PT88219B - Processo de fabricacao de um picornavirus hibrido - Google Patents

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Description

RESUMO presente invento refere-se ao processo de fabricação de um picornavírus híbrido, caracterizado por, partindo dum cADN obtido a partir do ARN virai e após se ter localizado previamente um epítopo imunogénico natural ou um encadeamento proteico do picornavírus correspondente, se introduzirem, de um e de outro lado da sequência imunogénica natural a substituir, os sítios de restrição específicos (na medida em que estes não estejam já presentes) no cADN, se clivar o cADN ao nível destes sítios específicos com as enzimas de restrição correspondentes, se reconstituir um cADN recombinante híbrido formado a partir de todos os elementos do ARN virai ou do cADN necessário à replicação posterior do vírus, que se encontravam anteriormente associados ã sequência que codifica □ epítopo natural, por um lado, e da sequência que codifica d epítopo imunogénico ou encadeamento proteico de substituição, em lugar e em vez da sequência que codifica o epítopo ou o encadeamento natural, por outro lado, e transfectar uma cultura celular sensível com este ADN recombinante e finaimente recolher o picornavírus recombinante correspondente.
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-2MEMÓRIA DESCRITIVA poliovírus, conhecido como sendo o agente de uma doença infecciosa humana, a poliomielite ou doença de Heine-Madin, foi estudado como protótipo dos virus da família dos picornavírus. D_e pois de alguns anos o progresso da engenharia genética contribuiu para um melhor conhecimento deste vírus e permitiu a clonação molecular da ARN virai em ADNc e a determinação nucleotídica do seu genoma (Kitamura e colab. 1981; Racaniello e Baltimore, 1981, van der Werf e colab., 1981). Por outro lado, a possibilidade de induzir um ciclo infeccioso nas células de primatas, a partir de plasmídeo portador de uma cópia completa do genoma virai contribuiu para a elaboração de outros vectores em que a infecciosidade especifica pôde ser aumentada (Semler e colab., 1984, Kean e colab., 1986). 0 estudo de outros picornavírus progride rapidamente também. Relembraremos também que este clone de vírus compreeri de os enterovírus, da qual os poliovirus dos tipos 1, 2 e 3 constituem uma sub-classe. Eles englobam também os cocksackievírus , os ecovirus, os rinovírus, os cardiovírus, os aftovírus e o vírus da hepatite virai A. Os genomas dos picornavírus são ARN, cujo tamanho é, em geral, da ordem de 7500 nucleótidos.
Os trabalhos de Hogle e colab. (1985) em conjunto com os de Rossmann (1985) demonstram que existem três sítios major de neutralização nos picornavírus: NIml sobre VP1, NImlI sobre VP2 e VP1 e NImlII sobre VP3 e VP2 (NIm é uma abreviatura da expressão inglesa neutralization antigen, daí em português: Antigénio de neutralização). Nos poliovírus do tipo 1, pôs-se em evidência um sítio NIml (aminoácidos 93-104, Wychouiski e colab.,
1983) em que o epítopo C3 é sequencial, e os sítios NImlI e NImlII que determinam os sítios conformacionais à superfície do virião.
No que diz respeita à localização e à identificação de outros epítopos imunogênicos, pode-se ainda, para os poliovírus, re correr-se aos trabalhas de E. A. Emini, A, Oamesan, A. 0. Leujis ,
G. R. Larsen, E. A. Wimmer, 0. Virol. 43.997 (1982); R. Crainic e colab., Infect. Immun. 41.1217 (1983); P. Minor e colab., Natu re (Londres) 301.674 (1983); P. Minor e colab., 0. Gen. Virol. 65.1159 (1985); M. Fergusson e colab., Virology 143.505 (1985);
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-3D. C. Diamond e colab. Science 229.1090 (1985); D. M. A. Evans e colab., Nature (Londres) vol. 304,459-462.
Do mesmo modo, pode recorrer-se, par exemplo, aos artigos de Rossmann Μ. A. e colab., (1985); Sherry B e colab., 0. Virol 57, 246-257 (1986) Duechler e colab. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 84, pp 2605-2609 (1987) no que diz respeito aos estudos conduzidos para localizar e identificar os epítopos neutralizantes compreendidos nos rinovírus.
Se a maior parte dos epítopos imunogénicos identificados até hoje estão compreendidos nas cápsides dos vírus respeitantes à superfície das suas cápsides, há outros que se revelaram susceptíveis de induzir respostas neutralizantes significativas, par exemplo no rato e no coelho sem estarem à superfície. 0 péptido correspondente à sequência dos resíduos de aminoácidos 113-121 de VP1, em que somente uma parte é exposta (B. A. Jameson e colab., na obra entitulada Vaccines (Vacinas) de R. Lerner e colab.,
Eds (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbopr Ν. Y.
(1985) pp 191-198), ou os péptidos internos ao vírus, por exemplo os correspondentes às sequências de resíduos de aminoácidos 61-80 e 180-201 do poliovírus, induziram assim anticorpos com propried_a des neutralizantes importantes.
invento baseia-se na ideia de utilizar um picornavírus susceptivel de se replicar nas células do hospedeira a vacinar cojn tra um agente patogénico determinado, como vector portador de um epítopo heterólogo em relação a este picornavírus, imunogénio sus. ceptível de induzir no hospedeiro a produção de anticorpos neutralizantes contra este agente patogénico, estando o referido ep_í topo incorporado numa proteína do picornavírus, em substituição de um epítopo imunogénico neutralizante em relação a esse picornavírus .
Os picornavírus preferidos utilizáveis como vectores, são os poliovírus, os aftovírus e os rinovírus.
Por outras palavras o invento diz respeito, por consequência a um picornavírus híbrido, viável, contendo um epítopo caracterís. tico duma proteína vacinante, heteróloga em relação às proteínas desse picornavírus em substituição de um dos seus próprios epíto68 072
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-4pos imunogénicos. De preferência, o epítopo heterólogo está exposto à superfície da cápside do picornavirus. Em particular, □ epítopo é então substituído por um epítopo endógeno, imunogénico, do picornavirus, normalmente exposto à superfície deste.
De uma maneira geral pode ser dito também que o epítopo he terólogo se encontra incorporado por construção na proteína porta^ dora que inicialmente continha o epítopo endógeno, imunogénico, desse picornavirus. De preferência, como se viu, o epítopo heterólogo está exposto na superfície da cápside. Todavia, o invento não estará limitado a este tipo de exposição. Ele diz respeito igualmente aos picornavirus nos quais o epítopo heterólogo será substituído por um epítopo imunogénico, interno, natural, cuja aç. tividade é, não obstante, susceptível de se manifestar in vivo.
Num modo preferível de realizar o invento, o picornavirus, vector da cápside dc poliovirus, é um poliovírus do tipo 1 no qual o epítopo heterólogo é substituido no epítopo C3 normalmente exposto à superfície da cápside do poliovirus.
invento diz respeito igualmente aos produtos intermediários intervenientes na construção dos picornavirus híbridos, viáveis, mais particularmente os ADNc híbridos, recombinantes, compreendendo a totalidade, ou pelo menos as partes, de ADNc de picornavírus necessárias à produção de um vírus viável numa cultura de células competentes nas quais o picornavirus não transformado é cultivável, por um lado, e a uma sequência de nucleótidos heterólogos, se adequado, sintética, codificando para um epítopo distin to, substituido nesse ADNc por uma sequência de ADN endógena ou natural codificando para uma sequência de aminoácidos imunogénica, por outro lado. De preferência a sequência heteróloga é subs tituída por uma sequência, endógena que, no picornavirus não modi. ficado e tendo em conta a natureza das sequências vizinhas, codifica uma sequência de aminoácidos exposta à superfície da cápside desse picornavirus.
Ela diz respeito mais particularmente aos plasmídeos recom binantes nos quais os ADNc híbridos, acima mencionados, foram incorporados por construção, sob o controlo de um promotor e de elç mentos de regulação, permitindo a replicação autónoma dos picorna .a68 072
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-5uirus recombinantes, correspondentes nos organismos procarióticos ou eucarióticos utilizáveis para a produção de quantidades importantes de picornavirus.
