CN106831959B - 一种人乳头瘤病毒33型l1蛋白的突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种突变的HPV33 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV33和HPV58，或者HPV33、HPV58和HPV52)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。

Description

一种人乳头瘤病毒33型L1蛋白的突变体
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种突变的HPV33 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV33和HPV58，或者HPV33、HPV58和HPV52)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤和粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的生殖器癌症的主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是施用HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。
HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体构成的20面体立体对称结构(Doorbar,J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol,61(9):2793-9)。HPV VLP的结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24):12180-4)。
然而，现有的研究显示，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在低的交叉保护作用(SaraL.Bissett,Giada Mattiuzzo,et al.2014 Vaccine.32:6548-6555)。因此，现有的HPV疫苗的保护范围非常有限。通常，一个型别的HPV VLP只能用于预防该型别的HPV感染。在这种情况下，如果要扩大HPV疫苗的保护范围，那就只能在疫苗中增加更多型别的HPV VLP。目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的(其为针对HPV16，18，6和11的四价疫苗)，GSK公司的(其为针对HPV16，18的二价疫苗)和Merck公司的9(其为九价疫苗)，均是通过混合多个型别的HPV VLP而制成。然而，这种方案将导致HPV疫苗的生产成本大大提高，并且可能因为免疫剂量的增加而导致潜在的安全性问题。
因此，本领域需要开发能够诱导针对多个型别的HPV的保护性中和抗体的HPV病毒样颗粒，以更经济、有效地预防多个型别的HPV感染和由此导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
发明内容
本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：将人乳头瘤病毒(HPV)33型L1蛋白中的一个特定区段置换为第二型别的HPV(例如HPV58)L1蛋白的相应区段后，所获得的突变的HPV33 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV33和第二型别的HPV(例如HPV58)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV33 VLP和第二型别的HPVVLP相当，并且其针对HPV33的保护效果与单独的HPV33 VLP相当，且针对第二型别的HPV(例如HPV58)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当。
此外，在上述置换的基础上，还可以将HPV33 L1蛋白中的另一个特定区段进一步置换为第三型别的HPV(例如HPV52)L1蛋白的相应区段，由此所获得的含有双置换的突变的HPV33 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV33、第二型别的HPV(例如HPV58)和第三型别的HPV(例如HPV52)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV33VLP、第二型别的HPV VLP和第三型别的HPV VLP相当；并且，其针对HPV33的保护效果与单独的HPV33 VLP相当，针对第二型别的HPV(例如HPV58)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当，且针对第三型别的HPV(例如HPV52)的保护效果与单独的第三型别的HPV VLP相当。
因此，在一个方面，本发明提供了一种突变的HPV33 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV33 L1蛋白与野生型HPV33 L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)N端截短了9-19个氨基酸，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸；和
(2)位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
任选地，所述突变的HPV33 L1蛋白还具有下述突变：
(3)位于野生型HPV33 L1蛋白第133-142位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(4)位于野生型HPV33 L1蛋白第266-286位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
并且，所述变体与所述突变的HPV33 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV33 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV33和HPV58，或者HPV33、HPV58和HPV52)的中和抗体。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV33 L1蛋白与野生型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9个、11个、14个或19个氨基酸。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV33 L1蛋白与野生型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9个氨基酸。
在某些优选的实施方案中，所述第二型别的野生型HPV为HPV58。在某些优选的实施方案中，(2)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述第三型别的野生型HPV为HPV52。在某些优选的实施方案中，(3)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV52 L1蛋白第161-170位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(4)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV52L1蛋白第295-317位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV33 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV58 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV52 L1蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:59所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV52 L1蛋白第161-170位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:60所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV52 L1蛋白第295-317位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:61所示。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV33 L1蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、12和14。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的突变的HPV33L1蛋白或其变体。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:24、26和28。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种HPV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的突变的HPV33 L1蛋白或其变体，或者由本发明的突变的HPV33 L1蛋白或其变体组成或形成。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV33 L1蛋白，其与野生型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9-19个氨基酸，例如9个、11个、14个或19个氨基酸，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV33 L1蛋白，其与野生型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9-19个氨基酸，例如9个、11个、14个或19个氨基酸，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第133-142位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52 L1蛋白第161-170位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV33 L1蛋白，其与野生型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9-19个氨基酸，例如9个、11个、14个或19个氨基酸，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第266-286位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52 L1蛋白第295-317位的氨基酸残基。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV33 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:10、12或14所示的序列。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述突变的HPV33 L1蛋白或其变体，或上述分离的核酸或载体或宿主细胞或HPV病毒样颗粒的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变的HPV33 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
在某些优选的实施方案中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV33感染、HPV58感染和/或HPV52感染)。在某些优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。
在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上所述的突变的HPV33 L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV33L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV33 L1蛋白或其变体。
在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV33 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV33 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV33 L1蛋白或其变体。
