DK169276B1 - Vaccine indeholdende et immunogent virusprotein - Google Patents

Description

i DK 169276 B1

Opfindelsen angår en hidtil ukendt vaccine omfattende et immunogent virusprotein, som er i stand til at inducere produktionen af beskyttende antistoffer i en vært, sammen med en mængde hjælpestof af bestemte proteiner eller pepti-5 der, der som sådan ikke er i stand til at inducere væsentlige beskyttende antistoftitere, men øger immuniseringsaktiviteten af det naturlige protein betydeligt.

Et særligt aspekt af opfindelsen angår en hidtil ukendt picornavirusvaccine omfattende inaktiveret picorna-10 virus og bestemte hjælpestof proteiner, beslægtet med picoma-virus.

Det er kendt at øge virkningen af immuniseringer ved gentagen indgift af antigenet. Den anden og om nødvendigt følgende boosterinjektioner inducerer høje titere af beskyt-15 tende antistoffer.

Det er ligeledes kendt at øge virkningen af et antigen ved en forbehandling af værten med en underenhed af det naturlige antigen. Denne såkaldte forstærkende ("priming") virkning er blevet påvist eksempelvis med et peptid indehol-20 dende aminosyresekvensen af B-underenheden af kolera-toxin. Dette peptid kobles til en proteinbærer, og konjugatet anvendes til at forstærke immuniseringer. Efter forstærkning fører injektion med en sub-immuniserende mængde koleratoxin til en væsentlig koncentration af neutraliserende antistof-25 fer. [Jacob et al., The EMBO Journal 4 (1985), side 3339--3343] .

I tilfældet med poliovaccine har Van Wezel et al. [Dev.Biol.Stand. 55 (1984), side 209-215] påvist en lignende forstærkende virkning. Injektion af polioviruscapsidprotei-30 ner, isoleret ved hjælp af SDS-PAGE, fulgt af en injektion med inaktiveret poliovaccine resulterer i stimulering af dannelsen af neutraliserende antistoffer.

I 1983 har Emini et al. [Nature 304 (1983), s. 699-703] beskrevet forstækningsprincippet i forbindelse med 35 peptider bestående af 5-10 aminosyrer koblet til bærerproteiner. Sekvensen af peptiderne svarer til dele af capsidprotei- 2 DK 169276 B1 net I af poliovirus type 1 (stamme: Mahoney) . I alle tilfælde blev der iagttaget en stimulering af den neutraliserende reaktion over for poliovirus af typen 1. Vira af picornavi-rusfamilien er vira indeholdende RNA. Deres diameter er ca.

5 30 nm, og deres proteincapsid har form af et icosaeder.

Baseret på fysisk-kemiske karakteristika deles familien i fire slægter: a. enterovirus (f.eks. polio, hepatitis A, echo og coxsackievirus) , 10 b. cardiovirus (f.eks. encephalomyocarditis og Mengovirus), c. rhinovirus og d. aphtovirus (f.eks. mund-og-klovsyge virus).

Inden for medlemmerne af slægterne foretages der en differentiering i typer. Eksempelvis er der tre typer polyo-15 virus (1-3), mindst 89 typer rhinovirus og 7 typer mund-og--klovsyge virus.

Poliovirionet indeholder 60 protomere. Hver af disse protomere består af 4 capsidproteiner (VP1-VP4). Capsidpro-teinerne VP1, VP2 og VP3 er anbragt på overfladen af virio-20 net, medens VP4 er anbragt i proteincapsidets indre. Placeringen af de tre overflade-placerede capsidproteiner er beskrevet i Hogle et al. Science 229 (1985), s. 1358-65.

Den tredimensionale opbygning af disse tre capsidproteiner er i det væsentlige identisk. I deres naturlige konformation 25 indeholder capsidproteinerne fire sløjfer og otte såkaldte beta-flader.

Aminosyresekvensen af capsidproteinerne af et antal picornavira er kendt. Picornavira med en kendt primær struktur er de tre typer poliovirus [Nature 291 (1981), s. 547-30 -553; J.Mol.Biol. 174 (1984), s. 561-585; Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81 (1984), s. 1539-1543], hepatitis A (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) s. 2627-2631], to typer rhinovirus [Nuel. Ac. Res. 13 (1985) s. 2111-2126; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), s.732-736], coxsackievirus B3 [Vir.

