CN113150131A - 广谱识别a组肠道病毒2c蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

广谱识别a组肠道病毒2c蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种广谱识别A组肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体及其应用。具体地，本发明提供了一种抗人类肠道病毒(Human Enteroviruses,HEV)2C蛋白的抗体，所述抗体特异性地靶向一抗原表位，所述的抗原表位包括对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第136‑145位的区段。本发明抗体适用于蛋白免疫印迹、细胞流式、免疫荧光与酶联免疫吸附等生化实验，可作为基础研究的重要工具。并且，本发明抗体能广谱识别A组肠道病毒，具有进一步开发用于手足口病临床样本检测、免疫组织化学病理的潜在价值。

Description

广谱识别A组肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域或医药领域，具体地涉及一种广谱识别A组肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
手足口病(Hand,foot and mouth disease，HFMD)是一种主要发生于5岁以下儿童的病毒性传染疾病，大多数临床症状为轻微的，开始是短暂的低烧，接着是咽炎，随后手、脚与口出现疱疹，但有些能引起严重的甚至致命的神经系统并发症，如无菌性脑膜炎、脑炎、肠胃炎、疱疹性咽炎和急性弛缓性麻痹等。已经发现，该疾病主要由人类肠道病毒引起。
为了进一步探索人类肠道病毒与各种疾病之间的联系以及这些病毒引起病理的潜在分子机制，研究者们建立了多种病毒诊断技术。例如，临床实验室可使用实时逆转录聚合酶链反应检测病毒，或基于抗原的免疫染色用于检测血清样本中的病毒特异性抗体。单克隆抗体(mAb)是检测和筛选临床样本的重要诊断工具，具有作为新型免疫疗法开发的潜力。然而，针对人类A组肠道病毒(HEV-A)非结构蛋白的单克隆抗体报道较少，甚至有些非结构蛋白单克隆抗体未见有报道，如2C蛋白的单克隆抗体。
因此，本领域迫切需要开发一种高效针对人类肠道病毒的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效针对人类肠道病毒的单克隆抗体。
在本发明中，提供了一种特异性地靶向人类肠道病毒非结构蛋白的单克隆抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗人类肠道病毒(HEV)2C蛋白的抗体，所述抗体特异性地靶向一抗原表位，所述的抗原表位包括对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第136-145位的区段。
在另一优选例中，所述的人类肠道病毒为人类A组肠道病毒。
在另一优选例中，所述的人类肠道病毒包括：CVA10、CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA12、CVA14、CVA16、EVA71、EVA76、EVA89、EVA90、EVA91、EVA92、EVA114、EVA119、EVA120、EVA121、EVA122、EVA123、EVA124、EVA125等；优选地为CVA10、CVA4、CVA6、CVA7、CVA8、CVA16、EVA89或EVA91；更加优选地为CVA10。
在另一优选例中，所述抗体包括一重链，所述的重链中包括一重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
(i)如SEQ ID NO:4所示的CDR1，
(ii)如SEQ ID NO:5所示的CDR2，和
(iii)如SEQ ID NO:6所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留与所述抗原表位的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区、鼠源的FR区、兔源的FR区，或羊源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源、兔源的，或羊源的。
在另一优选例中，所述抗体包括一轻链，所述的轻链中包括一轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
(i)如SEQ ID NO:9所示的CDR1，
(ii)如SEQ ID NO:10所示的CDR2，和
(iii)如SEQ ID NO:11所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留与所述抗原表位的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区、鼠源的FR区、兔源的FR区，或羊源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源、兔源的或羊源的。
在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体，或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体、或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、GGGS序列、FLAG标签、HA标签、Myc标签，或其组合。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体，或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合人类肠道病毒2C蛋白。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：如本发明第一方面所述的抗体，或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:2所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:7所示。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白，或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物。
