CN108586607A - 抗hpv16 l1蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。公开该抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体及其重链可变区和轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。设计了所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法。将所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体在免疫学检测、抗原或抗体检测试剂盒中应用。该抗HPV16 L1蛋白的单克隆抗体能够特异性识别HPV16这一主要的流行亚型，与HPV16假病毒以及HPV16 L1蛋白都具有良好的反应性，与其他亚型的L1蛋白没有交叉反应。为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体和进行HPV不同亚型病原的临床检测研究奠定了良好的基础。

Description

抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域，具体涉及一种抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是无包膜的、20面体双链闭合环状DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，可以通过性接触、皮肤接触和阴道分娩的微创伤口而感染，引起相应部位上皮组织的增生性病变。
HPV病毒衣壳由主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）组成。其中，L2蛋白为次要衣壳蛋白是高度可变核蛋白，反映HPV抗原的多态性。而L1蛋白是HPV病毒的主要衣壳蛋白，约占病毒蛋白总量的80%，为高度保守的糖蛋白，分子量为55～60kDa，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依据。其中，HPV16是国际公认的感染率最高的一个亚型。按感染部位分类， HPV16归类为黏膜型病毒；按发癌性分类，HPV16归类为高危型病毒。在HPV16 L1蛋白中共有12个相对保守的半胱氨酸（cysteine，Cys，C）残基，其中Cys175与Cys428在所有HPV亚型中都很保守，二者间形成链内的二硫键，参与病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）的形成及病毒粒子稳定性的维持。
研究显示体外表达的HPV L1蛋白可自组装成VLPs结构。这种体外组装的VLPs结构与55 nm的天然的HPV病毒结构没有什么差别，经免疫后可诱导机体产生型别特异性中和抗体，可有效保护机体免受同型病毒的感染，因此这种基于VLPs结构的疫苗常用于预防HPV病毒感染。因此，HPV L1蛋白是研究HPV VLPs疫苗的关键，快速、特异、敏感的L1蛋白检测方法对研究HPV VLPs疫苗具有重要的意义。
目前检测HPV的方法主要有免疫组化、分子杂交、PCR等。由于HPV基因在体内以游离体或整合于宿主染色体的整合形式存在，上述形式下均无或仅有少量的外壳蛋白存在，因此在病变组织中很难分离到HPV的天然病毒，因此HPV病毒抗原蛋白的检测在临床上很难得到应用。
而HPVL1蛋白检测技术的相关研究也相对较滞后。目前市场上的抗HPV16L1蛋白的单抗用ELISA及Western Blot检测显示与其他亚型HPV的L1蛋白都有交叉反应。
因此，目前亟需制备出一种可以同时用ELISA、Western Blot等检测方法特异性识别HPV16亚型的L1蛋白的单克隆抗体，进而确定其重链可变区序列和轻链可变区序列以改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体，以期进一步提升抗体的特异性和亲和力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，为基于HPV L1蛋白的疫苗研制提供便利；公开了一种制备抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的方法，该方法简单便捷；并将抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体在在免疫学检测中应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
筛选一种抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，其重链可变区DNA序列为如SEQ ID NO.1所示的序列；其重链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示的序列，或在所述SEQ ID NO.2序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列；和/或
其轻链可变区DNA序列为如SEQ ID NO.3所示的序列；其轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.4所示的序列，或在所述SEQ ID NO.4序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。
优选的，所述单克隆抗体的轻链型为Kappa，亚型为IgG3。
优选的，所述单克隆抗体的ELISA效价不小于1：1.024×106。
优选的，所述单克隆抗体的亲和力不小于2.56×10-10 mol/L。
设计一种所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）以HPV16 VLPs蛋白做抗原免疫小鼠；
（2）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（3）采用多次ELISA检测结合及亚克隆的方法得阳性杂交瘤细胞；
（4）提取阳性单克隆杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得HPV16 VLPs单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