在另一个方面，本发明涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV33感染、HPV58感染和/或HPV52感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，还涉及根据本发明的突变的HPV33 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV33感染、HPV58感染和/或HPV52感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，术语“第二型别的野生型HPV”是指，不同于HPV33的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第二型别的野生型HPV优选为野生型HPV58。根据本发明，术语“第三型别的野生型HPV”是指，不同于HPV33，且不同于第二型别的野生型HPV的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第三型别的野生型HPV优选为野生型HPV52。
根据本发明，表述“相应位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。
根据本发明，术语“野生型HPV33 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒33型(HPV33)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV33 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号P06416.1，ACV84008.1，ACV84011.1，ACV84012.1和ACL12333.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV33 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV33L1蛋白的第350-357位氨基酸残基”是指，SEQID NO：1所示的多肽的第350-357位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV33可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV33的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV33 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种HPV33分离株的L1蛋白(例如P06416.1，ACV84008.1，ACV84011.1，ACV84012.1和ACL12333.1所示的HPV33L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV33 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种HPV33分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV33 L1蛋白的第350-357位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第350-357位氨基酸残基，以及各种HPV33分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV58 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒58型(HPV58)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV58 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号P26535.1、ACJ13480、ACX32376.1或ACK37663.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV58 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV58L1蛋白的第376-383位氨基酸残基”是指，SEQID NO：2所示的多肽的第376-383位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV58可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV58的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV58 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:2所示的蛋白，而且应包括各种HPV58分离株的L1蛋白(例如P26535.1、ACJ13480、ACX32376.1或ACK37663.1所示的HPV58 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV58 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括各种HPV58分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV58 L1蛋白的第376-383位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第376-383位氨基酸残基，以及各种HPV58分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV52 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒52型(HPV52)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV52 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号ACX32362.1、Q05138.2或ABU55790.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV52 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：3所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV52L1蛋白的第161-170位氨基酸残基”是指，SEQID NO：3所示的多肽的第161-170位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV52可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV52的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV52L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:3所示的蛋白，而且应包括各种HPV52分离株的L1蛋白(例如ACX32362.1、Q05138.2或ABU55790.1所示的HPV52L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV33 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：3的序列片段，还包括各种HPV52分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV52 L1蛋白的第161-170位氨基酸残基”包括，SEQID NO：1的第161-170位氨基酸残基，以及各种HPV52分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1－X位氨基酸残基。例如，N端截短了9个氨基酸的HPV33 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV33 L1蛋白N末端的第1-9位氨基酸残基所获得的蛋白质。
根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPV33L1蛋白(如SEQ ID NO：10，12或14所示的蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，或者具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述突变的HPV33L1蛋白的功能。在本发明中，术语“突变的HPV33 L1蛋白的功能”是指：能够诱导机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV33和HPV58，或者HPV33、HPV58和HPV52)的中和抗体。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。
根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，术语“裂解上清”是指通过下述步骤所产生的溶液：将宿主细胞(例如大肠杆菌)在裂解液中破碎，然后将含有经破碎的宿主细胞的裂解液中的不溶物去除。各种裂解液是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。此外，可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现宿主细胞的破碎，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。去除裂解液中的不溶物的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于过滤和离心。
发明的有益效果
研究表明，虽然HPV33和其他型别的HPV(例如HPV58和HPV52)之间存在一定的交叉保护，但是这种交叉保护的能力很低，通常低于自身型别的VLP的保护水平的百分之一，甚至低于千分之一。因此，对于接种了HPV33疫苗的受试者来说，其感染其他型别的HPV(例如HPV58和HPV52)的风险依然很高。
本发明提供了一种突变的HPV33 L1蛋白以及由其形成的HPV病毒样颗粒。本发明的HPV病毒样颗粒能够在HPV33和其他型别的HPV(例如HPV58和HPV52)之间提供显著的交叉保护能力。特别地，在同等免疫剂量下，本发明的HPV病毒样颗粒能够诱发机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV33和HPV58，或者HPV33、HPV58和HPV52)的高滴度中和抗体，并且其效果与多个型别的HPV VLP的混合物(例如，HPV33 VLP和HPV58 VLP的混合物，或者HPV33 VLP、HPV58 VLP和HPV52 VLP的混合物)相当。因此，本发明的HPV病毒样颗粒能够用于同时预防至少两个型别的HPV(例如，HPV33和HPV58，或者HPV33、HPV58和HPV52)的感染以及与此相关的疾病，具有显著的有利技术效果。这在扩大HPV疫苗的保护范围和降低HPV疫苗的生产成本等方面具有特别显著的优势。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例1中经纯化的突变蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:HPV33N9(N端截短了9个氨基酸的HPV33 L1蛋白)；泳道2:H33N9-58T1；泳道3:H33N9-58T2；泳道4:H33N9-58T3；泳道5:H33N9-58T4；泳道6:H33N9-58T5；泳道7:H33N9-58T5；泳道8:H33N9-58T5-52S1；泳道9:H33N9-58T5-52S2；泳道10:H33N9-58T5-52S3；泳道11:H33N9-58T5-52S4。结果显示，经过色谱纯化后，蛋白H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4的纯度达到95％以上。
图2显示了用广谱抗体4B3检测实施例1中制备的H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4的蛋白质免疫印迹检测的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：HPV33；泳道2：H33N9-58T1；泳道3：H33N9-58T2；泳道4：H33N9-58T3；泳道5：H33N9-58T4；泳道6：H33N9-58T5；泳道7：H33N9-58T5；泳道8：H33N9-58T5-52S1；泳道9：H33N9-58T5-52S2；泳道10：H33N9-58T5-52S3；泳道11：H33N9-58T5-52S4。结果显示，突变蛋白H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4能够被广谱抗体4B3特异性识别。
