CN1134174A - 改构的植物病毒作为异源肽的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有插入到病毒外壳蛋白中的外源肽的装配植物病毒颗粒。插入的部位无位于插入片段两侧的直接重复序列。本发明还涉及产生装配病毒颗粒的方法及其应用，特别是在疫苗中的应用。

Description

改构的植物病毒作为异源肽的载体
本发明涉及利用病毒作为载体生产或提呈外源肽。更具体的是，本发明通过病毒核酸的遗传操作，将表达肽的外源核酸序列参入到病毒颗粒(病毒体)中。在本说明书中，“外源”这个术语当用于肽或编码的核酸时则表示它们不是作为载体的植物病毒本身的肽或核酸序列。这些序列也可称为外源性或异源性序列。“肽”这个本语包括小肽和多肽。
我们的专利申请WO92/18618，描述了利用植物病毒作为载体系统表达那些在自然界中发现的而植物病毒中不存在的外源核苷酸序列(RNA或DNA)，而且这些序列编码的肽在任何天然植物病毒中是找不到的。本发明包括含有外源肽的植物病毒颗粒的装配。因此，这里所介绍的植物病毒是天然病毒的改构形式，为方便起见称为改构病毒。
按照我们的申请WO92/18618，参入到植物病毒中的外源肽可能具有很多种类型，并且外源肽的性质和大小以及位于病毒体内或其上的部位在体外或体内培养时不能干扰改构病毒的装配能力。就广义而言，改构病毒可由任何生物学上有用的，对其活性所必需特殊构型的肽(通常为多肽)构成。为作到这一点，可将肽结合到大分子上，以此提高它在特定生物系统中的稳定性或提呈方式。这类肽的例子，象肽激素；酶类；生长因子；来源于原虫、病毒、细菌、真菌、和动物的抗原；包括抗独特型抗体在内的抗体；免疫调节剂和细胞介素，如干扰素及白细胞介素；受体；粘附蛋白；以及前面所提及的肽的部分前体。这些肽优选含有5个以上的氨基酸。
按照我们在先的发明，在植物病毒载体所提供的范围很广的生物活性肽中重点是一些与疫苗特别是动物(包括人类)病毒疫苗相关的抗原肽。应当指出，本发明中的疫苗既可用于预防(即疾病预防)又可用于治疗(即疾病治疗)。对于疫苗方面的应用，本发明提供了特别引人关注的表位提呈系统。当抗原肽成分用于疫苗时应位于病毒颗粒上如病毒外壳蛋白的暴露部位，这样易于被免疫系统所识别。因此，当应用于后者时我们的发明包括改构植物病毒颗粒的装配，它们含有来自病原体如动物病毒的抗原，这类抗原参入到植物病毒外壳蛋白表面的暴露部位。本发明还包括用这类装配的改构植物病毒颗粒作为疫苗的免疫原成分。这种可提供抗原肽的改构病毒也可用作免疫诊断的抗原提呈成分用于检测动物(包括人类的)致病原或疾病。
我们在先的专利申请所描述的系统可将不同大小的外源肽插入到病毒外壳蛋白中。因此，在我们继续的研究过程中已成功地插入含有38个或更多氨基酸的多肽。但是，这样产生的非天然结构的改构病毒的缺点，是在植物中增殖时与未改构病毒(野生型)发生竞争。作为结果，我们已观察到一些改构病毒在增殖期间有外源肽丢失的倾向，这样改构病毒的产率就降低。
根据本发明，对此问题的原因已经查明，并且制定了防止产生这种情况的必要措施。
首先，在将编码外源肽的核苷酸序列导入植物病毒核酸的过程，应避免插入片段两侧存在直接重复序列。在本发明中，含有直接重复序列的构建物就是在被插入片段两侧存在的相同的寡核苷酸序列。这类构建物在遗传学上是不稳定的，因为在重复序列之间可发生重组而导致外源肽编码序列的丢失，并回复成野生型序列。第二，在外源寡核苷酸序列插入到植物病毒基因组中取代其部分已存在的序列时，产生的改构病毒外壳蛋白可能失去对病毒在植物中复制、衣壳化及传播起重要作用的氨基酸序列。这种缺点是容易确定的并且可以避免。第三，异源序列不应插入在亚适位点。
本发明包括含有外源肽的植物病毒颗粒的装配，其中相应外源核酸已被插入到植物病毒基因组中，在插入序列两侧不存在直接重复序列，并且作为该核酸的附加物。
在一项优选的实施方案中植物病毒是豇豆花叶病病毒(CPMV)并且使外源插入序列直接位于小外壳蛋白(VP23)的βB-βC环中的脯氨酸23(Pro23)之前。
本发明可用于已明确编码外壳蛋白暴露部分的病毒基因组的任何植物病毒。在这部分基因组内选择两个不同的限制酶位点并用相应的限制酶进行裂解。合成互补的寡核苷酸对，其两者末端之间的序列编码所需的插入到病毒外壳蛋白中的外源肽。寡核苷酸的末端具有匹配的限制酶位点，因此可将外源序列插入到裂解的病毒核酸中。这种方法可将编码外源肽的核苷酸序列导入并可避免插入片段两侧存在直接的重复序列。优选在合成的互补寡核苷酸中编码异源氨基酸的序列两侧是植物病毒特异序列，这样外源核酸的插入即作为已存在的病毒核酸的附加物。
在一项优选的实施方案中，为了确定暴露在病毒表面的因此是潜在的插入片段最适位点的外壳蛋白部分，故需对植物病毒的三维结构进行研究。在另一实施方案中，应检测外壳蛋白暴露部分的可破坏α-螺旋结构的氨基酸序列，因为这些氨基酸是插入片段的最适位点。这类氨基酸的例子是脯氨酸和羟脯氨酸，它的不论何时出现在多肽链中都可中断α-螺旋而产生刚性扭折或结构扭曲。