Assim, o invento diz respeito, mais particularmente, aos plasmídeos portadores de ADNc recombinantes, derivados de ADNc de poliovírus, aftovírus e rinovírus, modificados nas condições ant_e riormente indicadas, por um polinucleótido codificando para um epítopo imunogénico, heterólogo, em particular os plasmídeos utilizáveis para a transformação de organismos celulares procarióticos ou eucarióticos e permitindo a replicação autónoma e a produção do poliovírus, aftovírus ou rinovírus, modificado, correspondente.
invento diz respeito também aos ARN recombinantes conten do a totalidade do ARN mensageiro do picornavirus correspondente e incluindo as sequências que codificam para as proteínas UPD,
UP3 e VP1 e compreendendo a substituição que corresponde à do ADNc correspondente. Este ARN mensageiro pode ser obtido seja in vitro, seja em culturas de células previamente transformadas, a partir de um vector contendo o ADNc do picornavirus correspondente, sob o controlo de um promotor e de elementos de regulação apropriados.
E realmente notável que as modificações assim introduzidas nas proteínas virais, em particular nas que apresentam normalmente os epitopos imunogênicos normalmente expostos à superfície das cápsides dos picornavirus, nomeadamente dos poliovírus, possam ser feitas, na maior parte dos casos, sem prejudicar a sua viabilidade. 0 invento fornece, em consequência, os princípios activos utilizáveis para a constituição de vacinas vivas ou inactivadas a partir da epitopos caracterís ticos, codificados por olig_o nucleótidos que podem ter sido produzidos por síntese. Estas vacinas podem naturalmente também ser produzidas a partir de uma s_e quência natural de nucleótidos, obtida por clivagem a partir de ADN natural ou de um ADNc derivado de ARN natural codificando para a proteína que contém normalmente a sequência de aminoácidos do epítopo.
invento diz respeito igualmente às vacinas obtidas a pag?
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-6tir dos vírus acima indicados, nomeadamente por inactivação da sua virulência por métodos clsssicos ou vacinas vivas de virulência atenuada.
Observaremos que os métodos aplicáveis à inactivação do pç> liovlrus para a constituição de vacinas contra a poliomielite são aplicáveis da mesma maneira; relembraremos e a título de exemplo somente, os tratamentos térmicos, por exemplo, entre 50 e 609C, os tratamentos por agentes químicos tais como o formol e outros aldeídos apropriados que podem ser utilizados para obter essas vacinas inactivadas.
principal interesse da vacina segundo o invento reside na possibilidade de empregar as caracteristicas perfeitamente dominadas e domináveis dos picornavlrus, mais particularmente dos poliovírus, e das vacinas contra esses picornavlrus, nomeadamente as vacinas contra a poliomielite para a fabricação de outras vaci nas. Além disso, os epítopos heterólogos das novas vacinas encori tram-se presentes no organismo do hospedeiro vacinado sob uma estrutura tridimensional aparentada da forma imunogénica natural dos poliovírus.
Por fim, o invento diz respeito a um processo para a produ. ção dos picornavlrus híbridos já definidos, sendo esse processo caracterizado por, a partir de um ADNc obtida a partir do ARN virai, e após ter previamente localizado um epítopo imunogénico natural do picornavlrus correspondente, se introduzir, de um lado e doutro da sequência imunogénica natural a substituir, os sítios de restrição específicos (na medida em que estes não estejam ainda presentes), no ADNc, clivar-se o ADNc ao nível destes sítios específicos por meio de enzimas de restrição correspondentes, se reconstituir um ADNc recombinante híbrido formado a partir de todos os elementos do ADNc necessário ã replicação ulterior do vírus, os quais se encontravam anteriormente associados à sequência codificando para o epítopo natural, por um lado, e â sequência codificando para o epítopo imunogénico de substituição, em substituição da sequência que codifica para o epítopo natural, por outro lado, trans fecte~-s e uma cultura celular sensível com este ADN recombinante e por fim recolher-se o picornavlrus recombinante
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-7correspondente.
No que se refere à informação dos sítios específicos envo_l vendo a sequência codificando para o epítopo imunogénico endógeno, a substituir, pode-se proceder por todos os métodos apropriados visando a introdução de um sítio de restrição específico num determinado lugar de um ácido nucleico. Vantajosamente, proceder-se-á por mutagénese dirigida como é, por exemplo, descrito no exemplo que se segue.
A fim de assegurar a clivagem específica dos lugares pretendidos do ADN a tratar e isto na ausência de clivagens parasitas noutras regiões deste ADN, este terá de preferência de ser previamente modificado nos seus outros lugares, para fazer desap_a recer os sítios de restrição semelhantes que podem estar presentes. Esta última operação pode ser concretizada por qualquer método apropriado permitindo a modificação dos sítios de restrição ou ainda por mutagénese dirigida.
No que se disse anteriormente, só se evocou uma substituição limitada do ADNc do picornavírus correspondente. 0 técnico da especialidade apreciará que se pode ainda ter em vista a prod_u ção de vírus híbridos mais profundamente transformados para responder às necessidades da prática. As técnicas já indicadas permitem, por exemplo o enxerto de toda ou de parte da sequência completa codificando para as proteínas sucessivas, VPD, VP3 e VP1, de um rinovírus ou do HAV no ADNc de um poliovírus, em substituição das sequências correspondentes codificando para as proteínas VPD, VP3 e VP1 do poliovírus.
E igualmente necessária neste caso modificar os sítios de corte específicos, no ADNc do rinovírus ou do HAV, por mutagénese dirigida a fim de que as clivagens necessárias à produção ulterjL or do vírus híbrido obtido por um lado entre as proteínas VPD e VP3 e per· outro lado, entre as proteínas VP3 e VP1, possam ser efectuadas sob o controlo da sequência codificando a protease especifica que, no poliovírus natural, corta as ligações glutamina-glicina, separando as proteínas acima indicadas.
Esta transformação permite, em consequência, a obtenção de
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-8um picornavírus derivado do poliovírus, provido, porém, de uma cápside de rinovírus ou do HAV.
Será evidente para o técnico da especialidade que as construções que fazem intervir outras associações de diferentes ρίοοχ navírus possam ser tidas em conta da mesma maneira, de acordo com o desejo do construtor e da compatibilidade máxima procurada entre o vírus híbrido produzido e o organismo do hospedeiro a vacinar.
Característicos, suplementares do invento aparecerão ainda durante o curso da descrição que se segue, do modo de construção de um ADN híbrido conforme o invento derivado de um poliovírus da tipo 1, apoiando-se nas figuras la a 5d que ilustram esquemat_i camente os passos sucessivos desta construção e as estruturas dos diferentes plasmídeos em causa.
I Construção do vector de sub-clonação pBR327 modificado □ plasmideo pBR327 (SOBERON e colab. 1980) (fig. la) capaz de se replicar nas bactérias £. coli, contendo os genes de resistência à ampicilina (ΑρΓ) g à tetraciclina (Tc1) e a sua origem de replicação (ori), é escolhido como vector para efectuar as construções. Este vector é modificado ds acordo com as necessida des de clonação da seguinte maneira.
