CN102552897B

CN102552897B - 一种宫颈癌预防性vlp疫苗

Info

Publication number: CN102552897B
Application number: CN 201210015614
Authority: CN
Inventors: 安鸿; 尹海滨
Original assignee: SOUTHERN CHINA UNITED VACCINE INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: Guangdong Southern China vaccine Limited by Share Ltd
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-01-18
Also published as: CN102552897A

Abstract

本发明公开了一种宫颈癌预防性VLP疫苗，VLP是HPV18型、52型、58型L1蛋白的环部位插入1个16型的E7表位而得到的嵌合蛋白的聚集体。本发明的疫苗可以高效地诱导抗多种抗高危型HPV病毒的中和抗体，免疫效果好，免疫时间长。

Description

一种宫颈癌预防性VLP疫苗

技术领域

本发明涉及一种用于诱导抗高危型人乳头瘤病毒的疫苗。

背景技术

人乳头瘤病毒（HPV）是小型DNA病毒，存在100个以上的基因型，其中有15个基因型（高危型：16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73型）是子宫颈癌的原因。HPV16型在50-60%的子宫颈癌中被检出。在欧美以18型居多，在亚洲以16、58型居多。

HPV病毒壳体为正20面体骨架上具有12分子的L2蛋白质的结构，所述正20面体骨架由72个L1蛋白质五聚体形成。L2蛋白质的两端位于病毒壳体的内部，而其N末端侧的一部分露出在壳体表面。如果采用重组DNA技术仅使L1蛋白质大量表达，则会产生病毒样颗粒（Virus-like particle；VLP）。实验证实，如果将牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒的VLP或L2蛋白质接种于动物，则会对病毒侵染表现出抵抗性。

目前尚没有可供HPV增殖的培养细胞系。为了监测HPV的感染，制作了假病毒。在表达SV40T抗原的人293细胞中导入具有SV40复制起点的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒、以及L1和E7蛋白质表达质粒，则复制的SEAP表达质粒组入L1/E7-病毒样颗粒，从而形成了感染性假病毒。可以通过抑制假病毒的感染性的活性来测定中和抗体（Rose,R.C.,Bonnez,W.,Reichman,R.C.,Garcea,R.L.,1993.Expression of human papillomavirus type11L1protein in insect cells:in vivo and in vitro assembly of virus-like particles.J.Virol.67,1936–1944）。

将HPV的VLP接种于动物而得到的抗血清具有基因型特异性的中和活性（Chen,X.S.,Garcea,R.L.,Goldberg,I.,Casini,G.,Harrison,S.C.,2000.Structure of small virus-like particulesassembled from the L1protein of human papillomavirus16.Mol.Cell5,557–567；Harper,D.M.,etal.:Sustained efficacy up to4.5years of abivalent L1virus-like particle vaccine against humanpapillomavirus type16and18:follow up from a randomized control trial.Lancet367(9518),1247-1255）。基于此，Merck公司开发出了HPV16、18型VLP的混合疫苗。这些疫苗在大规模临床实验中显示出基因型特异性的感染预防效果，Merck公司的疫苗于2006年取得了FDA和欧洲委员会的认证并上市销售。

但是，如上述，如果用HPV的L1-病毒壳体免疫动物，则会诱导出相应型病毒基因特异性的免疫应答。如使用16型L1-病毒壳体疫苗进行的临床实验的中间成绩显示对16型的感染的预防有效性，但也显示对于其它基因型基本没有预防效果。

在15个高危HPV群体中，现在销售的HPV疫苗仅对16型和18型有效。因为VLP诱导基因型特异性的中和抗体，为了针对全部高危HPV群，必须使用15种VLP的鸡尾酒，以此作为实用性疫苗抗原是困难的。因此，希望开发诱导交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。

WO2007/018049公开的抗原是至少能够抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其使用的感染性假病毒仅为16、18型，相对于这些感染性假病毒，WO2007/018049使用的抗原显示了良好的中和活性。而本申请发明人在后续的实验中发现，WO2007/018049公开的抗原对本发明人新开发的52、58型的感染性假病毒的中和活性并不高。

