CN105797152A

CN105797152A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN105797152A
Application number: CN201410848091.4A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 谷世江; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN105797152B

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端和C端蛋白、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端和C端蛋白以及药学上的载体，具有良好的免疫原性，能有效预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎。本发明还提供了该疫苗组合物的制备方法，通过基因工程手段对蛋白抗原进行大量表达产生，安全性良好，且利于大规模生产。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪萎缩性鼻炎疫苗组合物，及该疫苗的制备方法和应用。

背景技术

猪萎缩性鼻炎(atrophicrhinitis,AR)是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪业造成巨大的损失。

猪萎缩性鼻炎可分为进行性猪萎缩性鼻炎(progressiveatrophicrhinitis,PAR)和非进行性猪萎缩性鼻炎(nonprogressiveatrophicrhinitis,NPAR)。

非进行性猪萎缩性鼻炎单纯由支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)引起，其通常只引起轻微的鼻甲骨萎缩，往往观察不到鼻吻部的典型病变。百日咳杆菌黏附素(pertactin,PRN)是Bbprn基因编码的一种具有保护性的外膜蛋白成分，是Bb感染的重要的黏附因子，被认为是Bb主要的保护性抗原。

而进行性猪萎缩性鼻炎主要由产毒素多杀性巴士杆菌(toxigenicPasteurellamultocida，T⁺Pm)引起，病原通常为荚膜D型或A型，或与波氏杆菌共同感染引起，其给养猪业带来的危害十分巨大。与进行性猪萎缩性鼻炎密切相关的T⁺Pm分泌产生的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)是一种大小约146kDa的皮肤坏死毒素。该毒素由toxA基因编码，是T⁺Pm的主要致病因子。

随着人们对猪萎缩性鼻炎致病机理的深入了解，预防该病的最好方法为疫苗免疫。目前，用于预防和控制的商品化疫苗主要有灭活菌苗和类毒素苗，其中类毒素苗免疫效果优于灭活菌苗，并证实不同型菌株的类毒素具有交叉保护。然而，天然PMT的分泌量非常有限，不到菌体蛋白0.6％，且纯化工艺复杂，人工表达全毒素的效率也较低，因此通过提纯天然PMT来制备类毒素苗生产成本高，规模化生产难度大。为了适应大规模生产的需要，本发明通过基因工程技术分段进行体外表达支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白和产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素蛋白来制备疫苗，表达量高，且具有较好的保护效果。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎的基因工程亚单位疫苗，其中包含分段表达的支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白和分段表达的产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素蛋白。

本发明的第一方面包括一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原和C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原和C端蛋白抗原以及药学上的载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原包括至少1-540位氨基酸残基，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原包括至少541-911位氨基酸残基；

所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原包括至少95-468位氨基酸残基，所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原包括至少837-1279位氨基酸残基。

作为本发明的一种优选实施方式，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.2,所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.6,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.8。

本发明提供的预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物包括的支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原和C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原和C端蛋白抗原，还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。

本发明的另一方面在于提供包括支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原和C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原和C端蛋白抗原或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎的组合物中的应用。

术语“预防”指通过其与引起猪萎缩性鼻炎的菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与引起猪萎缩性鼻炎的菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。

术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对引起猪萎缩性鼻炎的菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。

术语“片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。

术语“保护性反应”意为在动物中预防引起猪萎缩性鼻炎的菌株相关疾病或由引起猪萎缩性鼻炎的菌株导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。

本发明涉及的引起猪萎缩性鼻炎的菌株多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。

如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对引起猪萎缩性鼻炎的菌株攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。

当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO.2、4、6、8中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。

在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

作为本发明的一种优选实施方式，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的含量范围均为12.5～50μg/ml。

更优选地，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的含量均为25μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶佐剂、MontanideGEL01、MontanidePETGELA、MontanideIMS1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质(MPIA)中的一种或几种。。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增强组合物的免疫原性的物质。作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物使用的佐剂为MontanideGEL01、MontanidePETGELA、蜂胶佐剂中的一种或几种。本发明实施例中使用了MontanideGEL01佐剂。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物，由所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原和MontanideGEL01佐剂组成。

本发明疫苗组合物还可以进一步包含其他的试剂。例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法

本发明的另一方面提供一种预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备方法,其中，所述制备方法包括：(1)分别克隆表达所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原；以及