图3A-3L显示了包含蛋白HPV33N9、H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、HPV58N35(N端截短了35个氨基酸的HPV58 L1蛋白)、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4、HPV52N40(N端截短了40个氨基酸的HPV52 L1蛋白)的样品的分子筛层析分析的结果。图3A：HPV33N9；图3B：H33N9-58T1；图3C：H33N9-58T2；图3D：H33N9-58T3；图3E：H33N9-58T4；图3F：H33N9-58T5；图3G：HPV58N35；图3H：H33N9-58T5-52S1；图3I：H33N9-58T5-52S2；图3J：H33N9-58T5-52S3；图3K：H33N9-58T5-52S4；图3L：HPV52N40。结果显示，各个样品的最先出现的蛋白峰均在12min左右，与HPV33 VLP、HPV58 VLP和HPV52 VLP相当。这表明，上述突变蛋白组装均可组装成VLP。
图4A-4F显示了HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP、HPV52N40 VLP、H33N9-58T5 VLP、H33N9-58T5-52S2 VLP、H33N9-58T5-52S4 VLP的沉降速率分析的结果。图4A，HPV33N9 VLP；图4B，HPV58N35 VLP；图4C，HPV52N40 VLP；图4D，H33N9-58T5 VLP；图4E，H33N9-58T5-52S2VLP；图4F，H33N9-58T5-52S4 VLP。结果显示，H33N9-58T5 VLP、H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP的沉降系数分别为109S、108S和107S，而HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP的沉降系数分别为133S、118S和131S。这表明，H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S2和H33N9-58T5-52S4组装成大小、形态与野生型VLP相似的病毒样颗粒。
图5A-5L显示了各种VLP样品的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)。图5A，由HPV33N9组装的VLP；图5B，由H33N9-58T1组装的VLP；图5C，由H33N9-58T2组装的VLP；图5D，由H33N9-58T3组装的VLP；图5E，由H33N9-58T4组装的VLP；图5F，由H33N9-58T5组装的VLP；图5G，由HPV58N35组装的VLP；图5H，由H33N9-58T5-52S1组装的VLP；图5I，由H33N9-58T5-52S2组装的VLP；图5J，由H33N9-58T5-52S3组装的VLP；图5K，由H33N9-58T5-52S4组装的VLP；图5L，由HPV52N40组装的VLP。结果显示，H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3和H33N9-58T5-52S4与HPV33N9、HPV58N35和HPV52N40类似，都能够组装成半径为30nm左右的VLP。
图6A-6F显示了H33N9-58T5 VLP、H33N9-58T5-52S1 VLP、H33N9-58T5-52S2 VLP、H33N9-58T5-52S3 VLP、H33N9-58T5-52S4VLP的热稳定性评价的结果。图6A，HPV33N9 VLP；图6B，H33N9-58T5 VLP；图6C，H33N9-58T5-52S1 VLP；图6D，H33N9-58T5-52S2VLP；图6E，H33N9-58T5-52S3 VLP；图6F，H33N9-58T5-52S4 VLP。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。
图7A显示了实验组H33N9-58T1 VLP、H33N9-58T2 VLP、H33N9-58T3 VLP、H33N9-58T4 VLP、H33N9-58T5 VLP和对照组HPV33N9VLP、HPV58N35 VLP在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H33N9-58T5 VLP可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV33和HPV58的中和抗体；并且其针对HPV33的保护效果与单独的HPV33N9 VLP相当，且显著高于单独的HPV58N35 VLP；并且其针对HPV58的保护效果与单独的HPV58N35 VLP相当，且显著高于单独的HPV33N9 VLP。这表明，H33N9-58T5 VLP可用作预防HPV33感染和HPV58感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV33 VLP和HPV58 VLP的混合疫苗。
图7B显示了实验组H33N9-58T5-52S1 VLP、H33N9-58T5-52S2VLP、H33N9-58T5-52S3 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP，以及对照组HPV33N9 VLP、HPV52N40 VLP、HPV58N35VLP、和混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV33、HPV58和HPV52的中和抗体；并且其针对HPV33的保护效果与单独的HPV33N9 VLP、混合的HPV33/HPV58/HPV52VLP相当，且显著高于单独的HPV58N35 VLP和单独的HPV52N40VLP；并且其针对HPV58的保护效果与单独的HPV58N35 VLP、混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP相当，且显著高于单独的HPV33N9 VLP和单独的HPV52N40 VLP；并且其针对HPV52的保护效果虽然略微弱于单独的HPV52N40 VLP、混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP，但仍然显著高于单独的HPV33N9 VLP和单独的HPV58N35 VLP。这表明，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4VLP可用作预防HPV33感染、HPV58感染和HPV52感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV33VLP、HPV58 VLP和HPV52 VLP的混合疫苗。
图8A-8D显示了用H33N9-58T5 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图8A：铝佐剂组1(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)；图8B：铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)；图8C：铝佐剂组3(免疫剂量为0.1μg，使用铝佐剂)；图8D：弗氏佐剂组(免疫剂量为1μg，使用弗氏佐剂)。结果显示，H33N9-58T5VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV33的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV33N9 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV58N35 VLP；并其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV58的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV58N35 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV33N9 VLP。这表明，H33N9-58T5 VLP对HPV33和HPV58具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
图8E-8G显示了用H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图8E：铝佐剂组1(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)；图8F：铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)；图8G：铝佐剂组3(免疫剂量为0.1μg，使用铝佐剂)。结果显示，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV33的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV33N9 VLP以及混合的HPV33N9VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV58N35 VLP或单独的HPV52N40 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV58的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV58N35VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV33N9 VLP或单独的HPV52N40VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV52的中和抗体，其保护效果虽然略微弱于单独的HPV52N40 VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP，但仍显著优于同剂量的单独的HPV33N9 VLP或单独的HPV58N35 VLP；这表明，H33N9-58T5-S2 VLP和H33N9-58T5-S4 VLP对HPV33、HPV58和HPV52具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
图9A-9B分别显示了H33N9-58T5 VLP的冷冻电镜观察结果及其重建的三维结构。图9A，H33N9-58T5 VLP的冷冻电镜图像；图9B，H33N9-58T5 VLP的重建的三维结构。重建的三维结构显示，H33N9-58T5 VLP是由72个壳粒(形态亚单位，五聚体)形成的T＝7的二十面体结构(h＝1,k＝2)。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，H33N9-58T5 VLP结构中的所有组成亚单位均为五聚体，而不存在六聚体。并且，该VLP的最外围直径为约60nm。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及通过真核表达系统(例如，痘病毒表达系统)制备的HPV VLP的三维结构(Baker TS,Newcomb WW,Olson NH.et al.Biophys J.(1991),60(6):1445-1456；Hagensee ME,Olson NH,Baker TS,et al.J Virol.(1994),68(7):4503-4505；Buck CB,Cheng N,Thompson CD.et al.J Virol.(2008),82(11):5190-7)类似。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
序列1(SEQ ID NO:1)：
MSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGHPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETGNKYPGQPGADNRECLSMDYKQTQLCLLGCKPPTGEHWGKGVACTNAAPANDCPPLELINTIIEDGDMVDTGFGCMDFKTLQANKSDVPIDICGSTCKYPDYLKMTSEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGTLGEAVPDDLYIKGSGTTASIQSSAFFPTPSGSMVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTLCTQVTSDSTYKNENFKEYIRHVEEYDLQFVFQLCKVTLTAEVMTYIHAMNPDILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTVPPKEKEDPLGKYTFWEVDLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKLKRAAPTSTRTSSAKRKKVKK
序列2(SEQ ID NO:2)：
MVLILCCTLAILFCVADVNVFHIFLQMSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
序列3(SEQ ID NO:3)：