为了用疫苗预防子宫颈癌的发生，至少必须开发出能够抵抗所有高危型病毒的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以对抗多种高危型HPV病毒的疫苗。

本发明所采取的技术方案是：

一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV18型、52型或58型的L1蛋白的140与141位之间插入HPV16型的E7表位而得到，其中，E7表位为MLDLQPETT（SEQ ID NO：1）、RAHYNIVTF（SEQ ID NO：2）、LLMGTLGIV（SEQ ID NO：3）、TLGIVCPI（SEQ ID NO：4）中的至少一种。

聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。优选的，五聚体病毒壳粒的个数为60～85个。

疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位，优选的，含有4种E7表位。

疫苗还含有可接受的药用辅料。

本发明的有益效果是：

本发明的疫苗，可以高效地诱导抗多种抗高危型HPV病毒的中和抗体，免疫效果好，免疫时间长。

具体实施方式

一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV18型、52型或58型的L1蛋白的140与141位之间插入HPV16型的E7表位而得到，其中，E7表位为MLDLQPETT（SEQ ID NO：1）、RAHYNIVTF（SEQID NO：2）、LLMGTLGIV（SEQ ID NO：3）、TLGIVCPI（SEQ ID NO：4）中的至少一种。

在本发明中，从蛋白质的氨基末端起依次对氨基酸残基进行编号，例如第50号位的氨基酸记作氨基酸50。本发明中HPV18型、52型或58型L1蛋白的序列分别如SEQ IDNO：5～7所示。

为了制作本发明的嵌合蛋白质而插入L1蛋白质的人乳头瘤病毒16型的E7表位序列为：

MLDLQPETT（以下简称12-20E7表位）

RAHYNIVTF（以下简称49-57E7表位）

LLMGTLGIV（以下简称82-90E7表位）或

TLGIVCPI（以下简称86-93E7表位）。

12-20E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸12-20区域的9个氨基酸构成。49-57E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸49-57区域的9个氨基酸构成。82-90E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸82-90区域的9个氨基酸构成。86-93E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸86-93区域的8个氨基酸构成。

HPV的基因型多，因而，通常以HPV16、HPV58等表示方式将其基因型一并表示出来。在本文中，类似将HPV16型的L1-病毒壳体表述为16L1-病毒壳体。

如前述，HPV粒子中，72个由5个分子的L1蛋白质聚集而成的病毒壳粒聚集在一起形成正20面体的病毒壳体。如果使L1蛋白质在细胞中高表达，则L1蛋白质集中在核内，并自主性的形成病毒壳体。仅由L1蛋白质形成的病毒壳体称为L1-病毒壳体或病毒样颗粒（virus-like particle：VLP）。如果使L1蛋白质和E7蛋白质同时表达，则12个分子的E7蛋白质会组入L1-病毒壳体，从而形成L1/E7-病毒壳体（或L1/E7-VLP）。L1-病毒壳体与L1/E7-病毒壳体无法用电子显微镜辨别。

天然型VLP通常由360个分子的L1蛋白质形成，这种情况下，每个粒子具有360个交叉反应性表位。使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16E7蛋白质的氨基酸12～20、49～57、82～90、86～93的序列插入HPV18型、52型、58型L1蛋白质的氨基酸140/141之间而VLP，电子显微镜照片显示各嵌合蛋白形成了VLP粒子，分别命名为Ch12/20、Ch49/57、Ch82/90、Ch86/93。

疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位，优选的，含有4种E7表位。这可以获得更多的交叉中各反应，使得该疫苗可以对抗更多的高危型HPV。

