对，共转染到HEK-293-6E细胞后进行细胞培养；引物F1/R1的基因序列分别如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

(8)取细胞培养的上清液，进行ELISA检测；筛选IgG浓度最高且滴度OD值大于0.3的配对，即为HPV58E6特异性兔单克隆抗体的重链和轻链配对。

一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体的应用，该应用为将HPV58E6特异性兔单克隆抗体应用于检测HPV58E6蛋白。

本发明的有益效果是：本发明实验步骤简单易操作,周期短,易于获得所需抗体。本方法通过设计特异性多肽段，可以获得特异性强的抗体。通过设计重链轻链表达质粒，可以获得高效的重组抗体，明显缩短了时间。将HPV58E6特异性兔单克隆抗体可用于检测HPV58E6蛋白，检测特异性高，灵敏度高。

附图说明

图1是检测血清抗体western blot图，图中，1和3上样样本为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染293T细胞所提蛋白2和4上样样本为pEGFP-C1空载质粒转染293T细胞所提蛋白；1和2所用一抗为ZJM-1兔#YK-353以1：1000倍比稀释，3和4所用一抗为ZJM-1兔#YK-353以1：1000倍比稀释加5ug多肽阻断剂；

图2是检测杂交瘤细胞上清western blot图，图中，左边4条带为pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染293T细胞所提蛋白，中间4条带为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染293T细胞所提蛋白，右边4条带为pEGFP-C1空载质粒转染293T细胞所提蛋白；所用一抗为：1所用一抗为ZJM-1-5以1:100稀释；2所用抗体为ZJM-1-9以1:100稀释；3所用抗体为ZJM-1-27以1:100稀释；4所用抗体为YK-353抗血清以1:1000稀释；

图3是检测重组抗体western blot图，图中，HPV58E6为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组，HPV16E6为pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组；所用一抗为：IB-5为ZJM-1b-5以1:100稀释，IB-9为ZJM-1b-9以1:100稀释，IB-27为ZJM-1b-27以1:100稀释；

图4是重组抗体SDS-PAGE纯度测定结果图；

图5是检测HPV58E6表达western blot图，图中，1为pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组，2为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组，3为pEGFP-C1空载质粒组，4为空白对照组，5为marker。所用一抗为：使用HPV58E6特异性兔单克隆抗体。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例制备HPV58E6特异性兔单克隆抗体，包括以下步骤：

第1步、多肽合成及交联

从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/搜索出HPV58E6、HPV16E6、HPV31E6、HPV33E6、HPV52E6、HPV67E6的序列，并比较HPV58E6与HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E6序列，找出HPV58E6的特异性序列，针对该特异性序列设计两条多肽，即为特异性HPV58E6多肽抗原ZJM-1a和ZJM-1b；两条特异性HPV58E6多肽抗原的序列分别为VCWRPRRRQTQV(SEQ ID NO.5)和ETSVHEIELKCV(SEQ ID NO.6)。

第2步、免疫动物和血清滴度测定

免疫方案：采用标准免疫方案进行免疫，每只兔子实施5-6次注射免疫，取2-3次血清用于测试。每次注射免疫时，把分装好的抗原解冻并与弗氏完全佐剂(CFA)(第一次注射免疫)或弗氏不完全佐剂(后面的免疫注射)充分混匀并采用皮下注射方式免疫兔子。具体如下:

用HPV58E6两条多肽抗原免疫4只新西兰大白兔(YK-350、YK-351、YK-352、YK-353)，免疫办法如表1所示。

	YK-350和YK-351	YK-352和YK-353
			Day1	取血2ml(YK-350B0、YK-351B0)	取血2ml(YK-352B0、YK-353B0)
Day1	注射0.4mg KLH-ZJM-1a	注射0.4mg KLH-ZJM-1b
			Day21	注射0.4mg KLH-ZJM-1a	注射0.4mg KLH-ZJM-1b
Day35	注射0.4mg KLH-ZJM-1a	注射0.4mg KLH-ZJM-1b
			Day49	注射0.2mg OVA-ZJM-1a	注射0.2mg OVA-ZJM-1b
Day61	取血10ml(YK-350B1、YK-351B1)	取血10ml(YK-352B1、YK-353B1)
			Day63	注射0.2mg OVA-ZJM-1a	注射0.2mg OVA-ZJM-1b
Day75	取血10ml(YK-350B2、YK-351B2)	取血10ml(YK-352B2、YK-353B2)

ELISA血清滴度测定：

免疫前血清B0，第一次免疫血清B1和第二次免疫血清B2的滴度测定采用通用ELISA方法测定。包被抗原是交联到BSA上的多肽。测试结果如表2和表3所示。

表2：ZJM-1a免疫的YK-350和YK-351的血清滴度表

表3：ZJM-1b免疫的YK-352和YK-353的血清滴度表

测试结果表明，所有免疫的兔子都对免疫原产生了较强的免疫反应，血清滴度明显高于判断标准(1:64K稀释度时ELISA读值O.D.>0.3)