为了证实该系统选择了豇豆花叶病毒(CPMV)，通过原子分辨法分析了CPMV的三维结构，这种方法能够确定用于改构的部位而不破坏病毒结构。
CPMV是一种双重基因组RNA病毒，为将任何RNA病毒改造成可表达外源肽，就必须应用RNA的cDNA克隆。已获得了两种CPMV RNA分子的全长cDNA克隆，并对其进行改建进而插入编码外源多肽的寡核苷酸序列。可将植物RNA病毒基因组的cDNA克隆用来产生体外转录体，把这种转录体接种到植物中时具有感染性。但是，转录体的感染性大大低于天然病毒RNA的，可能是由于在转录体末端存在非病毒的残基。这个问题也可由在接种期间转录体接触降解因子而产生。为此，通常在其5′末端加上帽状结构来稳定转录物，但这是一种效力低，费用高而且又费时的方法。
在本发明另一方面中已经构建了CPMV RNA M和B的cDNA克隆，其中M RNA的cDNA克隆含有编码外源肽的插入寡核苷酸序列，这些克隆利用了与病毒cDNA 5′末端连接的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子序列产生在植物中是感染性的转录体。这种技术克服了利用体外产生转录体所遇到的某些问题，并且这种方法可应用于所有植物RNA病毒。
为证明本发明应用的广泛性，采用了四种不同动物病毒的抗原肽，一种来自动物的细菌性病原体肽和一种哺乳类肽激素。两种病毒属于动物病毒的小RNA病毒组-口蹄疫病毒(FMDV)和人鼻病毒(HRV)。在此病毒组中有几种主要的病原体，特别是FMDV，脊髓灰质炎病毒(polio)和甲型肝炎。选择的第三种病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，它与任何已知的植物病毒均没有类似性并且现在尚未获得成功的疫苗。细菌病原体是金黄色葡萄球菌，它是几种动物性疾病包括奶牛乳腺炎的致病因子。肽激素是猪促性腺激素释放因子。
现在参考下列附图对本发明作进一步描述：
图1描述了编码VP23氨基端40氨基酸的CPMV M RNA区。核苷酸序列下的数字是指M RNA序列，并标明了单一NheI位点的位置。采用标准的单字母密码表示蛋白质的氨基酸序列，在其上标明了在形成VP23的βB和βC股时所涉及到的氨基酸。
图2，(A)构建pFMDV所用寡核苷酸的序列，以及由上部(正)股核酸编码的相对应于FMDV O1株VP1的136-160氨基酸残基的氨基酸序列。(B)为FMDV特异寡核苷酸插入后VP23的结构。箭号区代表插入的FMDV表位的长度。xNheI表示克隆时尚未恢复的NheI位点。插入序列中存在的鉴别性Bg/II位点亦被标示。
图3，表示编码FMDV O1血清型VP1的136-160氨基酸残基的FMDV特异寡核苷酸插入后对pMT7-FMDV-I中VP23结构的影响。在用标准单字母密码表示的蛋白质氨基酸序列之上标明了在形成VP23的βB和βC股时涉及到的氨基酸。
图4表示通过定点诱变构建“取代”性载体。星号表示通过定点诱变变为C残基的T，这样即产生一个新的AatII位点。
图5，(A)构建pMT7-HIV时采用的寡核苷酸序列，以及上部(正)股编码的，对应于HIV-Igp41的735-752氨基酸残基的氨基酸序列，(B)代表HIV特异寡核苷酸插入后VP23的结构。箭号区表示插入的HIV表位的长度。另外还标明了作为鉴别用的存在于插入序列中的PvuI位点。
图6(A)用于构建pMT7-HRV的寡核苷酸序列，及对应于HRV-14VP1的85-99氨基酸残基的上部(正)股编码的氨基酸序列。(B)HRV特异寡核苷酸序列插入后VP23的序列。箭号区代表插入的HRV表位的长度。另外还标明了插入序列中存在的作为鉴定用的Clal位点。
图7，插入的编码FMDV O1血清型VP1的141-160氨基酸残基的FMDV特异寡核苷酸(粗体字型)对pMT7-FMDV-II中VP23序列的影响。
图8，用于构建pMT7-FMDV-V，pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III的寡核苷酸序列。所用的全部寡核苷酸均在图上部粗体字所示的序列处终止。用于构建pMT7-FMDV-V(FMDV-V)，pMT7-HRV-II(HRV-II)和pMT7-HIV-III(HIV-III)的可变区序列展示在下面。在核苷酸序列之上标明了由正意义核苷酸编码的氨基酸序列，这些序列相对应于：FMDV-V，FMDV O1血清型VP1的141-160氨基酸；HRV-II，HRV-14VP1的85-98氨基酸；HIVIII，HIV-Igp41的731-752氨基酸残基。
图9：用来自在病毒表面表达gp41731-752氨基酸的CPMV-HIV-I嵌合病毒进行两次皮下注射的C57/BL6小鼠的血清对HIV-IIIIB的中和作用(用空心线条表示)。注射后第14天采集小鼠血。图中也展示了用野生型CPMV同时接种的小鼠对照组的平均血清中和效价(用实线条表示)。所有免疫原均在明矾佐剂中配制。
