CN105085626A - 人肠道病毒的广谱亲和表位多肽、抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫生物学领域，涉及一种表位多肽、如人肠道病毒的广谱亲和表位多肽及其用途，还涉及一种可与上述表位多肽结合的抗体及其用途。本发明还涉及所述亲和表位多肽或所述抗体在制备治疗和/或预防和/或诊断人肠道病毒和/或鉴定人肠道病毒滴度和/或鉴定人肠道病毒中和抗体效价的药物或方法中的用途。本发明的亲和表位多肽和抗体可用于治疗和/或预防和/或诊断人肠道病毒和/或鉴定人肠道病毒滴度和/或鉴定人肠道病毒中和抗体效价的药物或方法中。

Description

人肠道病毒的广谱亲和表位多肽、抗体及其用途

技术领域

本发明属于免疫生物学领域，涉及分离的表位多肽(例如人肠道病毒的广谱亲和表位多肽)、针对该表位多肽的抗体及它们的用途。

背景技术

人肠道病毒(HumanEnteroviruses，以下简称为HEV)属于小核糖核酸病毒目(Picornavirales)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)。HEV的基因组结构为单股正链RNA。HEV可分为4组：(1)脊髓灰质炎病毒(Polioviruses，以下简称为PV)；(2)柯萨奇病毒A组(CoxsackievirusgroupA，以下简称为CVA)；(3)柯萨奇病毒B组(CoxsackievirusgroupB，以下简称为CVB)；(4)埃可病毒(Echoviruses，以下简称为Echo)。此外，HEV还可以根据基因型进行分类，可分为HEV-A、HEV-B、HEV-C及HEV-D四组(Nasri等人，2007.ExpertRevMolDiagn.7:419-34)。

迄今为止，HEV中危害最大的是PV，该病毒通常经口鼻传播，并感染脊髓神经的灰白质，数日内可导致手脚麻痹，以致残废，严重者可致死亡。其次是人肠道病毒71型(Enterovirus71，以下简称为EV71)，该病毒的传播途径与PV相似，通常引起手足口病(Handfootandmouthdisease，以下简称为HFMD)和疱疹性咽峡炎(herpangina)，还可导致无菌性脑膜炎(asepticmeningitis)、脑干脑炎(brainstemencephalitis)、肺水肿(pulmonaryedema)、肺出血(pulmonaryhemorrhage)等多种神经系统疾病(Lee等人，2009.PediatrInfectDisJ.28:904-910)。除了上述2种危害性较大的肠道病毒外，其它的多种肠道病毒(包括CVA、CVB及Echo)也可导致HFMD，或引起胰腺、心脏及肺部相关疾病的发生(Tseng等人，2007.JMedVirol.12:1850-60)。

HEV的病毒颗粒近似于球形，为正二十面体结构，无包膜和突起。HEV由外部的衣壳和核心的RNA构成。衣壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4构成，VP1-VP3位于衣壳外部，VP4则位于内侧与RNA核心相连。HEV的基因组从5’端至3’端依次为：5’端非编码区(5’-UTR)、P1编码区、P2编码区、P3编码区及3’端非编码区(3’-UTR)；其中，P1-P3编码区编码1A(VP4蛋白)、1B(VP2蛋白)、1C(VP3蛋白)、1D(VP1蛋白)、2A(特异性蛋白酶)、2B(膜锚定蛋白)、2C(多功能蛋白)、3A(膜锚定蛋白)、3B(VPg，5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组分)、3’末端非编码区以及多聚腺苷酸尾(Oberste等人，2004.JGenVirol.85:1597；Norder等人，2011.AntiviralRes.89:204-218)。

近年来，HEV不断导致包括HFMD等在内的疾病爆发。开发针对HEV的检测方法以及有效的预防和治疗性药物(例如抗体、疫苗等)具有重大意义。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，鉴定了人肠道病毒中的关键表位多肽(例如氨基酸序列为SEQIDNO:1的表位多肽)。进一步，本发明人制备了所述表位多肽并将其用于免疫小鼠，或者利用重组表达或表面展示技术将所述表位多肽与其它载体或蛋白进行偶联或融合表达并将所获得的产物用于免疫小鼠，获得了针对所述表位多肽的抗血清。进一步，本发明人利用免疫荧光检测方法或酶联免疫检测方法，检测了针对所述表位多肽的抗血清与不同基因型或血清型的人肠道病毒的反应能力。结果显示，针对本发明的表位多肽(例如氨基酸序列为SEQIDNO:1的表位多肽)的抗血清对不同基因型或血清型的人肠道病毒均有良好的反应活性。进一步，本发明人进行了单克隆抗体的制备，鉴定获得了1株杂交瘤细胞株，其能够产生与本发明的表位多肽(例如氨基酸序列为SEQIDNO:1的表位多肽)具有特异性反应的单克隆抗体。进一步，本发明人利用免疫荧光检测方法或酶联免疫检测方法，检测了上述单克隆抗体与不同基因型或血清型的人肠道病毒的反应能力。结果显示，本发明的单克隆抗体对所用的不同基因型或血清型的人肠道病毒均有良好的反应活性。这些结果表明，发明人所鉴定的表位(例如氨基酸序列为SEQIDNO:1的表位)是人肠道病毒中的关键的保守性表位，其能够被用于制备人肠道病毒广谱亲和抗体、治疗药物或疫苗，并且能够被用于制备人肠道病毒通用检测方法或试剂盒。因此，本申请提供了下述发明。

1、分离的表位多肽

本发明的一个方面涉及分离的表位多肽，特别是广谱亲和表位多肽，尤其是人肠道病毒的广谱亲和表位多肽。

特别地，本发明涉及一种分离的表位多肽或其变体，其中，所述表位多肽由肠道病毒非结构蛋白2C的连续氨基酸片段组成，并且包含肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(相应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1266-1281)，并且，所述连续氨基酸片段的长度为16-30个氨基酸，例如16-25个、16-20个氨基酸；所述变体与所述表位多肽的区别在于个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代、缺失或添加，并且保留所述表位多肽的活性(例如，诱导广谱亲和抗体产生的能力)。

在某些实施方案中，所述肠道病毒非结构蛋白2C的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示。在某些实施方案中，所述肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170如SEQIDNO：1和22-85任一项所示。在某些实施方案中，所述肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170如SEQIDNO：1所示。

在某些实施方案中，所述表位多肽或其变体包含选自下列的氨基酸序列，或由选自下列的氨基酸序列组成：

a)如SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列；

b)与SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列具有至少45％的序列同一性，例如至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

c)相对于SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列包含一个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述氨基酸取代或缺失发生在一个或多个选自下列的位置处：相应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸残基的位置处(即，相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸残基的位置处，或相应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的第1267、1268、1270、1271、1273、1274和/或1277位氨基酸残基的位置处)。

在某些实施方案中，所述表位多肽选自：

(a)表位多肽，它为肠道病毒非结构蛋白2C的片段(其长度为16-30个氨基酸，例如16-25个或16-20个氨基酸)，并且含有肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列)；

(b)表位多肽，它是在肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列)的基础上经一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换而得到的；和

(c)表位多肽，它的氨基酸序列与肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列)相异在于一个或者几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸的延伸和/或替换。

在某些实施方案中，所述表位多肽或其变体具有诱导广谱亲和抗体产生的能力。

在某些实施方案中，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1和22-85任一项所示。

在某些实施方案中，所述变体与所述表位多肽的区别在于选自下列的位置处的一个保守性置换：相应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸残基的位置处(即，相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸残基的位置处)。

在某些实施方案中，所述分离的表位多肽包含如SEQIDNO:1(YSLPPDPDHFDGYKQQ)所示的氨基酸序列或其衍生物或变体，或者由其组成。

在某些实施方案中，所述分离的表位多肽包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的衍生物或变体。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少45％的序列同一性，例如至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％的序列同一性。

在某些实施方案中，所述分离的表位多肽包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的衍生物或变体。在某些实施方案中，所述衍生物或变体为在如SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个或8个)氨基酸而衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述分离的表位多肽相对于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加等)。可产生所述分离的表位多肽的氨基酸序列衍生物，从而使它们是取代、插入或缺失衍生物。缺失衍生物缺少天然多肽的一个或多个对于功能(例如，特异性产生抗体或与抗体结合)不是必需的残基。插入衍生物通常包括，添加在多肽中的非末端位点的残基。取代衍生物通常涉及在氨基酸序列内的一个或多个位点上包含一种氨基酸与另一种氨基酸的替换/取代，并且可被设计来调节多肽的一种或多种性质，例如抗蛋白水解切割的稳定性，而不丧失其它功能或性质。该类型的取代优选是保守的，即，一种氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守取代在本领域是公知的，包括例如如下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸,亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

在某些实施方案中，氨基酸的取代或缺失可发生在一个或多个选自下列的位置处：SEQIDNO:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位的氨基酸处(相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸残基的位置处)。