MVQILFYILVIFYYVAGVNVFHIFLQMSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLTVGHPYFSIKNTSSGNGKKVLVPKVSGLQYRVFRIKLPDPNKFGFPDTSFYNPETQRLVWACTGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETSNKYAGKPGIDNRECLSMDYKQTQLCILGCKPPIGEHWGKGTPCNNNSGNPGDCPPLQLINSVIQDGDMVDTGFGCMDFNTLQASKSDVPIDICSSVCKYPDYLQMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGTLGDPVPGDLYIQGSNSGNTATVQSSAFFPTPSGSMVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCAEVKKESTYKNENFKEYLRHGEEFDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHKMDATILEDWQFGLTPPPSASLEDTYRFVTSTAITCQKNTPPKGKEDPLKDYMFWEVDLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLQARPKLKRPASSAPRTSTKKKKVKR
序列4(SEQ ID NO:4)：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGHPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGQPLLNKFDDTETGNKYPGQPGADNRECLSMDYKQTQLCLLGCKPPTGEHWGKGVACTNAAPANDCPPLELINTIIEDGDMVDTGFGCMDFKTLQANKSDVPIDICGSTCKYPDYLKMTSEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGTTASIQSSAFFPTPSGSMVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTLCTQVTSDSTYKNENFKEYIRHVEEYDLQFVFQLCKVTLTAEVMTYIHAMNPDILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTVPPKEKEDPLGKYTFWEVDLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKLKRAAPTSTRTSSAKRKKVKK
序列5(SEQ ID NO:5)：
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序列28(SEQ ID NO:28)：
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序列59(SEQ ID NO:59)：
KEGTYKND
序列60(SEQ ID NO:60)：
SNKYAGKPGI
序列61(SEQ ID NO:61)：
TLGDPVPGDLYIQGSNSGNTATV
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.突变的HPV33 L1蛋白的表达与纯化
表达载体的构建
采用多点突变PCR反应来构建编码含有来源于HPV58 L1蛋白的区段的突变的HPV33 L1蛋白的表达载体，其中，所使用的初始模板为pTO-T7-HPV33L1N9C质粒(其编码N端截短了9个氨基酸的HPV33 L1蛋白；在表2中简写为33L1N9)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。
向扩增产物(50μL)中加入2μL DpnI限制性内切酶，并在37℃温育60min。取10μL酶切产物，用于转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10(所对应的蛋白分别命名为H33N9-58T1，H33N9-58T2-1，H33N9-58T2-2，H33N9-58T2，H33N9-58T3，H33N9-58T4和H33N9-58T5)。
突变蛋白H33N9-58T1与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33L1蛋白第54-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第80-87位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T2与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第118-142位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第144-168位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T3与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第177-183位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第203-209位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T4与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33L1蛋白第266-285位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第292-311位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T5与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基。
采用Gibson装配(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods.2009；6:343 5.doi:10.1038/nmeth.1318)来构建编码双置换的突变的HPV33 L1蛋白的表达载体，所述突变的HPV33 L1蛋白含有来源于HPV58 L1的区段和来源于HPV52 L1的区段。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。所使用的初始模板包括pTO-T7-H33N9-58T5质粒(其编码突变蛋白H33N9-58T5；在表2中简写为H33N9-58T5)，和pTO-T7-HPV52N40C质粒(其编码N端截短了40个氨基酸的HPV52 L1蛋白；在表2中简写为52L1N40)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2X Gibson装配预混试剂(2 X Gibson Assembly MasterMix，购自NEB，包含T5 exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNA ligase)，并在50℃反应1小时。
用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素的固体LB培养基，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQID NO：25、26、27、28，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、12、13、14(所对应的蛋白分别命名为H33N9-58T5-52S1，H33N9-58T5-52S2，H33N9-58T5-52S3，和H33N9-58T5-52S4)。
突变蛋白H33N9-58T5-52S1与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第55-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52 L1蛋白的第81-89位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T5-52S2与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV33L1蛋白第133-142位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52 L1蛋白的第161-170位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T5-52S3与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第174-183位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52L1蛋白的第202-212位的氨基酸残基。突变蛋白H33N9-58T5-52S4与HPV33N9的区别在于：位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV33 L1蛋白第266-286位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52 L1蛋白的第295-317位的氨基酸残基。
表2.用于构建表达载体的PCR反应的模板和引物
表3：所使用的引物的具体序列(SEQ ID NO:29-58)
突变蛋白的大量表达
从-70℃冰箱中取出携带重组质粒pTO-T7-H33N9-58T1、pTO-T7-H33N9-58T2、pTO-T7-H33N9-58T3、pTO-T7-H33N9-58T4、pTO-T7-H33N9-58T5、pTO-T7-H33N9-58T5-52S1、pTO-T7-H33N9-58T5-52S2、pTO-T7-H33N9-58T5-52S3、pTO-T7-H33N9-58T5-52S4的大肠杆菌菌液，分别接种入100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后分别转接入500ml含卡那霉素的LB培养基中(接入1ml菌液)，并继续进行培养。当细菌浓度达到OD600为0.6左右时，将培养温度降至25℃，并向各培养瓶中加入500μL IPTG，继续培养8小时。培养结束后，离心收集菌体。获得表达了H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4蛋白的菌体。
表达突变蛋白的菌体破碎
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。用超声波仪破碎菌体30min。以13500rpm(30000g)离心含有经破碎的菌体的裂解液15min，留取上清(即，菌体破碎上清)。
突变蛋白的色谱纯化
仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SP Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)、CHT-Ⅱ(购自Bio－RAD)和Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)。
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT；以及，20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。
样品：如上获得的含有H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4的菌体破碎上清。
洗脱程序为：
(1)用SP Sepharose 4 Fast Flow对菌体破碎上清进行阳离子交换纯化：将样品上柱，然后用含有400mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有800mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有800mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；
(2)用CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)对前一步获得的洗脱级分进行色谱纯化：对前一步骤获得的洗脱级分进行稀释，以使得NaCl的浓度降至0.5M；将样品上柱，然后用含有500mMNaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；
(3)用HIC(疏水相互作用色谱)对前一步骤获得的洗脱级分进行色谱纯化：将样品上柱，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有200mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有200mM NaCl的缓冲液洗脱的级分。
取步骤(3)获得的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading Buffer中，混匀，并于80℃水浴中温育10min。然后取10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果示于图1中。结果显示，经过上述纯化步骤后，H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4蛋白的纯度大于95％。