CPMV的改建
为了将外源序列插入到CPMV的外壳蛋白中，需对病毒基因组进行改造，其方法在WO92/18618中描述。象CPMV B RNA的全长cDNA克隆(pBT7-123)一样，可利用转录载体pPMI中CPMV M RNA的全长cDNA克隆(pPMM2902)。来自pPMM2902和pBT7-123转录体的混合物，当电穿孔到豇豆原生质体中时可引起病毒感染。
我们已选择VP23中的βB-βC环用于外源肽的插入。此环明显地暴露在病毒颗粒表面，并且计算机模拟已表明在此部位插入更大环也不可能干扰担负衣壳结构及稳定性的相邻亚单位之间的相互作用。此环在可能插入外源序列的M RNA-特异序列的2708位置有一个独特的NheI位点(见图1)。
细小RNA病毒口蹄疫(FMDV)和人鼻病毒(HRV)及慢反录病毒人免疫缺陷病毒(HIV)的主要抗原位点已被用来说明改构植物病毒用来生产动物病毒疫苗。
在WO92/18618中描述了pFMDV-含有编码FMDV环蛋白片段的DNA插入序列的CPMV M RNA的全长cDNA克隆的设计和构建。将编码来自FMDV血清型O1 BFS1860株VP1的136-160氨基酸残基的寡核苷酸插入到pPMM2902的独特NheI位点，这样作为己存在的核酸的添加物。利用这种方法导致插入序列两测产生直接重复序列(见图2B)。在WO92/18618中描述了pFMDV转录体的性质。用pFMDV和pBT7-123转录体混合物感染豇豆原生质体可导致改构病毒颗粒的增殖和装配。
但是，为了大批量生产改构的植物病毒就必需制备一种可直接接种到全植物中并且象在原生质体系统中那样复制并装配成病毒颗粒的构建体。因此，应对pPMM2902进行改造，通过更有效的启动子启动RNA合成。这种改造的质粒在使转录体5′-末端带有“帽状”结构的条件下被转录。pPMM2902改造产生pMT7-601的步骤在WO92/18618中详细作了描述。发现带帽结构的pMT7-601和pBT7-123的混合物对完整的豇豆植物有感染性。
从pMT7-601和pFMDV开始的pMT7-FMDV-I的设计与构建在WO92/18618中加以描述。将编码FMDV O1血清型VP1的136-160氨基酸残基的寡核苷酸序列插入到pMT7-601的单-NheI位点作为现存核酸的添加物。所采用的方法使插入序列两侧产生直接的重复序列(见图3)。pMT7-FMDV-I转录体的性质Usha等已作了详细的描述(Virology，1993，197，366-374)。用pMT7-FMDV-I和pBT7-123转录体混合物接种的植物，其接种叶片上产生的损害比用野生型转录体接种植物叶片上所看到要小。对pMT7-FMDV-I感染植物的接种叶片均浆物的免疫吸附电镜观察，证实CPMV一样病毒颗粒的存在。但是，尚没有嵌合病毒颗粒系统传播给未接种叶子的证据。
后来我们通过对来自用pMT7-FMDV-I接种的叶片抽提的RNA进行了逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析，对pMT7-FMDV-I感染的子代进行鉴定。结果表明，存在两种产物：一种是主要的预期产物约580bp，另一个较小500bp。后一种产物可与由野生型CPMV感染的植物提取的RNA合成产物共移。当将PCR产物克隆到噬菌体M13中并对插入位点附近的序列进行测定，发现这两类克隆中的一类保留了完整的FMDV特异的序列(主要产物)，而另一类含有野生型CPMV的相应序列(次要产物)。这些结果表明，在转录体接种的叶片中通过单步过程出现了回复变异成野生型序列的情况。
当用由pMT7-FMDV-I转录体接种的叶片提取的RNA在未感染的豇豆植物中进行传代时，这种植物在其接种的叶片上出现症状是用pMT7-FMDV-I感染产生的小损害特征和用野生型CPMV感染产生的大损害的混合症状。另外，上部叶片出现了野生型CPMV感染产生的花叶病症状。对这种植物接种的叶片中提取的RNA进行RT-PCR分析，结果又产生两种产物，但是在此情况下主要产物相当于由野生型MRNA所产生的产物。对来自主要PCR产物的克隆进行分析，结果又出现了以前所发现的同样两种类型的序列。但是在此情形下大多数克隆代表野生型序列。这些结果不但说明在一步法中可能由于插入序列两侧存在直接重复序列pMT7-FMDV-I趋于失去完整的FMDV特异序列，而且也说明野生型子代病毒具有超过嵌合病毒的优点。
为避免插入序列两侧直接重复序列的产生，在CPMV基因组VP23编码区的核苷酸序列中产生第二个限制酶位点。在M RNA的2740位单个无表型碱基改变(U变为C)，这样在缬氨酸27(核苷酸序列的2735位)产生一个单一AatII位点。可采用WO92/18618中所述的方法通过M13-JP-1的定点诱变来作到这种碱基的改变(见图4)。AatII位点的产生可用NheI和AatII消化去除编码CPMV中天然βB-βC环中6氨基酸的核苷酸序列。然后这段序列可被具有NheI-和AatII-匹配末端的任何序列所代替。