所述的多肽或亲和表位多肽可以通过人工化学合成的方式得到，也可以由本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到，例如参考核苷酸序列SEQIDNO：2(TACTCGCTTCCACCAGACCCAGACCATTTTGACGGTTACAAGCAACAG)、SEQIDNO:3(GTCTGGGTCTGGTGGAAGCGAGTACTGTTGCTTGTAACCGTCAAAATG)，通过基因重组手段克隆到表达载体后转染宿主细胞进行蛋白表达。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。

2、多肽偶联物

在另一个方面，本发明涉及一种多肽偶联物，其包含本发明的表位多肽或其变体，和偶联部分。在某些实施方案中，本发明涉及一种表位多肽偶联物，其包含本发明的分离的表位多肽(例如广谱亲和表位多肽，尤其是人肠道病毒的广谱亲和表位多肽，其衍生物或变体)和偶联部分。

在某些实施方案中，偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述亲和表位多肽偶联物为融合蛋白或类病毒颗粒。在某些实施方案中，所述偶联部分为HBcAg蛋白或其片段。在某些实施方案中，所述HBcAg蛋白的片段为HBcAg蛋白的aa1-149。在某些实施方案中，HBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示。

在某些实施方案中，所述偶联部分通过已知的偶联方法与所述表位多肽连接。在某些实施方案中，所述偶联方法可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。

在某些实施方案中，所述载体蛋白包括例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白等蛋白类载体。在某些实施方案中，所述偶联部分可以为重组载体，例如多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸-S甘油半胱氨酰-丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。

在某些实施方案中，所述分离的表位多肽与所述偶联部分通过连接子相连。所述连接子可以为肽或多肽，例如氨基酸序列为SEQIDNO:6中所示的肽或多肽。

在一个具体的实施方案中，所述多肽偶联物包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、其变体或衍生物。

3、分离的核酸分子

在另一个方面，本发明还提供分离的核酸分子。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的分离的表位多肽(例如广谱亲和表位多肽，尤其是人肠道病毒的广谱亲和表位多肽)、其衍生物或变体。

在一些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的多肽偶联物，例如融合蛋白。所述多肽偶联物包含本发明的分离的表位多肽(例如广谱亲和表位多肽，尤其是人肠道病毒的广谱亲和表位多肽)、其衍生物或变体，和偶联部分。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQIDNO：2(TACTCGCTTCCACCAGACCCAGACCATTTTGACGGTTACAAGCAACAG)或SEQIDNO:3(GTCTGGGTCTGGTGGAAGCGAGTACTGTTGCTTGTAACCGTCAAAATG)中所示的核苷酸序列，其衍生物或变体，或由它们组成。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列编码包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的融合蛋白，其衍生物或变体，或由它们组成。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列与SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列具有至少45％的序列同一性，例如至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％的序列同一性。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列为在如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而衍生的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子相对于SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸修饰(例如，取代、缺失或添加等)。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列可与SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列在严格条件下杂交。术语“杂交”，如本文中所使用的，是指两条单链核酸之间的结合、退火或碱基配对的过程。“杂交的严格性”由温度和离子强度的条件确定。核酸杂交体的稳定性表示为解链温度或Tm，其是杂交体在确定的条件下发生50％变性时的温度。已得到公式来估计给定的杂交体的Tm；该公式考虑了核酸的G+C含量，杂交核酸的长度等(例如，Sambrook等，1989)。为了使两条核酸链之间的退火率达到最大，通常在比Tm低大约20-25℃的温度下在高离子强度的溶液(6xSSC或6xSSPE)中进行杂交。如果待杂交的序列不同一，则对于每1％的错配，杂交温度降低1-1.5℃。通常，清洗条件应当尽可能严格(即，在比计算的Tm低大约12-20℃的温度下在低离子强度中)。例如，高严格条件通常包括在68℃下在6xSSC/5xDenhardt's溶液/1.0％SDS中进行杂交和在65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中进行清洗。在溶液中进行的杂交与使用固定的核酸进行的杂交之间的最适杂交条件通常不同。本领域技术人员将了解操纵哪些参数以最优化杂交。

4、重组载体

在又一个方面，本发明提供一种重组载体，其包含本发明的分离的核酸分子。

可以将本发明的分离的核酸分子和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该表达载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当的表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。所述调控序列可包括表达本发明的表位多肽或多肽偶联物所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子，以及其任何组合。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。

重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。在某些实施方案中，所述重组载体为克隆载体或表达载体。

5、宿主细胞

另一方面，本发明提供一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组载体。

在某些实施方案中，可将包含本发明的核酸分子的重组载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。在某些实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。

6、类病毒颗粒

本发明还涉及，能够展示本发明的表位多肽或其变体的类病毒颗粒。在某些实施方案中，所述表位多肽或其变体典型地通过与载体蛋白融合，经过蛋白纯化和组装后可形成类病毒颗粒，并将所述表位多肽或其变体展示在类病毒颗粒表面，使其仍保持诱导亲和抗体产生的能力。

在某些实施方案中，所述类病毒颗粒包含融合蛋白或由融合蛋白构成，所述融合蛋白包含本发明所述的表位多肽或其变体，以及载体蛋白。在某些实施方案中，所述载体蛋白优选地为HBcAg蛋白或其片段。在本发明的某些实施方案中，所述HBcAg蛋白的片段为由HBcAg的aa1-149构成的蛋白。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、其变体或衍生物。

7、杂交瘤

在另一个方面，本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体特异性结合本发明的分离的表位多肽和/或多肽偶联物。

在一个具体实施方案中，所述杂交瘤为杂交瘤细胞株L8F12，其保藏编号为CCTCCNO:C2014101，保藏日期为2014年5月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌珞珈山(邮编430072)。

8、抗体及抗体偶联物

在又一个方面，本发明提供抗体或抗体片段，其能够特异性地结合本发明的表位多肽或其变体、本发明的多肽偶联物和/或本发明的展示上述表位多肽的类病毒颗粒。

在某些实施方案中，所述抗体具有：(a)如SEQIDNO:16所示的重链CDR1；(b)如SEQIDNO:17所示的重链CDR2；(c)如SEQIDNO:18所示的重链CDR3；(d)如SEQIDNO:19所示的轻链CDR1；(e)如SEQIDNO:20所示的轻链CDR2；和，(f)如SEQIDNO:21所示的轻链CDR3。

在某些实施方案中，所述抗体具有：(a)单克隆抗体L8F12的重链可变区，和，(b)单克隆抗体L8F12的轻链可变区。

在某些实施方案中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗体片段选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。

在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段选自单克隆抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。

在某些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体为本发明的杂交瘤细胞株产生的抗体L8F12。在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段为与单克隆抗体L8F12具有相同的结合特异性的抗体，例如与单克隆抗体L8F12具有相同的重链和/或轻链可变区的抗体，或者与单克隆抗体L8F12具有相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)的抗体。

在某些实施方案中，本发明的抗体为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，例如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。

本发明还提供抗体偶联物，其包括本发明的抗体或抗体片段，以及偶联部分。在某些实施方案中，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。

本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明的抗体或抗体片段、或者本发明的抗体偶联物。

在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段、或者抗体偶联物特异性识别病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种。在某些实施方案中，病毒EV71的代表性毒株为JS06-52-3(其GenBank登录号为FJ600325)。在某些实施方案中，病毒CA16的代表性毒株为TW07-00190(其GenBank登录号为JF420566)。在某些实施方案中，病毒CB3的代表性毒株为XM08-2035(其GenBank登录号为JQ042700)。在某些实施方案中，病毒CA6的代表性毒株为141(其GenBank登录号为JF420565)。在某些实施方案中，病毒CB5的代表性毒株为09-5428(其GenBank登录号为JQ042699)。在某些实施方案中，病毒CA2的代表性毒株为3352(其GenBank登录号为JF420570)。在某些实施方案中，病毒CA9的代表性毒株为4629(其GenBank登录号为JQ042702)。在某些实施方案中，病毒CB2的代表性毒株为09-3985(其GenBank登录号为JQ042701)。在某些实施方案中，病毒PV1的代表性毒株具有GenBank登录号V01149.1。

在某些具体实施方案中，所述抗体为单克隆抗体L8F12(IgG3)，其由杂交瘤细胞株L8F12产生(保藏编号为CCTCCNO:C2014101，保藏日期为2014年5月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌珞珈山(邮编430072))。

在其它的实施方案中，所述抗体为与单克隆抗体L8F12(IgG3)具有相同的结合特异性的抗体，例如与单克隆抗体L8F12具有相同的重链和/或轻链可变区的抗体，或者与单克隆抗体L8F12具有相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)的抗体。

在某些具体实施方案中，所述抗体的6个互补决定区(CDR)分别为单克隆抗体L8F12(IgG3)所包含的6个CDR。在某些具体实施方案中，所述抗体的重链和轻链可变区分别为单克隆抗体L8F12(IgG3)所包含的重链和轻链可变区。

在另一个方面，本发明还提供一种分离的核酸分子，其包含编码本发明所述的抗体或抗体片段的核酸序列。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。