疫苗还含有可接受的药用辅料。

将E7表位对应的核酸序列插入到相应的L1蛋白基因中的对应位置，之后将得到的核酸序列插入表达载体中表达，即可得到相应的嵌合蛋白。

下面结合实施例，进一步说明本发明。

兔肽抗血清的制作：

对2只新西兰兔（2.5kg～3.0kg）进行了免疫。所使用的抗原是化学合成的肽与KLH（keyhole limpet hemocyanin）相结合而得到的。首次致敏是将0.5mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。首次施用2周后将0.25mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。而且，在2周后、4周后、6周后同样（0.25mg）地进行致敏，共计进行5次致敏。在末次致敏1周后，采集全血，得到了血清。

采用以下所示的中和实验，考察了用具有HPV16型E7-表面区域的氨基酸序列的合成兔肽兔而得到的抗血清。结果如表1所示。由表1所示的结果可知：氨基酸12-20、49-57、82-90、86-93区域中存在交叉反应性表位。

中和实验：

1)中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板中播种10000个/孔的293FT细胞（购自Invitrogen公司）；

2)用Neautralization Buffer(在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酸、10mM HEPES而得到)稀释血清，并与感染性假病毒相混合，4℃反应1小时，再将其添加于前一天播种的293FT细胞；

3)培养约72小时后，回收上清20μl,采用Roden等的方法（参照http://home.ccr.cancer.gov/lco/colorimetricSEAP.htm）测定碱性磷酸酶活性。

表1、抗E7肽抗体中和活性

病毒壳体抗原的制作方法：

1)嵌合基因和合成：

(1)利用从Genebank里面调取的HPV18型、52型、58型L1蛋白质已知基因序列，进行全序列合成得到L1基因，设计HPV18型、52型、58型L1特异性引物扩增L1全长基因。为了便于目的基因克隆到杆状病毒供体质粒上，在上、下游引物中分别引人了BamHI和EcoRI限制性酶切位点识别核苷酸序列，利用PCR技术进行扩增，将回收的HPV18型、52型、58型L1PCR产物与pGEM--T载体连接后经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取阳性克隆质粒，同时将阳性克隆中的HPV16型、18型、52型、58型L1序列进行测序；

(2)合成HPV16型E7相应表位蛋白基因片段，并通过重组PCR技术进行扩增，并与HPV16型、18型、52型、58型L1基因进行嵌合，形成HPV18L1/E7、HPV52L1/E7、HPV58L1/E7嵌合基因，将回收的PCR产物与pGEM--T载体连接后经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取阳性克隆质粒，同时将阳性克隆中的序列进行测序。

2)供体质粒的构建：

(1)将HPV18Ll/E7、HPV52Ll/E7、HPV58Ll/E7阳性克隆质粒经BamHI和EcoRI酶切后，回收HPV18Ll/E7、HPV52Ll/E7、HPV58Ll/E7DNA片段，与经BamHI和EcoRI酶切的pFASTBacHTb质粒连接，反应过程为：

(2)HPV18Ll/E7DNA8μL,2倍T4连接Buffer10μL,T4连接酶1μL,pFASTBacHTb1μL，4℃连接过液，将连接物转化至DH5α，提取pFASTBacHTb-HPV18L1供体质粒，备用；

(3)HPV52Ll/E7DNA8μL,2倍T4连接Buffer10μL,T4连接酶1μL,pFASTBacHTb1μL，4℃连接过液，将连接物转化至DH5α，提取pFASTBacHTb-HPV52L1供体质粒，备用；

(4)HPV58Ll/E7DNA8μL,2倍T4连接Buffer10μL,T4连接酶1μL,pFASTBacHTb1μL，4℃连接过液，将连接物转化至DH5α，提取pFASTBacHTb-HPV58L1供体质粒，备用。

3)供体质粒与DH10BAC菌的转座反应：

(1)制备Luria平板：称取Luria培养基适量，8磅高压后，凉至55℃时，加人以下成分:卡那霉素80μg/mL，庆大霉素20μg/mL，四环素20μg/mL,IPTG60μg/mL,X—gal100μg/mL，制平板；