通过类似的方法，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV33L1N9C质粒制备和纯化了HPV33N9蛋白；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV52N40C质粒制备和纯化了HPV52N40蛋白；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV58L1N35C质粒(其编码HPV58N35蛋白)制备和纯化了HPV58N35蛋白。
突变蛋白的免疫印迹实验
按上述方法对经纯化的H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4进行电泳。电泳结束后，使用抗HPV L1蛋白的广谱抗体4B3进行Western Blot检测，结果示于图2中。结果显示H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4能够被广谱抗体4B3特异性识别。
实施例2：HPV病毒样颗粒的组装与颗粒形态学检测
HPV病毒样颗粒的组装
取一定体积(约2ml)的蛋白H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4，分别依次透析至(1)2L储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.5M NaCl)；(2)2L复性缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl)；和(3)20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.5M NaCl中。在三种缓冲液中各自进行透析12h。
通过类似的方法，将HPV58N35、HPV33N9和HPV52N40蛋白分别组装为HPV58N35VLP、HPV33N9 VLP和HPV52N40 VLP。
分子筛层析分析
用美国安捷伦公司的1120 Compact LC高效液相色谱系统对经透析的样品进行分子筛层析分析，其中，所使用的分析柱为TSK Gel PW5000xl 7.8x300 mm。分析结果如图3A-3L所示。结果显示，包含蛋白HPV33N9、H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、HPV58N35、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4、HPV52N40的样品最先出现的蛋白峰均在12min左右，与HPV33 VLP、HPV58 VLP和HPV52VLP相当。这表明，如上制备的蛋白均可组装成VLP。
沉降速率分析
沉降速率分析所使用的仪器为Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP、HPV52N40 VLP、H33N9-58T5VLP、H33N9-58T5-52S2 VLP、H33N9-58T5-52S4 VLP的沉降系数。结果如图4A-4F所示。结果显示，H33N9-58T5 VLP、H33N9-58T5-52S2VLP和H33N9-58T5-52S4VLP的沉降系数分别为109S、108S和107S，而HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP的沉降系数分别为133S、118S和131S。这表明，H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S2和H33N9-58T5-52S4组装成大小、形态与野生型VLP相似的病毒样颗粒。
病毒样颗粒的形态学检测
取100μL含有VLP的样品进行透射电镜观察。所使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。简言之，取13.5μL样品，用2％磷钨酸pH7.0进行负染，并固定于喷炭的铜网上，然后进行透射电镜观察。观察结果如图5A-5L所示。结果显示，H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4均可组装成病毒样颗粒。此外，结果还显示，这些突变蛋白所组装形成的颗粒的半径均在30nm左右，大小均一。这表明，这些突变蛋白与HPV33、HPV58和HPV52的L1蛋白类似，能够形成大小均一的VLP。
实施例3：病毒样颗粒的热稳定性的评价
使用购自美国GE公司(原MicroCal公司)的差温量热仪VP Capillary DSC来评价H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4所形成的VLP的热稳定性，其中，使用所述蛋白的储存缓冲液作为对照，并且以1.5℃/min的升温速率在10℃-90℃区间对各蛋白进行扫描。检测结果如图6A-6F所示。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。
实施例4：病毒样颗粒在动物体内的免疫保护性的评价1
使用小鼠来评价由H33N9-58T1、H33N9-58T2、H33N9-58T3、H33N9-58T4、H33N9-58T5、H33N9-58T5-52S1、H33N9-58T5-52S2、H33N9-58T5-52S3、H33N9-58T5-52S4形成的VLP的免疫保护性。用于免疫接种的动物为，5-6周龄BalB/c普通级小鼠(购自上海斯莱康实验动物有限公司)。
将如上制备的H33N9-58T1 VLP、H33N9-58T2 VLP、H33N9-58T3VLP、H33N9-58T4VLP、H33N9-58T5 VLP、HPV33N9 VLP与HPV58N35VLP分别吸附于弗氏佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为7组，每组包含3只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为皮下注射，所使用的免疫原与剂量如表4所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图7A所示。结果显示，H33N9-58T5 VLP可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV33和HPV58的中和抗体；并且其针对HPV33的保护效果与单独的HPV33N9VLP相当，且显著高于单独的HPV58N35 VLP；并且其针对HPV58的保护效果与单独的HPV58N35 VLP相当，且显著高于单独的HPV33N9VLP。这表明，H33N9-58T5 VLP可用作预防HPV33感染和HPV58感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV33 VLP和HPV58 VLP的混合疫苗。
表4.免疫方案
免疫抗原 佐剂 免疫剂量 数量 免疫程序(周)
HPV33N9 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
HPV58N35 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
H33N9-58T1 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
H33N9-58T2 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
H33N9-58T3 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
H33N9-58T4 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
H33N9-58T5 VLP 弗氏佐剂 100μg 3 0、2、4
另外，将如上制备的H33N9-58T5-52S1 VLP、H33N9-58T5-52S2VLP、H33N9-58T5-52S3 VLP、H33N9-58T5-52S4 VLP、HPV33N9 VLP、HPV52N40 VLP、HPV58N35 VLP和混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP(即，混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP)分别吸附于铝佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为8组，每组包含4只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为腹腔注射，所使用的免疫原与剂量如表5所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图7B所示。结果显示，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV33、HPV58和HPV52的中和抗体；并且其针对HPV33的保护效果与单独的HPV33N9 VLP、混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP相当，且显著高于单独的HPV58N35 VLP和单独的HPV52N40 VLP；并且其针对HPV58的保护效果与单独的HPV58N35 VLP、混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP相当，且显著高于单独的HPV33N9 VLP和单独的HPV52N40 VLP；并且其针对HPV52的保护效果虽然略微弱于单独的HPV52N40 VLP、混合的HPV33/HPV58/HPV52 VLP，但仍然显著高于单独的HPV33N9 VLP和单独的HPV58N35 VLP。这表明，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP可用作预防HPV33感染、HPV58感染和HPV52感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV33 VLP、HPV58 VLP和HPV52 VLP的混合疫苗。
表5.免疫方案
免疫抗原 佐剂 免疫剂量 数量 免疫程序(周)
HPV33N9 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
HPV52N40 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
HPV58N35 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
H33N9-58T5-52S1 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
H33N9-58T5-52S2 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
H33N9-58T5-52S3 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
H33N9-58T5-52S4 VLP 铝佐剂 5μg 4 0、2、4
HPV33/HPV58/HPV52 VLP 铝佐剂 每种VLP各5μg 4 0、2、4
实施例5：病毒样颗粒在动物体内的免疫保护性的评价2
H33N9-58T5 VLP的ED50
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H33N9-58T5 VLP，对照组使用单独的HPV33N9 VLP或单独的HPV58N35 VLP；免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg；免疫体积为1mL。在免疫后第五周，抽取眼球静脉血，对血液中的HPV抗体进行检测，并通过Reed-Muench法(Reed LJ MH.A simplemethod of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)来计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED50。结果如表6-8所示。
表6.HPV33N9 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58抗体的ED50
表7.H33N9-58T5 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58抗体的ED50
表8.HPV58N35 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58抗体的ED50
结果显示，在免疫小鼠5周后，H33N9-58T5 VLP诱导小鼠产生抗HPV33的ED50与单独的HPV33N9 VLP相当，且显著优于单独的HPV58N35 VLP；并且，其诱导小鼠产生抗HPV58的ED50与单独的HPV58N35 VLP相当，且显著优于单独的HPV33N9 VLP。这表明，H33N9-58T5 VLP对HPV33和HPV58具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP的ED50