在某些实施方案中，所述抗体具有：(a)如SEQIDNO:16所示的重链CDR1；(b)如SEQIDNO:17所示的重链CDR2；(c)如SEQIDNO:18所示的重链CDR3；(d)如SEQIDNO:19所示的轻链CDR1；(e)如SEQIDNO:20所示的轻链CDR2；和，(f)如SEQIDNO:21所示的轻链CDR3。

在某些实施方案中，所述抗体具有：(a)单克隆抗体L8F12的重链可变区，和，(b)单克隆抗体L8F12的轻链可变区。

在另一个方面，本发明还提供一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，还提供了包含如上所述的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

在另一个方面，还提供了制备本发明的抗体或抗体片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的抗体或抗体片段。

9、组合物

在另一个方面，本发明还提供组合物。

在某些实施方案中，所述组合物包含本发明的分离的表位多肽或其变体、多肽偶联物、分离的核酸分子、载体、宿主细胞和/或类病毒颗粒。在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含本发明的抗体或其片段或者本发明的抗体偶联物。在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

在某些实施方案中，所述组合物为药物组合物或诊断组合物。例如，所述组合物可用于疾病的诊断或治疗。所述疾病可以为，病毒感染(例如肠病毒感染)，或与病毒感染(例如肠病毒感染)相关的疾病，例如手足口病。所述病毒可以为例如，病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2。

术语“药学上可接受的”意指经有关管理机构批准或公认药典中所列用于动物，更特别地用于人的。术语“载体”是指与试剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、赋形剂或媒介物。这样的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物和/或诊断组合物时，水是常用载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、无水脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药学上可接受的载体、赋形剂和稳定剂的另外实例包括但不限于缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖以及其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM，如本领域中已知的。除了上述成分外，本发明的药物和/或诊断组合物还可包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等形式。

10、方法

在另一个方面，本发明提供一种治疗和/或预防和/或诊断人肠道病毒所致疾病和/或检测肠道病毒滴度和/或检测肠道病毒中和抗体效价的方法，包括使用有效量的本发明的表位多肽或其变体、多肽偶联物、抗体或其片段、抗体偶联物和/或组合物的步骤。

在又一个方面，本发明涉及一种免疫组织化学检测方法，其包括使用本发明的抗体或抗体片段、或者本发明的抗体偶联物。

本发明的方法可以用于体内或体外应用。本发明的方法可以用于治疗目的，诊断目的，或者非治疗非诊断目的。例如，本发明方法可应用于受试者，以诊断，预防或治疗受试者中人肠道病毒所致的疾病。此外，本发明方法可应用于体外样品(例如细胞培养物，病毒培养物等等)，以确定肠道病毒在样品中的存在或其水平，或者肠道病毒中和抗体的存在或其效价。

在具体的实施方案中，所述疾病可以是手足口病。

在具体的实施方案中，所述肠道病毒可以为病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种。

11、用途

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离的表位多肽或其变体、多肽偶联物、展示所述表位多肽的类病毒颗粒或者本发明的组合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断肠道病毒所致疾病和/或检测肠道病毒滴度和/或检测肠道病毒中和抗体效价的试剂(例如药物)中的用途。

在又一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、本发明的抗体偶联物、本发明的组合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断肠道病毒所致疾病(特别是手足口病)和/或检测肠道病毒滴度的试剂(例如药物)中的用途。

在具体的实施方案中，所述疾病为手足口病。

在具体的实施方案中，所述肠道病毒可以为病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种。

本发明的表位多肽具有良好的亲和活性和抗原性。在某些实施方案中，本发明的表位多肽、抗体、组合物等能够被用于治疗和/或预防和/或诊断人肠道病毒所致疾病和/或检测人肠道病毒滴度和/或检测人肠道病毒中和抗体效价。

定义

如本文中所使用的，当提及肠道病毒非结构蛋白2C的氨基酸序列时，其使用EV71病毒株(JS06-52-3)的非结构蛋白2C的氨基酸序列(SEQIDNO：10所示的序列)来进行描述。例如，表述“肠道病毒非结构蛋白2C的第155-170位氨基酸残基(aa155-170)”是指，SEQIDNO：10所示的多肽的第155-170位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在肠道病毒非结构蛋白2C的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBcAg)，而不影响其生物学功能。例如，在肠道病毒的不同病毒株(例如，CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和CB2)中，非结构蛋白2C的氨基酸序列可天然存在差异(突变或变异)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“肠道病毒非结构蛋白2C”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO：10所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述肠道病毒非结构蛋白2C的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO：10的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170”包括，SEQIDNO：10的第155-170位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

另外，根据EV71病毒株的完整基因组(FJ600325)可知，肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO:1所示的序列)对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1266-1281。因此，在本发明中，表述“肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170”与表述“由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1266-1281”具有等同含义，且可互换使用。

如本文中所使用的，当提及HBcAg的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO：11所示的序列来进行描述。例如，表述“HBcAg的第1-149位氨基酸残基(aa1-149)”是指，SEQIDNO：11所示的多肽的第1-149位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBcAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBcAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBcAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO：11所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBcAg的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO：11的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBcAg的第1-149位氨基酸残基”包括，SEQIDNO：11的第1-149位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

术语“衍生物”，当用于蛋白质试剂(包括全长蛋白质、多聚体蛋白质、多肽、肽、其抗体和片段以及特别包括表位多肽)的情境中时，是指具有与第二试剂相似或相同的功能，但不一定包含与第二试剂相似或相同的氨基酸序列、修饰例如糖基化或二级、三级或四级结构的试剂。具有相似氨基酸序列的蛋白质试剂是指满足下列至少之一的蛋白质试剂：(a)具有与第二蛋白质试剂的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一的氨基酸序列的蛋白质试剂；(b)由在严格条件下与编码至少3个连续氨基酸残基、至少4个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少6个连续氨基酸残基、至少7个连续氨基酸残基、至少8个连续氨基酸残基、至少9个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少11个连续氨基酸残基、至少12个连续氨基酸残基、至少13个连续氨基酸残基、至少14个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少16个连续氨基酸残基或更多的第二蛋白质试剂的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的蛋白质试剂；和(c)由与编码第二蛋白质试剂的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一的核苷酸序列编码的蛋白质试剂。与第二蛋白质试剂具有相似结构的蛋白质试剂是指具有与第二蛋白质试剂相似的二级、三级或四级结构的蛋白质试剂。多肽的结构可通过本领域技术人员已知的方法来测定，所述方法包括但不限于肽测序、X射线晶体学、核磁共振、圆二色性和晶体学电子显微镜术(crystallographicelectronmicroscopy)。

为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的数目的函数(即，百分比同一性＝同一重叠位置的数目/位置的总数x100％)。在某些实施方案中，两个序列长度相同。

两个序列之间的百分比同一性的测定还可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul的算法，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268，如同Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中改进的。将这样的算法整合至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。

如本文中所用，术语“衍生物”，在多肽的情境中(包括表位多肽)也指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加改变的氨基酸序列的多肽或肽。如本文中所用，术语“衍生物”还指已被修饰(即，通过将任何类型的分子共价连接至多肽或肽)的多肽或肽。例如，但非限制性地，多肽可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白质等。衍生多肽或肽可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来产生，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生多肽或肽衍生物具有与其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。

如本文中所用，“衍生物”与“变体”可互换地使用。

如本文中所用，术语“片段”是指这样的肽或多肽，所述肽或多肽包含另一个多肽的氨基酸序列的至少3个连续氨基酸残基、至少4个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少6个连续氨基酸残基、至少7个连续氨基酸残基、至少8个连续氨基酸残基、至少9个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸、至少11个连续氨基酸残基、至少连续12个氨基酸残基、至少连续13个氨基酸残基、至少连续14个氨基酸残基、至少连续15个氨基酸残基、至少16个连续氨基酸残基、至少连续20个氨基酸残基、至少连续25个氨基酸残基、至少连续30个氨基酸残基或更多的氨基酸序列。在具体的实施方案中，多肽的片段保持多肽的至少一种功能。

如本文中所用，术语“重链”、“轻链”、“可变区”、“框架区”、“恒定区”等具有它们在免疫学领域中的普通含义，并且是指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成(例如，重组)结合蛋白(例如，人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体等)的对应结构域。天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本结构单元是具有2个轻链(L)和2个重链(H)的四聚体，通常表达为约150,000Da的糖蛋白。每一条链的氨基末端(“n”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端(“c”)部分定义恒定区，轻链具有单个恒定结构域，重链通常具有3个恒定结构域和铰链区。因此，每一个轻链通常由可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)构成；而每一个重链通常包括可变结构域(VH)和3个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)以及铰链区(H)。因此，免疫球蛋白分子例如IgG的轻链的结构为n-V_L--C_L-c并且免疫球蛋白分子例如IgG的重链的结构为n-V_H--C_H1--H--C_H2--C_H3-c(其中H为铰链区)。抗体或抗体片段的可变区包括互补决定区(CDR)(其包含与抗原接触的残基)，和非CDR区段(称为框架区段或框架区(FR或FwR)，其通常维持CDR环的结构和确定其定位(尽管某些框架残基也可接触抗原))。因此，V_L和V_H结构域具有结构n-FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4-c。