pMT7-FMDV-II，pMT7-HIV和pMT7-HRV的构建
为取代诱变了的M RNA序列中的NheI和AatII位点之间的序列，设计了三种不同序列。在所有三种情形中，外源序列均可取代编码6氨基酸的野生型序列。被取代到VP23中的第一个序列包括编码人免疫缺陷病毒(HIV-I)跨膜糖蛋白gp41的735-752残基的寡核苷酸。之所以选择这段序列，是由于该区的合成肽在酶联免疫吸附测定(ELISA)中可被血清阳性AIDS患者的抗血清识别，并且能够诱导中和许多种HIV-I分离株的抗体产生。第二种序列是编码人鼻病毒14(HRV-4)的VP1中85-99残基的核苷酸序列。在这两种情况下，所设计的寡核苷酸均含有限制酶位点，这样利于筛选。这些寡核苷酸序列和取代序列对VP23的氨基酸序列的影响，如图5和图6所示。构建pMT7-HIV和pMT7-HRV所采用的方法已在WO92/18618中描述。
第三个序列包括编码FMDV O1血清型VP1的141-160残基的核苷酸序列。取代对VP23氨基酸序列的影响见图7。构建pMT7-FMDV-II的方法，Usha等(1993)已作了介绍。
在WO92/18618中和Usha等(1993)分别描述了pMT-HIV和pMT7-FMDV-II转录体的性质。pMT7-HIV转录体，当与pBT7-123转录体混合后可在豇豆原生质体中复制并且产生的改构外壳蛋白可装配成嵌合病毒颗粒。同样，pMT7-FMDV-II转录体也可在豇豆原生质体中复制，但是所积聚的子代RNA的水平，比来自pMT7-FMDV-I，或来自含有野生型VP23序列的pMT7-601的要低得多。在用pMI7-FMDV-II感染的原生质体中没有检测出病毒粒子。获自pMT7-FMDV-II的转录体能够在豇豆植物中增殖，Usha等(1993)也进行过研究。在接种的植物上没有出现症状，并且在接种的叶片中或上部叶片均未检测出子代RNA。pMT7-FMDV-II低的感染性，可能归因于所产生的嵌合病毒颗粒缺少野生型病毒和由pMT7-FMDV-I感染产生的嵌合病毒中存在的一段氨基酸序列。这段序列对病毒在植物中的复制和传播是重要的。
实施例1
pMT7-FMDV-V，pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III的构建
pMT7-FMDV-I与野生型CPMV相比产生较少损害表型和竞争性不利条件，表明异源序列可能插入到次最适部位。对CPMV三维结构的详细检测表明，位于S蛋白βB-βC环中心的脯氨酸23(pro23)是特别地暴露在病毒表面并且对任何插入序列都是潜在的最适部位。鉴于这种事实和防止可能有助回复突变的重复序列的引入，合成了互补寡核苷酸对，在寡核苷酸对中野生型CPMV中存在的序列位于编码异源氨基酸序列的两侧，这样使插入序列直接位于Pro23之前。寡核苷酸两侧带有NheI和AatII-匹配末端，这样它可插在pMT7-FMDV-II(Usha等，1993)或用其衍生的pMT7-FMDV-II AatII代替原FMDV-特异插入序列的NheI和AatII位点之间。这种策略不仅保证异源序列插在最适部位且其两测不存在直接重复序列，而且也保证CPMV特异序列不会缺失，这对病毒颗粒的装配是重要的(Usha等，1993)。以这种方式插入的序列包括：FMDV O1血清型VP1的141-160残基(此pMT7-FMDV-I中表位的编码序列稍短一些，组成HRV-14的VP1免疫优势位点-NIm-1A的85-98残基(Sherry等，J.Virology，1986，57：246-257)，以及由HIV-Igp41残基731-752构成的表位即所谓的“Kennedy表位(Kennedy等，Science，1986，231，1556-1559)。在这些构建物中所用的寡核苷酸序列见图8，这些构建物分别称为pMT7-FMDV-V，pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III。
质粒pBT7-123，pMT7-FMDV-I和pMT7-FMDV-II的构建及性质，已经被描述(Usha等，1993)。这些构建物及其衍生物已在大肠杆菌JM83株中传代。寡核苷酸是用Pharmacia GeneAssembler Plus合成仪合成。序列分析是用大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow大片段)或SequenaseTM Version 2.0通过“双脱氧”法进行测定的。
为了构建pMT7-FMDV-V，用NheI消化(在MRNA序列的2708位裂解)pMT7-FMDV-II，并且用AatII进行部分消化：在M RNA序列(2735位)内裂解一次，并在该质粒的来自pUC的部分(pUC19图谱中的2617位)裂解一次。对位于编码CPMV VP23蛋白的18-22和23-26残基序列两侧的、编码FMDV O1血清型VP1的141-159残基的互补寡核苷酸对进行磷酸化，退火并连接到NheI/AatII消化的pMT7-FMDV-II上。对于含有所需结构的重组子通过限制酶图谱和序列分析法进行鉴定。