Substituição do sitio HindIII (posição 29) deste plasmídeo por um sítio Xhol.
vector é aberto no sítio HindIII pela enzima de restrição correspondente (Boehringer, condições de utilização fornecidas pe. la firma), as extremidades coesivas geradas (AO^g ADN/ml) são cheias por tratamento com ADN polimerase de Klenov (lOB ll/ml) em presença de 4 nucleótidos (dNTP) (200yxM, cada um) segundo o protocolo descrito por Maniatis e colab. (1982). 0 ADN linearizado é desfosforilado por tratamento com fosfatase alcalina de intestjL no de vitela (2 x 0,02 unidades por ^.g de ADN), duas vezes com um tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgC^ 10 mM, EDTA 0,1 mM, ZnC^ 1 mM (enzima e protocolo de utilização BOEHRINGER) durante 30 minutos a 3720, antes de ligação com um adaptador (linker) sintético Xhol fosforilado (8 nucleótidos, comercializado por NEW ENGLAND
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-9BIOLABS). A reacção de ligação efectua-se durante 48 horas a + 49C (ou durante 16 horas a + 159C) numa solução Tris-HCl 60 mM, pH
7,5, EDTA 1 mM, MgC^ 10 mM, OTT 10 mM, ATP 1 mM, em presença duma unidade de ADN ligase de T4 (BOEHRINGER) por y^g de ADN, numa r_e lação molar de 100 (lin.ker/ADN com extremidades livres). A mistura de ligação é utilizada para transformar as bactérias £. coli HB 101 (BOYER, ROULLAND-DUSSOIS, 1969) tratadas com cloreto de cá/ cio (protocolo MANIATIS e colab. 1982). As bactérias são em seguida espalhadas em caixas de agarose LB contendo ampicilina (100 ^ug/ml). Os plasmídeos são extraídos segundo a técnica descrita por BIRNBOIM e DOLY (1979) e triados com o fim de isolar os que contêm o sitio de restrição Xhol.
Um plasmídeo pAMl (fig. 16) possuindo o sítio de restrição Xho I no lugar do sítio HindIII é retido. Este plasmideo é preparado em grande quantidade após lise das bactérias com lisozima-sulfato de dodecilo e sódio (GODSON e VAPNEK, 1973) e purificação em gradiente de cloreto de césio. 0 ADN plasmídico retirado do gradiente é utilizável após extracções sucessivas, volume a volume, pelo butanol-1 (3 vezes), a mistura 1 : 1 de fenol saturado em TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) clorofórmio, álcool iso-amílico (24:1). A fase aquosa extraída é precipitada por adição de 2 volumes de etanol a 95% depois centrifugada e o sedimento re tomado num tampão, TE.
Substituição do sítio EcoRV (posição 185) por um sítio BglII no plasmídeo modificado obtido.
Duma maneira semelhante, o plasmídeo pAMl é linearizado no sítio EcoRV, desfosforilado e ligado com umlinker BglII fosfori. lado (8 nucleótidos). 0s clones resistentes à ampicilina são obtidos após transformação das bactéricas HBlOl pela mistura de ligação. Os plasmídeos são preparados segunda a técnica precederi temente descrita e analisados em relação à presença do sítio de restrição BglII. Um plasmídeo pAM2 (fig. lc ou fig. 2a) possuindo os sítios de restrição Xhol e BglII no lugar dos sítios HindIII e EcoRV respectivamente é purificado em gradiente de cloreto de césio.
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-ΙΟΙ I 5ub-clonação do fragmento Xhol-BqlII do ADNc de poliovírus tipo I MAHQNEY no vector pAM2
A sub-clonação do fragmento compreendendo os 5 601 primeiros nucleótidos de ADN complementar (ADNc) do poliovírus tipo 1 MAHONEY (sobre 7 441 nucleótidos) é feita de modo a que os sítios de restrição a gerar nesse fragmento por mutagénese dirigida sejam únicos na construção. Os novos sítios da restrição serão assim acessíveis às digestões totais pelas enzimas de restrição cor respondentes, a fim de que o fragmento compreendido entre esses sítios possa ser facilmente deleccionado e substituído por uma sje quência estranha de substituição.
fragmento polia e o vector necessário a essa sub-clonação são obtidos do modo descrito a seguir.
is Fragmento polio □ fragmento de restrição Xhol e BglII contendo os 5 601 primeiros nucleótidos do ADNc de polio (5 638 pares de bases) é procedente do plasmídeo pKK17 (K. ΚΕΑΝ e colab. 1986) (fig. 2b). Este plasmídeo contém a totalidade do ADNc (representado por uma região sombreada) do poliovírus clonado imediatamente após o promotor tardio do PL SV4D contido no fragmento (TAg) proveniente do SV40, assim como os elementos necessários à sua replicação autóno ma nas células de macaco (origem de replicação de SV40) promotor da transcrição, sequência melhoradora da transcrição, antigénio T funcional. Contêm igualmente a origem de replicação bacteriana e o gene que codifica para a resistência à ampicilina.
plasmídeo pKK17 é digerido totalmente palas enzimas de restrição Xhol e BglII (80EHRINCER) às quais correspondem sítios únicos neste plasmídeo. 0 fragmento de 5 633 pares de bases (pb) é isolado a partir de um gel de agarose com um baixo ponto de fusão (1 ouj melting) (WIESLANDER, 1979) purificado por duas extracçõas em fenol, uma extracção pela mistura fenol/clorofórmio ' álc_o ol isoamílico (IAA) e duas extracções pela mistura clorofórmio :
: álcool isoamílico (IAA).
Vector
Paralelamente, o plasmídeo pAM2 é digerido de maneira total (sítios únicos) pelas enzimas de restrição Xhol e BglII. 0
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-11fragmento BglII-Xhol (3 109 pb) contenda a origem da replicação bacteriana e o gene de resistência à ampicilina é isolado e purificado do mesmo modo a partir de um gel de agarose de baixo ponto de fusão.
Sub-clonação
Efectua-se uma reacção de ligação dos dois fragmentos (relação molar inserido/vector (2:l)). As bactérias HB101 são trans. formadas com a mistura de ligação. Obtêm-se os clones resistentes à ampicilina. 0 ADN plasmídico é extraído, depois analisado com base no tamanho dos fragmentos gerados após digestão pelas eri zimas Xhol e BglII.
Recolhe-se o pAM3 (fig. 2c ou fig. 3a) que possui a sequêri cia dos 5 601 primeiros pares de bases do ADNc de polio e purifica-se sob gradiente de cloreto de césio.
III Criação de novos sítios de restrição na sequência 1-5 601 do poliovírus
0s novos sítios de restrição são criados pela técnica de mutagénese dirigida pela oligonucleótido sintético (MORINAGA e c.o lab. 1984) aplicado sobre plasmídeo de dupla haste (brin) no caso presente o pAM3. Para este fim, foi escolhido criar sítios Hpal ou EcoRV na posição 2 756 e um sítio HindIII na posição 2 786 na sequência do poliovírus. Estas duas posições enquadram exactamente o anel 93-103 da proteína da cápside VP1 que corresponde a um sítio antigénico neutralizante de tipo I do poliovírus, situada entre dois folhetos Beta. Os sítios de restrição que serão assim gerados permitirão deleccionar a sequência nucleó. tida codificando para os aminoácidos deste anel e substitui-la por uma sequência heteróloga escolhida em função do seu papel antigénico, com o objectivo de axpêr esta sequência heteróloga à superfície do virião.
A mutação de um só nucleótido no ADN do poliovírus pode ser suficiente para criar um novo sítio de restrição. A técnica é aqui usada para criar (graças aos pares de oligonucleótidos sin táticos correspondentes (fig. 3)) duplos mutantes do poliovírus contendo, em relação aos primeiros sítios Hpal e HindIII através da realização de mutações pontuais nas posições 2 757 - 2 791 res
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12.018.199 cr'
S-4 5 </ -/ fi
A»
-12pectivamente, e em relação aos segundos, os sítios EcoRI/ e HindlII através de mutações nas posiçães 2 760 e 2 791 respectivamente.
Estas técnicas são aplicadas utilizando além dos plasmideos acima indicados, oligonucleótidos sintéticos. Estes comportam, cada um,uma mutação pontual, em relação â sequência nucleotidica duma parte do fragmento polio acima referido. Os seus comprimeri tos foram escolhidos de maneira a enquadrar o nucleótido mutado e a apresentar um mínimo de homologia com as outras sequências do p_o liovirus selvagem de MAHONEY. Procede-se nomeadamente nas condições que se seguem.
IS 0 plasmldeo pAM3 é digerido por Sall (na posição 651 da parte pBR327) para gerar um fragmento linear 1 (fig. 5b).