抗体片段可从完整的常规IgG产生，并包括抗原结合片段、Fc结构域、Fab片段(F(ab))、F(ab’)片段、单链Fv片段(scFv)(VH-VL二聚体)、仅重链结构域、仅轻链结构域、以及单个(单一)结构域，例如，VH结构域、VL结构域、CH₁结构域、CH₂结构域、CH₃结构域、CL结构域等。

术语“抗体单结构域”、“单结构域抗体”或“sdAb”是指包含抗体的VH或VL结构域或由所述结构域组成的抗体片段，即单个单聚体可变抗体结构域。像完整抗体一样，抗体单结构域可免疫特异性地结合特定抗原。然而，与完整抗体不同，抗体单结构域不显示补体系统触发的细胞毒性，因为它们缺少Fc区域。两个或更多个抗体单结构域可组合以产生二聚体及其更高级的结构。

如本文中所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”、“特异性识别”和类似术语是指在生理条件下特异性结合抗原(例如，表位多肽或表位多肽的融合蛋白)并且不特异性结合另一种分子的分子。可以例如通过免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定特异性结合抗原的分子。特异性结合抗原的分子可以以更低的亲和力(如通过例如免疫测定、酶联免疫斑点法、BIAcore或本领域已知的其它测定确定的)结合其它肽或多肽。在一些实施方案中，特异性结合抗原的分子与其它分子(例如来自其它物种的类似蛋白质)交叉反应。

如本文中所用，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA与RNA分子的组合或杂交DNA/RNA分子，以及DNA或RNA分子的衍生物。这样的衍生物可使用例如核苷酸(其包括但不限于肌苷或三苯甲基化的碱基)来产生。这样的衍生物还可包括含有经修饰的主链的DNA或RNA分子，所述经修饰的主链给分子提供了有益的特性，例如核酸酶抗性或增强的穿过细胞膜的能力。核酸或核苷酸序列可以是单链、双链的，可包含单链和双链部分，并且可包含三链部分，但优选是双链DNA。

“分离的”或“纯化的”分子大体上不含来自分子所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染物，或当化学合成时，大体上不含化学前体或其它化学品。语言“大体上不含细胞材料”包括下述分子制剂，其中分子与其所从中分离或重组产生的细胞的细胞组分分离。因此，大体上不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的污染性蛋白质的制剂。当重组地产生分子(通常为蛋白质)时，其通常也大体上不含培养基，即培养基代表少于约30％、20％、10％或5％的制剂体积。当分子通过化学合成产生时，其通常大体上不含化学前体或其它化学品，即，其与化学前体或参与分子合成的其它化学品是分离的。因此，这样的制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的化学前体或除目标分子外的化合物。在本发明的某些实施方案中，多肽、蛋白质，特别是融合蛋白是分离的或纯化的。

如本文中所用，术语“受试者”、“宿主”和“患者”可互换地使用。受试者通常是哺乳动物例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)，最通常为人。所述“受试者”可以指患者或者其它接受本发明的产品和/或方法以治疗、预防、减轻、缓解和/或诊断、鉴定本申请所述疾病或病症的动物。

术语“广谱亲和表位多肽”是指识别该表位多肽区段的单抗或多抗血清能够与不同基因型或血清型的人肠道病毒结合。

术语“调控序列”定义为包括表达本发明的抗原表位所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。

术语“广谱亲和单克隆抗体”是指由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体，并且能与不同基因型或血清型的人肠道病毒结合。

在本申请中，术语“结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。

在本申请中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

附图说明

图1：位于人肠道病毒蛋白2C内的氨基酸序列A01(肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170，对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1266-1281)：YSLPPDPDHFDGYKQQ(SEQIDNO:1)、位于人肠道病毒蛋白3C内的氨基酸序列A02(肠道病毒非结构蛋白3C的aa159-166，对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1707-1714)：GIHIGGNG、位于人肠道病毒蛋白3D内的氨基酸序列A03(肠道病毒非结构蛋白3D的aa297-307，对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa2028-2038)：FNSMINNIIIR的保守性分析图。

图2：显示针对PA01、PA02和PA03多肽的抗血清对感染肠道病毒的RD细胞的免疫荧光图。

图3：C149-2C(aa155-170)的质粒构建流程图和质粒示意图。

图4：显示蛋白C149和C149-2C(aa155-170)的SDS-PAGE电泳图(泳道1、2)，其中，泳道1的样品为纯化的C149蛋白；泳道2的样品为纯化的C149-2C(aa155-170)融合蛋白；泳道M为蛋白质Marker。

图5：C149-2C(aa155-170)和C149重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图(放大25,000倍)。其中，图A的样品为由蛋白C149组装的类病毒颗粒；图B的样品为由融合蛋白C149-2C(aa155-170)组装的类病毒颗粒。

图6：显示C149-2C(aa155-170)融合蛋白抗血清对感染肠道病毒的RD细胞的免疫荧光图。

图7：显示筛选到的单克隆抗体L8F12稀释1000倍后与合成多肽2C(aa155-170)之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度矩形图。

图8：显示单抗L8F12对感染肠道病毒的RD细胞的免疫荧光图。

图9：显示单抗L8F12通过ELISPOT检测被病毒感染的RD细胞的斑点数。

图10：显示单抗L8F12通过免疫组织化学法检测被病毒感染的动物组织，检测的组织部位包括大脑、脊髓和肌肉。

序列信息

本申请涉及的序列的描述提供于表1中。

表1

SEQ ID NO:	序列描述
		1	肠道病毒非结构蛋白2C的aa 155-170
2	编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列
		3	编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列
4	HBcAg蛋白的aa 1-149
		5	编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列
6	连接子
		7	引物
8	引物
		9	融合蛋白C149-2C(aa155-170)的氨基酸序列
10	肠道病毒非结构蛋白2C的氨基酸序列
		11	HBcAg蛋白的氨基酸序列
12-15	引物
		16	重链CDR1
17	重链CDR2
		18	重链CDR3
19	轻链CDR1
		20	轻链CDR2
21	轻链CDR3
		22-85	不同病毒株的肠道病毒非结构蛋白2C的aa 155-170

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国武汉，武汉大学)进行保藏的生物材料：杂交瘤细胞株L8F12，其具有保藏号CCTCCNO:C2014101，且保藏时间为2014年5月21日，保藏地址为武汉市武昌珞珈山(邮编430072)。

具体实施方案

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应被视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：人肠道病毒高保守多肽的设计

本实施例对不同血清型的人肠道病毒基因组氨基酸序列采用Clustal软件进行同源性分析。使用的毒株序列包括EV71、CVA16、CVA2、CVB3、E30等共65株病毒，具体信息如表2所示。经同源性分析，筛选到3个高度保守的肽段：即，位于人肠道病毒蛋白2C内的氨基酸序列A01(肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170，对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1266-1281)：YSLPPDPDHFDGYKQQ(SEQIDNO:1)；位于人肠道病毒蛋白3C内的氨基酸序列A02(肠道病毒非结构蛋白3C的aa159-166，对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1707-1714)：GIHIGGNG；和位于人肠道病毒蛋白3D内的氨基酸序列A03(肠道病毒非结构蛋白3D的aa297-307，对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa2028-2038)：FNSMINNIIIR。这三个肽段的氨基酸序列(其肽段长度分别为16、8和11个氨基酸)在65株病毒中均具有极高的保守性和同源性。特别地，这三个肽段各自的氨基酸序列中，各个氨基酸位置的保守性大部分都超过90％(图1)。

表2.氨基酸序列比对中选取的病毒株信息

为方便起见，上述65株病毒的肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170分别提供于SEQIDNO:1和22-85(表3)。

表3.65株病毒的非结构蛋白2C的aa155-170的氨基酸序列

实施例2：人肠道病毒高保守多肽抗血清的制备

根据实施例1中筛选到的三个肽段的氨基酸序列，设计合成了3个多肽，编号为:PA01(下文中也称为2C(aa155-170))、PA02和PA03(由上海博亚公司进行合成)。将合成肽蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫5只小鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只小鼠，初免混合弗氏完全佐剂(购自Sigma)，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂(购自Sigma)，共加强三针，在第三针加强后的第11天采血。

实施例3：鉴定人肠道病毒高保守多肽抗血清与人肠道病毒的结合活性

将实施例2中的多肽抗血清对不同代表性的肠道病毒采用免疫荧光进行检测。我们选择了JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、141(CA6)、09-5428(CB5)和PV1六种代表性肠道病毒(这些肠道病毒均来自厦门CDC或台湾CDC)，免疫荧光方法步骤如下：