(2)按一定比例混合所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，其中，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.2,所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.6,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.8；所述四种蛋白抗原的含量范围均为12.5～50μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，其中，所述步骤(2)中还加入佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶佐剂、MontanideGEL01、MontanidePETGELA、MontanideIMS1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质(MPIA)中的一种或几种。

作为本发明的一种最优选实施方式，所述制备方法包括：

(1)构建所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端和C端蛋白抗原表达工程菌株，产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端和C端蛋白抗原表达工程菌株；

(2)将构建的所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端和C端蛋白抗原表达工程菌，产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端和C端蛋白抗原表达工程菌于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养14-16h，之后于适宜培养基扩大培养4-6h，加入诱导剂进行蛋白表达，收获菌液，灭活；以及

(3)按一定比例混合所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原，加入佐剂，乳化。

抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段，例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如“克隆载体”，其被设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸；“表达载体”，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列；或“病毒载体”，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或“穿梭载体”，其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明猪链球菌抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎的抗原的制备还包括通过人工合成的方式来实现

本发明的另一方面在于提供一种疫苗组合物在制备预防和/治疗猪萎缩性鼻炎的药物的应用。

本发明的突出优点在于：

1、本发明疫苗组合物为全新的疫苗组合，具有良好的免疫原性。

2、本发明疫苗组合物的分段蛋白具有表达量高，不需要纯化，具有生产方便，成本低的优势，解决了培养菌体提取毒素成本高的问题以及表达蛋白菌体破碎后内毒素高导致的副反应大等问题。

3、因本发明疫苗的四个蛋白为PRN和PMT的片段，无致病性，安全性良好，解决了培养病原菌体和提取毒素灭活不完全有潜在安全风险的问题。

附图说明

图1为prn基因5’端1620bp和3’端1113bp扩增电泳结果，从左至右各泳道分别为:Marker、prn基因5’端扩增条带、prn基因3’端扩增条带、PCR阴性对照；

图2为重组质粒pET28a-prnN和pET28a-prnC双酶切鉴定结果，从左至右各泳道分别为：Marker、pET28a-prnN双酶切条带、pET28a-prnC双酶切条带；

图3为pET28a-prnN和pET28a-prnC蛋白表达SDS-PAGE分析结果及Westernblot检测结果(箭头指示为目的条带)，从左至右各泳道分别为：蛋白Marker、表达rPRN-N蛋白条带、表达rPRN-C蛋白条带、表达rPRN-N蛋白Westernblot分析、表达rPRN-C蛋白Westernblot分析；

图4为toxA5’端1122bp和3’端1329bp扩增电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker、toxA5’端扩增条带、toxA3’端扩增条带、PCR阴性对照；

图5为重组质粒pET28a-toxAN和pET28a-toxAC双酶切鉴定结果，从左至右各泳道分别为：Marker、pET28a-toxAC双酶切条带；pET28a-toxAN双酶切条带；

图6为pET28a-toxAN和pET28a-toxAC蛋白表达SDS-PAGE分析结果及Westernblot检测结果(箭头指示为目的条带),从左至右各泳道分别为：蛋白Marker、表达rPMT-N蛋白条带、表达rPMT-C蛋白条带、空白对照、表达rPMT-N蛋白Westernblot分析、表达rPMT-C蛋白Westernblot分析。

序列表中：

序列1为PRN-N核苷酸序列；序列2为PRN-N蛋白氨基酸序列；序列3为PRN-C核苷酸序列；序列4为PRN-C蛋白氨基酸序列；序列5为PMT-N核苷酸序列；序列6为PMT-N蛋白氨基酸序列；序列7为PMT-C核苷酸序列；序列8为PMT-C蛋白氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1菌种的构建

1.1支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端和C端蛋白表达工程菌株的构建

1.1.1引物设计

参考GenBank上公布的prn基因序列(AJ245927)，利用Primer5.0软件，分别设计两对引物，其序列见表1，分别扩增prn基因5’端1620bp和3’端1113bp的片段。

表1prn基因5’端和3’端扩增引物序列

引物	引物序列	限制性内切酶
			prn F1	5’-CGCGGATCCAACATGTCTCTGTCACGCATTGTC-3’	BamHI
prn R1	5’-CCGCTCGAGGATATCGACCTTGCCGTCCTT-3’	XhoI
			prn F2	5’-CCGGAATTCGGTACCTACCGCTATCGATTG-3’	EcoR I
prn R2	5’-CCCAAGCTTCCAGCTGTACCGGTAGCC-3’	Hind III