在另一优选例中，所述的药物为靶向治疗人类肠道病毒感染性疾病(优选地为手足口病)的药物。
在另一优选例中，所述的人类肠道病毒感染性疾病包括但不限于：手足口病、疱疹性咽峡炎、肺水肿、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎，和急性弛缓性麻痹等。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(如DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的(a)。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的(a)。
在本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于人类肠道病毒2C蛋白；并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的抗体的重链可变区和轻链可变区。
在本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物；
或者，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第九方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、如本发明第七方面所述的CAR构建物、如本发明第八方面所述的免疫细胞、或其组合，所述活性成分被用于(a)制备人类肠道病毒感染的诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗人类肠道病毒感染的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：检测样品中的人类肠道病毒2C蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在本发明的第十方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第一方面所述抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、如本发明第八方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、如本发明第八方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、如本发明第八方面所述的免疫细胞、或其组合，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第十二方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白，所述的方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；和
(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。
在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中人类肠道病毒或人类肠道病毒2C蛋白或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在人类肠道病毒或人类肠道病毒2C蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗人类肠道病毒感染性疾病的方法，包括步骤：向有需要的对象施用有效量的如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第十一方面所述的药物组合物，或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了单克隆抗体的筛选和制备过程，以及纯化抗体效价的鉴定结果。
其中，(A)显示了以CVA10病毒2C蛋白为免疫原免疫六只8周龄的Balb/c小鼠，收集血清用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体效价。(B)显示了三轮亚克隆筛选的结果。(C)显示了M3-8细胞上清的鉴定结果。(D)显示了ELISA检测所得的纯化的抗体效价。
图2显示了M3-8 mAb用于蛋白免疫印迹、免疫荧光与细胞流式实验的结果。
图3显示了M3-8 mAb所识别的抗原表位的筛选和鉴定。
其中，(A)和(B)显示了寻找抗原表位过程中各筛选步骤的结果。(C)显示了A组肠道病毒2C蛋白的氨基酸序列比对结果。(D)显示了将抗原表位序列(2C-136-145aa)依次进行单个氨基酸突变和合成替换肽(与CVA10-2C表位有差异的其它病毒(如CVA-4/14、EVA-76/89/90/91/121/92/125)序列替换CVA10-2C在此处的氨基酸序列)，以寻找抗原识别的关键位点的实验结果。
图4显示了M3-8 mAb对A组肠道病毒广谱性的验证结果。
图5显示了M3-8 mAb重组抗体的构建与表达鉴定的结果。
其中，(A)显示了构建具有重组抗体重、轻链可变区的pcDNA3.4真核表达载体流程图。(B)显示了用SDS-PAGE对重组抗体进行分析的结果。(C)-(E)分别显示了用蛋白免疫印迹、免疫荧光与细胞流式实验对重组抗体的功能的检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一株针对CVA10病毒2C蛋白的单克隆抗体，并探究其在基础实验如蛋白免疫印迹、细胞流式和免疫荧光实验的运用；发明人还鉴定了抗体识别表位及关键氨基酸残基，，并用免疫荧光实验验证抗体对A组肠道病毒(包括传统型与非传统型肠道病毒)的广谱性；最后，发明人克隆了该抗体基因并成功将其表达，获得了重组抗体，验证其活性。在此基础上完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的针对人类肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
人类肠道病毒(Human Enteroviruses，HEV)