35 Res. 3 (1985), s. 263-270], encephalomyocarditisvirus [Nucl.Ac.Res. 12, (1984) s. 2969-2985], og et antal mund- 3 DK 169276 B1 -og-klov-syge virusstammer [Gene 17 (1982), s. 153-161;

Nuel.Ac.Res, 12 (1984), s. 6587-6601]. Sammenligning af disse sekvenser viser, at den primære struktur af de tre typer poliovirus er nærmere beslægtet til rhinoviras primære 5 struktur end til hepatitis A's primære struktur. Hepatitis A hører, ligesom poliovirus, til enterovira-slægten. Dette viser, at slægtskabet inden for slægten ikke nødvendigvis er stærkere end udenfor slægten. Emini et al. (Virology 140 (1985), s. 13-20) har ved hjælp af immunokemiske fremgangs-10 måder vist, at der er slægtsskaber mellem capsidproteinerne af et antal enterovira og rhinovirus 2's capsidproteiner. Capsidprotein 3 viser den stærkeste tværreaktivitet.

Immunisering med inaktiveret poliovaccine (almindeligvis formalin-inaktiveret virussuspension af de tre poliovi-15 rustyper) resulterer i dannelsen af neutraliserende antistoffer. Disse antistoffer forbinder sig med det intakte virus. Placeringen af antigen-determinanterne, som giver anledning til dannelsen af neutraliserende antistoffer, er bestemt ved hjælp af de såkaldte "escape mutans" (Nature 301 (1983), 20 s. 674-679; J. Virol. 57 (1986), s. 246-257). Det fremgår i praktisk taget alle tilfælde, at disse determinanter forekommer i capsidproteinernes sløjfer. Capsidproteinerne i poliovirus viser en kraftig indbyrdes vekselvirkning. Som en følge af denne vekselvirkning har man anvendt denatureringsbetin-25 gelser til isolering af capsidproteinerne. Injektioner med de rensede capsidproteiner af polovirus resulterer ikke i dannelsen af signifikante titere af neutraliserede antistoffer. Denne mangel på evne til at inducere dannelsen af neutraliserede antistoffer må tilskrives det faktum, at den 30 tredimensionale opbygning af de isolerede capsidproteiner stærkt afviger fra den tredimensionale opbygning af proteinerne i viruset.

Toyoda et al. beskriver i J.Mol.Biol. 1984, s. 561--585 den primære struktur af capsidproteinerne af de tre 35 typer poliovirus (af hver enkelt type analyseredes Sabin--stammen). Sammenligning mellem disse strukturer viser kraf- DK 169276 91 4 tige sekventielle homologier for de tre typer. De positioner i capsidproteinerne, hvor der iagttages forskelle, er almindeligvis placeret i capsidproteinernes sløjfer.

Mindst to lymfecellepopulationer er involveret i 5 dannelsen af antistoffer efter injektion af antigener: B--cellen og hjælpercellen T. B-cellen genkender antigen-determinanten, og hjælpercellen genkender bærerdeterminanten efter behandling af antigenet. Senere er B-cellen efter differentiering ind i en plasmacelle ansvarlig for dannelsen af 10 antistoffer, rettet mod antigen-determinanten. Baseret på disse immunologiske data har Gupta et al. (Proc.Natl.Acad.

Sci. USA 83 (1986), s. 2604-2608) foreslået, at B-cellen genkender antigen-determinanten, mod hvilken der dannes neutraliserende antistoffer, og at hjælpercellen T genkender 15 resten af viruset. Som omtalt ovenfor indeholder resten af viruset et stor antal fælles sekvenser. Genkendelsen ved hjælp af hjælpercellen T er betydeligt mindre konformations-afhængig end genkendelsen ved hjælp af B-cellen. Baseret på disse data og forekomsten af fælles sekvenser i naturlige 20 antigener synes det at være sandsynligt, at hjælperceller T, som genkender disse fælles strukturer, dannes efter immunisering med naturlige proteiner eller efter injektion med proteiner eller peptider, som har sekventiel homologi med de naturlige proteiner.

25 Stimuleringen iagttages ikke kun med virustypen, som er homolog med capsidproteinet (homotypisk) men ligeledes for de andre virustyper (heterotypisk). Graden af forstærkende stimulering svarer praktisk taget til graden af boo-stervirkningen, når vaccinen injiceres to gange. De denatu-30 rerede capsidproteiner er ikke eller næsten ikke i stand til at inducere dannelsen af neutraliserende antistoffer.

Det menes, at denne forstærkende stimulering, der fås ved injektion med bærerdelen af et antigen, fulgt af en injektion med det fuldstændige antigen, resulterer i stimulering af 35 antistof reakt ionen mod hapten (antigen-determinant). Sandsynligvis er de fælles primære stukturer ansvarlige for den 5 DK 169276 B1 heterotypiske stimulering ved hjælp af capsidproteinerne.