为构建pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III，首先用AatII对pMT7-FMDV-II进行部分消化并经琼脂糖胶电泳后回收全长的线性分子。对线性化质粒用大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow大片段)处理去除AatII消化后所留下的3′-突出序列，将此质粒进行环化并且转化到大肠杆菌JM83株中。通过限制酶分析法鉴定出一个称为pMT7-FMDV-AatII的重组子，在该重组子中，在质粒的pUC部分中的AatII位点已被破坏，但在M RNA特异部分中仍保留了这个位点。对编码HRV-14的VP185-98残基或HIV-Igp41731-752残基，其两侧为CPMV特异序列的互补寡核苷酸进行磷酸化，退火并连接到NheI-/AatII-消化的pMT7-FMDV-AatII质粒上，分别产生pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III。
实施例2
pMT7-FMDV-V，pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III在豇豆植物中的复制能力
当将由嵌合质粒转录的RNA与pBT7-123的转录体混合，再接种到豇豆植物中时，在每种情况下接种的叶片均出现野生型CPMV感染的慢性损害。用RNA杂交分析的结果表明，在这些叶子中均存在M RNA特异序列。在所有三种情形下，这种感染均可机械地传播给健康的豇豆植物。对pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III，感染可传播给大多数被感染植物的上部叶子产生典型花叶病。但是，由pMT7-FMDV-V所诱导产生的感染仅限于被接种的叶子，没有观察到整个植物产生症状，在其上部叶子中也未检测到病毒特异的RNA。
当从用pMT7-FMDV-V转录体接种的叶子中抽提总RNA并用RT-PCR进行分析时，只观察到单一带条，其分子大小相当于来自含有插入序列的RNA产物。甚至在进行三次连续传代后，仍观察到类似的结果。为证实植物中存在插入序列，将初次接种和经3次传代后来自植物标本的产物克隆到噬菌体M13中，测定代表性数量的克隆的核苷酸序列。在此两种情况下的所有克隆中，都含有相当于有完整插入片段的病毒RNA序列。这些结果表明，pMT7-FMDV-V RNA没有以可测频率出现回复突变。对由纯化的pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III颗粒抽提的RNA进行分析(见下文)支持这一结论：新的构建物在遗传学上是稳定的，在经10次连续传代后未发现回复突变。
采用标准的CPMV纯化方法(van Kammen和de Jager，1978，豇豆花叶病毒，CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses，197)，可从pMT7-HRV-II或pMT7-HIV-III感染的叶子组织中制备病毒颗粒，病毒产率(每克新鲜组织1.2-1.5mg病毒)与野生型CPMV类似。但是，用此标准方法或其一些改良法均未从pMT7-FMDV-V感染的组织中获得病毒颗粒。这种情形并不是由于感染的植物组织中没有病毒颗粒，因为通过免疫吸附电镜(ISEM)用CPMV抗血清包被的网栅对组织匀浆物进行观察可看到大量的病毒颗粒。
实施侧3
来自pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III的嵌合病毒颗粒的免疫学性质
为了证实纯化的pMT7-HRV-II颗粒具有插入序列的抗原性，用HRV-14的多克隆抗血清对纯化的病毒样品进行免疫印迹分析。用这种方法检测出的产物大小与改造的VP23蛋白相一致，因而证实了插入序列的抗原性。利用同种方法对野生型CPMV进行分析，未观察到与该抗血清的反应。
当通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性病毒样品时，仅可看到三条带。最大的多肽(L)相当于大的(VP37)病毒外壳蛋白，并且可与野生型CPMV的L多肽共移。中间条带的多肽(Sa)对应于含有HIV-I特异表位的小的病毒外壳蛋白(VP23)。移动最快的多肽(S′)代表VP23蛋白C-端192氨基酸。末端序列分析结果表明，S′多肽是通过插入片段的2个C-末端氨基酸残基之间的蛋白酶水解由VP23蛋白而产生。因此，Sa而非S′含有插入序列，并且正如所预测的那样，它可在免疫印迹试验中与gp41特异抗体反应。预测的N-末端裂解产物仅由43个氨基酸残基组成，在所采用的凝胶系统中不能分辨。这两种S多肽仍与病毒颗粒结合。因为不管病毒如何快速纯化在CPMV-HIV制剂中总是存在一定量的S′蛋白，因此这种裂解可能在planta中发生。