2S D plasmldeo pAM3 é digerido por Xbal, sítio presente nas posições 2 546, 2 861, 3 581, 4 866 do fragmenta de ADNc do poliovírus. Geram-se então 4 fragmentos em que um (2 546 - 2 86l) é eliminado após separação em gel de agarose louj melting (com baixo ponto de fusão). Notar-se-à que o fragmento eliminado continha a sequência de ácido nucleico que codifica para o acima referido anel 93 - 103 da proteína da cápside VP1 assim como os nucleótidos que o envolvem no que será chamado a seguir a sequêri cia polioselvagem.
Pelo contrário os 3 outros fragmentos são extraídos. Estes apresentam os tamanhos respectivamente de 720 pb:(fragmento lia), 1 305 pb : (fragmenta Ilb) e 6 405 pb : (fragmento lic). Is. to permitirá a seguir obter após desnaturação e hibridação com o fragmento pAM3 digerido por Sall, uma região de haste simples entre as posições 2 546 - 2 861, quando sa deseja introduzir as mutações.
Os fragmentos I, Ila, Ilb, lic são purificados individuaimente por extracção com fenol, em seguida precipitados com etanol a 95%. Eles são dissolvidos no tampão TE Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM. Os fragmentos Ila, Ilb, lic são em seguida reunidos na mesma solução.
Os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador automático, purificados por cromatografia em fase líquida de elevado rendimento (HPLC), depois por electroforese sobre gel de
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-13acrilamida a 2O/á contendo ureia 7M. Por fim, foram fosforilados por tratamento/polinucleótido quinase de T4 (2 χ 1 unidade/^g de ADN) num tampão Tris-HCl 50 mM pH 9,0 MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, em presença de ATP 1 mM durante 2 χ 1 hora a 3720.
Estes oligonucleótidos correspondem às partes da sequência polioselvagem cuja estrutura se segue. Em particular comprB endem uma mutação de um nucleótido do codão codificando para os aminoácidos:
93 para o oligonucleótido A,
104 para o oligonucleótido 0,
94 para o oligonucleótido C.
0s números que precedem correspondem às numerações dos am_i noácidos da proteína VP1 codificados pelos codões correspondentes da sequência polioselvagem seguinte.
4| 93 1 03
5'... G ACC GTG GAT AaC CCA GCT TCC ACC ACG AAT AAG GAT AAG CTA
3 ... C TGG CAC CTA TTG GGT CGA AGG TGG TGC TTA TTC CTA TTC GAT
Thr Yal Asp Asn Pro Ale Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu
TTT
AAA
Phe *-> <Hpal Hindi II <->.
EcoRY lofc
GCA GTG TGG 3‘
CGT CAC ACC 5‘
Ala Yal Trp
-►
Hind III
Sob as linhas que identificam os codões da sequência poli_o selvagem e os aminoácidos correspondentes aparece a indicação das localizações relativas, dos oligonucleótidos sintéticos (setas) cu jas fórmulas se seguem, graças a uma mutação pontual nas suas estruturas respectivas (enquadradas). Estas mutações pontuais são
/1.
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-14ilustrados por utilização de letras a branco tanto para designar o nucleótido de substituição resultante desta mutação como para identificar a mudança de natureza do aminoácido codificado pelo codão mutado.
Oligonucleótido A
Hpal 5' G ACC GTG G?T AAC CCA GC 3'
3‘ C TGG CAC (&Α TTG GGT CG 5’ Oligonucleótido sintético 91 93 95 (18-mero)
Thr Vai V7aD Asn Pro sítio Hpal foi criado modificando-se o codão que codifica para o resíduo Aspartato (posição 93 de UPl) num codão codificando para a valina (A 2 757 >T).
Oligonucleótido B
HindIII 5’ G GAT AAG CUT TTT GCA GTG TGG 3'
3' C CTA TTC Gtò AAA CGT CAC ACC 5' Oligonucleótido
102 104 108 (22-mero)
Asp Lys Leu Phe Ala Vai Trp sitio HindIII resulta de uma mutação muda (no que diz respeito ao aminoácido expresso) sobre o resíduo em posição 104 UPl (A 2 791 > T).
01igonucleótido C
EcoRV 5' CC GTG GAT A?C CCA GCT TCC 3’
3’ GG CAC CTA TQG GGT CGA AGG 5’ (2O-mero)
94 97
Yal Asp DBG Pro Ala Ser
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-150 sítio EcoRV foi criado modificando-se o codão que codifica para um resíduo Asparagina (posição 94 de UPl) num codSo que codifica para uma Isoleucina (A 2 760 > T).
Os fragmentos I e II (0,05 pmole de cada) são misturados em 10yMl de água, seja com os oligonucleótidos A e B, seja com os oligonucleótidos BeC, aproximadamente 20 pmole de cada um dos oligonucleótidos para formar nos plasmídeos híbridos ulteriores, quer os pares de sítios Hpal + + HindIII, quer os pares de sítios EcoRU + HindIII. A estas misturas juntam-se 2 ^ul de tampão polimerase-ligase 10 vezes concentrado (NaCl 1 M Tris-HCl 65 mM pH 7,5, MgC^ 80 mM, /J-mercaptoetanol 10 M). Os fragmentos da mistura contidos num capilar sela, do são desnaturados por incubação em banho-maria de água fervente durante 5 minutos, depois a renaturação das moléculas faz-se por arrefecimento lento. Entre o conjunto das moléculas formadas, encontram-se moléculas das quais uma haste da matriz selvagem est& hibridada quer com os pares de oligonucleótidos A e B, quer com os pares de oligonucleótidos BeC.
□ produto destas hibridaçães é ilustrado na fig. 4a no que diz respeito mais particuiarmente à primeira alternativa anterior. Não nos resta senão preencher as partes ainda mono haste da matriz, ilustradas nas figuras 4b e 4c que dizem respeito aos fragmentos que comportam ainda estas partes mono haste e nas quais as inserçães são representadas por pequenas saliências angulares.
Para este fim, a mistura é tratada pela ADN polimerase de KLENOU (3 unidades + 4 dNTP + ADN ligase de T4 (3 unidades) dura_n te uma noite a 12,52C a fim de que o ADN de haste simples seja convertido num ADN de dupla haste circular e contendo as mutações geradas pbIos dois oligonucleótidos.
As bactérias HB101 são transformadas pela mistura; em mais de 1000 transformantes resistentes à ampicilina, obtidos por cada construção., 600 transformantes são triados (screening) por hibridação de colónias (segundo GRUNSTEIN e HOGNESS 1975). Os oligo32 nucleótidos sintéticos marcados com p pela polinucleótido quina se servem em seguida como sonda de hibridaçâo para identificar as bactérias transformadas pelos plasmídeos mutados (hibridaçães rea lizadas a 4230, lavagens realizadas a 5320). Uma dezena de clones
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-16positivos são retidos e utilizados para retransformar as bactérias HBlOl a fim de separar os plasmídeos mutantes dos plasmídeos selvagens podendo estar contidos no mesmo transformante. Os plasmídeos preparados de acordo com o método de BIRNBOIM e DOLY são testados pela presença dos sítios de restrição correspondentes, seja Hpal e HindIII, seja EcoRV e HindIII.
Os plasmídeos retidos (fig. 4d) são:
- pAM4 : sítios Hpal e HindIII
- pAM5 : sítios EcoRV e HindIII,
Os plasmídeos são preparados e purificados em CsCl depois sequenciados para confirmar as mutaçães. 0 sequenciamento faz-se segundo o método de ZAGURSKY directamente sobre o plasmídeo prep£ rado segundo o método BIRNBOIM e DOLY ou em cloreto de césio.
IV CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS HÍBRIDOS
Os sitios de restrição Hpal e HindIII únicos no plasmídeo pAM4 (ou EcoRV e HindIII de pAM5) permitem fazer a delecção da se quência nucleotidica correspondente aos aminoácidos 94 a 102 de VP1 do poliovírus, quer dizer no epitopo 03 e de o substituir por qualquer outra sequência que codifique um motivo antigênico heterólogo, por exemplo de um enterovírus (poliovírus tipo 2 ou tipo 3 ou da hepatite A) ou de qualquer outro epitopo heterôlogo imuno génico.