注：划线部分为酶切位点

1.1.2rPRN-N和rPRN-C表达工程菌株的构建

按北京全式金生物技术有限公司的试剂盒说明书(EasypureGenomicDNAExtractionKit)提取支气管败血波氏杆菌HN8株基因组，使用设计引物prnF1和prnR1扩增prn基因5’端1620bp的片段，上游引物设计有BamHI酶切位点，下游引物设计有XhoI酶切位点(表1)。使用设计引物prnF2和prnR2扩增prn基因3’端1113bp的片段，上游引物设计有EcoRI酶切位点，下游引物设计有HindIII酶切位点(表1)。PCR产物按北京全式金生物技术有限公司的DNA胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，将回收后的DNA片段进行双酶切，将酶切片段克隆至双酶切的pET28a质粒，转化感受态DH5α大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的质粒送到上海生工进行测序分析，获得构建正确的表达质粒pET28a-prnN和pET28a-prnC。

按北京全式金生物技术有限公司试剂盒(EasyPurePlasmidMiniPrepKit)说明书制备鉴定正确的质粒，通过热击转化的方式分别将表达质粒pET28a-prnN和pET28a-prnC转化入BL21(DE3)分别构建BL21-PRNN和BL21-PRNC表达工程菌，分别从LB(含卡那抗性)平板上挑取单菌落，进行PCR鉴定，将鉴定正确的菌株保存于-70℃备用。

1.1.3rPRN-N和rPRN-C蛋白的表达、Westernblot检测

将鉴定正确的表达工程菌BL21-PRNN和BL21-PRNC，分别划线于含卡那霉素的LB平板(30μg/ml)37℃温箱培养12～16小时。分别挑取BL21-PRNN和BL21-PRNC单个菌落，接种于含有卡那霉素(终浓度30μg/ml)的5mlLB液体培养基中，37℃摇床(200转/分)培养，培养至对数生长期OD₆₀₀达0.8～1.0时，加入异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，继续培养3～4小时。

分别取lml诱导物于4℃10000转/分离心5分钟，收集菌体，重悬于100μl灭菌去离子水中，加1/3体积的4×SDS-PAGE上样缓冲液。100℃水浴10分钟后，进行12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

样品经SDS-PAGE电泳后，进行Westernblot检测。一抗为支气管败血波氏杆菌感染猪康复血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。

1.2PMT蛋白N端和C端蛋白表达工程菌株的构建

1.2.1引物设计

参考GenBank上公布的toxA基因序列(AF240778)，利用Primer5.0软件，设计两对引物，其序列见表2，分别扩增toxA5’端1122bp和3’端1329bp的片段。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表2猪D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA5’端和3’端扩增引物序列

引物	引物序列	限制性内切酶
			toxA F1	5’-CGGGATCC GGGAACGTTTTTCATATAACTC-3’	BamHI
toxA R1	5’-CCGCTCGAGTTAGAAAGAAGATAAAATTTCTG-3’	XhoI
			toxA F2	5’-CGGGATCCGAAGTACAAGGTGATTTAGG-3’	BamHI
toxA R2	5’-CCGCTCGAGTTAAGGCTTTGTGAAAAGAGGAGG-3’	XhoI

注：划线部分为酶切位点

1.2.2rPMT-N和rPMT-C表达工程菌株的构建

按北京全式金生物技术有限公司的试剂盒说明书(EasypureGenomicDNAExtractionKit)提取猪D型产毒素多杀性巴氏杆菌基因组，使用设计引物toxAF1和toxAR1扩增toxA5’端1122bp的片段，使用设计引物toxAF2和toxAR2扩增toxA3’端1329bp的片段，上游引物设计有BamHI酶切位点，下游引物设计有XhoI酶切位点(表1)。PCR产物按北京全式金生物技术有限公司的DNA胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，将回收后的DNA片段进行双酶切(BamHI和XhoI)，将酶切片段克隆至BamHI和XhoI双酶切的pET28a质粒，转化感受态DH5α大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的质粒送到上海生工进行测序分析，获得构建正确的表达质粒pET28a-toxAN和pET28a-toxAC。