Ifølge opfindelsen har det vist sig, at antigenisk uvirksomme proteiner og peptider med sekventiel homologi med et naturligt antigen ikke kun viser den forstærkende 5 virkning, når de injiceres nogen tid forud for vaccination med det naturlige antigen, men ligeledes er anvendelige som hjælpestoffer til de naturlige antigenproteiner.

Opfindelsen er særdeles nyttig, fordi den tilvejebringer en vaccine, som ved en enkelt vaccination inducerer 10 høje titere af neutraliserende antistoffer med lavere doser af naturligt antigenprotein.

I overensstemmelse hermed er vaccinen ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at den indeholder et immunogent virusprotein, som er i stand til at inducere produktionen af 15 beskyttende antistoffer i en vært, sammen med et protein eller peptid med sekventiel homologi med det immunogene protein, hvorhos proteinet eller peptidet med sekventiel homologi inducerer den forstærkende ("priming'·) virkning for det immunogene protein, men ikke inducerer dannelsen af 20 beskyttende antistoffer i en udstrækning, som er tilstrækkelig til at give en beskyttende immunitet, idet dog proteinet eller peptidet med sekventiel homologi er til stede i vaccinen i en mængde, som er tilstrækkelig til at forøge værtens reaktion på det immunogene protein.

25 En fordelagtig udførelsesform for vaccinen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det immunogene protein er inaktiveret picornavirus, og at proteinet eller peptidet med sekventiel homologi er denatureret picornaviruscapsidpro-tein.

30 Udtrykket "denatureret picornaviruscapsidprotein" omfatter proteiner, isoleret fra viruscapsidet, såvel som peptider, produceret ved andre fremgangsmåder, såsom syntetiske metoder eller rekombinant DNA-teknik, for så vidt som disse peptider viser sekventiel homologi med viruscap-35 sidproteinerne. Almindeligvis omfatter de denaturerede picor-naviruscapsidproteiner alle de peptider, som viser den kendte DK 169276 Bl 6 forstærkende virkning, der, som omtalt ovenfor, er øgningen af produktionen af neutraliserende antistoffer ved hjælp af en picornavirusvaccine, når værten injiceres med det forstærkende peptid nogen tid forud for vaccinationen.

5 Det faktum, at forstærkende injektioner eller gentagne boostervaccinationer således er blevet overflødige, er en stor fordel for patienten.

Det formodes, at den nyligt fundne hjælpestofvirkning af de denaturerede capsidproteiner og af de beslægtede syn-10 tetiske peptider skyldes en yderligere stimulering af T— hjælpecellepopulationen, som er involveret i B-cellereakti-onen over for det naturlige protein.

Skønt opfindelsen belyses ved hjælp af forsøgsresultater, der fås med poliovirus, tyder den kendte tilstedevæ-15 relse af identiske eller lignende primære strukturer i cap-sidproteinerne fra vira samt den kendte forstærkende virkning, der sker med mange forskellige antigener på at den nyligt fundne hjælpestofvirkning vil være anvendelig på alle slags naturlige proteinvacciner.

20 Opfindelsen er især anvendelig på vacciner, der inde holder inaktiveret picornavirus, især inaktiveret enterovirus, nærmere bestemt enterovira, valgt blandt inaktiveret poliovirus, hepatitis A-virus, echovirus, rhinovirus og coxsackievirus.

25 Opfindelsen angår vacciner, hvori det inaktiverede enterovirus er en inaktiveret poliovirus, valgt blandt poliovirus type 1, poliovirus type 2, poliovirus type 3 og blandinger deraf.

I vaccinerne ifølge opfindelsen er det ikke nødven-30 digt, at de sekventielt homologe proteiner eller peptider, såsom de denaturede picornaviruscapsidproteiner, er afledt af en slægt eller art, som er identisk med det naturlige protein, anvendt sammen med hjælpestofproteinerne ellerpeptiderne.

35 Man har opnået fortrinlige resultater med en vaccine indeholdende inaktiveret poliovirus, såsom poliovirus type DK 169276 B1 7 1, type 2, type 3 og blandinger deraf, sammen med denatureret polioviruscapsidproteiner, såsom VP1, VP2, VP3, VP4 og blandinger deraf. I dette tilfælde er de primære strukturer af de tre typer capsidproteiner, som er fælles for alle cap-5 sidproteiner, ligeledes ansvarlige for den iagttagne hetero-typiske hjælpestofvirkning på reaktionen af det neutraliserende antistof over for poliovaccine.

Det følgende eksempel belyser opfindelsen.

10 Eksempel

Trivalent inaktiveret poliovaccine.