Exemplos de construção de um plasmídeo poliovírus (hepatite A vírus HAV) a partir de pAM4 (fig. 5a-5d).
plasmídeo pAM4 (igualmente representado na fig. 4b) é dj. gerido pelas enzimas de restrição Hpal e HindIII, gerando a Hpal extremidades livres e a HindIII extremidades coesivas, sendo depois desfosforilado. A sequências da hepatite A é introduzida sob a forma de dois oligonucleótidos complementares sintetizados, purificados e fosforilados, como foi descrito acima sendo um deles completada por um A e o outro precedido por uma sequência AGCTT (ver a seguir) para restaurar um sítio HindIII permitindo a ligação das extremidades coesivas com o vector. Os dois oligonucleótidos enquadrados, hibridados entre si como se mostra a se68 072
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-17guir, são de seguida incorporados na sequência do vector poliovlrus (em que os nucleótidos e aminoácidos exteriores à sequência HAU são representados por letras a branco, procedendo-se em especial como é indicado já a seguir.
s‘ stts sw
3’ 023 022 ϋαΰ CcS
YP1 HAY
Hindi II fl©S
AAG CCT GGA GAG TCT AGA CAT ACA TCA GAT4 20 TO TO 002 TTC GGA CCT CTC AGA TCT GTA TGT AGT CTA TTC Gfl2 2Ú2 TO
3'
5'
Lys Pro Gly Glu Ser Arq HÍ3 Thr Ser Asp Í3Z3 02)3 2£C
A reacção de ligação é efectuada, em presença de ADN ligase de T4 durante 4B h a + 4SC entre o vector deleccionado e os 2 oligonucleótidos hibridados numa relação molar de l/20. As bacté rias HB 101 são transformadas com a mistura e os clones transformantes são analisados por hibridação de colónias com um dos 2 ol/ gonucleótidos de HAV utilizados como sonda marcada com P (hibri dação a 3720, lavagem a temperaturas sucessivas de 422C a 689C).
0s plasmídeos são extraídos de clones positivos segundo o método de BIRNBDIM e DOLY e são testados para a presença do sitio HindIII por digestão com a enzima correspondente. Um plasmideo pAM42 (fig. 5b) é retido. A sua sequência na zona de inserção é contro lada por sequenciamento segundo o método descrito.
A sequência 1 a 5601 de poliovírus contendo uma sequência heteróloga é em seguida substituída no plasmideo pKK17 (representado de novo na fig. 5c), de maneira a reconstituir um ADNc completo de poliovírus. Para isso, o plasmideo pAM42 é digerido pelas enzimas de restrição Xhol e BglII e o fragmento Xhol.BglII (5641 pb) contendo a sequência polio-HAV é isolado e purificado a partir de um gel de agarose de baixo ponto de fusão ( louj-mel ting) Paralelamente o plasmideo pKK17 é igualmente digerido por Xhol e BglII e o fragmento BglII-Xhol (10023 pb) contendo os 1840 últimos pares de bases de polio assim como as sequências necessárias à re plicação do plasmideo nas bactérias e nas células de primatas, é isolado e purificado da mesma maneira.
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-18Uma reacção de ligação é efectuada entre os 2 fragmentos e as bactérias HB1D1 são transformadas pelo recombinante. Os plasmideos extraídos dos clones transformantes são analisados por digestões duplas pelas enzimas de restrição Xhol e Hpal e/ou Xhol + + HindIII e triados com base no tamanho dos fragmentos.
Um plasmídeo pAM420 (fig. 5d) é retido: ele contêm a tota lidade do ADNc do poliovírus com o inserido de HAV, num plasmídeo infeccioso para as células de prima.ta. Em seguida deu lugar à pro dução de um poliovírus híbrido, designado a seguir por v420, nas condições explicitadas mais ã frente.
plasmídeo é sequenciado segundo a técnica descrita a fim de confirmar as sequências da inserção.
Da mesma maneira, outras sequências podem ser substituídas no sitio antigénico I do poliovírus tipolde Mahoney, por exemplo:
a sequência 94 a 102 VP1 do poliovírus tipo 2 de Lansing, graças aos oligonucleótidos sintéticos seguintes
Hindi II
0S 94
5' @7@ @77
VPl T2
102 008 AEG
AAT GAT GCT CCA ACA AAG CGT GCC AGT A2@ @77 707
3‘ Ε££}ΤΤΑ CTA CGA CGT TGT TTC GCA CGG TCA TTC Ga|£>
@@S 3· @37 5*
CfelO Aan Asp Ala Pro Thr Lgs Arg Ala Ser QjQGI PGe
ΡΟΟϋΟ QQEl O sequência poliovírus ti POOflQ po2 de Lansing
Qnatoâsflúo
0S Π2Εΰθΰ0 ou a sequência 97 a 107 de VPl do HAV:
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· -19Hind III
97
YP1 HAY
107 Q®8
ACT TTT ACC TTC AAT TCA AAT AAT AAA GAG TAC SW TO 3’
TGA AAA TGG AAG TTA AGT TTA TTA TTT CTC ATG TTC Gí2 &ΏΩ 5’ fàJO ÇfcJD Thr Phe Thr Phe Asn Ser Asn Asn Lys Glu Tyr β,ζρ ϋοα Pto poOto QGE] O sequência HAV
CXDOfiQ edgjQgúq para formar as sequências de AON híbridas (na qual os oligonucleó^ tidos sintéticos hibridados se encontram representados por letras a branco) contendo as ditas sequências VP1 de HAV incorporadas no ADNc do poliovirus.
As construções feitas no plasmídeo pAM5 permitem eliminar a mutação causada pelo sítio de restrição EcoRV pois ela está cor» tida na sequência deleccionada enquanto que, no plasmídeo pAM4 a mutação devida ao sítio Hpal situada imediatamente a montante da sequência deleccionada, subsiste (Valina em lugar de Aspartato). Uma comparação dos dois sistemas é interessante para o estudo do papel do aminoácido 93.
Por exemplo construiu-se no pAM5 o plasmídeo híbrido poli_o virus/HAV 72-81 (igualmente denominado v520), caracterizado pela inserção heteróloga, a seguir:
072
-20Ref: 0684 D
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Hind lii
B3 72 YP1 HAY 81 QS3
5' 0ΠΘ Θ2? AAG CÇT GGA GAG TCT AGA CAT ACA TCA GAT t£Q (TO TO Θ3ώ 3* 3‘ θ£β gffú TTC GGA CCT CTC AGA TCT GTA TGT AGT CTA TTC GAÔ CTO 5’
Μ] ώθρ LysProGlgGlu Ser Arg Hb Thr Ser Asp Q,g9 ββθ PCl3 £)DQ
PqDQo qqDoqqqgd sequência HAV poDflo
V ESTUDO EM CÉLULAS ANIMAIS
Os plasmídeos híbridos tipo pAM420 são utilizados para transfectar, em presença de DEAE dextrano (McCutchan e Pagano, 1965) segundo o método de Sompayrac e Danna (l98l) das células de rim de macaco, CV1 ou células VERO, cu das células humanas (HeLa, Hep2, etc..). Os ADN são preparados pelo método de BIRNBOIM e DOLY ou em gradiente de cloreto de césio.
10^ células CV1 ou VERO são espalhadas em caixas de Petri de 60 mm e incubadas com 0,4 ml duma mistura com 0,25^xg/ml de ADN em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sem soro, co_n tendo Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e SOO^g/ml DEAE dextrano. A incub_a ção faz-se a 372C numa estufa em CO2 durante 2 horas. As células são de seguida lavadas com DMEM sem soro, depois mantidas em DMEM suplementado com 5% de soro de vitela fetal. Após uma dezena de dias, assim que o efeito citopático (ECP) é total, as células são então partidas por 5 congelaçoes/descongelações sucessivas em vidro de carbono, centrifugadas durante 50 minutos a 1500 rpm para eliminar os detritos celulares; 0 sobrenadante é utilizado como mini-stock virai.