将所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体在免疫学检测中应用。
优选的，所述免疫学检测为ELISA、IFA、Western Blot中的至少一种。
将所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体在抗原或抗体检测试剂盒中应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明利用从大肠杆菌获得的HPV16 L1 VLPs疫苗免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，为基于HPV L1蛋白的疫苗研制提供便利。
2. 本发明筛选得到的单克隆抗体具有稳定的抗体分泌能力，能快速特异的识别HPV16及其L1蛋白，为HPV16L1蛋白快速检测技术的解决奠定基础，在HPV16相关的免疫检测中具有广泛的研究应用价值和商业使用价值。
3. 本发明筛选得到的单克隆抗体特具有高特异性和灵敏度，不识别HPV18、HPV31、HPV45、HPV52及HPV58等其他高危亚型HPV。
4. 本发明所公开的单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列的基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，但仍能够与HPV16 L1蛋白特异性结合，为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体打下基础，以进一步提升抗体的特异性和亲和力。
附图说明
图1为ELISA测定免疫小鼠血清效价结果图；
图2为IFA检测单抗19H7的特异性结果图；
图3为Western Blot检测单抗19H7的特异性结果图；
其中，泳道M为蛋白标准分子量Marker；泳道1 为原核表达的HPV16 L1蛋白；泳道2 为BL21阴性对照；
图4为ELISA检测单抗19H7与HPV6、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52及HPV58等其他亚型HPV的交叉反应性结果图；
图5为Western Blot检测单抗19H7与HPV6、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52及HPV58等其他亚型HPV的交叉反应性结果图；
其中，泳道M为蛋白标准分子量Marker；泳道1～6分别为原核表达的HPV6、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52及HPV58的L1蛋白；PC为原核表达的HPV16 L1蛋白；NC 为BL21阴性对照；
图6为IFA检测单抗19H7与HPV6、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52及HPV58等其他亚型HPV的交叉反应性结果图；
其中，6、16、18、31、45、52、58分别为p6SheLL、p16SheLL、p18SheLL、p31SheLL、p45SheLL、p52SheLL及p58SheLL转染293T细胞；NC 为293T细胞阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：分泌抗HPV16 L1蛋白单抗的杂交瘤细胞株的制备
1. 主要试剂和材料
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、PEG -1500、RPMl-1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司，液体AEC酶底物试剂盒购自中杉金桥公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbio公司，单抗亚型测定试剂盒购自北京义翘神州生物技术有限公司；商品化抗HPV16 L1单克隆抗体购自Abcam（Abcam，英国）；包含相应HPV L1和L2 ORF区基因的质粒p6SheLL、p16SheLL、p18SheLL、p31SheLL、p45SheLL、p52SheLL及p58SheLL购自Addgene公司，由Prof.John Schiller提供（Addgene，美国），BALB/c小鼠购自郑州大学医学院。
2. 免疫原及包被原的制备
免疫原HPV16 VLPs具体制备方法参照文献（Chen Y, Liu Y, Wang A, Zhang G, DongZ, Qi Y, Wang J, Zhao B, Li N, Jiang M. Human papillomavirus L1 proteinexpressed in Escherichia coli self-assembles into virus-like particles thatare highly immunogenic[J]. Virus Research 2016, 220: 97–103.）进行。
包被原分别为重组原核表达载体pE-SUMO-HPV16L1经大肠杆菌诱导表达获得的SUMO-HPV16-L1超声上清及原核表达载体pE-SUMO经大肠杆菌诱导表达获得的SUMO tag超声上清、HPV16 VLPs以及假病毒制备质粒pSheLL16与报告基因GFP共转染293FT细胞制备的HPV16假病毒，具体制备方法参照上述文献进行。
3. 免疫BALB/c小鼠
（1）将抗原成分为HPV16 VLPs的疫苗分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，其中VLPs（20μg/只）与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂体积比均为1：1；
（2）通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，100μl/只；
（3）在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；
（4）免疫14 d，尾部采血，测小鼠血清效价；
（5）细胞融合前3～5天，选取血清效价最高的小鼠通过腹腔注射的方法，用不含佐剂的VLPs疫苗对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是40μg/只。
4. 免疫小鼠血清抗体效价测定
ELISA测效价：