将培养在含10％FBS(PAA)的MEM(GIBCO)培养基中的RD细胞以4×10⁵/mL的密度铺于24孔细胞培养板(NUNC)中，2×10⁵/孔；12h后，每孔感染20000TCID₅₀的肠道病毒；12h后吸去培养基，用固定液(含有4％多聚甲醛的PBS溶液)固定，室温避光静置30min；30min后吸去固定液，加入1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置10min；10min后吸去通透液，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入封闭液(含有4％胎牛血清的PBS溶液)封闭，放置于37℃中反应1h；1h后吸去封闭液，加入以1:200稀释的多肽免疫抗血清，放置于37℃中反应1h；1h后吸去血清，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入FITC偶联的羊抗鼠抗体，以1:500稀释，放置于37℃中反应0.5h；0.5h后吸去抗血清，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入DAPI，以1:2000稀释，室温避光静置5min；5min后吸去DAPI，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；封片后在荧光显微镜下进行结果观察。结果示于图2中。

图2的结果显示，仅针对多肽PA01的抗血清能够交叉结合六种代表性肠道病毒感染的RD细胞，显示出绿色荧光；而针对多肽PA02或PA03的抗血清不能交叉结合六种代表性肠道病毒感染的RD细胞，未显示出绿色荧光。这一结果表明：(1)抗多肽PA01(即多肽2C(aa155-170))的免疫血清能够特异性交叉结合不同亚型的肠道病毒；多肽PA01可能含有广谱亲和表位；和，(2)抗多肽PA02或PA03的免疫血清无法特异性交叉结合不同亚型的肠道病毒；多肽PA02和PA03不含广谱亲和表位。这些结果还表明，并非所有的保守性肽段都包含广谱亲和表位。相反地，在很多情况下，保守性肽段(例如PA02和PA03)不能用作广谱亲和表位，无法诱发广谱亲和抗体的产生。基于上述实验结果，选择2C(aa155-170)多肽用于进行下一步实验。

上述六种代表性肠道病毒的GenBank登录号如下：

JS06-52-3(EV71)：FJ600325。

TW07-00190(CA16)：JF420566。

XM08-2035(CB3)：JQ042700。

141(CA6)：JF420565

09-5428(CB5)：JQ042699

PV1：V01149.1。

实施例4：人肠道病毒广谱亲和多肽抗血清用于检测人肠道病毒的感染和滴度

在稀释度足够的情况下，肠道病毒感染细胞后通过酶联免疫斑点法可以使被感染细胞带有能够被Elispot检测的信号，带有信号的阳性细胞数即被感染细胞数可以认为是在该次感染实验中使用了多少感染单位的肠道病毒。我们以梯度稀释斑点计数方法检测肠道病毒的滴度。本实施例中我们选择了实施例3中的六种肠道病毒，进行感染滴度的测定。具体步骤如下：

将RD细胞铺于96孔细胞培养板中，2×10⁴个/孔，培养基为MEM培养基。37℃培养10小时。取病毒培养原液一份，用无血清MEM培养基10倍连续稀释4个梯度，最终使每100μL培养基中分别含有100μL、10μL、1μL、0.1μL、0.01μL5个浓度梯度的病毒稀释液。将各梯度的病毒稀释液取50μL加入预铺于96孔细胞培养板中的RD细胞中，每个梯度采取4孔重复。将96孔板放入37℃培养。培养14小时后，酶联免疫斑点法检测：

(1)吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h。

(2)1h后吸去固定液，每孔中加入100μL1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5h。

(3)0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。

(4)在每个孔中加入100μL2C(aa155-170)多肽抗血清，多肽抗血清用酶稀(成分为20mMPBS+0.5％酪蛋白+2％明胶+0.1％防腐剂的缓冲液，下同)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h。

(5)每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入100μL酶标记的羊抗鼠单克隆抗体GAM-HRP，酶标抗体GAM-HRP(1.9mg/mL)用酶稀稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h。

(6)1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μLTMB显色液，放置在37℃中显色15min。

(7)15min后吸弃板中的显色液终止显色。

(8)启动斑点检测仪器ELISPOT(型号：Series3B)，将进行显色反应后的细胞培养板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。ELISPOT的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。

(9)实验对照为未进行感染实验的RD细胞。

肠道病毒效价计算方法：感染效价(IU/mL)＝检测孔被感染细胞数/检测孔病毒原液用量(mL)。其中，检测孔被感染细胞数＝检测孔平均显色细胞数-阴性孔平均显色细胞数。上述公式中“检测孔被感染细胞数”和“检测孔病毒原液用量”选择被感染细胞数最接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数与其对应的肠道病毒原液的用量。

本实施例选择JS06-52-3(EV71)病毒进行效价检测，结果如表4所示，病毒原液用量对应的为被感染细胞的数量(为4孔平均值)，代入上述公式即可计算获得该病毒效价为3.73×10⁵(IU/mL)。

表4.肠道病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系

实施例5：人肠道病毒广谱亲和多肽抗血清用于检测人肠道病毒中和抗体效价

本实施例中我们将2C(aa155-170)多肽抗血清用于酶联免疫斑点法，检测人肠道病毒中和抗体效价。该方法具有高效、准确的优点，同时更有利于提高工作效率，更适合于对不同亚型的肠道病毒进行高通量检测。具体方法描述如下：

(1)将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。

(2)10小时后将待检测的样品(单克隆抗体样品、血清样品、腹水样品、细胞培养上清液样品、细胞裂解液样品等)用无血清MEM进行梯度稀释(以单抗原液起点，进行2倍比稀释，稀释8个梯度)。

(3)各孔取50μL与50μL稀释于无血清MEM的肠道病毒(5000TCID50)混合。37℃混合孵育2小时。

(4)加入预铺RD细胞的96孔细胞培养板中，培养14小时后进行酶联免疫斑点反应。

(5)吸去各孔中的培养基，每孔加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h。

(6)吸去固定液，每孔中加入100μL1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置30min。

(7)吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。

(8)在每个孔中加入100μL2C(aa155-170)多肽抗血清，多肽抗血清用酶稀稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h。

(9)每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入100μL酶标记的羊抗鼠单克隆抗体GAM-HRP，酶标抗体GAM-HRP(1.9mg/mL)用酶稀稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h。

(10)吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入100μLTMB显色液，放置在37℃中显色15min。

(11)吸弃板中的显色液，终止显色。

(12)启动斑点检测仪器ELISPOT，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。详细操作步骤见ELISPOT仪器的操作说明书。

(13)未进行感染实验的RD细胞作为阴性孔，只进行EV71感染的RD细胞为阳性孔，每个96孔板各设置5个孔。

(14)以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。

(15)各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％。样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。

本实施例随机选取了5份江苏疾病预防控制中心(CDC)的手足口病(HFMD)病人血清分别进行EV71、CVA16、CVB3的中和检测。HFMD病人的血清样品中和抗体的检测结果显示(表5)，病人血清能够中和EV71、CVA16及CVB3中的一种或几种。

表5.临床血清背景资料及中和抗体滴度检测结果

实施例6：人肠道病毒广谱亲和表位多肽与HBVcAg蛋白的融合表达

1.pTO-T7-C149表达载体的构建

本领域人员知悉，HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayorimmunodominantregion，78-83aa)的融合不会改变其颗粒的多聚特性、抗原活性和免疫原性，且可使外源表位暴露于颗粒表面(参考文献Fu,T.M.,K.M.Grimm,etal.(2009)."ComparativeimmunogenicityevaluationsofinfluenzaAvirusM2peptideasrecombinantviruslikeparticleorconjugatevaccinesinmiceandmonkeys."Vaccine27(9):1440-1447；Jin,H.,W.Xiao,etal.(2007)."Protectiveimmuneresponsesagainstfoot-and-mouthdiseasevirusbyvaccinationwithaDNAvaccineexpressingvirus-likeparticles."ViralImmunol20(3):429-440；和Yin,Y.,J.Xu,etal.(2010)."[HepatitisBviruscoreproteinasanepitopevaccinecarrier:areview]."ShengWuGongChengXueBao26(4):431-438)。

HBcAg的氨基酸序列可参见GenBankNo.AAF82721.1，具体如下：

MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVVRRRCRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQIDNO:11)。

其中HBcAg的1-149aa在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达，其氨基酸序列参见GenBankNo.AF233235，具体如下：

HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQIDNO:4)；

其对应的核苷酸序列如下：

catATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCTTTGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA(SEQIDNO:5)。

利用HBcAg的aa1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本发明人将该149氨基酸插入大肠杆菌表达载体pTO-T7(此载体的制备步骤见参考文献罗文新，张军，杨海杰等，一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J]。生物工程学报，2000，16(5):578-581)(也可以使用其它本领域常用的大肠杆菌表达载体)中，并以连接子(GGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGG(SEQIDNO:6))替代HBcAgB细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸(其对应氨基酸为PA)，并在265nt－270nt处引入GGATCC，274nt－279nt处引入GAATTC(相对pTO-T7-C149)以引入两个限制性内切酶识别位点(BamHⅠ和EcoRⅠ)构建了突变型HBc表达质粒pTO-T7-C149。外源蛋白在C149第93个氨基酸处插入。