人类肠道病毒属于小核糖核酸病毒属，包含100种以上的血清型，依据结构蛋白氨基酸序列的相似性与生物学特性，人类肠道病毒可分为13个种属，包括肠道病毒A-J及鼻病毒A-C，A组肠道病毒包含25种或以上血清型病毒。目前全球主要流行的肠道病毒71(enterovirus 71，EV-A71)，柯萨奇病毒A16(coxsackievirus A16，CVA16)，柯萨奇病毒A6(coxsackievirus A6，CVA6)与柯萨奇病毒A10(coxsackievirus A10，CVA10)均属于A组肠道病毒。A组肠道病毒能引起许多疾病，其中最常见的是手足口病(Hand,foot and mouthdisease，HFMD)。
CVA10病毒是一个无包膜的二十面体结构颗粒，含有单股正链RNA，长度约为7.5kb，包括一个编码多聚蛋白的开放阅读框与两个非编码区，5’UTR与3’UTR。编码的多聚蛋白被蛋白酶2A、3C或3CD(3C前体)切割为结构蛋白VP1、VP2、VP3与VP4，非结构蛋白2A、2B与2C以及3A、3B、3C与3D。结构蛋白包装为病毒衣壳，非结构蛋白在病毒的复制，成熟，感染与抗细胞免疫中起作用。
2C蛋白是肠道病毒中较为保守的非结构蛋白，在病毒的复制、感染与免疫逃逸中起着至关重要的作用。2C蛋白含有几个重要结构域，分别为N末端膜结合结构域，中间的ATPase结构域和富含半胱氨酸结构域，C末端螺旋结构域。在病毒复制过程中，脊髓灰质炎病毒与EVA71病毒的2C蛋白均能融合与重排哺乳动物细胞内的胞膜结构形成复制复合物，为病毒的复制提供场所；浆膜细胞3(reticulon 3，RTN3)，是宿主细胞浆膜蛋白家族的一员，病毒的2C蛋白通过截获RTN3蛋白来促进病毒的感染与复制。NF-κB信号通路在细胞的抗病毒反应中至关重要，激活后可介导表达β干扰素、MHC-1与许多不同的炎性细胞因子。2C蛋白可通过两条路径来抑制NF-κB的激活，从而达到免疫逃逸的效果。其一为通过与IKKβ作用来抑制IKKβ的磷酸化，从而抑制NF-κB的激活；其二为通过与p50竞争p65的IPT结构域来抑制p65/p50异质二聚物的形成，从而抑制NF-κB的激活。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
在本发明中，所述抗体能够特异性地识别人类肠道病毒2C蛋白中的保守表位。所述的保守表位在CVA10病毒的2C蛋白中，位于的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第136-145位区段。
SASWLKKFNDMANAAKGLEWISNKISKFIDWLKEKIIPAAKEKVEFLNNLKQLPLLENQISNLEQSAASQEDLEAIFGNVSYLAHFCRKFQPLYATEAKRVYALEKRVNNYMQFKSKHRIEPVCLIIRGSPGTGKSLATGIIAR AIADKYHSSVYSLPPDPDHFDGYKQQVVTVMDDLCQNPDGKDMSLFCQMVSTVDFIPPMASLEEKGVSFTSKFVIASTNASNIIVPTVSDSDAIRRRFYMDCDIEVTDSYKTDLGRLDAGRAAKLCSENNTANFKRCSPLVCGKAIQLKDRKSKVRYSVDTMVSELIREYNNRSAVGNTIEALFQ(SEQ ID NO:1)
在其他实施方式中，所述的表位位于其他人类肠道病毒的2C蛋白的对应于SEQ IDNO:1所示序列的第136-145位区段。
其中，所述的其他人类肠道病毒包括：CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA12、CVA14、CVA16、EVA71、EVA76、EVA89、EVA90、EVA91、EVA92、EVA114、EVA119、EVA120、EVA121、EVA122、EVA123、EVA124、EVA125等；优选地为CVA4、CVA6、CVA7、CVA8、CVA16、EVA89或EVA91。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397，在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明中，所述抗体为特异性结合人类肠道病毒2C蛋白的抗体。本发明提供一种针对人类肠道病毒2C蛋白的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:4所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:5所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:6所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:10所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:11所示的VL-CDR3；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留与人类肠道病毒2C蛋白的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；更佳地为IgG1。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向人类肠道病毒2C蛋白的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本发明的实施方式中，所述靶向人类肠道病毒2C蛋白的抗体为M3-8。
在一个更加优选的实施方式中，本发明各抗体具体地包括以下各VL和VH序列，以及Fc、CL和CH1序列。
表B M3-8 mAb序列总结
Figure BDA0002954257590000151
其中，各重链和轻链的CDR序列依据Kabat方法确定。
编码的多核苷酸
本发明还提供一种多核苷酸，其编码上述的抗体或包含其的重组蛋白或其重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADC)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure BDA0002954257590000191
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗人类肠道病毒感染的疾病的药物。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。