为克服pMT7-FMDV-I的局限性而设计的策略已证明是成功的，因为所有3个新的嵌合体(pMT7-FMDV-V，pMT7-HRV-II和pMT7-HIV-III)在接种的叶子上均可产生野生型症状，并且没有回复突变的迹象。而且其中两个嵌合体象野生型CPMV一样增殖得很好，很容易进行纯化。pMT7-FMDV-V在接种的叶子上可产生野生型损害，但不能系统性传播，这一事实表明这些嵌合病毒颗粒完全能够在细胞之间进行移动，但是缺乏长距离的迁移。这种现象可能与来自pMT7-FMDV-V的病毒颗粒似乎聚积成细胞内晶状排列使得很难纯化有关。这些特征不是异源序列的长度的结果，因为pMT7-FMDV-V含有中等大小的插入序列(19残基)，它介于pMT7-HRV-II含有的序列(14残基)和pMT7-HIV-III含有的序列(22残基)之间。
实施例4
利用嵌合的pMT7-HRV-II病毒颗粒产生HRV抗体
采用例2中所描述的方法纯化pMT7-HRV-II和野生型CPMV病毒，将纯化的病毒免疫兔子，并将收集的抗血清作为对变性HRV-14病毒进行免疫印迹试验的探针。用所产生的pMT7-HRV-II病毒抗血清甚至在血清1∶16,000稀释时也可检测出相应于HRV-14的VP1的单一带。而与HRV-14的其它外壳蛋白(VP2和VP3)没有反应。当用野生型CPMV抗血清检测蛋白印迹带时，与HRV-14的任何蛋白都没有反应。pMT7-HRV-II病毒能够产生识别HRV-14的VP1的抗体的能力，表明在CPMV颗粒表面存在的表位是具免疫原性的。
实施例5
利用嵌合的pMT7-HIV-III病毒颗粒产生HIV中和抗体
把来自pMT7-HIV-III的转录体与来自质粒pBT7-123的转录体混合后接种到10日龄的豇豆植物叶子上。为了获得大量的重组病毒颗粒，把具有CPMV感染典型特征的叶子标本在100mM磷酸钠缓冲液中(pH7.0)进行匀浆，经简单离心后把收集的上清接种到健康的豇豆植物中。接种后2-3周收获植物，然后象例2中描述的那样纯化嵌合病毒。将纯化的病毒(称作CPMV-HIV-I)悬于含0.05％(w/v)叠氮钠的pH7.0  10mM磷酸钠溶液中，在4℃保存。病毒制剂的质量可用电镜和变性病毒在15％聚丙烯酰胺/SDS/还原胶上进行的电泳进行检测。用考马氏亮兰R250对凝胶染色观察蛋白。病毒制剂在接种到小鼠中之前应对磷酸缓冲盐溶液进行透析，并用Bio-RadTM法测定蛋白浓度。
免疫所用动物是8周龄的C57/BL6成年小鼠。将病毒(CPMV-HIV-I或CPMV)与氢氧化铝佐剂以1∶5的比例混合，室温搅拌30分钟。用含100μg病毒的总体积为100μl的病毒与佐剂混合物免疫小鼠，每组6只，在小鼠颈背部5个部位进行皮下注射。在所需的时间间隔从小鼠尾部取血，并将血清保存于-20℃。在测定中和抗体前把所有血清于56℃加热30分钟。
在0和35天给小鼠注射两次CPMV-HIV-I或野生型CPMV，14天后自小鼠尾部放血。然后按下述方法测定对HIV-I IIIB的中和滴度。将不同稀释度热处理的血清与约2000合胞体形成单位(sfu)/ml病毒于37℃保温60分钟。在已用多聚-L-赖氨酸预处理的96-孔组织培养板中制备半融合C8166细胞单层(每孔5×104细胞)。去除培养液，每孔中加入50μl接种物。在新鲜培养液加入前，将板于37℃保温1小时。然后于37℃继续保温3天，然后用显微镜对合胞体进行计数并计算每孔的百分抑制率。
图9表明，用CPMV-HIV-I免疫的小鼠，产生50％中和抗体效价在83％小鼠中约为1/1000。1/100稀释的抗血清可使100％的小鼠产生应答，平均中和效价为97％。反应是高度一致的。图9还表明，在平行注射野生型CPMV的对照组也产生对HIV-I的中和反应。中和效价比用CPMV-HIV-I低约10倍，50％中和效价约为1/100。这显然是-种全抗体反应，因为用来自未免疫的同窝小鼠的血清甚至在1/10稀释度下也没有中和作用。
通过在小鼠第二次注射后的第48天放血研究了对CPMV-HIV嵌合病毒的中和抗体反应的稳定性。这些抗血清在1/10稀释下没有明显的中和效价，表明中和抗体的水平下降100倍以上。用野生型CPMV刺激的中和活性也未检测出。
同样小鼠在第二次注射后第3个月，再第3次注射CPMV-HIV-I，并于14天后放血。平均中和效价在1/1000稀释度时为54％，所有小鼠均有反应。在此稀释度下用野生型CPMV追加免疫的小鼠血清没有中和作用。因此，中和活性没有什么增加。对CPMV-HIV-I的中和抗体反应的稳定性，用第56天的抗血清进行了检测。此时效价已经下降，但来自所有小鼠的抗血清在1/10稀释度时仍有明显的中和作用，平均中和滴度为58％。注射野生型CPMV对照组抗血清几乎没有中和作用。