对肠道病毒非结构蛋白2C(aa155-170)区段进行引物设计(表6)，插入HBcAg蛋白中得到的融合蛋白称为C149-2C(aa155-170)。

肠道病毒(JS06-52-3(EV71))非结构蛋白2C的氨基酸序列如下：

SASWLKKFNDMANAAKGLEWVSNKISKFIDWLKEKIVPAAKEKVEFLNNLKQLPLLENQISNLEQSAASQEDLEVMFGNVSYLAHFCRKFQPLYATEAKRVYALEKRMNNYMQFKSKHRIEPVCLIIRGSPGTGKSLATGIIARAIADKYHSSVYSLPPDPDHFDGYKQQVVTVMDDLCQNPDGKDMSLFCQMVSTVDFIPPMASLEEKGVSFTSKFVIASTNASNIIVPTVSDSDAIRRRFYMDCDIEVTDSYKTDLGRLDAGRAAKLCSENNTANFKRCSPLVCGKAIQLRDRKSKVRYSVDTVVSELIREYSNRSAIGNTIEALFQ(SEQIDNO:10)。

表6：C149-2C(aa155-170)表面多肽融合蛋白的克隆引物序列

对合成2C(aa155-170)区段的上下游引物通过互搭，获得具有BamHⅠ和EcoRⅠ粘性末端的片段(克隆构建的具体方法步骤参照参考文献，XuL,etal.2014.ProtectionagainstLethalEnterovirus71ChallengeinMicebyaRecombinantVaccineCandidateContainingaBroadlyCross-NeutralizingEpitopewithintheVP2EFLoop.Theranostics4:498-513.)。各取1μL的上下游引物，同时加入48μL的结合缓冲液(100mMNaCland50mMHEPESpH7.4)，混合后于90℃中反应4min,然后置于70℃反应10min，缓慢地降到室温。同时以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pTO-T7-C149，回收载体后与互搭好的片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566，进行表达鉴定及质粒酶切鉴定(同时以pTO-T7-C149为空白对照)，鉴定正确的质粒即插入所需的目的片段，分别命名为C149-2C(aa155-170)，构建流程如图3。

C149-2C(aa155-170)融合蛋白的氨基酸序列为：

HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSYSLPPDPDHFDGYKQQEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQIDNO:9)(其中斜体为插入的片段)。将上述表达质粒的ER2566菌以及含pTO-T7-C149空质粒的ER2566菌，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按1:1000的比例转接扩大培养至500mLLB(含有硫酸卡那霉素)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG500μL，25℃诱导6h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用10mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件：工作时间：3min/瓶；脉冲：打2sec，停5sec；输出功率：60％。12000rpm离心10min，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白均为上清表达(图4)。

由于表达上清中含有很多杂蛋白，本发明人采用以下方式进行纯化并促进蛋白自发组装形成颗粒：将超声离心后得到上清至于65℃水浴中热变性30min，12000rpm离心10min。然后将纯化后的蛋白在20mMPB6.0含0.3MNaCl的条件下促进蛋白自发组装形成颗粒，再进行电镜观察，组装成功的颗粒呈均匀的空心球体，见图5。

将经过纯化并组装的融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫5只小鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂(购自Sigma)，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂(购自Sigma)，共加强三针，在第三针加强后的第11天采血。

实施例7：人肠道病毒广谱亲和表位多肽与HBVcAg蛋白的融合表达蛋白的免疫血清与人肠道病毒的结合活性

将实施例6中的C149-2C(aa155-170)融合蛋白抗血清对不同代表性的肠道病毒采用免疫荧光进行检测。免疫荧光方法步骤参照实施例3。结果证明多肽抗血清能够交叉结合JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、141(CA6)、09-5428(CB5)和PV1六种代表性肠道病毒，感染的RD细胞显示出绿色荧光，而未感染肠道病毒的RD细胞对照则没有任何反应，说明C149-2C(aa155-170)融合蛋白的免疫血清能够特异性交叉结合不同亚型的肠道病毒(图6)。这一结果表明，载体蛋白能够以类病毒颗粒的形式来呈递本发明的表位多肽。

实施例8：人肠道病毒广谱亲和表位多肽与HBVcAg蛋白的融合表达蛋白的免疫血清用于检测人肠道病毒的感染和滴度

将实施例6中的C149-2C(aa155-170)融合蛋白抗血清以梯度稀释斑点计数方法检测肠道病毒的滴度。本实施例中我们选择了实施例3中的六种肠道病毒，进行感染滴度的测定。具体步骤见实施例4。实验结果示于下面的表7中。

表7.肠道病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系

根据上述实验结果可知，JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、141(CA6)、09-5428(CB5)和PV1六种代表性肠道病毒的病毒效价分别为4.06×10⁵(IU/mL)、4.52×10⁵(IU/mL)、6.3×10⁵(IU/mL)、4.44×10⁵(IU/mL)、4.74×10⁵(IU/mL)和4.36×10⁵(IU/mL)。本实施例的结果表明，针对融合蛋白C149-2C(aa155-170)的抗血清能够测定出不同代表性肠道病毒的感染滴度。

实施例9：人肠道病毒广谱亲和表位多肽与HBVcAg蛋白的融合表达蛋白的免疫血清用于检测人肠道病毒中和抗体效价

利用酶联免疫斑点法，本实施例中我们将C149-2C(aa155-170)融合蛋白抗血清用于检测人肠道病毒中和抗体效价。具体方法描述参考实施例5。

本实施例随机选取了5份江苏CDC的手足口病病人血清分别进行EV71、CVA16、CVB3的中和检测。采用融合蛋白抗血清检测HFMD病人的血清样品中和抗体结果显示(表8)，病人血清能够中和EV71、CVA16及CVB3中的一种或几种。

表8.临床血清背景资料及中和抗体滴度检测结果

实施例10：抗人肠道病毒广谱亲和表位多肽的单克隆抗体的制备

(1)小鼠免疫

1、免疫原的准备：参照实施例6的融合蛋白的制备和免疫方法，初次免疫时使用福氏完全佐剂，后续加强免疫使用福氏不完全佐剂，融合前72h的最后一次免疫加强时不加佐剂。

2、小鼠的基础免疫：对6-8周龄BALB/c雌鼠使用上述病毒免疫原进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等，注射剂量为500μL/只/次。每隔2周加强免疫一次，每次免疫前采集200μL眼框静脉血或20μL尾静脉血以备滴度测定。当小鼠血清滴度达到平台期后，停止免疫，休息两个月后进行融合。

3、单抗融合前72h的加强对激发抗体应答十分重要，需在融合前72h对小鼠免疫加强。直接用100μL0.5mg/mL的重组蛋白对小鼠进行尾静脉注射或脾脏免疫。脾脏免疫前，需先用乙醚麻醉小鼠，剖开腹腔外皮取出脾脏，沿脾脏纵向注射100μL抗原，迅速手术缝合腹皮切口

(2)融合杂交瘤的制备和筛选

1、小鼠巨噬细胞的制备：(ⅰ)将一只6周龄左右的BALB/c小鼠处死，自来水冲洗后，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，腹部朝上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，并用大镊子向上下方向撕拉开皮肤，充分暴露腹部。(ⅱ)用无菌镊子提起腹膜，换一把剪刀将腹膜中央处剪一小口，用1mL吸管通过小口向腹腔内注入适量培养液，用吸管小心在腹腔内搅动，最后吸出培养液于离心管中。(ⅲ)将腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，使终浓度为2×105/mL。(ⅳ)将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。

2、小鼠胸腺细胞的制备：(ⅰ)将一只13天龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，腹部朝上。(ⅱ)用镊子提起小鼠腹部皮肤，将腹部和胸部的外皮剪开。(ⅲ)用另一把干净的剪刀剪开胸腔，用镊子取出乳白色的胸腺。将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液。

3、小鼠骨髓瘤细胞的制备：(ⅰ)小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)易培养，融合率高，是目前最理想的融合细胞，但要注意该细胞在过度稀释(密度低于3×10⁵/mL)和pH碱性(pH>7.3)条件时会生长不良。(ⅱ)用20％FBSRPMI-1640培养液培养骨髓瘤细胞。当细胞数在104-10⁶/mL时，细胞呈对数生长，此时细胞浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布。一般在细胞处于对数生长中期时(约1×10⁵-5×10⁵/mL)，可按1:5–1:10的比例进行稀释传代。选处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合用。融合骨髓瘤细胞的活细胞数应达95％以上。(ⅲ)融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm，5min)。用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。(ⅳ)一般从融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm2Sp2/0细胞。

4、免疫脾细胞的制备：(ⅰ)取待融合的BALB/C小鼠，摘除眼球放血致其死亡，收集血液制成抗血清，可作为抗体检测的阳性对照。自来水冲洗小鼠并浸泡于75％乙醇溶液中5min，随即放入超净台内解剖板上，右侧卧位。(ⅱ)打开腹腔取出脾脏，用剪刀将其剪成小块放于200目细胞筛网上，再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨。用吹管滴加RPMI-1640培养液。(ⅲ)补加适量的RPM-1640培养液，静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复2–3次。(ⅳ)用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm离心10min)。(ⅴ)用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。