按北京全式金生物技术有限公司试剂盒(EasyPurePlasmidMiniPrepKit)说明书制备鉴定正确的质粒，通过热击转化的方式分别将表达质粒pET28a-toxAN和pET28a-toxAC转化入BL21(DE3)分别构建BL21-PMTN和BL21-PMTC表达工程菌，分别从LB(含卡那抗性)平板上挑取单菌落，进行PCR鉴定，将鉴定正确的菌株保存于-70℃备用。

1.2.3rPMT-N和rPMT-C蛋白的表达、Westernblot检测

将鉴定正确的表达工程菌BL21-PMTN和BL21-PMTC，分别划线于含卡那霉素的LB平板(30μg/ml)37℃温箱培养12～16小时。分别挑取BL21-PMTN和BL21-PMTC单个菌落，接种于含有卡那霉素(终浓度30μg/ml)的5mlLB液体培养基中，37℃摇床(200转/分)培养，培养至对数生长期OD₆₀₀达0.8～1.0时，加入异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，继续培养3～4小时。

样品经SDS-PAGE电泳后，进行Westernblot检测。一抗为猪D型产毒素多杀性巴氏杆菌HB4株感染康复血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。

实施例2抗原的制备

2.1支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端和C端蛋白的制备

表达工程菌BL21-PRNN和BL21-PRNC，分别划线于含卡那霉素的LB平板(30μg/ml)37℃温箱培养16小时。分别挑取BL21-PRNN和BL21-PRNC单个菌落，接种于5ml含有卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，37℃摇床(200转/分)培养16小时，以1％的比例接种于含30μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床(200转/分)培养至OD₆₀₀达0.8～1.0时，加入适量异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养3～4小时。诱导结束水浴加热，60℃灭活60分钟，期间每5分钟摇动一次。灭活完毕后取样分别进行灭活检验和蛋白定量。

基因工程表达菌BL21-PRNN和BL21-PRNC灭活后取lml于4℃8000转/分离心5分钟，收集菌体，重悬于100μl灭菌去离子水中，加1/3体积的4×SDS凝胶加样缓冲液。95℃水浴5～10分钟后，进行12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。在进行SDS-PAGE分析时，另取浓度为750μg/ml、500μg/ml、375μg/ml、187.5μg/ml、93.75μg/ml牛血清白蛋白液(Bovineserumalbumin，BSA；Sigma)分别加入1/3体积的4×SDS-PAGE上样缓冲液，经SDS-PAGE电泳后，经考马斯亮蓝染色并脱色后使用扫描仪扫描，以Alph-Imager^TM3400对图像进行定量分析，以BSA分析值蛋白浓度建立回归曲线，再以回归曲线计算表达rPRN-N和rPRN-C蛋白的浓度。

将灭活菌液离心去除上清，据灭活前定量结果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将菌体悬浮并调节浓度，rPRN-N和rPRN-C蛋白浓度不低于250.0μg/ml。

2.2PMT蛋白N端和C端蛋白的制备

表达工程菌BL21-PMTN和BL21-PMTC，分别划线于含卡那霉素的LB平板(30μg/ml)37℃温箱培养16小时。分别挑取BL21-PMTN和BL21-PMTC单个菌落，接种于5ml含有卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，37℃摇床(200转/分)培养16小时，以1％的比例接种于含30μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床(200转/分)培养至OD₆₀₀达0.8～1.0时，加入适量异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养3～4小时。诱导结束水浴加热，60℃灭活60分钟，期间每5分钟摇动一次。灭活完毕后取样分别进行灭活检验和蛋白定量。

基因工程表达菌BL21-PMTN和BL21-PMTC灭活后取lml于4℃8000转/分离心5分钟，收集菌体，重悬于100μl灭菌去离子水中，加1/3体积的4×SDS凝胶加样缓冲液。95℃水浴5～10分钟后，进行12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。在进行SDS-PAGE分析时，另取浓度为750μg/ml、500μg/ml、375μg/ml、187.5μg/ml、93.75μg/ml牛血清白蛋白液(Bovineserumalbumin，BSA；Sigma)分别加入1/3体积的4×SDS-PAGE上样缓冲液，经SDS-PAGE电泳后，经考马斯亮蓝染色并脱色后使用扫描仪扫描，以Alph-Imager^TM3400对图像进行定量分析，以BSA分析值蛋白浓度建立回归曲线，再以回归曲线计算表达rPMT-N和rPMT-C蛋白的浓度。