0s mini-stocks virais são titulados em placas de 6 depósitos: os depósitos são semeados cada um com 4.10^ células CV1 ou VERO, depois infectadas com 0,2 ml de diluições sucessivas da suspensão virai em meio DMEM, sem soro suplementado com MgC^ 10 mM. A incubação faz-se a 372C numa estufa em CO2 durante 30 minutos. A suspensão virai é então retirada e as células recober63 072
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-21tas com uma gelose contendo DMEM com 2% de soro de vitela fetal. Dois dias após a infecção, as placas são coradas com violeta de cristal: a gelose ê retirada e a camada celular, placas de lise disseminadas, é corada com uma solução aquosa contendo 10% de fojr mol, 20% de etanol e 2 g/1 de violeta de cristal. As placas de lise são contadas na diluição adequada. 0 titulo da suspensão vi ral é expresso em unidades formadoras de placa (pfu)/ml.
Os mini-stocks são utilizados para fabricar maxi-stocks de vírus: para isso, 5.10^ células CU1 ou 8.10 células HEp2 (c_é lulas de cancro epitelial humano, sobre as quais o poliovírus se desenvolve melhor) são espalhadas em caixas de Petri de 100 mm e infectadas pela suspensão virai à multiplicidade de 1 pfu/célula.
A incubação faz-se a 379C numa estufa em C02 durante 1 hora. As células são em seguida mantidas em DMEM contenda 2% de soro de vi tela fetal. 22 horas mais tarde, quando o ECP é total, as células são tratadas como foi descrito para a obtenção do mini-stock. 0 maxi-stock é igualmente titulado.
A sequência do ARN virai extraído dos viriões que compãem este maxi-stock é controlada ao nível da inserção. Desde logo, a partir desse maxi-stock, diferentes análises são realizadas:
caracterização dos vírus: reacções com anticorpos policlonais ou monoclonais dirigidos contra o poliovírus vector e contra o antigénio ao qual se tirou o epítopo heterólogo; se for caso disso, verifica-se a perda da capacidade que tinham os anticorpos monoclonais específicos da sequência substituída no picornavírus usado de neutralizar este, por exemplo perda da capacidade dos ari ticorpos monoclonais C3 de neutralizar o poliovírus híbrido ou quimérico derivado de um poliovírus de tipo 1, pelo facto da subs. tituição do epítopo C3 pelo epítopo heterólogo;
injecção dos vírus híbridos purificados em coelhos, análise dos soros obtidos (ELISA, immunoblot, seroneutralização);
marcação e preparação de extractos de células infectadas através de análise das proteínas da cápside (nomeadamente l/Pl) dos v_í rus híbridos em gel de poliacrilamida SDS (Laemmli, 1970);
em caso de necessidade de injecção,em coelhos,de péptidos sin68 072
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-22téticos correspondentes às sequências inseridas nos poliovírus: análise dos anticorpos obtidos: reconhecimento e neutralização dos vírus híbridos.
Cada vez que se dispõe de vários epítopos de inserção possível nos picornavlrus usados, selecciona-se num primeiro tempo os que apresentam melhores caracteristicas de resistência ao calor e melhores rendimentos de produção em relação ao picornavlrus não modificado.
Os picornavlrus híbridos retidos podem em seguida ser testados pela sua imunogenicidade e a sua capacidade de neutralizar os agentes patogénicas aos quais os epítopos inseridos nos picornavírus híbridos correspondem, nomeadamente após injecção em animais de laboratório (ratos, cobaias, coelhos). Retêm-se os vírus híbridos ou quiméricos que têm tanto quanto possível a estabilida. de e os rendimentos do poliovírus em cultura e capazes de induzir no animal os anticorpos neutralizantes num título elevado, não sçi mente contra o poliovírus mas também contra os alvos retidos (por exemplo HAV, HIV, rotavírus). Estes vírus são testados de seguida pela sua capacidade de induzir nos sistemas animais apropriados (macacos, chimpanzés, etc..) uma protecção contra uma infecção de ensaio do vírus considerado.
Em particular par2 os poliovírus modificados por uma sequência oroveniente do vírus da hepatite A (HAV) pode-se testar a imunogenicidade do novo princípio vacinante como a seguir se descreve:
g aproximadamente 10 pfu de cada stock virai clarificado são misturados volume a volume com o adjuvante de Freund completo (AFC) e injectados em cada coelho de um lote de 4 coelhos (fêmeas de raça Neu/Zeland branca) por via intradérmica (ID) em múltiplos pontos no dorso do animal. Um primeiro reforço é efectuado três g
semanas após a imunização, nas mesmas condições (10 pfu de vírus injectados por via ID, em presença de AFC). Os soros provenientes da sangria colectada duas semanas após o reforço são analisados por seroneutralização: procura-se a presença de anticorpos neutralizantes HAV e igualmente de anticorpos neutralizantes PV-1.
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-23Na metodologia descrita acima para a produção de poliovírus híbrido ou quiméricos, utilizou-se directamente o ADNc dos híbridos, cionado no plasmídeo infeccioso pKK17 (descrito na parte II—l) para dar origem aos vírus correspondentes, por transfecção de células de primata.
E igualmente possível passar pelo intermediário duma trans crição in vitro dos ADNc e originar os vírus correspondentes após transfecção das células, pelos ARN de polaridade positiva obtidos in vitro. A infecciosidade desses ARN é superior à dos clones de ADNc, aquando das transfecções nas células de primatas.
Para esta segunda metodologia, os ADNc híbridos são danados, por exemplo, atrás do promotor do fago T7 (num plasmídeo des. crito por S. van der Werf e outros., 1986) ou o promotor do fago SP6 de Salmonela (num plasmídeo descrito por G. Kaplan e outros, 1985). Os ADNc são transcritos num sistemascelular utilizando a ARN polimerase de T7 purificada ou a ARN polimerase de SP6 e susceptível de originar in vitro cópias de ARN virai infeccioso, de polaridade positiva. A muito elevada especificidade da ARN polimerase de T7 para os seus próprios promotores, a sua capacidade de fabricar os transcritos completos de longos ADNc permitem produzir grandes quantidades de ARN nesse sistema. Esses ARN servem de ma triz para a tradução nas células transfectadas plasmídeo pT7PVl-5 descrito por Ξ. van der Werf (1986) permite, pela sua construção, obter os ARN (+) contendo somente 2 resíduos G excedentários em 5' e 3 resíduos excedentários a jusa_n te do polio A em 3'. A eliminação de longas sequências excedentá rias em 5' e 3' dos ARN produzidos a partir das construções inici. ais permitiu aumentar a infecciosidade dos ARN de 103 pfu/^g para 10 pfu/^wg (ou seja a volta de 5% da inf ecciosidade dos ARN virais extraídos dos viriões).
Além disso, estas metodologias podem ser aplicadas de um modo geral aos ADNc híbridos sobre uma grande parte do seu genoma. Pelo mesmo sistema de cassete enquadrado pelos sítios de restri. ção que se podem originar por mutagénese dirigida, pode-se deleccionar a totalidade da parte PI do genoma do poliovírus e substituí-la por uma região PI de um outro picornavirus, e originar vírus híbridos (com,eventualmente,complementação por um sistema po-
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-24dendo fornecer as cápsides de poliovirus exógenos se necessário).
Apresenta-se ainda, a seguir e a título de exemplos não l_i mitativos um certo número de péptidos imunogênicos neutralizantes susceptíveis de serem incorporados como foi descrito anteriormente nas proteínas da cápside de um poliovirus.