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H33N9-58T5-52S2 VLP或H33N9-58T5-52S4 VLP(免疫剂量为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)；对照组使用单独的HPV33N9 VLP、单独的HPV58N35VLP或单独的HPV52N40 VLP(免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)，或者混合的HPV33N9VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP(每种VLP的免疫剂量各为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)；免疫体积为1mL。在免疫后第五周，抽取眼球静脉血，对血液中的HPV抗体进行检测，并通过Reed-Muench法(Reed LJ MH.A simple methodof estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)来计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED50。结果如表9-14所示。
表9.HPV33N9 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58和抗HPV52抗体的ED50
表10.HPV58N35 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58和抗HPV52抗体的ED50
表11.HPV52N40 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58和抗HPV52抗体的ED50
表12.混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58和抗HPV52抗体的ED50
表13.H33N9-58T5-52S2 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58和抗HPV52抗体的ED50
表14.H33N9-58T5-52S4 VLP诱导小鼠产生抗HPV33、抗HPV58和抗HPV52抗体的ED50
结果显示，在免疫小鼠5周后，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP诱导小鼠产生抗HPV33抗体的ED50与单独的HPV33N9VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于单独的HPV58N35 VLP以及单独的HPV52N40 VLP；并且，其诱导小鼠产生抗HPV58抗体的ED50与单独的HPV58N35 VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于单独的HPV33N9 VLP以及单独的HPV52N40VLP；并且，其诱导小鼠产生抗HPV52抗体的ED50与单独的HPV52N40 VLP以及混合的HPV33N9VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于单独的HPV33N9 VLP以及单独的HPV58N35 VLP。这表明，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP对HPV33、HPV58以及HPV52具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
用H33N9-58T5 VLP免疫小鼠后血清中的中和抗体滴度的评价
在本实验中，免疫方案如表15所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为4个组：弗氏佐剂组(免疫剂量为1μg，使用弗氏佐剂)，铝佐剂组1(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)，铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)，和铝佐剂组3(免疫剂量为0.1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为3个亚组，对照亚组1和2分别用单独的HPV33N9 VLP和单独的HPV58N35VLP进行免疫，实验亚组用H33N9-58T5 VLP进行免疫。
对于弗氏佐剂组，采用皮下注射方式免疫6只小鼠/亚组，其中免疫剂量为1μg，注射体积为200μl。对于铝佐剂组1-3，采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量分别为10μg、1μg、0.1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV33和HPV58抗体的滴度。分析结果如图8A-8D所示。结果显示，H33N9-58T5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV33的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV33N9 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV58N35 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV58的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV58N35 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV33N9 VLP。这表明，H33N9-58T5VLP对HPV33和HPV58具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表15.免疫方案
用H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP免疫小鼠后血清中的中和抗体 滴度的评价
在本实验中，免疫方案如表16所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为3个组：铝佐剂组1(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)，铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)，和铝佐剂组3(免疫剂量为0.1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为6个亚组，对照亚组1、2和3分别用单独的HPV33N9 VLP、单独的HPV58N35 VLP和单独的HPV52N40 VLP进行免疫，对照亚组4用混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP进行免疫，实验亚组1和2分别用单独的H33N9-58T5-52S2 VLP和单独的H33N9-58T5-52S4 VLP进行免疫。
对于铝佐剂组1-3，采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量分别为10μg、1μg、0.1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV33、HPV58和HPV52抗体的滴度。分析结果如图8E-8G所示。结果显示，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV33的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV33N9VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV58N35 VLP或单独的HPV52N40 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV58的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV58N35 VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35VLP和HPV52N40 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV33N9 VLP或单独的HPV52N40 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV52的中和抗体，其保护效果虽然略微弱于同剂量的单独的HPV52N40 VLP以及混合的HPV33N9 VLP、HPV58N35 VLP和HPV52N40VLP，但仍显著优于同剂量的单独的HPV33N9 VLP或单独的HPV58N35 VLP。这表明，H33N9-58T5-52S2 VLP和H33N9-58T5-52S4 VLP对HPV33、HPV58和HPV52具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表16.免疫方案
实施例6：H33N9-58T5 VLP的三维结构的重建
通过使用冷冻电镜的三维结构重建实验(Wolf M,Garcea RL,Grigorieff N.etal.Proc Natl Acad Sci U S A.(2010),107(14):6298-303)来重建H33N9-58T5 VLP的三维结构。简而言之，在H33N9-58T5 VLP的冷冻电镜图像中(图9A)选取233个大小均一、直径超过50nm的颗粒进行计算机重叠和结构重建，从而获取H33N9-58T5 VLP的三维结构。所获得的三维结构如图9B所示(分辨率为)。结果显示，H33N9-58T5 VLP是由72个壳粒(形态亚单位，五聚体)形成的T＝7的二十面体结构(h＝1,k＝2)。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，H33N9-58T5 VLP结构中的所有组成亚单位均为五聚体，而不存在六聚体。并且，该VLP的最外围直径为约60nm。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及通过真核表达系统(例如，痘病毒表达系统)制备的HPV VLP的三维结构(Baker TS,Newcomb WW,Olson NH.et al.Biophys J.(1991),60(6):1445-1456；Hagensee ME,Olson NH,BakerTS,et al.J Virol.(1994),68(7):4503-4505；Buck CB,Cheng N,Thompson CD.et al.JVirol.(2008),82(11):5190-7)类似。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学; 厦门万泰沧海生物技术有限公司
<120> 一种人乳头瘤病毒33型L1蛋白的突变体
<130> IDC160018
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 499
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒 33
<400> 1
Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val
1 5 10 15
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser
20 25 30
Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro
35 40 45
Tyr Phe Ser Ile Lys Asn Pro Thr Asn Ala Lys Lys Leu Leu Val Pro
50 55 60
Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp
65 70 75 80
Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr
85 90 95
Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp
115 120 125
Asp Thr Glu Thr Gly Asn Lys Tyr Pro Gly Gln Pro Gly Ala Asp Asn
130 135 140
Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Leu
145 150 155 160
Gly Cys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys
165 170 175
Thr Asn Ala Ala Pro Ala Asn Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn
180 185 190
Thr Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met
195 200 205
Asp Phe Lys Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile
210 215 220
Cys Gly Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Thr Ser Glu
225 230 235 240
Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255
Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Thr Leu Gly Glu Ala Val Pro
260 265 270
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ala Ser Ile Gln Ser
275 280 285
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275 280 285
Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro
290 295 300
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒 52
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atgacagtgt acctgcctcc tgtacctgta tctaaagttg tcagcactga tgagtatgtg 60
tctcgcacaa gcatttatta ttatgctggt agttccagac ttcttgctgt tggccatcca 120
tatttttcta ttaaaaatcc tactaacgct aaaaaattat tggtacccaa agtatcaggc 180
ttgcaatata gggtttttag ggtccgttta ccagatccta ataaatttgg atttcctgac 240
acctcctttt ataaccctga tacacaacga ttagtatggg catgtgtagg cctggagatc 300
ggcaggggcc agcccctggg cgtgggcatc agcggccacc ccctgctgaa caagttcgac 360
gacaccgaga ccagcaacaa gtacgccggc aagcccggca tcgacaacag ggagtgcctg 420
agcatggact acaagcagac ccagctgtgc ttacttggat gtaagcctcc aacaggggaa 480
cattggggta aaggtgttgc ttgtactaat gcagcacctg ccaatgattg tccaccttta 540
gaacttataa atactattat tgaggatggt gatatggtgg acacaggatt tggttgcatg 600
gattttaaaa cattgcaggc taataaaagt gatgttccta ttgatatttg tggcagtaca 660
tgcaaatatc cagattattt aaaaatgact agtgagcctt atggtgatag tttatttttc 720
tttcttcgac gtgaacaaat gtttgtaaga cactttttta atagggctgg taaattagga 780
gaggctgttc ccgatgacct gtacattaaa ggttcaggaa ctactgcctc tattcaaagc 840
agtgcttttt ttcccactcc tagtggatca atggttactt ccgaatctca gttatttaat 900
aagccatatt ggctacaacg tgcacaaggt cataataatg gtatttgttg gggcaatcag 960
gtatttgtta ctgtggtaga taccactcgc agtactaata tgactttatg cacacaggtg 1020
accaaggagg gtacatacaa gaatgacaat tttaaagaat atataagaca tgttgaagaa 1080
tatgatctac agtttgtttt tcaactatgc aaagttacct taactgcaga agttatgaca 1140
tatattcatg ctatgaatcc agatatttta gaagattggc aatttggttt aacacctcct 1200
ccatctgcta gtttacagga tacctatagg tttgttacct ctcaggctat tacgtgtcaa 1260
aaaacagtac ctccaaagga aaaggaagac cccttaggta aatacacatt ttgggaagtg 1320
gatttaaagg aaaaattttc agcagattta gatcagtttc ctttgggacg caagttttta 1380
ttacaggcag gtcttaaagc aaaacctaaa cttaaacgtg cagcccccac atccacccgc 1440
acatcatctg caaaacgcaa aaaggttaaa aaataaa 1477
<210> 27
<211> 1480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H33N9-58T5-52S3
<400> 27
atgacagtgt acctgcctcc tgtacctgta tctaaagttg tcagcactga tgagtatgtg 60
tctcgcacaa gcatttatta ttatgctggt agttccagac ttcttgctgt tggccatcca 120
tatttttcta ttaaaaatcc tactaacgct aaaaaattat tggtacccaa agtatcaggc 180
ttgcaatata gggtttttag ggtccgttta ccagatccta ataaatttgg atttcctgac 240
acctcctttt ataaccctga tacacaacga ttagtatggg catgtgtagg ccttgaaata 300
ggtagagggc agccattagg cgttggcata agtggtcatc ctttattaaa caaatttgat 360
gacactgaaa ccggtaacaa gtatcctgga caaccgggtg ctgataatag ggaatgttta 420
tccatggatt ataaacaaac acagttatgt ttacttggat gtaagcctcc aacaggcgag 480
cactggggca agggcacccc ctgcaacaac aacagcggca accccggcga ctgccccccc 540
ctggaactta taaatactat tattgaggat ggtgatatgg tggacacagg atttggttgc 600
atggatttta aaacattgca ggctaataaa agtgatgttc ctattgatat ttgtggcagt 660
acatgcaaat atccagatta tttaaaaatg actagtgagc cttatggtga tagtttattt 720
ttctttcttc gacgtgaaca aatgtttgta agacactttt ttaatagggc tggtaaatta 780
ggagaggctg ttcccgatga cctgtacatt aaaggttcag gaactactgc ctctattcaa 840
agcagtgctt tttttcccac tcctagtgga tcaatggtta cttccgaatc tcagttattt 900
aataagccat attggctaca acgtgcacaa ggtcataata atggtatttg ttggggcaat 960
caggtatttg ttactgtggt agataccact cgcagtacta atatgacttt atgcacacag 1020
gtgaccaagg agggtacata caagaatgac aattttaaag aatatataag acatgttgaa 1080
gaatatgatc tacagtttgt ttttcaacta tgcaaagtta ccttaactgc agaagttatg 1140
acatatattc atgctatgaa tccagatatt ttagaagatt ggcaatttgg tttaacacct 1200
cctccatctg ctagtttaca ggatacctat aggtttgtta cctctcaggc tattacgtgt 1260
caaaaaacag tacctccaaa ggaaaaggaa gaccccttag gtaaatacac attttgggaa 1320
gtggatttaa aggaaaaatt ttcagcagat ttagatcagt ttcctttggg acgcaagttt 1380
ttattacagg caggtcttaa agcaaaacct aaacttaaac gtgcagcccc cacatccacc 1440
cgcacatcat ctgcaaaacg caaaaaggtt aaaaaataaa 1480
<210> 28
<211> 1483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H33N9-58T5-52S4
<400> 28
atgacagtgt acctgcctcc tgtacctgta tctaaagttg tcagcactga tgagtatgtg 60
tctcgcacaa gcatttatta ttatgctggt agttccagac ttcttgctgt tggccatcca 120
tatttttcta ttaaaaatcc tactaacgct aaaaaattat tggtacccaa agtatcaggc 180
ttgcaatata gggtttttag ggtccgttta ccagatccta ataaatttgg atttcctgac 240
acctcctttt ataaccctga tacacaacga ttagtatggg catgtgtagg ccttgaaata 300
ggtagagggc agccattagg cgttggcata agtggtcatc ctttattaaa caaatttgat 360
gacactgaaa ccggtaacaa gtatcctgga caaccgggtg ctgataatag ggaatgttta 420
tccatggatt ataaacaaac acagttatgt ttacttggat gtaagcctcc aacaggggaa 480
cattggggta aaggtgttgc ttgtactaat gcagcacctg ccaatgattg tccaccttta 540
gaacttataa atactattat tgaggatggt gatatggtgg acacaggatt tggttgcatg 600
gattttaaaa cattgcaggc taataaaagt gatgttccta ttgatatttg tggcagtaca 660
tgcaaatatc cagattattt aaaaatgact agcgagccct acggcgacag cctgttcttc 720
ttcctgagga gggagcagat gttcgtgagg cacttcttca acagggccgg caccctgggc 780
gaccccgtgc ccggcgacct gtacatccag ggcagcaaca gcggcaacac cgccaccgtg 840
cagagcagcg ccttcttccc cacccccagc ggcagcatgg tgaccagcga gagccagctg 900
ttcaacaagc cctactggct gcagagggcc cagggccaca acaacggcat ctgctggggc 960
aaccaggtat ttgttactgt ggtagatacc actcgcagta ctaatatgac tttatgcaca 1020
caggtgacca aggagggtac atacaagaat gacaatttta aagaatatat aagacatgtt 1080
gaagaatatg atctacagtt tgtttttcaa ctatgcaaag ttaccttaac tgcagaagtt 1140
atgacatata ttcatgctat gaatccagat attttagaag attggcaatt tggtttaaca 1200
cctcctccat ctgctagttt acaggatacc tataggtttg ttacctctca ggctattacg 1260
tgtcaaaaaa cagtacctcc aaaggaaaag gaagacccct taggtaaata cacattttgg 1320
gaagtggatt taaaggaaaa attttcagca gatttagatc agtttccttt gggacgcaag 1380
tttttattac aggcaggtct taaagcaaaa cctaaactta aacgtgcagc ccccacatcc 1440
acccgcacat catctgcaaa acgcaaaaag gttaaaaaat aaa 1483
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
atttttctat taaaagccct aacaacaaca aaaaagtgtt ggtacccaaa g 51
<210> 30