将灭活菌液离心去除上清，据灭活前定量结果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将菌体悬浮并调节浓度，rPMT-N和rPMT-C蛋白浓度不低于250.0μg/ml。

实施例3疫苗的制备

取制备的rPRN-N、rPRN-C、rPMT-N和rPMT-C蛋白抗原，加入适量的MontanideGEL01佐剂，用磁力搅拌器搅拌，最后加入柳硫汞，使柳硫汞最终浓度为万分之一，混匀、检验、分装，即为猪萎缩性鼻炎亚单位疫苗，其中疫苗中每种抗原含量为12.5-50μg/ml。各实施例具体成分配比如表3：

表3疫苗配比具体实施案例

	疫苗1	疫苗2	疫苗3
				rPRN-N	12.5μg/ml	25μg/ml	50μg/ml
rPRN-C	12.5μg/ml	25μg/ml	50μg/ml
				rPMT-N	12.5μg/ml	25μg/ml	50μg/ml
rPMT-C	12.5μg/ml	25μg/ml	50μg/ml
				Montanide GEL 01	20％	20％	20％

实施例4疫苗的无菌检验

无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录的方法对三种疫苗进行无菌检验。

实施例5安全试验

选取7～10日龄的无支气管败血波氏杆菌及PMT抗体的仔猪15头，随机分为3组，分别免疫疫苗1、疫苗2和疫苗3，颈部肌肉注射，4ml/头，观察14日，应无不良反应，且全部健活。

实施例6效力检验

选择波氏杆菌抗体、多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb、Pm抗原阴性的7～10日龄仔猪20头，分为4组，每组5头，3组分别免疫疫苗1、疫苗2和疫苗3，另一组作为对照。7～10日龄仔猪进行第一次免疫，颈部肌肉注射，2ml/头，间隔14日，以相同的方式和剂量进行第二次免疫，间隔21日，对免疫猪连同对照猪进行第1次攻毒，间隔2日后连续2日进行第2次和第3次攻毒，三次攻毒的方式和剂量相同。攻毒时采用滴鼻的方式进行，将猪支气管败血波氏杆菌HN8株和猪多杀性巴氏杆菌HB4株菌液混合，混合后的菌液中含HN8株2×10⁹CFU/ml，多杀性巴氏杆菌HB4株菌液含2×10¹⁰CFU/ml，攻毒时1ml/鼻孔，两个鼻孔同时攻毒。

最后一次攻毒后35天处理仔猪，对鼻甲骨萎缩情况进行评分，具体解剖和评分标准如下：

将尸体横卧，将其下颌稍抬高，除去鼻部表皮，在猪上颌两侧第一前臼齿之间的连线，用钢锯切一横断面，从横断面上观察鼻甲骨萎缩(TA)情况和鼻中隔偏曲(NSD)。

鼻甲骨萎缩(TA)判断分0-4分

0:正常，没有任何病变。

1：很小一部分萎缩(一个蜷曲将近一半萎缩)。

2：轻微萎缩：一个蜷曲超过一半萎缩。

3中度萎缩：鼻甲骨强直。

4：严重萎缩：鼻甲股整个蜷曲消失。

鼻中隔弯曲(NSD)判断分0-2分

0：正常

1：轻微弯曲

2：严重弯曲

鼻甲骨萎缩(TA)情况和鼻中隔弯曲(NSD)相加最高分数为18分，仔猪鼻甲骨萎缩分数不低于8分判为发病。将每一试验组鼻甲骨病变分数取其平均分(Meannasallesionscores)，然后进行统计学分析。

对照组至少4/5发病，免疫组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数应显著低于照组。

实施例7本发明疫苗于其他组分疫苗对比试验

A疫苗：含有灭活的支气管败血波氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌。每头份(2ml)抗原含量为支气管败血波氏杆菌D型多杀性巴氏杆菌灭活前活菌数均为2×10⁹CFU，佐剂为MontanideGEL01。

B疫苗：含有灭活的支气管败血波氏杆菌、D型多杀性巴氏杆菌和PMT类毒素，PMT类毒素为产毒素巴氏杆菌培养后破碎，提纯的PMT经甲醛灭活的蛋白。每头份(2ml)抗原含量为支气管败血波氏杆菌、A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌灭活前活菌数均为2×10⁹CFU，PMT类毒素含量10μg/头份，佐剂为MontanideGEL01。