5、使用PEG促融剂融合制备杂交瘤：(ⅰ)融合前先将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL完全培养基平衡至37℃。(ⅱ)将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50mL离心管内(1×108脾细胞和1×107骨髓瘤细胞，约10:1)，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。(ⅲ)吸取0.8mLPEG加入离心管内，在60s内加完，边加边轻轻搅拌。随即加入10mL预温至37℃的RPM-1640完全培养液，温和搅拌。最后补加RPMI-1640培养液至40mL，1000rpm离心5min。(ⅳ)弃上清，取少量HT培养液将细胞吹散，之后将准备好的HT培养液加入。将细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养。(ⅴ)12h后，配置HAT完全培养基，每个孔中滴加100μL。5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清进行50-100％的换液。9-14天后，吸取上清进行检测。

6、杂交瘤的筛选：使用间接ELISA筛选，包被重组抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，并挑选出阳性克隆孔。

7、杂交瘤细胞的克隆化：在筛选出的含阳性上清的培养孔中通常是二个以上的杂交瘤集落。其中有的集落可能不分泌抗体或分泌非实验所要的抗体，只有其中某一个集落才是分泌特异抗体的杂交瘤细胞。因此，须利用克隆培养方法把它们分开，选出所需的杂交瘤细胞。最常用的克隆培养方法是有限稀释法。先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。一般杂交瘤单克隆阳性细胞株需要重复克隆2-3次，直到100％阳性后才算是稳定克隆株。得到了稳定的杂交瘤细胞株L8F12，其保藏编号为CCTCCNO:C2014101，保藏日期为2014年5月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌珞珈山(邮编430072)。

(3)单抗腹水的诱导

1、取BALB/c小鼠2-3只，腹腔注入0.5mL液体石蜡油。

2、1周后，处理对数生长期的杂交瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清液。用无血清培养液悬浮杂交瘤细胞，并将细胞数调至(1-2)×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。

3、7-10天，小鼠腹部明显膨大后，引颈处死小鼠。将小鼠用自来水冲洗，浸泡于75％乙醇中5min。使小鼠腹部朝上，用注射针头将小鼠四肢固定于解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠背部方向剪开，用大镊子撕开皮肤，充分暴露腹部。用无菌眼科镊子提起腹膜，在腹膜中央处剪一小口，然后用1mL吸管通过小口吸出腹腔内全部腹水。将所有腹水混合放入离心管中，3000rpm离心20min，之后收集上清。

(4)单抗腹水的纯化:将腹水用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和ProteinA亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得纯化的单克隆抗体(表9)。

表9.单抗信息

(5)单抗的HRP标记：操作均在避光条件下进行：(ⅰ)称取xmgHRP干粉溶于x/20mLddH2O中。(ⅱ)称取ymg(y>x)，溶于y/20mL的ddH2O中。取x/20mL的NaIO4溶液与x/20mL的HRP缓慢混合，4℃下静置30min。(ⅲ)加入xμL乙二醇，室温避光静置30min。(ⅳ)加入等量体积即(x/20+x/20+0.05)mLCB(pH9.6，50mM)，使溶液的pH值在碱性条件下。(ⅴ)将离心管中的反应液移至含抗体的透析袋中，4℃CB透析4h，换液1次。(ⅵ)x/5mgNaBH4溶于10xμL的ddH2O中并加进透析袋，4℃静置2h，每30min摇动1次。(ⅶ)用50％的SAS离心，取沉淀(注意将SAS倒扣干净,以免残留的SAS影响抗体)。加入500μL的缓冲液(50％甘油和10％NBS)，-20℃保存。

(6)Anti-C149-2C(aa155-170)小鼠单克隆抗体的性质分析

1、将实施例2的合成肽分别以1μg/孔的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用封闭液(20mMPB7.4含150MmNaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。

2、将上面得到的抗体酶标记物以1:1000稀释(稀释液配方同封闭液)后加100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值。结果示于图7。图7的结果显示，单抗L8F12能够与肽段结合且具有良好的活性。接下来的实施例选用L8F12完成。

实施例11：抗人肠道病毒广谱亲和表位多肽的单克隆抗体与人肠道病毒的结合活性

将实施例10中的单克隆抗体L8F12对不同代表性的肠道病毒采用免疫荧光进行检测。免疫荧光方法步骤参照实施例3。结果证明L8F12能够交叉结合JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、PV1四种肠道病毒感染的RD细胞，显示出绿色荧光，而未感染肠道病毒的RD细胞对照则没有任何反应，说明识别2C(aa155-170)表位的L8F12单克隆抗体能够特异性交叉结合不同亚型的肠道病毒(图8)。这些结果表明，L8F12是广谱亲和抗体，并且2C(aa155-170)含有广谱亲和表位。

实施例12：抗人肠道病毒广谱亲和表位多肽的单克隆抗体用于检测人肠道病毒的感染和滴度

将实施例10中的单克隆抗体L8F12以梯度稀释斑点计数方法检测肠道病毒的滴度。本实施例中我们选择了实施例3中的六种肠道病毒，同时增加了3352(CA2)、4629(CA9)和09-3985(CB2)三个毒株(该三个毒株来源于台湾CDC)，进行感染滴度的测定。具体步骤见实施例4。本实施例结果显示单抗L8F12能够测定出不同代表性肠道病毒的感染滴度(图9)。

上述增加的三种代表性肠道病毒的GenBank登录号如下：

3352(CA2)：JF420570。

4629(CA9)：JQ042702。

09-3985(CB2)：JQ042701。

实施例13：抗人肠道病毒广谱亲和表位多肽的单克隆抗体用于检测人肠道病毒中和抗体效价

利用酶联免疫斑点法，本实施例中我们将L8F12用于检测人肠道病毒中和抗体效价。具体方法描述参考实施例5。

本实施例随机选取了5份江苏CDC的手足口病病人血清分别进行EV71、CVA16、CVB3的中和检测。采用融合蛋白抗血清检测HFMD病人的血清样品中和抗体结果显示(表10)，病人血清能够中和EV71、CVA16及CVB3中的一种或几种。

表10.临床血清背景资料及中和抗体滴度检测结果

该5份样品性别及年龄采集时未记录

实施例14：人肠道病毒广谱亲和表位多肽的单克隆抗体用于检测肠道病毒感染的动物组织

将实施例10获得亲和单抗L8F12用于肠道病毒感染的小鼠的免疫组织化学检测，本实施例选择肠道病毒EV71进行检测，方法步骤如下：

1日龄新生BALB/c小鼠通过腹腔方式攻毒EV71-B3亚型(GenebankNo.AB469182)的鼠适应株pSVA-MP4，攻毒剂量为10⁷TCID₅₀，对照组攻毒等体积的PBS缓冲液。每组均含8只小鼠。在攻毒后第6天，将小鼠处死，将脏器充分暴露后浸泡于福尔马林溶液中室温静置72小时。将固定后的组织进行脱水，包埋于蜡块后进行切片(4μm厚)。检测用免疫组织化学超敏试剂盒及生物素-链霉素DAB染色试剂均购自福州迈新生物科技有限公司，免疫组织化学检测步骤按照试剂盒说明书进行。检测用一抗为针对2C的广谱亲和单抗L8F12，检测用浓度为1mg/mL，稀释度为1：1,1000。

结果如图10所示，在感染EV71的小鼠的大脑、脊髓和肌肉中发现了阳性染色信号，而未感染EV71的小鼠的大脑、脊髓和肌肉检测结果为阴性。说明针对2C的广谱亲和单抗能特异性得检测出被肠道病毒感染的小鼠组织，能够应用于肠道病毒感染的免疫组织化学检测。

实施例15：抗人肠道病毒广谱亲和表位多肽的单克隆抗体的轻链及重链可变区的序列测定

半贴壁培养10⁷个L8F12鼠源杂交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使之悬浮，将其转移到新的4ml离心管中，并1500rpm离心3min。收集沉淀的细胞，重悬于100μl无菌PBS(pH7.45)中，并转移到一新的1.5ml离心管中，加入800μlTrizol(Roche，Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10min。加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，静置10min，4℃12000rpm离心15min，转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。4℃12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70μlDEPCH₂O中，加入1μl反转录引物Oligo(dT)_(12-18)(Promega)，1μldNTP(上海生工)，置于72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min，加入20μl5X反转录缓冲液，2μlAMV(10U/μl,Promega)，1μlRnasin(40U/μl,Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。

轻链基因的分离使用上述cDNA为模板，以MVkF-F4为上游引物，以MVkR-M13为下游引物，进行PCR扩增，获得一条大小约500bp的DNA片段，PCR条件为：95℃3min，23个循环的(95℃15s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。回收后进行测序。序列经blast比对后确定为L8F12的轻链序列。