把第3次注射后获得的抗血清对同源HIV-I IIIB株的中和作用与对HIV-IRF和SF2株的中和作用进行了比较。在92％中和IIIB株的稀释度下，对RF株为78％，而对SF2株为66％。对野生型CPMV的抗血清也可中和所有3个株，但是与IIIB株比较这些抗血清比用CPMV-HIV-I的抗血清对RF和SF2株的中和作用要低。
已证实，在野生型CPMV抗血清中的中和抗体对CPMV表位都是特异的，而通过用纯化的野生型CPMV吸收的抗血清则对HIV-Igp41肽没有特异性。用CPMV连续吸附3次之后并未降低CPMV-HIV-I抗血清中HIV-I的中和效价，但是却降低CPMV抗血清的中和活性5倍。因此，我们得出结论，针对CPMV-HIV嵌合病毒的大部分中和抗体是针对HIV特异表位的，但CPMV刺激产生的抗体与HIV-I的中和表位有交叉反应。
实施例6
可直接用于接种植物的CPMV RNA M和B的cDNA克隆的构建
CPMV RNA M和B的cDNA克隆是在pUC18中构建，这样病毒RNA的5′末端直接与CaMV 35S启动子的转录起始部位相邻。另外，可在病毒序列的3′末端通过在单一MluI位点用限制酶消化而精确地使RNA B克隆(pCP1)线性化，同样也可用EcoRI使RNA M克隆(pCP2)。因此，用这些酶消化后可产生在5′或3′末端均不含有非病毒序列的失控转录物。
克隆的构建如Dessens等述(Journal of General Virology，1993，74：889-892)。CaMV 35S启动子克隆在pUC18的HindIII和PstI位点之间，在此过程中丧失了HindIII位点。该启动子序列两侧是SstII和StuI限制酶位点，后者可使平末端消化而暴露出转录起始位点。由RNA M和B产生cDNA，并通过分别用SstI和BamHI消化来克隆它们的5′半分子，然后连接到StuI/SstI-或StuI/BamHI一切的CaMV 35S载体上。通过利用前面所构建的，并经过改造的用限制酶消化可确切暴露出3′末端的cDNA克隆(pMT7-601和pBT7-123)，将RNA的3′半分子克隆到这些构建物中。RNA M被克隆到PstI/EcoRI片段上，RNA B克隆到BglII/EcoRI片段中。
CaMV 35S启动子可利用植物宿主的依赖DNA的RNA聚合酶，并且它具有很高的活性。因此，在线性化的pCP1和pCP2混合物存在下通过涂擦植物叶子表面即可使植物感染。在植物中聚合酶从CaNV 35S启动子开始指导病毒RNA的转录，并且在pCP1和pCP2都被转录的细胞中产生的感染与用野生型CPMV的相类似。因此，体外RNA转录阶段已不再需要。这与以前接种植物的方法相比，无论是在应用方面还是费用上都有很大的优点。
为了使含有被直接插入在小外壳蛋白βB-βC环中的pro23残基之前的外源肽的CPMV装配颗粒的产生，并且在装配颗粒中相应的外源核酸在其两测不存在直接重复序列并作为现存核酸的添加物的情况下已被插入到CPMV基因组中，因此，象早在本说明书中对pMT7所描述的那样，应使cDNA克隆pCP2突变在RNA M序列2735位产生单一的AatII位点。这被称为pCP2-AatII。
编码不同外源肽的寡核苷酸序列(见表1)取代象实施例1中所述的pCP2一AatII的NheI和AatII位点之间的序列。将pCP2-AatII重组体和pCP1线性化并接种到豇豆植物的原代叶子上。在所有这些情况下均可产生感染，并且可从植物中回收表达相应外源肽的稳定的嵌合病毒。
表1.由用cDNA克隆直接接种植物产生嵌合病毒所表达的外源肽
构建物   长度(氨基酸)                    肽的来源
HIV-I     22  HIV-I IIIB株gp41的731-752氨基酸
HIV-3     6  HIV-I IIIB株gp120的312-317氨基酸(V3环)
HIV-4     11  HIV-I IIIB株gp120的140-150氨基酸(V1环)
HIV-5     11  HIV-I IIIB株gp120的117-127氨基酸
FMDV-5     19  FMDV O1株VP1的141-159氨基酸(G-H环)
FMDV-12     21  FMDV CS8株VP1的肽序列(G-H环)
FMDV-13     23  FMDV A10株VP1的肽序列(G-H环)
FMDV-14     10  FMDV O1株VP1的40-49氨基酸(B-C环)
PARVO-1     17 犬细小病毒VP213-29氨基酸
PARVO-2     17  PARVO-1反向插入序列
PARVO-3     17  PARVO-1侧面序列变异株
GNRH-1     10 猪促性腺激素释放激素的免疫优势表位
MAST-1     30 来自金黄色葡萄球菌的纤维结合素结合蛋白
MAST-2     38 一种MAST-1较长变体形式
HRV-2     14  HRV14株VP1的85-98氨基酸

Claims (38)

1.装配的植物病毒颗粒，它含有插入到病毒外壳蛋白中的外源肽，插入的部位不受插入片段两侧的直接重复序列影响。