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ctttgggtac caacactttt ttgttgttgt tagggctttt aatagaaaaa t 51
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
attaggcgtt ggcgtgagtg gtcatcctta cttaaacaaa tttg 44
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
caaatttgtt taagtaagga tgaccactca cgccaacgcc taat 44
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
gatgacactg aaaccagcaa caggtatcct ggacaac 37
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
gttgtccagg atacctgttg ctggtttcag tgtcatc 37
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
aacaggtatc ctgcccaacc gggtagcgat aatagggaat 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
attccctatt atcgctaccc ggttgggcag gatacctgtt 40
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
gtgttgcttg taataataat gcagctgcca ctgattgtcc acc 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ggtggacaat cagtggcagc tgcattatta ttacaagcaa cac 43
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aaggttcagg aaacaccgcc gttattcaaa gcagt 35
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
actgctttga ataacggcgg tgtttcctga acctt 35
<210> 41
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
gcacacaggt gaccaaggag ggtacataca agaatgacaa ttttaaag 48
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ctttaaaatt gtcattcttg tatgtaccct ccttggtcac ctgtgtgc 48
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
gtccgtttac cagatcctaa t 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
agcaagaagt ctggaactac c 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ttacttggat gtaagcctcc 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
ctgcccatac taatcgttgt gt 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
gaacttataa atactattat tg 22
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
tgttggaggc ttacatcc 18
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
gtatttgtta ctgtggtaga t 21
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
agtcattttt aaataatctg gat 23
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
gctggtagtt ccagacttct tgctgtgggc cacccctact tcagc 45
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
tattaggatc tggtaaacgg accctgaaca ccctgtactg cag 43
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
acgattagta tgggcatgtg taggcctgga gatcggcagg ggc 43
<210> 54
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
ttggaggctt acatccaagt aagcacagct gggtctgctt gtag 44
<210> 55
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
tacttggatg taagcctcca acaggcgagc actggggcaa gggcac 46
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
tcaataatag tatttataag ttccaggggg gggcagtcgc cggggt 46
<210> 57
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
tccagattat ttaaaaatga ctagcgagcc ctacggcgac agcct 45
<210> 58
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
tatctaccac agtaacaaat acctggttgc cccagcagat gccg 44
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒 58
<400> 59
Lys Glu Gly Thr Tyr Lys Asn Asp
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒 52
<400> 60
Ser Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile
1 5 10
<210> 61
<211> 23
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒 52
<400> 61
Thr Leu Gly Asp Pro Val Pro Gly Asp Leu Tyr Ile Gln Gly Ser Asn
1 5 10 15
Ser Gly Asn Thr Ala Thr Val
20

Claims (24)

1.一种突变的HPV33 L1蛋白，其中，所述突变的HPV33 L1蛋白与野生型HPV33 L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)N端截短了9个、11个、14个或19个氨基酸；和
(2)位于野生型HPV33 L1蛋白第350-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV58的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
2.权利要求1所述的突变的HPV33 L1蛋白，其中，所述突变的HPV33 L1蛋白还具有下述突变：
(3)位于野生型HPV33 L1蛋白第133-142位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(4)位于野生型HPV33 L1蛋白第266-286位的氨基酸残基被替换为野生型HPV52的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
3.权利要求1所述的突变的HPV33 L1蛋白，其中，(2)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV58 L1蛋白第376-383位的氨基酸残基。
4.权利要求2所述的突变的HPV33 L1蛋白，其中，(3)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV52 L1蛋白第161-170位的氨基酸残基；和/或，(4)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV52 L1蛋白第295-317位的氨基酸残基。
5.权利要求1-4任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白，其具备以下特征中的一项或多项：
(1)所述野生型HPV33 L1蛋白如SEQ ID NO:1所示；
(2)所述野生型HPV58 L1蛋白如SEQ ID NO:2所示；
(3)所述野生型HPV52 L1蛋白如SEQ ID NO:3所示。
6.权利要求1-4任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白，其中，所述突变的HPV33 L1蛋白由选自下列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:10、12和14。
7.一种分离的核酸，其编码权利要求1-6任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白。
8.包含权利要求7所述的分离的核酸的载体。
9.包含权利要求7所述的分离的核酸和/或权利要求8所述的载体的宿主细胞。
10.一种HPV病毒样颗粒，其含有权利要求1-6任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白，或者由权利要求1-6任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白组成。
11.一种组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白，或权利要求7的分离的核酸，或权利要求8的载体，或权利要求9的宿主细胞，或权利要求10的HPV病毒样颗粒。
12.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求10的HPV病毒样颗粒，以及药学可接受的载体和/或赋形剂。
13.权利要求12所述的药物组合物或疫苗，其中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。
14.权利要求12所述的药物组合物或疫苗，其中，所述HPV感染是HPV33感染、HPV58感染和/或HPV52感染。
15.权利要求12所述的药物组合物或疫苗，其中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
16.制备权利要求1-6任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV33 L1蛋白，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV33L1蛋白。
17.权利要求16所述的方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
18.权利要求17所述的方法，其中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV33 L1蛋白，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV33 L1蛋白。
19.权利要求18所述的方法，其中，通过色谱法从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV33 L1蛋白。
20.权利要求19所述的方法，其中，所述色谱法选自阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱。
21.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求10的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
22.权利要求1-6任一项所述的突变的HPV33 L1蛋白或权利要求10的HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。
23.权利要求22所述的用途，其中，所述HPV感染是HPV33感染、HPV58感染和/或HPV52感染。
24.权利要求22所述的用途，其中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
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