EXEMPLOS DE SEQUÊNCIAS IMUNOGENICAS TENDO SIDO INSERIDAS OU PODEN DO SER INSERIDAS NUM VECTOR CASSETE APROPRIADO, TAL COMO pAM4 OU pAM5 que
Para determinados poliovírus híbridos v iáv eis/fo efect_i vamente obtidos, indica-se a seguir a sua designação sobre a forma de uma letra v, seguida de um número, assim como a designação do plasmídeo usado na construção do ADNc intermediário. As sequênci. as híbridas correspondentes foram inseridas em substituição do epítopo C3 do poliovírus.
l/ Sequências características do vírus da hepatite virai A (HAV) codificando para os péptidos imunogénicos neutralizantes (J. COHEN e colab. (1986) 3. VIROL 61, 50-59) nomeadamente as sequências correspondentes à:
R pgi ão 102 102-110 VP1 HAV (v545 ; pAM5 ) 110
5 ' Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro 3'
5 1 TCA AAT AAT AAA GAG TAC ACA TTT CCA A 3’ (28-mero)
3 ’ AGT TTA TTA TTT CTC ATG TGT AAA GGT TTCGA 5'
(3 2-mer
— Rpni ãn 102-115 VP1 HAV
102 110
5 ' Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro Ile Thr Leu Ser
1 15
Ser 3'
5 ’ TCA AAT AAT AAA GAG TAC ACA TTT CCA ATA ACC TTG TCT
TCG A 3' (43-mero)
3 ' AGT TTA TTA TTT CTC ATG TGT AAA GGT TAT TGG AAC AGA
AGC TTCGA (47-mero)
072
Ref: 0684 D
12.018.199
-25- região 99-106 de VP1-HAV
Thr Phe Asn Ser Asn Asn Lys Glu rodeada pelos resíduas Asp(93)-Asn(94), por um lado, e Lys(i03), por outro lado do VP1 do poliovírus
- região 67-76 de VP3 HAV (v564 ; pAM5)
Asn Ala Ser Asp Ser Vai Gly Gin Glu Ile rodeada pelos resíduas Asp(93) e Lys(l03) de VP1 do poliovírus.
2/ Sequências características do vírus da hepatite 8 codificando para os péptidos imunogénicos neutralizantes desse vírus, correspondendo esses péptidos à:
“ região 120-145 do quadro de leitura codificando para pré-5
(região N-terminal da proteína média: 33 e 36KD).
120 130
5' Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin Thr Leu
140
Gin Asp Pro Arg Vai Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala
Gly Gly 3'
ref. A.R.NELJRATH. S.B.H.KENT, N.STRICK (1984).
Science, 224. 392-394. - reÇlião 12-32 pre-S
20
5 ' Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro Leu Gly
30 32
Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro 3 '
iet · A .R.NEURATH, S.B. H.KENT, N.STRICK , P.TAYLOR,
C .E.STEVENS. Nature 315. 154- 156 (1985)
- região 139-147 S
139 147
5 ‘ Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys 3 1
ref. BHATNAGAR ecol. (1982), PNAS 79, 4400-4404.
THANAVALA ecol. (1986), J. Exp. Med:164, 227-236
072
Ref: 0684 D
12.018.199
-263/ Sequências codificando para os péptidos imunogénicos do vírus do herpes simplex tipo-1, nomeadamente:
- região 8-23 da glicoproteína D madura (resíduos 33 a 48 da sequência vaticinada de gDl).
10
5' Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly 20 23
Lys Asp Leu Pro 3' ref. COHEN e col. ( 1984), J. Virol. 49, 102.108.
“ regido 340-356 da glicoproteína D (resíduos 365 a 381 da sequência vaticinada).
340 350
5' His Arg Arg Thr Arg Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg
356
Leu Pro His Ile Arg 3' ref. EISENBERG e col. (1985), J.Virol. 53, 634-644
- ou região codificada pela sequência da glicoproteína D HSV-1:
R. 3. WATSON, 3. H WEIS, 3. S, SALSTROM, L. W. ENQUIST. (1982), Science 218, 381-384.
4/ Sequências codificando para um antigénio de superfície imunodominante do circumsporozoíto de piasmodium falciparum, agejn te da Malária, em particular 0 motivo antigénico presente na proteína CS (proteína do circumsporozoíto -412 aminoácidos e contendo 41 repetições de um tetrapéptiao , em posição central na proteína). □ motivo antigénico utilizável é então constituído por um certo número, por exemplo 4 repetições do tetrapéptido - Pro Asn Ala Asn ref. V. ENEA e colab. (1984)- Science 225, 628-630.
3. B. DAME e colab. (1985)- Vaccines 85 -Cold Spring Harbor Laboratary (7-ll) ref. sequência de proteína CS : 3. B. DAME e colab. (1984)
Science 225, 593-599.
5/ Epítopo de vírus da gripe contendo os resíduos 138-164
072
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12.018.199
-27da hemaglutinina ref: M SHAPIRA, M. 3IBS0N, G. MULLER, R. ARNON (1984)
PNAS 8_1, 2461-2465.
6/ Epítopos caracterís ticos da glicoproteína do envólucro de HIV I e HIV 2, por exemplo os epítopos importantes para a sero neutralização localizados na gpl20, tais como os definidos respectivamente pelos grupos de Bolognesi e Putney (epítopo específica de tipo) e pelo grupo de Ho e colaboradores (epítopo especif_i co de grupo) ou por Matsuhito e colab., 3. Virol. 1988, 62 2107-2114; ou ainda os epítopos de neutralização de grande especificidade, tais como os identificados na gp41, a qual possui por acréscimo a sequência hidrófoba necessária à fusão do envólucro do vírus com a membrana celular (Robin Weiss).
Em particular, pode-se recorrer ao epítopo de Bolognesi-Putney (Putney e colab., Science, 1986, 2 34, 1392-1395) (classicamente descrito sob a forma de anel constituído pelos aminoácidos 301 a 336 da gpl20).
NH- -C-T-R-P-N-N-N-T-R-K-S-I-R-I-Q-R-G ι
307
310
COOH-C-H-A-Q-R-M-N-G-I-K-G-I-T-V-F-A-R
330 320 ou às partes do anel correspondentes às sequências
N T R K SIRIQRGPGR (eventualmente suficiente para iri duzir anticorpos neutralizantes específicos da variante tipo IIIB (LAV-l)) ou à sequência K G P G R V I, susceptivel de induzir anticorpos neutralizantes da variante RF.
Pode-se também recorrer ao segundo epítopo da gpl20 (sequência dos aminoácidos 254 a 271 de Ho e colab., 1988, Science 239, 1021):
CTHGIRPVVSTqLLLNCS que induz anticorpos neutralizantes (a taxas diversas) tendo sido testadas todas as variantes africanas, europeias e americanas; cu a uma parte deste epítopo: GIRPVVSTQL. Lstes epítopos são particularmente interessantes para incluir numa vacina já que
072
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-28deverão permitir induzir anticorpos de largo espectro de neutrali. zação.
A título de exemplo de outros anticorpos utilizáveis, refe re-se o epítopo da gp41 correspondente aos aminoácidos 735 a 752, a saber:
GIEEECGERDRDRSIRLVNC 740 750 ou o epítopo (LASKY e colab.) que parece implicado no reconhecimento do receptor CD4 (aminoácidos 404 a 425):
IKQIINMWQKVCKAMYAPPISG
410 420
7/ Epítopo de cadeias polipeptídicas VP3 e VP7 para a pro tecção contra o rotavirus; tais como os epítopos recentemente identificados por Mackou, Harry Greenberg e colab. (Proc. Natl. Acad. Sei., 1988 , 85, 645-649) em particular:
menciona-se em particular os epítopos contidos em VP3, sequências dos aminoácidos 87 a 89:
l_ L A P T A A G V V V E G T 90
148 a 150:
D V V K T T Q N G S Y S Q Y G P 150 e 338 a 393:
GDYSEALPVGOWP
390
Este último epítopo parece particularmente interessante uma vez que os anticorpos neutralizantes que lhe correspondem mostram uma reactividade cruzada importante com múltiplos serotipos de rotavirus.
Outros epítopos de neutralização presentes no VP7, podem ser utilizados, em particular os que coincidem com as regiões de aminoácidos 87 a 101 e 208 a 221 (Taniguchi, Channock e colab., Virol., 1988, 62.. 1870-1874), em particular os que contêm as sequências :
sf’
072
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-29TEASTQINDGDWKDSLSQe
GCQTTNVDSEEMVAEN.
8/ Epítopos da glicoproteína do vírus da raive.