（1）用包被液稀释纯化的HPV16 VLPs至1µg/mL，每孔加入50µl包被液，37℃孵育2小时，弃包被液，用PBST 洗涤3次；
（2）用300µl封闭液（5％脱脂奶粉+PBST） 4℃过夜封闭；
（3）每孔加入用稀释缓冲液（PBST）以4倍倍比稀释的待检血清各50µl（初始稀释倍数为1：1000），于37℃孵育1h，弃上清，用PBST洗涤6次；
（4）向每孔加入用稀释缓冲液以1：5000 稀释的HRP 标记的羊抗小鼠IgG 各50µl，37℃保温0.5 h后弃上清，用PBST洗涤液洗涤6次；
（5）向凹孔中加入50µl DAB 显色液，室温避光作用20min后加2M H2SO4 50µl终止液终止反应；
（6）用酶标仪测定OD450值。
如图1所示：
ELISA结果显示1号小鼠ELISA效价为最高可达到1：25600，选取1号小鼠用于细胞融合制备单克隆抗体。
5.细胞融合
（1）脾细胞的制备
取经过超免5 d后的1号BALB/c小鼠引颈致死，用75%酒精体表消毒。无菌操作取出小鼠脾脏，用37℃预热的GNK溶液洗2次，加少许HAT培养基在无菌的120目尼龙纱布上用小剪刀剪碎脾脏，将脾细胞滤至无菌烧杯并转至无菌细胞离心管中，1000 r/min离心10 min用GNK溶液洗涤细胞1～2次备用。
（2）细胞融合及融合细胞的培养
采用聚乙二醇法进行细胞融合，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养液轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，220μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，融合后7d 改用HT培养基半量换液，第10 d吸取25 µl细胞培养上清，用ELISA进行初筛。
实施例二：分泌抗HPV16 L1蛋白单抗的杂交瘤细胞株的鉴定
1. 杂交瘤细胞的筛选鉴定与亚克隆
（1）ELISA筛选
第一轮ELISA筛选选用SUMO1-16 L1重组蛋白（用CBS 1：100稀释）作为包被原，包被22个ELISA板对杂交瘤细胞培养上清进行初筛；将初步筛选到的96株杂交瘤细胞株转移至2个48孔细胞板继续培养。
第二轮ELISA筛选分别选用SUMO1-16 L1纯化蛋白（用CBS 1：100稀释）及SUMO-tag重组蛋白超声破碎上清（用CBS 1：1000稀释）作为包被原，经SUMO-tag重组蛋白检测排除假阳性后共筛出67株阳性杂交瘤细胞株。
第三轮ELISA筛选选用提前制备好的HPV16 PsV作为包被原（用CBS 1：100稀释），对上述阳性杂交瘤细胞进行第三轮ELISA筛选，结果共筛出56株阳性杂交瘤细胞株。
（2）阳性细胞的亚克隆和进一步筛选鉴定
通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。
用1640/10完全培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约3 cells/ml，每孔100 µl加入到预铺有100 µl饲养细胞的96孔板中，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养6～8 d后对开始进行ELISA筛选鉴定，随后将阳性单克隆细胞株转入24孔细胞培养板进行扩大培养，如有必要需进行2～3次亚克隆，直至直到获得稳定分泌抗猪圆环病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即可获得目的杂交瘤细胞19H7，将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×106/管进行冻存。
2. 单克隆杂交瘤细胞稳定性鉴定
将获得的阳性单克隆杂交瘤细胞19H7进行连续传代至35次，分别取不同代次的培养上清用ELISA进行稳定性测定。
检测结果如表1所示。
表1 不同代次的杂交瘤细胞分泌抗体的效价
。
ELISA结果表明，细胞传至20代相应的杂交瘤细胞株19H7均能够稳定地分泌特异性单克隆抗体，说明这一株杂交瘤细胞株的单克隆化程度都比较高，性状稳定，可以用做种子长期保存和大量制备单克隆抗体。
实施例三：抗HPV16L1蛋白单克隆抗体腹水的制备及纯化
1. 抗HPV16L1蛋白单克隆抗体腹水的制备
将实施例二中单克隆杂交瘤细胞株19H7扩大培养，ELISA法测培养上清效价，确保单克隆细胞株性状稳定，收集细胞用于大量制备当克隆抗体，具体步骤如下：
（1）选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500 μl灭菌石蜡，刺激免疫细胞用以促进杂交瘤细胞的增殖。
（2）观察小鼠状态，7~10 d后按照每只约1×107个细胞的量注入提前准备好的单克隆阳性细胞，及时观察小鼠状态；
（3）10 d后抽取腹水，8000 r/min，4℃离心20 min去除油脂及细胞沉淀，收集腹水上清-80℃保存备用；
（4）一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞；
（5）一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，使用辛酸硫酸铵法粗提腹水IgG；
（6）用DE-52离子交换柱纯化小鼠IgG；
（7）用ELISA对腹水效价进行测定。
2. 单克隆抗体腹水ELISA效价测定
（1）用CBS液将HPV16 VLPs稀释成浓度1 µg/mL包被液包被酶标板，50µl/孔，4℃封闭过夜；
（2）将19H7单抗用5%的脱脂奶进行倍比稀释，依次加入酶标板中，50µl/孔，阳性对照为商品化抗HPV16 L1单克隆抗体（Abcam，英国），37℃孵育30min；
（3）弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；
（4）将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗）加入反应孔中，50µl/孔，37℃孵育30min；
（5）用PBST冲洗干净，拍干；
（6）每孔加入现配的TMB显色液50µl，暗室反应15min；
（7）每孔加入50µl 2M H2SO4终止反应；
（8）。酶标仪读取每孔的OD450值。
ELISA检测结果显示该单克隆抗体腹水效价为1：1.024×106。
实施例三：抗HPV16L1蛋白单克隆抗体性能测定
1. 单克隆抗体亚型鉴定