本发明疫苗：疫苗1和疫苗3。各疫苗抗原含量见实施例3。

7.1安全性比较试验

使用本发明抗原含量最高的疫苗3分别与A疫苗、B疫苗进行安全性比较。选取7～10日龄的无支气管败血波氏杆菌及PMT抗体的仔猪15头，随机分为3组，分别免疫疫苗3、A疫苗和B疫苗，颈部肌肉注射，4ml/头，观察14日，观察各免疫组仔猪的不良反应以及测定免疫前后仔猪体温。

7.2效力比较试验

使用本发明抗原含量最低的疫苗1分别与A疫苗、B疫苗进行效力比较。选择波氏杆菌抗体、多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的7～10日龄仔猪20头，分为4组，每组5头，3组分别免疫疫苗1、A疫苗和B疫苗，另一组作为对照。7～10日龄仔猪进行第一次免疫，颈部肌肉注射，2ml/头，间隔14日，以相同的方式和剂量进行第二次免疫，间隔21日，对免疫猪连同对照猪进行第1次攻毒，间隔2日后连续2日进行第2次和第3次攻毒，三次攻毒的方式和剂量相同。攻毒时采用滴鼻的方式进行，将猪支气管败血波氏杆菌HN8株和猪多杀性巴氏杆菌HB4株菌液混合，混合后的菌液中含HN8株2×10⁹CFU/ml，多杀性巴氏杆菌HB4株菌液含2×10¹⁰CFU/ml，攻毒时1ml/鼻孔，两个鼻孔同时攻毒。最后一次攻毒后35天处理仔猪，对鼻甲骨病变情况进行评分(评分方法见实施例6)，然后进行统计学分析。

实施例8结果分析

8.1菌种的构建

8.1.1支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端和C端蛋白表达工程菌株的构建

8.1.1.1目的基因的克隆

以提取的支气管败血波氏杆菌HN8株基因组DNA为模板，使用设计的引物prnF1和prnR1扩增prn基因5’端1620bp的基因片段，使用设计的引物prnF2和prnR2扩增prn基因3’端1113bp的基因片段，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。结果显示，PCR扩增产物分子量约为1600bp和1100bp，大小与设计扩增基因片段的大小(1620bp和1113bp)相符。

8.1.1.2重组表达载体的鉴定

将构建好的重组表达载体pET28a-prnN用BamHI和XhoI双酶切，和pET28a-prnC用EcoRI和HindIII双酶切后进行1％琼脂糖电泳，结果显示pET28a-prnN双酶切后有两条条带，一条片段大小约为1600bp，另一条片段大小约为5300bp(图2)，pET28a-prnC双酶切后有两条条带，一条片段大小约为1100bp，另一条片段大小约为5300bp(图2)，表明构建质粒正确。

8.1.3表达工程菌株的构建

构建好的重组表达质粒pET28a-prnN和pET28a-prnC分别转化大肠杆菌BL21，分别构建表达工程菌BL21-PRNN和BL21-PRNC，BL21-PRNN和BL21-PRNC菌株在含30μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基中37℃培养14～16小时，菌落光滑圆润，培养物涂片染色为革兰氏阴性杆菌，具有大肠杆菌的典型形态。使用实施例1中1.1.1的PCR引物对挑取的单菌落提取DNA进行PCR鉴定，产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下可分别观察到大小约为1600bp和1100bp的特异性扩增条带，将鉴定正确的菌株冻干后保存于-70℃备用。

8.1.1.4蛋白的表达和Westernblot分析

表达的PRN蛋白N端和C端蛋白分别对应于PRN的1～540和541～911氨基酸残基片段，PRN-N和PRN-C片段的氨基酸序列见序列表SEQIDNO.2和NO.4，PRN-N和PRN-C片段大小分别为55kDa和39kDa，蛋白的表达和Westernblot结果显示，PRNN端表达蛋白和C端表达蛋白与预期分子量大小一致(图3)，可以与支气管败血波氏杆菌的猪康复期血清反应，在特定位置处有明显的条带(图3)。

8.1.2PMT蛋白N端和C端蛋白表达工程菌株的构建

8.1.2.1目的基因的克隆

以提取的HB4株基因组DNA为模板，使用设计的引物toxAF1和toxAR1扩增toxA5’端1122bp的基因片段，使用设计的引物toxAF2和toxAR2扩增toxA3’端1329bp的基因片段，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图4)。结果显示，PCR扩增产物分子量约为1100bp和1300bp，大小与设计扩增基因片段的大小(1122bp和1329bp)相符。