2.按照权利要求1的病毒颗粒，其中的插入物是新加到外壳蛋白中的。
3.按照权利要求1或2的病毒颗粒，其中的外源肽是具有生物学功能的肽，它在生物学上的应用需要肽与大分子或粒子的结合，或通过肽与大分子或粒子的结合来增强。
4.按照权利要求1至3的病毒颗粒，其中的肽是一种抗原。
5.按照权利要求4的病毒颗粒，其中的抗原是一种病毒抗原。
6.按照权利要求5的病毒颗粒，其中的抗原是一种动物(包括人类)的病毒抗原。
7.按照1至6的任一权利要求的病毒颗粒，其中外源肽被掺入到植物病毒外壳蛋白的暴露表面。
8.按照1至7的任一权利要求的病毒颗粒，其中植物病毒是一种RNA病毒。
9.按照权利要求1至8中的任何一项的病毒颗粒，其中病毒外壳蛋白具有β-筒状结构。
10.按照权利要求9的病毒颗粒，其中外源肽插入与植物病毒的β-折叠片结构相连的环中。
11.按照权利要求10的病毒颗粒，其中插入的外源肽靠近与植物β-折叠片相连的环中脯氨酸或羟脯氨酸残基。
12.按照权利要求1-11的病毒颗粒，其中植物病毒是一种豇豆花叶病毒。
13.按照权利要求12的病毒颗粒，其中豇豆花叶病毒是豇豆花叶病毒(CPMV)。
14.按照权利要求9，10，11，12或13的病毒颗粒，其中外源肽被插入在植物病毒的βB-βC环中。
15.按照权利要求1-14的任何一项的病毒颗粒，其中外源肽是一种来自口蹄疫病毒(FMDV)的动物病毒抗原。
16.按照权利要求1-14中的任一项的病毒颗粒，其中外源肽是一种来自人免疫缺陷病毒(HIV)的动物病毒抗原。
17.按照权利要求1-14中的任一项的病毒颗粒，其中外源肽是一种来自人鼻病毒(HRV)的动物病毒抗原。
18.按照权利要求1-14中的任一项的病毒颗粒，其中外源肽是一种来自犬细小病毒的动物病毒抗原。
19.按照权利要求1-14中的任一项的病毒颗粒，其中的外源肽是一种来自金黄色葡萄球菌的动物病原体抗原。
20.按照权利要求1-14中任一项的病毒颗粒，其中外源肽是一种来自肽激素的抗原。
21.按照权利要求20的病毒颗粒，其中的外源肽是一种来自促性腺激素释放激素的抗原。
22.抗人或动物病原体的保护性疫苗，它包含按照权利要求4-21的任一项装配的植物病毒颗粒，作为其免疫原成分。
23.动物病毒疫苗，它包含按照权利要求6的病毒颗粒作为一种免疫原成分。
24.按照权利要求1-21中的任一项植物病毒颗粒的制备方法，它包括：引入编码外源肽的核苷酸序列来改构编码外壳蛋白的植物病毒核酸，这样可避免插入序列两侧产生直接的重复序列；用改构的病毒核酸感染植物，植物组织，植物细胞，或原生质体；以及收获装配的改构病毒颗粒。
25.按照权利要求24的方法，其中被引入的核苷酸序列插入到编码外壳蛋白暴露部分的植物病毒核酸中。
26.按照权利要求24中的方法，应用到RNA植物病毒中，它包括：将编码外源肽的DNA序列引入到相应的编码外壳蛋白暴露部分的植物病毒RNA的cDNA中；因此，由这种改构的cDNA产生RNA转录体；用该转录体接种植物，植物组织，植物细胞，或原生质体，如果必要的话可用对在植物材料中的全病毒颗粒的复制和装配所需要的任何其它RNA一起接种；收获装配的改构病毒颗粒。
27.按照权利要求26中的方法，其中改构cDNA的产生可通过将编码外源肽的DNA引入到由植物病毒cDNA剪切的DNA片段中，重组成改构片段，这样以改构形式重建植物病毒cDNA。
28.按照权利要求24-27中的任一方法，其中外源核苷酸顺序的插入，可通过选择植物病毒核酸中两个不同的限制酶位点；用相应的限制酶剪切植物病毒核酸；将编码外源肽的并且其末端具有匹配的限制酶切位点的一对互补寡核苷酸插入到已切的病毒核酸中。
29.按照权利要求28的方法，其中在互补的寡核苷酸中编码外源肽的寡核苷酸序列被植物病毒特异序列所嵌合，因此，插入的外源核苷酸序列是加到植物病毒核酸中的。
30.按照权利要求26或27的方法，其中所产生的改构病毒或由其提取的RNA可在植物中进行传代产生更多的改构病毒。
31.按照权利要求24-29中任一种的方法，其中cDNA含有一与构建5′末端连结的花椰菜花叶病毒35S启动子序列。
32.CPMV外壳蛋白cDNA片段，它含有编码位于相应外壳蛋白暴露表面的外源肽的cDNA序列，此插入部位不受位于外源DNA两侧的直接重复序列的影响。
33.按照权利要求32的片段，此片段是SstI片段。
34.一种载体，它包含按照权利要求32或33的片段。
35.一种载体，它包括CPMV mRNA的全长cDNA，它含有编码位于相应CPMV外壳蛋白暴露表面的外源肽的DNA插入片段，其插入部位不受位于外源DNA两侧的直接重复序列的影响。
36.按照权利要求32-35中的任一项的片段或载体的RNA转录体。
37.根据权利要求36的有帽结构的RNA转录体。
38.保护动物(包括人类)免受病原体攻击的一种方法，它包括给予按照权利要求22或23的疫苗。
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