Trivalent inaktiveret poliovaccine fremstilles som beskrevet af Van Wezel et al. (Develop. Biol. Stand., 41, 159-168 (1978), Rev.Inf.Dis., 6, 335-340 (1984)) og indehol-15 der 10,1 og 6 D-antigenenheder pr. ml for henholdsvis vaccinekomponenterne 1, 2 og 3.

Fremstilling af en koncentreret virussuspension.

Poliovirus type 1 (Mahoney-stammen) dyrkes i en mikro-20 bærerkultur på tertiære abenyreceller. Virushøsten klares, koncentreres og renses ifølge de fremgangsmåder, der er beskrevet i de ovennævnte referencer. Den rensede virussuspension koncentreres ved tilsætning af 6,3 vægt/volumen-procent polyethylenglycol. Den opaliserende suspension cen-25 trifugeres (4000 g, 15 minutter), og pelleten suspenderes atter i M 199 og dialyseres mod dette medium. Virussuspensionen klares (4000 G, 15 minutter) , og viruset pelletteres atter (100.000 g, 4 timer). Pelleten suspenderes i RBS-puffer (sammensætning: 0,01 M Tris, 0,01 M NaCl og 1,5 mM MgCl2, 30 pH 6,0), og proteinindholdet bestemmmes ved fremgangsmåden ifølge Peterson (Anal. Biochem., 83, 346-356 (1977).

Isolering af capsidproteiner.

i. ved hjælp af HPLC

35 Isolering af capsidproteinerne udføres i det væsent lige som beskrevet af Dernick et al. (Virology 130, 243-246 DK 169276 B1 8 (1983)). I stedet for at anvende storporet C18 silica anvendes storporet phenylsilica fra Vydac (The Separation Groups, Hesparia, Kalifornia, katalog nr. 219). En virusprøve indeholdende 1,1 mg virus i 160 /iliter puffer blandes med 240 5 jul myresyre og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter klaring (10.000 g, 5 minutter) injiceres en 400 μΐ prøve, og capsidproteinerne elueres i 60 volumenprocent myresyre med en lineær gradient på 60% myresyre i acetoni-tril. Fraktioner indeholdende capsidproteinerne opsamles.

10 Overskuddet af myresyre og acetonitril fjernes i en højhastigheds -vakuuminddamper (Savant Inc., Hickville, NY) i forening med en FTS systems Multi Cool (Stone Ridge, NY). Derefter dialyseres fraktionerne mod 8 M urinstof og analyseres ved hjælp af SDS-PAGE (Nature 227, 680-685 (1970)). Til 15 slut analyseres proteinindholdet i fraktionerne,

ii. ved hjælp af SDS-PAGE

Den rensede virussuspension inkuberes i Laemmli prøvepuffer (Nature 227, 680-685 (1970)) indeholdende 8 M urinstof, 2 vægt/volumenprocent SDS og 0,1 M dithiothreitol i 20 løbet af 3 timer ved 37°C. Capsidproteiner isoleres ved hjælp af præparativ SDS-PAGE i en 3 mm tyk 10% tyktflydende gel indeholdende 1 M urinstof. Placeringen af capsidproteinerne lokaliseres ved at dække gelen i et kort tidsrum med en plade af nitrocellulose og derpå visualisere proteinlinier 25 på pladen ved hjælp af en enzymimmunanalyse som beskrevet af Tonbin et al. (Proc.Natl.Acad,Sci.USA 76, 4350-4354 (1979)) . Det konjugerede antiserum rettes mod de denaturerede capsidproteiner (Vaccine 1, 17-22 (1983)). Capsidproteinerne elektroelueres fra de udskårne dele af gelen indeholdende 30 proteinerne. Deres identitet efterprøves ved hjælp af SDS--PAGE, og der anvendes Peterson-analyse til bestemmelse af deres proteinindhold.

Immunisering af rotter.

35 Fire grupper bestående af tre i laboratoriet aflede spf Wistar rotter injiceres intramuskulært med en blanding 9 DK 169276 B1 af 30 μg af de særskilt rensede capsidproteiner (0,25 ml), trivalent inaktiveret poliovaccine (injiceret mængde: 2,5, 0,25 og 1,5 D enheder for henholdsvis komponent type 1, 2 og 3) og 1,5 mg A1P04. Fem forskellige kontrolgrupper inji-5 ceres med den samme dosis af de fire særskilt rensede peptidproteiner plus A1P04 eller den samme dosis trivalent inaktiveret poliovaccine plus A1P04. Blodprøver opsamles forud for og fire uger efter injicering.