重链基因的分离使用上述cDNA为模板，以MVhF-E3为上游引物，以MVhR-M13为下游引物，进行PCR扩增，获得一条大小约为500bp的DNA片段，PCR条件为：95℃3min，23个循环的(95℃15s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。回收后进行测序。序列经blast比对后确定为L8F12的重链序列。

表11.测序使用的引物

名称	序列	SEQ ID NO：
			MVkF-F4	5'-ATgAAgTTgCCTgTTAggCTgTTggTgCT-3'	12
MVkR-M13	5'-AgCggATAACAATTTCACACAggAACTggATggTgggAAgATggA-3'	13
			MVhF-E3	5'-ATgAACTTYgggYTSAgMTTgRTTT-3'	14
MVhR-M13	5'-AgCggATAACAATTTCACACAggACCAgggRCCARKggATARACNgRTgg-3'	15

进一步，使用Kabat编号系统，在测序获得的L8F12的重链序列和轻链序列中，确定了单抗L8F12的轻链及重链的CDR序列，示于表12中。

表12.单抗L8F12的轻链/重链的CDR序列

名称	序列	SEQ ID NO：
			重链CDR1	GFTFSGYW	16
重链CDR2	IRLKSDNYAT	17
			重链CDR3	TPRTKSFPY	18
轻链CDR1	KSVSTSGYSY	19
			轻链CDR2	LVS	20
轻链CDR3	CQHIRELTR	21

尽管上文中详细描述了本发明的某些具体实施方案，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对其中的细节进行各种修改和替换而不偏离本发明的精神和主旨，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的范围仅由所附的权利要求及其任何等同方案限定。

Claims (18)

1.一种分离的表位多肽或其变体，其中，所述表位多肽由肠道病毒非结构蛋白2C的连续氨基酸片段组成，并且包含肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170，并且，所述连续氨基酸片段的长度为16-30个氨基酸，例如16-25个、16-20个氨基酸；所述变体与所述表位多肽的区别在于个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代、缺失或添加，并且保留所述表位多肽的活性(例如，诱导广谱亲和抗体产生的能力)；

优选地，所述肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170如SEQIDNO：1和22-85任一项所示；

优选地，所述表位多肽或其变体包含选自下列的氨基酸序列，或由选自下列的氨基酸序列组成：

a)如SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列；

b)与SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列具有至少45％的序列同一性，例如至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

c)相对于SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列包含一个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；

优选地，所述氨基酸取代或缺失发生在一个或多个选自下列的位置处：相应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸残基的位置处(即，相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸残基的位置处)；

优选地，所述表位多肽选自：

(a)表位多肽，它为肠道病毒非结构蛋白2C的片段(其长度为16-30个氨基酸，例如16-25个或16-20个氨基酸)，并且含有肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列)；

(b)表位多肽，它是在肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列)的基础上经一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换而得到的；和

(c)表位多肽，它的氨基酸序列与肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO：1和22-85任一项所示的氨基酸序列)相异在于一个或者几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸的延伸和/或替换；

优选地，所述表位多肽或其变体具有诱导广谱亲和抗体产生的能力；

优选地，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1和22-85任一项所示；

优选地，所述变体与所述表位多肽的区别在于选自下列的位置处的一个保守性置换：相应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸残基的位置处(即，相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸残基的位置处)。

2.多肽偶联物，其包含权利要求1的表位多肽或其变体，和偶联部分；

优选地，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种；

优选地，所述多肽偶联物为融合蛋白或类病毒颗粒；

优选地，所述偶联部分为HBcAg蛋白或其片段(例如，HBcAg蛋白的aa1-149)；

优选地，所述分离的表位多肽或其变体与所述偶联部分通过连接子相连；优选地，所述连接子为肽或多肽，例如氨基酸序列如SEQIDNO:6所示的肽或多肽；

优选地，所述多肽偶联物包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、其变体或衍生物。

3.分离的核酸分子，其编码权利要求1所述的表位多肽或其变体，或者权利要求2所述的多肽偶联物；

优选地，所述分离的核酸分子包含SEQIDNO：2或SEQIDNO:3中所示的核苷酸序列，其衍生物或变体，或由它们组成；

优选地，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列编码包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的融合蛋白，其衍生物或变体，或由它们组成；

优选地，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列与SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列具有至少45％的序列同一性，例如至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％的序列同一性；

优选地，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列为在如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)核苷酸而衍生的核苷酸序列；

优选地，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列可与SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO:9的核苷酸序列在严格条件下杂交。

4.重组载体，其包含权利要求3所述的分离的核酸分子，以及任选的调控序列；

优选地，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合；

优选地，所述重组载体为克隆载体或表达载体。

5.宿主细胞，其包含权利要求4所述的重组载体；

优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

6.类病毒颗粒，其能够展示权利要求1所述的表位多肽或其变体；

优选地，所述类病毒颗粒包含融合蛋白或由融合蛋白构成，所述融合蛋白包含权利要求1所述的表位多肽或其变体，以及载体蛋白；

优选地，所述载体蛋白为HBcAg蛋白或其片段(例如，HBcAg的aa1-149)；

优选地，所述融合蛋白包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、其变体或衍生物。

7.组合物，其包含权利要求1的表位多肽或其变体、权利要求2的多肽偶联物、权利要求3的分离的核酸分子、权利要求4的重组载体、权利要求5的宿主细胞和/或权利要求6的类病毒颗粒，

优选地，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料；

优选地，所述组合物为药物组合物或诊断组合物。

8.杂交瘤，其为杂交瘤细胞株L8F12，其保藏编号为CCTCCNO:C2014101，保藏日期为2014年5月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

9.抗体或其抗体片段，其能够特异性地结合权利要求1的表位多肽或其变体、权利要求2的多肽偶联物和/或权利要求6的类病毒颗粒；

优选地，所述抗体具有：(a)如SEQIDNO:16所示的重链CDR1；(b)如SEQIDNO:17所示的重链CDR2；(c)如SEQIDNO:18所示的重链CDR3；(d)如SEQIDNO:19所示的轻链CDR1；(e)如SEQIDNO:20所示的轻链CDR2；和，(f)如SEQIDNO:21所示的轻链CDR3；

优选地，所述抗体具有：(a)单克隆抗体L8F12的重链可变区，和，(b)单克隆抗体L8F12的轻链可变区，所述单克隆抗体L8F12由权利要求8所述的杂交瘤产生；

优选地，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体；

优选地，所述抗体片段选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体；

优选地，所述抗体或抗体片段为鼠源或人源或羊源或其它动物来源的；

优选地，所述抗体为单克隆抗体L8F12，其由权利要求8所述的杂交瘤产生；

优选地，所述抗体或抗体片段特异性识别病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种；

优选地，所述抗体或抗体片段为与单克隆抗体L8F12具有相同的结合特异性的抗体，例如与单克隆抗体L8F12具有相同的重链和/或轻链可变区的抗体，或者与单克隆抗体L8F12具有相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)的抗体。

10.抗体偶联物，其包括权利要求9所述的抗体或抗体片段以及偶联部分；

优选地，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种；

优选地，所述抗体偶联物特异性识别病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种。

11.试剂盒，其包含权利要求9所述的抗体或抗体片段，或者权利要求10所述的抗体偶联物。

12.组合物，所述组合物包含权利要求9的抗体或其片段或者权利要求10的抗体偶联物，

优选地，所述组合物包含药学上可接受的载体或辅料；

优选地，所述组合物为药物组合物或诊断组合物。

13.权利要求1的表位多肽或其变体、权利要求2的多肽偶联物、权利要求7的类病毒颗粒、或权利要求8的组合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断肠道病毒所致疾病和/或检测肠道病毒滴度和/或检测肠道病毒中和抗体效价的试剂(例如药物)中的用途；

优选地，所述肠道病毒为病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种；

优选地，所述疾病为手足口病。

14.权利要求9的抗体或抗体片段、权利要求10的抗体偶联物或者权利要求12的组合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断肠道病毒所致疾病和/或检测肠道病毒滴度的试剂(例如药物)中的用途；

优选地，所述肠道病毒为病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一种或多种；

优选地，所述疾病为手足口病。

15.分离的核酸分子，其包含编码权利要求9所述的抗体或抗体片段的核酸序列；

优选地，所述抗体具有：(a)如SEQIDNO:16所示的重链CDR1；(b)如SEQIDNO:17所示的重链CDR2；(c)如SEQIDNO:18所示的重链CDR3；(d)如SEQIDNO:19所示的轻链CDR1；(e)如SEQIDNO:20所示的轻链CDR2；和，(f)如SEQIDNO:21所示的轻链CDR3；

优选地，所述抗体具有：(a)单克隆抗体L8F12的重链可变区，和，(b)单克隆抗体L8F12的轻链可变区，所述单克隆抗体L8F12由权利要求8所述的杂交瘤产生。

16.一种载体，其包含权利要求15的分离的核酸分子。

17.一种宿主细胞，其包含权利要求15的分离的核酸分子，或权利要求16的载体。

18.制备权利要求9所述的抗体或抗体片段的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求17的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述抗体或抗体片段。