(2)DH10BAC感受态的制备：挑取大肠杆菌DH10BAC单个菌落，接种于含10μg/mL氨苄青霉素和7μg/mL庆大霉素的LB培养液中，37℃培养过夜，次日，按1%的量接种于同样的LB中，37℃培养至光密度值A600约为0.4时，取出冰浴l0min,4℃，离心，收集菌体，用冰浴的TSS(含10%PEG,20mM MgCl2,5%DMSO的LB8.5mL)悬浮，分装，-70℃冰箱冻存；

(3)转座反应：取出冻存的DH10BAC感受态，置冰上融化，加5μL重组供体质粒，轻弹管壁混匀，冰浴30min,42℃90sec，取出，冰浴2min，加入900μL的SOC培养基至转化物中，37℃慢摇培养4h。对培养物做10-1,10-2`,10-3系列稀释(即100μL的转座培养物加900μL的SOC培养基，依次类推)。每个稀释度各取100μL，加于Luria平板上，涂匀，37℃培养36-48小时至蓝及白斑出现；

(4)重组Bacmid DNA提取：挑取上述平板上的白色菌落3～4个，分别再在Luria平板划线培养过夜，挑取仍为白斑的菌落，加入5mL的LB(含80μg/mL卡那霉素，20μg/mL庆大霉素，50μg/mL四环素)中，37℃振摇培养24h。取1.5mL的培养物，离心，收集菌体，沉淀中加入0.3mL溶液1(15mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA.100μg/mL RNase A)悬浮菌体，加人0.3mL溶液11(0.2M NaOH,l%SDS)混匀，室温放置5min，加人0.3mL3M pH5.5醋酸钾，混匀，冰浴5-10min,14000g离心10min，取上清，加人0.8m1的异丙醇，混匀，冰浴5-10min,14000g离心15min，沉淀用70%的乙醇洗后，离心，沉淀室温干燥，溶于40μL的PH8.0TE中。

4)培养：

(1)细胞转染：Sf9细胞培养采用含10%胎牛血清和双抗(50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素)的SFM培养基(Grace培养基中含酵母提取物5.3g/L，水解乳蛋白4.3g/L)中27℃培养。细胞生长液为含10%胎牛血清的SFM培养基；细胞维持液为含2%胎牛血清的SFM培养基。转染前24h将细胞传至6孔板中，待细胞长至约70%丰度时进行转染。转染在无血清无抗生素的SFM培养液中进行，反应体系如下：A液:取重组Bacmid DNA10μL，与100μL的无血清无抗生素的SFM混合。B液:取7μL的细胞脂质体CELLFECTIN，与100μL无血清无抗生素的SFM混合。将上述A液与B液混合，轻弹管壁混匀，室温下放置40min。用无血清无抗生素的SFM培养液洗细胞2次，将上述A液与B液的混合物加至Sf9细胞中，每孔补加0.8mL的无血清无抗生素的SFM,27℃孵育5h，将转染液移去，换为2%的细胞维持液，27℃培养72h；

(2)重组杆状病毒的收获和繁殖：细胞转染72h后，收获转染上清至无菌管中，此即为含重组杆状病毒的原代毒种。Sf9细胞大量传代，选取24h后生长成90%丰度的细胞，弃细胞生长液，接种0.1ml的原代毒，加人2%细胞维持液，27℃培养72h，收取上清，此即为2代毒种，按同样的方法收获3代毒种，2代毒与3代毒的细胞留做鉴定用。Sf9细胞大量繁殖、传代，接种3代毒种后，收获大量接毒后的Sf9细胞；

(3)重组杆状病毒的PCR鉴定：收集2代和3代毒接种后的Sf9细胞于无菌管中，用酚:氯仿法提取细胞DNA，酒精沉淀，干燥后溶于20μL去离子水中，作为PCR鉴定的模板。PCR反应条件同上。反应结束后，取5μL经1%的琼脂糖电泳鉴定；