单抗亚类和型的鉴定按 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit 使用说明书操作。
测定结果如表2所示。
表2 单克隆抗体亚型鉴定
。
注：+表示阳性，-表示阴性。
单抗亚类和亚型的鉴定结果显示单克隆抗体19H7亚型为IgG3，轻链型为Kappa型。
2. 单克隆抗体亲和力测定
用CBS液将HPV16 L1 蛋白稀释成浓度0.5µg/mL和1µg/mL的包被液分别包被酶标板，通过间接 ELISA 法测定单抗腹水效价，以单抗浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，绘出相应的2 条间接 ELISA 反应曲线，以每条曲线上部平坦段的 OD450值作为100%，在曲线上算出50% OD450值时对应的抗体浓度。
按照公式 Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算单抗的亲和常数，其中 n=[Ag] t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t为2个不同的包被原浓度，[Ab]t、[Ab′]t为各包被原浓度下50%OD450值对应的抗体浓度。
根据亲和力测定结果计算出19H7单克隆抗体亲和常数K值为2.56×10-10mol/L。
3. 单克隆抗体19H7特异性鉴定
分别用ELISA、Western blot及IFA实验鉴定单抗19H7的特异性，取经原核表达获得的HPV16 L1重组蛋白及大肠杆菌其他无关蛋白作对照，进行ELISA检测。
结果显示单抗19H7可与HPV16 L1重组蛋白发生特异性反应而与无关蛋白不反应；。
取经原核表达获得的HPV16 L1重组蛋白及大肠杆菌其他无关蛋白作对照，进行SDS-PAGE电泳，然后将其转印到硝酸纤维素膜上进行Western blot检测，19H7作为一抗（1：50000）， HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗（1:5000），用AEC酶底物试剂盒显色。
如图2所示：单抗19H7可与原核表达获得的重组HPV16L1蛋白发生特异性反应，而与无关蛋白不发生反应。
如图3所示：用含有HPV L1和L2 ORF区基因的质粒p16SheLL转染293T细胞，用于IFA检测，结果显示，单抗19H7可以与HPV16发生特异性反应，而与293T细胞对照不发生反应。
4. 单克隆抗体19H7与HPV6、HPV18、HPV33、HPV45、HPV52及HPV58等亚型的交叉反应性
分别用ELISA、Western blot及IFA实验鉴定单克隆抗体19H7与HPV6、HPV18、HPV33、HPV45、HPV52及HPV58等亚型的交叉反应性，取经原核表达获得的HPV16、HPV6、HPV18、HPV33、HPV45、HPV52及HPV58等亚型的重组L1蛋白及空载pE-Sumo及pET32a对应的超声上清做阴性对照，进行ELISA检测。
结果如图4所示：单抗19H7可与HPV16 L1重组蛋白发生特异性反应而与其他6个亚型HPVL1蛋白以及其他无关蛋白不反应。
取经原核表达获得的不同亚型HPV的L1重组蛋白超声上清进行SDS-PAGE电泳，然后将其转印到硝酸纤维素膜上进行Western blot检测，19H7作为一抗（1：50000），HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗（1：5000），用AEC酶底物试剂盒显色。
如图5所示：单抗19H7可与原核表达获得的重组HPV16L1蛋白发生特异性反应，而与其他6个亚型HPVL1蛋白以及其他无关蛋白不反应。
分别选用含有相应HPV L1和L2 ORF区基因的质粒p6SheLL、p16SheLL、p18SheLL、p31SheLL、p45SheLL、p52SheLL及p58SheLL转染293T细胞，用于IFA检测。
如图6所示：单抗19H7可以与HPV16发生特异性反应，而与HPV33、HPV45、HPV52及HPV58亚型有微弱反应，而与HPV6、HPV18等亚型及293T细胞对照不发生反应。
实施例四：单克隆抗体可变区序列的测定
提取阳性单克隆杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-CCGGACTGGT CAGCTGCACT-3’；
P2：5’-TTTGAGGAGACCGGTGAC-3’ 。
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’- GAAGGTCATG GAGTCAGA -3’ ；
P4：5’-TTCCAGGCTGGTGCAGCAT-3’ 。
通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体19H7的可变区序列，送上海生工生物有限公司测序。测定单克隆抗体19H7的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示，由其推导的19H7的重链可变区及轻链可变区的氨基酸为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学，河南中泽生物工程有限公司
<120> 抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 349
<212> DNA
<213> BALB/c小鼠
<400> 1
ccggactggt cagctgcact cgtgaagata gcctgcaaga cttctggcta cagtttcaca 60
agctactata aacactgggt gaagcagagg cctggactgg gacttgagtg gattggatgg 120
atttatcctg gaagtggtaa aactaactac aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg 180
acggcagaca catcctccag cactgcctac atgcacctca gcagcctaac atctgaggac 240
tctgcggtct attactgtgc aaggtcctta ctatcccctt ttgcttactg gggccaaggg 300
accacggtca cgggtctcct caaggaccac ggtcaccggt ctcctcaaa 349