第3步、取血清进行蛋白免疫印迹测试(WB测试)

将血清样本(YK-350B0、YK-351B0、YK-350B1、YK-351B1、YK-350B2、YK-351B2、YK-352B0、YK-353B0、YK-352B1、YK-353B1、YK-352B2、YK-353B2)进一步通过western blot检测血清的抗体特异性，YK-353相对于其他兔子表现出更好的特异性，如图1所示，在37～50KD之间存在58E6组，可见条带；而在阴性组未见条带。

第4步、细胞融合与培养

取YK-353的脾脏，制备脾细胞悬液待用；将脾细胞与融合伴侣细胞240E-W2进行细胞融合，之后铺板到96孔培养板，在1640AB培养基(含有体积分数为9％的血清，体积分数为1％的GlutaMAX)中分别进行克隆培养，培养10天后换液，换液后继续培养5天，筛选出73个活性较强的克隆。

第5步、将初筛得到的73个克隆转移至24孔板继续培养6天，挑选出41个活性较强的克隆；取细胞上清液，用ELISA测定上清液的滴度；将上清液20倍稀释后，用ELISA测定稀释液的滴度，如表4所示。

表4：ELISA测定结果

测试结果表明，筛选出的融合细胞都对免疫原产生了较强的免疫反应，血清滴度明显高于0.3。

第6步、将步骤5筛选出的细胞上清液样本进行抗体western blot检测，检测结果如图2所示，ZJM1b-5、ZJM1b-9、ZJM1b-27表现出较好的特异性，在阴性对照和16E6组未见条带，在58E6组条带可见。

第7步、提取ZJM1b-5的RNA，用引物F1/R1进行RT-PCR扩增(F1的基因序列如SEQ ID NO.7所示，R1的基因序列如SEQ ID NO.8所示)，得到2个重链cDNA和3个轻链cDNA；提取ZJM1b-9的RNA，用RT-PCR扩增，得到3个重链cDNA和2个轻链cDNA；提取ZJM1b-27的RNA，用RT-PCR扩增，得到3个重链cDNA和2个轻链cDNA。将cDNA分别构建到表达载体pTT5质粒中，将包含重链cDNA的pTT5质粒与包含同一克隆体的轻链cDNA的pTT5质粒进行配对，配对后的质粒共转染到HEK-293-6E细胞后进行细胞培养；

第8步、取细胞培养的上清液进行ELISA检测；并检测上清液和40倍稀释液的滴度OD值，如表5所示。

由上表可知，ZJM1b-5中的H2/L2、ZJM1b-9中的H2/L1以及ZJM1b-27中的H1/L1的滴度值和IgG较高，下面用western blot检测进一步检测其特异性。测试结果如图3所示，ZJM1b-9中的H2/L1对16E6组未见条带，在58E6组条带可见，对58E6具有较好的特异性，因此确定为本发明的HPV58E6特异性兔单克隆抗体。

第9步、重组抗体测序。

对ZJM-1-9H2/L1克隆进行测序，以获得重组抗体的cDNA序列；并进行SDS-PAGE纯度测定。ZJM1b-9中的H2/L1进行测序，重链的基因序列如SEQ IDNO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链的基因序列如SEQ IDNO.2所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。SDS-PAGE纯度测定结果如图4，从图中可以看出，SDS-PAGE纯度测定在25～50KD之间可见两条条带，50KD处为重链和25KD处为轻链。

实施例2

本实施例将实施例1制备的HPV58E6特异性兔单克隆抗体应用于检测HPV58E6蛋白。分别将HPV58E6和HPV16E6序列构建入pEGFP-C1质粒载体中，将pEGFP-C1空载质粒和包含HPV58E6和HPV16E6的质粒转染293T细胞，48小时后提取细胞蛋白，将所得蛋白为待测样本。分组为空白对照组，pEGFP-C1空载质粒组，pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组，pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组。通过western blot检测HPV58E6蛋白表达情况，结果如图5，从图中可以看出，在40～55KD间在HPV58E6组可见明显条带，而在其余各组未见条带。由此可见，实施例1制备的HPV58E6特异性兔单克隆抗体可应用于检测HPV58E6蛋白，且特异性高，灵敏度高。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学医学院附属妇产科医院

<120> HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aagcttgtac ccttcaccat ggagactggg ctgcgctggc ttctcctggt cgctgtgctc 60

aaaggtgtcc agtgtcagtc ggtggaggag tccgggggtc gcctggtcac gcctgggaca 120

cccctgacac tcacctgcac cgtctctgga ttctccctca gtagcaagac aataagctgg 180

gtccgccagg ctccagggaa ggggctagaa tggatcggag ccattgatag taatggtatg 240

aaagcctacg cgaggtgggc gaaaggccga tttaccatct ccaaaagctc gaccacggtg 300

tatctgaaaa tcaccagtcc gacaaccgag gacacggcca cctatttctg tgtcaaaccc 360

aacaatttgt ggggcccagg caccctggtc accgtctcct cagggcaacc taaggctcca 420

tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480

tgcctggtca aagggtacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540

accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600

agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660

accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc cacgtgccca 720

ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780

ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840

cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg 900

ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960

caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080

atgggccctc cccgggagga gctgagcagc aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac 1140

ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200

tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260

tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag 1320

gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atgagcgctg 1380

tgccggcgag ctgcggccgc 1400

<210> 2

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aagcttgtac ccttcaccat ggacacgagg gcccccactc agctgctggg gctcctgctg 60

ctctggctcc caggtgccac atttgcccaa gtgctgaccc agactccatc cccagtgtct 120

gcagctgtgg gaggcacagt caccatcaat tgccagtcca gtcagagtgt ttataataac 180

aatgccttat cctggtatca gcagaaacca gggcagcctc ccaagctcct gatctattct 240

gcatccaaag tggcaactgg ggtcccatcg cggttcagcg gcagtggatc tggggcacag 300

ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt gacgatgctg ccacttacta ctgtcaaggc 360

gaatttagtt gtagtagtgc tgattgtttt gctttcggcg gagggaccga ggtggtggtc 420

aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc atcttcccac cagctgctga tcaggtggca 480

actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc 540

tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat 600

tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc actctgacac tgaccagcac acagtacaac 660

agccacaaag agtacacctg caaggtgacc cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc 720

aataggggtg actgttagag tgagagcggc cgc 753

<210> 3

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Ala Ile Asp Ser Asn Gly Met Lys Ala Tyr Ala Arg Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Ser Thr Thr Val Tyr Leu

85 90 95

Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val

100 105 110

Lys Pro Asn Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly

130 135 140

Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

145 150 155 160

Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn

165 170 175

Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys

195 200 205

Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala

210 215 220

Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

260 265 270

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val

275 280 285

Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile

290 295 300

Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val

340 345 350

Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu

370 375 380

Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val

405 410 415

Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 4

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro

20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Ala Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Lys Val Ala Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser Ala Asp Cys Phe Ala Phe Gly Gly

115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu

130 135 140

Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile

145 150 155 160

Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu

165 170 175

Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro

180 185 190

Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

195 200 205

Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr

210 215 220

Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg Arg Gln Thr Gln Val

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Glu Thr Ser Val His Glu Ile Glu Leu Lys Cys Val

1 5 10

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aagcttgtac ccttcacctg ccggcgagct gcggccgc 38

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aagcttgtac ccttcaccag tgagagcggc cgc 33

Claims

1.一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体，其特征在于，该抗体的基因序列由SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链组成。

2.一种权利要求1所述的HPV58E6特异性兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）比较HPV58E6与HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E6序列，找出HPV58E6的特异性序列，针对该特异性序列设计多肽ZJM-1b；ZJM-1b的序列SEQ ID NO.6所示；

（2）用ZJM-1b免疫新西兰大白兔，取免疫后的新西兰大白兔的血清，用ELISA检测血清的抗体滴度，筛选出滴度大于ELISA血清滴度判断标准的血清样本；

（3）将步骤2筛选出的血清样本进一步通过Western Blot检测血清的抗体特异性，筛选出抗体阳性的大白兔；

（4）将筛选出的大白兔的脾细胞与融合伴侣细胞240E-W2进行细胞融合，之后铺板到96孔培养板，在1640AB培养基（含有体积分数为9%的血清，体积分数为1%的GlutaMAX）中进行克隆培养，培养10天后换液，换液后继续培养5天，对上清进行ELISA筛选，找到阳性细胞克隆；

（5）将阳性细胞克隆转移至24孔板继续培养6天（在1640AB培养基中培养，所述培养基中含有体积分数为9%的血清，体积分数为1%的GlutaMAX），取细胞上清液，用ELISA测定上清液的滴度；将上清液20倍稀释后，用ELISA测定稀释液的滴度，筛选出上清液和稀释液滴度OD值均大于0.3的细胞上清液样本；

（6）将步骤5筛选出的细胞上清液样本进行抗体Western Blot检测，进一步筛选出表达HPV58E6特异性抗体的克隆；

（7）针对每个克隆，提取RNA，用引物F1/R1进行RT-PCR扩增，得到多个重链cDNA和多个轻链cDNA；将cDNA分别构建到pTT5质粒表达载体中，将包含重链cDNA的pTT5质粒与包含轻链cDNA的pTT5质粒进行两两配对，共转染到HEK-293-6E细胞后进行细胞培养；引物F1/R1的基因序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

（8）取细胞培养的上清液，进行ELISA检测；筛选IgG浓度最高且滴度OD值大于0.3的配对，即为HPV58E6特异性兔单克隆抗体的重链和轻链配对。

3.一种权利要求1所述的HPV58E6特异性兔单克隆抗体的应用，其特征在于，该应用为将HPV58E6特异性兔单克隆抗体用于检测HPV58E6蛋白。