(4)HPV16L1表达蛋白的鉴定：1）SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳-收集3代毒接种后的Sf9细胞，1500g离心5min，收集细胞沉淀，加l×电泳加样缓冲液，100℃变性5min，电泳采用12%的分离胶和5%的成层胶。开始电泳电压8V/cm，行至分离胶后电压加大到15V/cm。电泳结束后染色、脱色；2）蛋白印迹反应(Western一blot)-SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白质直接电转移至硝酸纤维素滤膜上，电转结束后用丽春红染液染色观察是否转膜完全。5%脱脂奶室温封闭2h后，加人HPV16Ll或HPV18Ll或HPV52Ll或HPV58Ll单抗，平缓摇动2h,,PBS洗膜3次，加人辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，平缓摇动2h。PBST洗膜3次。在9mL的10mmol/L Tris-Cl(PH7.5)溶液中溶解6mg的二氨基联苯胺，加人10μL30%过氧化氢，混匀后将膜加入，观察反应过程，至蛋白带的颜色深度达到要求。

5)纯化：

(1)层析柱的处理：1）3～5倍柱体积去离子水冲洗柱子，流速为0.2mL/min；2）2～3倍柱体积0.2mol/L硫酸镍过柱，流速为0.2mL/min；3）3～5倍柱体积去离子水冲洗柱子，流速为0.2mL/min；4）3～5倍柱体积15%乙醇冲洗柱子，流速为0.2mL/min；取30%Ni-NTA Agarose适量至离心管中，1500g离心5min，用10倍体积的Buffer A(20mM Tris-Cl PH8.5,300mM KCl,10mMm咪唑，5mM2-琉基乙醇,10%甘油，8M尿素)平衡，备用；

(2)样品制备：用3代毒种大量接种Sf9细胞，72h收毒，细胞沉淀用6M PH7.8盐酸胍溶解，水浴2h,4000g离心，收集上清，上清用1mL注射器吹打后备用；

(3)表达蛋白的纯化：将制备好的细胞上清加至平衡好的层析柱中，4℃磁力搅拌器搅拌过夜，4000g离心5min，收集沉淀。用离心的方法经Buffer A液(20mM Tris-Cl PH8.5,500mMKC1,20mM咪唑,5mM2-琉基乙醇,10%甘油，8M尿素)、Buffer B液(20mM Tris-Cl pH8.5,1M KCl,5mM2-琉基乙醇,10%甘油，8M尿素),Buffer C液(20mM Tris-Cl PH8.5,100mMKCl,100mM咪唑，5m M2-琉基乙醇，10%甘油，8M尿素)分别依次洗脱，如下:10倍柱体积的Buffer A洗脱，去上清，7次；2倍柱体积的Buffer B洗脱，去上清，3次；2倍柱体积的Buffer A洗脱，去上清，2次；与镍柱等体积的Buffer C洗脱表达蛋白，保留上清，反复洗脱5次；

(4)纯化蛋白的鉴定：将每次洗脱的蛋白各取15μL，与等量的2×电泳加样缓冲液混合，经SDS-PAGE电泳，一部分经考马斯亮蓝染色，观察纯化情况，另一部分转膜，进行Western blot鉴定。

以HPV18型L1/E7为例：通过上述病毒壳体抗原的制作方法，使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16E7蛋白质的氨基酸12～20、49～57、82～90、86～93的序列插入HPV16L1蛋白质的氨基酸140/141间而得到的嵌合蛋白质，制作了嵌合VLP，分别命名为：Ch12/20、Ch49/57、Ch82/90、Ch86/93。电子显微镜照片显示各嵌合VLP形成了粒子。在以这些嵌合VLP作为抗原的ELISA中显示：针对插入表位的抗体特异性地结合，表位被呈递在VLP表面。结果如表2所示。