10 Bestemmelse af neutraliserende antistoffer.

De neutraliserende antistof-titere af sera bestemmes i mikrotiterplader ved tilsætning af en smitsom poliotype 1 (Mahoney-stamme), type 2 (MEF-stamme) eller type 3 (Saukett--stamme) virussuspension (100 TCID50 for hver enkelt stamme) 15 til en 2 x fortyndingsrække af serumprøverne (50 μΙ^βΓ) . Serum-virusblandingerne inkuberes i 24 timer ved 37°C. Derefter tilsættes der 1 x 104 Hela celler, og efter fem dages forløb bestemmes 50%·s neutraliseringstitrene.

20 Resultater af immuniserinasforsøg.

Neutraliseringstitrene af serumprøver, der fås forud for og fire uger efter immunisering, bestemmes ved neutraliseringsanalysen. Hverken præ-immuniseringsserumprøver eller prøver, der fås fra rotter, udelukkende injiceret med de 25 fire capsidproteiner, er i stand til at neutralisere de tre afprøvede poliovirusstammer. Antistof-titrene af postimmuniseringsprøverne fra de grupper, der er injicerede med kombinationerne af capsidproteiner og trivalent inaktiveret poliovaccine, i sammenligning med kontrolgrupperne, som 30 udelukkende er injicerede ved den samme lave dosis trivalens-vaccine, er vist i den tilhørende tegning. Resultaterne er anført som geometriske middelværdititere og viser, at tilsætningen af alle fire capsidproteiner stimulerer neutralise-rings-antistofreaktionen med en faktor fra ca. 10 til mere 35 end 100. På tegningen viser tallene i parentes disse stimuleringsfaktorer. Hjælpestofvirkningen af capsidproteinerne på 10 DK 169276 Bl type 3 vaccinekomponenten ligger noget bagefter den virkning, som er i agttaget for type 1 og type 2 komponenterne.

Væsentligt de samme resultater iagttages med kombinationen af capsidprotein 2, isoleret ved hjælp af præpara-5 tiv SDS-PAGE, og trivalent inaktiveret poliovaccine.

Claims (11)

11 DK 169276 B1 Patentkrav.

1. Vaccine, kendetegnet ved, at den indeholder et immunogent virusprotein, som er i stand til at inducere produktionen af beskyttende antistoffer i en vært, 5 sammen med et protein eller peptid med sekventiel homologi med det immunogene protein, hvorhos proteinet eller peptidet med sekventiel homologi inducerer den forstærkende ("priming") virkning for det immunogene protein, men ikke inducerer dannelsen af beskyttende antistoffer i en udstrækning, 10 som er tilstrækkelig til at give en beskyttende immunitet, idet dog proteinet eller peptidet med sekventiel homologi er til stede i vaccinen i en mængde, som er tilstrækkelig til at forøge værtens reaktion på det immunogene protein.

2. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved, at det immunogene protein er inaktiveret picornavirus, og at proteinet eller peptidet med sekventiel homologi er denatureret picornaviruscapsidprotein.

3. Vaccine ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det inaktiverede picornavirus er et inaktiveret 2. enterovirus.

4. Vaccine ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det inaktiverede enterovirus er valgt blandt inaktiveret poliovirus, hepatitis A virus, echovirus, rhinovirus og coxsackievirus.

5. Vaccine ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det inaktiverede enterovirus er et inaktiveret poliovirus, valgt blandt poliovirus type 1, poliovirus type 2, poliovirus type 3 og blandinger deraf.

6. Vaccine ifølge krav 2, kendetegnet 30 ved, at det denaturerede picornaviruscapsidprotein stammer fra en picornavirusslægt, som er forskellig fra den slægt, som det i vaccinen tilstedeværende inaktiverede picornavirus tilhører.

7. Vaccine ifølge krav 2, kendetegnet 35 ved, at det denaturerede picornaviruscapsidprotein stammer fra samme picornavirusslægt, som det i vaccinen tilstedevæ 12 DK 169276 B1 rende inaktiverede picornavirus tilhører.

8. Vaccine ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det inaktiverede picornavirus er et inaktiveret enterovirus, og at det denaturerede picornaviruscapsidprotein 5 er et denatureret enteroviruscapsidprotein.

9. Vaccine ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det inaktiverede enterovirus er inaktiveret poliovirus, og at det denaturerede enteroviruscapsidprotein er denatureret polioviruscapsidprotein.

10. Vaccine ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det denaturerede polioviruscapsidprotein er valgt blandt VP1, VP2, VP3, VP4 og blandinger deraf.

11. Vaccine ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det inaktiverede poliovirus er valgt blandt inakti-15 veret poliovirus type 1, type 2, type 3 og blandinger deraf.