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> BALB/c小鼠
<400> 2
Pro Asp Trp Ser Ala Ala Leu Val Lys Ile Ala Cys Lys Thr Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Lys His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
20 25 30
Leu Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Lys Thr
35 40 45
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr
50 55 60
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
65 70 75 80
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Leu Ser Pro Phe Ala Tyr
85 90 95
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Gly Leu Leu Lys Asp His Gly His
100 105 110
Arg Ser Pro Gln
115
<210> 3
<211> 420
<212> DNA
<213> BALB/c小鼠
<400> 3
gaaggtcatg gagtcagaca cactcctgtt atgggtactg ctgctctggg ttccaggttc 60
cactggtgac attgtgctga cacagtctcc tgcttcctta gctgtatctc tggggcagag 120
ggccaccatc tcatacaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tctggctata gttatatgca 180
ctggaaccaa cagaaaccag gacagccacc cagactcctc atctatcttg tatccaacct 240
agaatctggg gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa 300
catccatcct gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaca ttagggagct 360
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacggg ctgatgctgc accagcctgg 420
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> BALB/c小鼠
<400> 4
Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys
115 120 125
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ccggactggt cagctgcact 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tttgaggaga ccggtgac 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gaaggtcatg gagtcaga 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ttccaggctg gtgcagcat 19

Claims (8)

1.一种抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区DNA序列为如SEQ IDNO.1所示的序列；其重链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示的序列，或在所述SEQ IDNO.2序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列；和/或
其轻链可变区DNA序列为如SEQ ID NO.3所示的序列；其轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.4所示的序列，或在所述SEQ ID NO.4序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。
2.根据权利要求1所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链型为Kappa，亚型为IgG3。
3.根据权利要求1所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的ELISA效价不小于1：1.024×106。
4.根据权利要求1所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亲和力不小于2.56×10-10 mol/L。
5.一种权利要求1所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以HPV16 VLPs蛋白做抗原免疫小鼠；
（2）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（3）采用多次ELISA检测结合及亚克隆的方法得阳性杂交瘤细胞；
（4）提取阳性单克隆杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得HPV16 VLPs单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
6.一种权利要求1所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测为ELISA、IFA或WesternBlot。
8.一种检测试剂盒，含有权利要求1所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体。
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