表2、抗E7-肽抗体与嵌合VLP的结合

其中，各肽抗原用血清1:500稀释，HPV18L1VLP用血清1：2000稀释用上述嵌合VLP免疫兔，得到抗血清。抗血清的制备与前述的方法相同（但嵌合病毒壳体的1次施用量为50μg，施用TiterMax(美国TiterMax公司生产)作为佐剂）。在以与交叉反应性表位具有相同序列的合成肽作为抗原的ELISA中，各抗血清与插入表位特异性地反应。结果如表3所示。86/93的肽容易凝集，在ELISA平板上的结合量少，因而与其它2个的结果相比，显示低效价。

表3、抗嵌合VLP抗体（血清）与E7肽的结合

表中的数值为ELISA中的吸光度，其中，各肽抗原用血清1：500稀释，HPV18L1VLP用血清1：2000稀释。

感染性假病毒制作

1)对于293FT细胞，使用HPV18L1蛋白质表达质粒、HPV18E7蛋白质表达质粒、分泌型碱性磷酸酶表达质粒通过Fugene HD进行了转染。转染72小时后，回收细胞；

2)将回收的细胞悬浮于洗涤剂缓冲液（Detergent buffer）（含0.5%Briji58,0.5%Benzonase,1%ATP依赖性质粒安全外切核酸酶C（1%ATP dependentplasmid safe exonucleaseC）的D-PBS（CaCl₂1mM,MgCl₂10mM））中，37℃静置一夜；

3)4℃、静置10分钟后，添加5M NaCl使得NaCl终浓度为850mM；

4)1500g离心10分钟，回收上清；

5)将回收的上清加载27%，33%，39%的optiprep(AXIS-SHIELD PoCAS制造)溶液（用PBS稀释）之上，50000rpm、16℃超离心3小时

6)超离心后，从底面对级分进行回收，一次回收约300μl，将效价最高的级分作为感染性假病毒级分用于感染实验。

中和实验

1)中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板上播种10000个/孔的293FT细胞（购自Invitrogen公司）；

2)用Neautralization Buffer（在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酸、10mM HEPES而得）稀释血清，并与感染性假病毒混合，4℃反应1小时，将其添加于前一天播种的293FT细胞；

3)培养约72小时后，回收上清20μl，采用Roden等的方法测定碱性磷酸酶活性。

采用上述方法，考察了HPV16、18、31、35、52、58型假病毒的中和活性。结果如表4所示。抗Ch12/20的抗体中和了16、18、31型，抗Ch49/57的抗体中和了全部的6个类型，抗Ch82/90的抗体中和了16、18、31、58型，抗Ch86/93的抗体中和了16、18、31、52型。作为比较的抗HPV16VLP中和了16、31、35型。

表4、抗-嵌合VLP血清对HPV16，18，31，35，52，58中和中和效价

<110> 广东华南联合疫苗开发院有限公司

<120> 一种宫颈癌预防性VLP疫苗

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒（HPV）16型E7蛋白

<400> 1

Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒（HPV）16型E7蛋白

<400> 2

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒（HPV）16型E7蛋白

<400> 3

Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒（HPV）16型E7蛋白

<400> 4

Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile

1 5

<210> 5

<211> 472

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒（HPV）18型L1蛋白

<400> 5

Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro

1 5 10 15

Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro

35 40 45

Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys

50 55 60

Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro

65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln

85 90 95

Arg Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro

100 105 110

Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg

130 135 140

Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly

145 150 155 160

Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys

165 170 175

Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn

180 185 190

Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe

245 250 255

Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro

260 265 270

Gln Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser

275 280 285

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Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn

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Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

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Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val

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Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu

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Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu

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Claims

1.一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV 18型、52型或58型的L1蛋白的140与141位之间插入HPV 16型的E7表位而得到，其中，E7表位为MLDLQPETT（SEQ ID NO：1）、RAHYNIVTF（SEQ ID NO：2）、LLMGTLGIV（SEQ ID NO：3）、TLGIVCPI（SEQ ID NO：4）中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。

3.根据权利要求2所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为60～85个。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：所述疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位。

5.根据权利要求4所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：所述疫苗的聚集体中，含有4种E7表位。

6.根据权利要求1所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：所述疫苗还含有可接受的药用辅料。