8.1.2.2重组表达载体的鉴定

将构建好的重组表达载体pET28a-toxAN和pET28a-toxAC用BamHI和XhoI双酶切后，进行1％琼脂糖电泳，结果显示pET28a-toxAN双酶切后有两条条带，一条片段大小约为1100bp，另一条片段大小约为5300bp(图5)，pET28a-toxAC双酶切后有两条条带，一条片段大小约为1300bp，另一条片段大小约为5300bp(图5)，表明构建质粒正确。

8.1.2.3表达工程菌株的构建

构建好的重组表达质粒pET28a-toxAN和pET28a-toxAC分别转化大肠杆菌BL21，分别构建表达工程菌BL21-PMTN和BL21-PMTC，BL21-PMTN和BL21-PMTC菌株在含30μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基中37℃培养14～16小时，菌落光滑圆润，培养物涂片染色为革兰氏阴性杆菌，具有大肠杆菌的典型形态。使用实施例1中1.2.1的PCR引物对挑取的单菌落提取DNA进行PCR鉴定，产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下可分别观察到大小约为1100bp和1300bp的特异性扩增条带，将鉴定正确的菌株冻干后保存于-70℃备用，每种菌冻干保存20瓶。

8.1.2.4蛋白的表达和Westernblot分析

表达的PMT蛋白N端和C端蛋白分别对应于PMT的95～468和837～1279氨基酸残基片段，PMT-N和PMT-C片段的氨基酸序列见序列表SEQNO.6和NO.8，PMT-N和PMT-C片段大小分别为43.6kDa和50.3kDa，蛋白的表达和Westernblot结果显示，PMTN端表达蛋白和C端表达蛋白与预期分子量大小一致(图6)，可以与感染HB4株的猪康复期血清反应，在特定位置处有明显的条带(图6)。

8.2疫苗配制

8.2.1抗原的制备与蛋白定量

收获诱导后菌液，加热灭活后取样进行蛋白浓度的测定，表达rPRN-N、rPRN-C、rPMT-N和rPMT-C蛋白的浓度见表4。

表4诱导培养的菌液灭活后蛋白定量结果

蛋白	菌液表达蛋白浓度(μg/ml)
		rPRN-N	212
rPRN-C	308
		rPMT-N	516
rPMT-C	563

8.2.2蛋白浓度调整

将灭活菌液离心去除上清，据灭活前定量结果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将菌体悬浮并调节浓度，rPRN-N、rPRN-C、rPMT-N和rPMT-C蛋白浓度不低于250.0μg/ml。

8.2.3配苗

按照实施例3的方法分别配制疫苗1、疫苗2和疫苗3，疫苗1每种抗原含量为12.5μg/ml，疫苗2每种抗原含量为25μg/ml，疫苗3每种抗原含量为50μg/ml，具体见表5。

表5疫苗的配制(按1L疫苗量计算)

	疫苗1	疫苗2	疫苗3
				rPRN-N抗原(250.0μg/ml)	50ml	100ml	200ml
rPRN-C抗原(250.0μg/ml)	50ml	100ml	200ml
				rPMT-N抗原(250.0μg/ml)	50ml	100ml	200ml
rPMT-C抗原(250.0μg/ml)	50ml	100ml	200ml
				PBS	600ml	400ml	0ml
Montanide GEL 01	200ml	200ml	200ml

8.3无菌检验

按现行《中华人民共和国兽药典》附录的方法对三种疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长，如表6。

表6疫苗无菌检验结果

疫苗	T.G培养	G.A培养	G.P培养	判定
					疫苗1	-	-	-	无菌生长
疫苗2	-	-	-	无菌生长
					疫苗3	-	-	-	无菌生长

8.4安全试验结果

对7～10日龄仔猪双倍剂量注射疫苗1、疫苗2和疫苗3，注射后观察14日，未见有不良反应，仔猪采食和饮水正常，神状态良好，全部健活，仔猪安检合格。

8.5效力检验结果

各免疫组和未免疫组攻毒后35天处理观察鼻甲骨萎缩情况，结果见表7。非免疫攻毒对照组仔猪攻毒后剖检时鼻甲骨萎缩严重，鼻甲骨评价在9～14分之间(表7)，非免疫攻毒对照组5/5发病，免疫攻毒组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数与非免疫攻毒对照组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数相比显著降低(P＜0.05)，免疫仔猪得到有效保护。