9/ Epítopos do antigénio da cólera (Patente francesa n.2. 83.13828, publicada sob o nS. 2 551 088), etc..
z
E de inferir naturalmente que qualquer outro epítopo poderá ser utilizado para a produção de vacinas, de preferência vacinas vivas, utilizando um picornavírus da virulência atenuada a ti tulo de vector portador (por exempla uma estirpe SABIN). Essas vacinas serão destinadas ao homem ou ao animai segundo a natureza do epítopo escolhido e do vector escolhido. Será evidente para o técnico da especialidade que o picornavírus utilizado a titulo de vector possa ser também um vírus virulento, caso em que nos servi remos do recombinante obtido para fabricar uma vacina inactivada. Por fim, cabe ao clínico determinar as doses e o protocolo de administração da vacina escolhida, de acordo com o mamífero a que será destinada.
Indicam-se ainda a seguir as referências dos artigos e dos autores aos quais foi feita referência acima.
Enfim, é sabido que não se está limitado unicamente ao ep.í topo C3 (sítio MIM I) mas que construções parecidas podem ser empreendidas nos sítios NIM II (UP2) e NIM III (UP3). Particuiarmente, pode-se substituir 2 dos 3, ou mesmo os 3 sítios de neutra lização do picornavírus vector (por exemplo poliovlrus l) pelos 2 ou 3 epítopos de neutralização correspondentes e provenientes de um outro picornavírus (por exemplo o HAV/).
No caso já mencionada, acima, em que se substitui por exe_m pio a cápside do rinovlrus pela cápside do poliouírus ou vice-vej? sa, compreende-se naturalmente que esta cápside de substituição pode por sua vez ser substituída localmente por um epítopo heter_ó logo em presença desta cápside; esta substituição do epítopo natural desta cápside, no picornavírus de que ela provém, encontra-se à superfície da referida cápside.
z
E sabido que a expressão epítopo tal como foi utilizada no contexto do presente texto não deve ser interpretada de manei68 072
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-30ra restritiva. Em particular, a expressão epítopo não está limitada à única sequência de aminoácidos aos quais é atribuída a capacidade de indução in vivo de anticorpos neutraiizantes contra o antigénio ao qual este epitopo foi tirado. A expressão deve ser entendida como englobando eventual mente sequências de aminoácidos mais ou menos curtas que, normalmente, envolvem o epítopo (no sentido restrito da expressão) no antigénio ao qual ele foi t_i rado. Viu-se que essas sequências podem mesmo, no caso do picornavírus, ir até à inclusão da totalidade das proteínas das cápsides dos picornavirus aos quais o antigénio de substituição foi t_i rado.
Pode-se assim proceder também à transferência de substitui ções realizadas no ADNc de uma estirpe selvagem (Mahoney) no ADNc de uma estirpe Sabin. A invenção permite então a utilização de vacinas quiméricas vivas utilizáveis por via bucal. Isto consid£ ra em particular a produção de vacinas contra a hepatite A e as diarreias a rotavirus. A subclonação directa tornada possível a partir de um fragmento do plasmldeo pAM5 substituído no ADNc Sabin deverá permitir responder a esta preocupação.
Entede-se que todas as operações que foram descritas no que precedeu se aplicam da mesma maneira a um ADNc derivado de uma estirpe Sabin de tipo I, por exemplo pela substituição nesse ADNc de um oligonucleótido contendo a sequência que codifica para o epítopo heterélogo escolhido na sequência endógena que codifica para o péptido correspondendo essencial mente ao epítopo C3 da proteína VP1 da estirpe Mahoney, no caso:
His Vai Vai Gin His
Arg Ser Arg Ser Glu Ser Ser Ile Glu Ser
Phe Phe Ala Arg Gly Ala Cys Vai Ala Ile
Ile Thr Vai Asp Asn Ser Ala Ser Lys Thr
Asn Lys Asp Lys Leu Phe Thr
ESraHSliGlAS
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072
Ref: 0684 D
12.018.199

Claims (15)

  1. 68 072 Ref: 0684 D 12.018.199
    reivindicaçBes 1 - Processo de fabricação de um picornav/irus híbrido, ca-racterizado por, partindo dum cADN obtido a partir do ARN virai, e após se ter localizado previamente um epitopo imunogénico natural ou um encadeamente proteico do picornavlrus correspondente, se introduzirem, de um e deoutro lado da sequSncia imunogénica na tural a substituir, os sítios de restrição específicos (na medida em que estes não estejam jâ presentes) no cADN, se clivar o cADN ao nível destes sítios específicas com as eszimas de restrição correspondentes, se reconstituir um cADN recombinante híbrido fojr mado a partir de todos os elementos do ARN virai ou do cADN neces sário à replicação posterior do vírus, que se encontravam anteri-ormente associados à sequência que codifica o epitopo natural, por um lado, e da sequência que codifica o epitopo imunogénico ou encadeamento proteico de substituição, em lugar e em vez da sequência que codifica o epitopo ou o encadeamento natural, por outro lado, e transfectar uma cultura celular sensível com este ADN recombinante e finalmente recolher o picornavlrus recombinante correspondente.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do por o picornavlrus obtido ser um picornavlrus híbrido viável contendo um epitopo ou encadeamento proteico caracteristico duma proteína vacinante ou encadeamento de proteínas, heterólogo em re lação às proteínas deste picornavlrus, substituído num dos seus próprios epítopos imunogénicos ou encadeamentos proteicos.
  3. 3 - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, carac-terizado por o epitopo heterólogo estar exposto na superfície da cápside do picornavlrus.
  4. 4 - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2 ou a reivindicação 3, caracterizado por o picornavlrus ser formado por um poliovírus humano. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o picornavlrus consistir num poliovírus do tipo 1, no qual o epitopo heterólogo está substituído no epitopo C3 normalmente exposto na superfície da cápside do poliovírus. 68 072 Ref! 0684 D 12.018.199
  5. 6 - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2 ou a reivindicação 3, caracterizado por o picornavírus consistir num rinovírus ou num aftovírus.
  6. 7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçSes de 1 a 6, caracterizado pelo facto do epítopo heterólogo ser contíguo às sequências de aminoácidos pertencentes à proteína virai, no qual ele ê incorporado, na ausência de resíduos de aminoácidos ou de péptidos de ligação.
  7. 8 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçSes de 1 a 7, caracterizado por, à excepçSo do ou dos epítopos imunogén_i cos nos quais o epítopo ou os epítopos heterogéneos foram substituídos, todos os outros epítopos normalmente expostos do picorna-vírus nativo correspondente serem reconhecidos pelos anticorpos específicos que lhes correspondem e produzidos a partir do picor-navirus nativo ou de proteínas obtidas a partir dele.
  8. 9 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por, no cADIM constituindo a réplica do genoma do picornavírus, as junções entre a sequência que codifica o epi-topo imunogánico heterólogo e as sequências que o envolvem se efectuarem em redor de sítios de restrição dos quais, por outro lado, a réplica de ADN é desprovida.
  9. 10 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por o epítopo heterólogo ser um epítopo imu-nogénico duma proteína de vírus da Hepatite A.
  10. 11 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por o epítopo heterólogo ser um epítopo imu-nogénico dum glicoproteína do anvólucro ou duma glicoproteína transmembranar de HIV.
  11. 12 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por o epítopo heterólogo ser um epítopo imu-nogênico de uma proteína de rotavírus.
  12. 13 - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, cara_ç terizado por o picornavírus conter um encadeamento proteico hete-rólogo de substituição pertencente a um outro picornavírus. -35- 68 072 Ref: 0684 D 12.018.199
  13. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o encadeamento proteico heterólogo possuir a sequência de proteínas VPO, VP3 e VP1 do outro picornavírus.
  14. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o picornavírus ser constituído por um poliovírus humano e por as sequências de proteínas VPO, VP3 e VP1 heterólogas serem obtidas dum rinovírus ou dum HIV humano.
  15. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o picornavírus ser constituído por um poliovírus humano Mahoney do tipo 1 e por as sequências de proteínas VPO, VP3 e VPi heterólogas serem obtidas dum poliovírus Sabin de tipo 1. Lisboa, -8. ASO. 1988 Por INSTITUT PASTEUR O AGENTE OFICIAL
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