表7各组仔猪鼻甲骨萎缩情况

“*”：上标不同表示有显著差异，P≤0.05。

8.6本疫苗于其他组分疫苗对比试验

8.6.1安全性比较试验

用本发明的疫苗3、A疫苗和B疫苗分别肌肉注射仔猪，每组5头，每头注射2头份4ml，注射后观察临床表现，连续观察14日以及测定注射前后体温，临床观察和体温记录见表8和表9，疫苗3超剂量注射免疫猪后均未出现异常临床表现，注射后6小时体温有所升高，到注射后24小时体温回复正常。A疫苗和B疫苗注射免疫猪后均出现不同程度的呕吐、颤抖等不良反应，注射后6小时和24小时体温有所升高，到注射后48小时才体温回复正常。有以上结果可见本发明疫苗3的安全性优于疫苗A和疫苗B。

表8各疫苗注射后临床症状

表9各疫苗注射前后各组仔猪平均体温

8.6.2效力比较试验

本发明疫苗1、A疫苗、B疫苗免疫组和未免疫组攻毒后35天处理观察鼻甲骨萎缩情况，结果见表10。非免疫攻毒对照组仔猪攻毒后剖检时鼻甲骨萎缩严重，鼻甲骨评价在8～15分之间，非免疫攻毒对照组5/5发病，各免疫攻毒组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数与非免疫攻毒对照组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数相比显著降低(P＜0.05)，疫苗1免疫组猪鼻甲骨病变平均分数较A和B疫苗免疫组低，疫苗1免疫组0/5发病，A疫苗免疫组2/5发病，B疫苗免疫组1/5发病。以上结果表明三种疫苗都具有良好的保护效果，但本发明的疫苗1从病变评分和发病率来看免疫保护效果最好。

表10各组仔猪鼻甲骨萎缩情况

“*”：上标不同表示有显著差异，P≤0.05。

本发明利用基因工程手段，分别将PRN蛋白N端和C端蛋白分别对应于PRN的1～540和541～911氨基酸残基片段，PMT蛋白N端和C端蛋白分别对应于PMT的95～468和837～1279氨基酸残基片段分别克隆表达，有蛋白表达量可见四种蛋白的表达量为212～563μg/ml，蛋白表达量高。蛋白经加热灭活后，不需要进行菌体破碎和纯化，配制的基因工程亚单位疫苗包含分段表达的支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白(rPRN-N、rPRN-C)和分段表达的PMT蛋白(rPMT-N、rPMT-C)，该疫苗为全新的疫苗组合，不同抗原含量的该疫苗(每种抗原含量为12.5μg/ml～50μg/ml)能够对仔猪提供很好的保护，证明本发明分段的蛋白具有良好的免疫原性，因本发明疫苗的四个蛋白为PRN和PMT的片段，没有了这两种蛋白的致病性，仔猪安全性试验证明安全性良好。分别与全菌体疫苗、全菌体添加天然类毒素疫苗相比安全性和效力更好。因此本发明解决了培养病原菌体和提取毒素灭活不完全有潜在安全风险的问题，同时表达的蛋白具有表达量高，不需要纯化，具有生产方便，成本低的优势，解决了培养菌体提取毒素成本高的问题以及表达蛋白菌体破碎后内毒素高导致的副反应大等问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原和C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原和C端蛋白抗原以及药学上的载体。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原包括至少1-540位氨基酸残基，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原包括至少541-911位氨基酸残基；

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.2,所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.6,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.8。

4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的含量范围均为12.5～50μg/ml；优选地，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的含量均为25μg/ml。

5.根据权利要求1～4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶佐剂、MontanideGEL01、MontanidePETGELA、MontanideIMS1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质(MPIA)中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括MontanideGEL01。

7.一种权利要求1所述疫苗组合物的制备方法,其特征在于，所述方法包括：

(1)分别克隆表达所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原、支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原以及产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原；以及

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.2,所述支气管败血波氏杆菌PRN黏附素蛋白C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.6,所述产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素C端蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ.NO.8；所述四种蛋白抗原的含量范围均为12.5～50μg/ml。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中还加入佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶佐剂、MontanideGEL01、MontanidePETGELA、MontanideIMS1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质(MPIA)中的一种或几种。

10.根据权利要求1～6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗引起猪萎缩性鼻炎的药物中的应用。