较佳地，所述的样本是来自于检测对象的血液样本或咽拭子、粪便或肛拭子或疱疹液等样本。
本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗人类肠道病毒感染的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合人类肠道病毒2C蛋白分子或其片段，因而可用于预防和治疗病毒感染所引发的疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗人类肠道病毒感染的疾病的药物中的应用。较佳地，所述人类肠道病毒感染的疾病为手足口病。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明针对人类肠道病毒的M3-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在获得生产本发明的M3-8单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原(例如CVA10病毒2C蛋白)，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Col lection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明的主要优点包括：
1)本发明首次发现一株能识别多亚型A组肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体(M3-8mAb)，鉴定了其识别表位与关键氨基酸残基。
2)本发明抗体适用于蛋白免疫印迹、细胞流式、免疫荧光与酶联免疫吸附等生化实验，可作为基础研究的重要工具。
3)本发明抗体能广谱识别A组肠道病毒，具有进一步开发用于手足口病临床样本检测、免疫组织化学病理的潜在价值。
4)在本发明中，克隆和表达了本发明的重组抗体，其活性得到验证；重组克隆可保障该抗体的质量稳定和持续生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：制备M3-8单克隆抗体
在本实施例中，选取8周龄的Balb/c小鼠作为免疫对象。以CVA10病毒2C蛋白为免疫原免疫六只8周龄的Balb/c小鼠，收集血清；用酶联免疫吸附实验检测血清抗体效价。抗体效价的检测结果如图1A所示。
接下来，进行了三轮亚克隆筛选，以产生高滴度抗体的杂交瘤细胞。将M3小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后铺板96孔板进行亚克隆。其中，第二次亚克隆来源于第一次亚克隆中检测效价最高的细胞孔(序号6)；同理，第三次亚克隆来源于第二次亚克隆细胞孔(序号2)。经第三次亚克隆检测后，选择序号8进行建株，编号M3-8。其中，第一次亚克隆的结果如图1B的左图所示；第二次亚克隆的结果如图1B的中间柱形图所示；第三次亚克隆的结果如图1B的右图所示。
对M3-8细胞上清进行了鉴定。将RD细胞接种于6孔板，37℃培养箱过夜培养。随后用感染复数为1(MOI＝1)的CVA10病毒量感染细胞，7小时后收细胞。以M3-8细胞上清为一抗用蛋白免疫印迹法进行检测(图1C，左图)。用适量的CVA10病毒2C蛋白4℃过夜包被ELISA板子，随后用M3-8细胞上清为一抗进行ELISA检测上清的抗体效价(中图)与抗体亚型(右图)。其中，以M3-8细胞上清为一抗进行的蛋白免疫印迹检测结果如图1C的左图所示；以M3-8细胞上清为一抗进行的ELISA检测上清的抗体效价结果如图1C的中图所示；ELISA检测上清的抗体亚型的结果如图1C的右图所示。
用适量的CVA10病毒2C蛋白4℃过夜包被ELISA板子，随后用纯化的单克隆抗体(M3-8 mAb)为一抗，进行ELISA检测纯化的抗体效价，结果如图1D所示。
在蛋白免疫印迹结果中，在分子量大小相符的目标位置处出现了明显的条带，这表明M3-8细胞上清确实存在可识别2C蛋白的单克隆抗体。ELISA结果显示M3-8细胞上清抗体效价约为1：625(OD值大于阴性的2倍即可判定为阳性)，亚型为IgG1，kappa；纯化的单克隆抗体(M3-8 mAb)效价高于1：80000。
以上结果表明，已成功制备识别2C蛋白的单克隆抗体。
实施例2：M3-8 mAb适用于蛋白免疫印迹、免疫荧光与细胞流式实验
将RD细胞接种于6或12孔板。过夜培养后用MOI＝1的CVA10病毒与EVA71病毒感染，7小时后收细胞。
以实施例1中筛选所得的M3-8 mAb为一抗进行蛋白免疫印迹、免疫荧光与细胞流式实验检测。蛋白免疫印迹、免疫荧光、和细胞流式实验的结果分别如图2的A图、B图和C图所示。
蛋白免疫印迹结果中，在CVA10与EVA71病毒感染的样本中，预测分子量大小位置处均出现了明显条带，这说明M3-8 mAb可适用于蛋白免疫印迹，且该抗体不仅能识别CVA10，亦能识别EVA71。因此可以推测M3-8 mAb可能识别一个保守表位。
免疫荧光与细胞流式的结果进一步证实了该抗体能识别CVA10与EVA71，再次表明M3-8 mAb可能识别一个保守的表位。
实施例3：探索M3-8 mAb的识别表位
首先，将三个截短的2C蛋白的肽段插入pcDNA6.0真核表达载体，转染293T细胞表达，48h后用蛋白免疫印迹检测，Flag抗体用来检测肽段的表达，M3-8mAb用来寻找抗原表位。
结果如图3A所示。从结果中可知，M3-8 mAb所识别的抗原表位位于2C蛋白的121-270区段。
接下来，将2C-121-270aa肽段分成28个小肽段。其中，每15个氨基酸为一小肽段，相邻两肽段之间有10个氨基酸的重叠。用化学合成法合成小肽段后，4℃过夜包被ELISA板子，以M3-8mAb为一抗用ELISA寻找精准表位。
结果如图3B所示。从结果中可知，M3-8 mAb所识别的抗原表位位于编号为#3或#4的肽段上。
随后，本发明人还对A组肠道病毒2C蛋白的氨基酸序列进行了比对，包括源自于CVA10、CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA12、CVA14、CVA16、EVA71、EVA76、EVA89、EVA90、EVA91、EVA92、EVA114、EVA120、EVA121、EVA122、EVA123、EVA124、EVA125的2C蛋白。
比对结果如图3C所示。结果表明，上述各A组肠道病毒的2C蛋白中，位于对应于CVA10 2C蛋白的第136-145位的氨基酸短序列具有高度的同源性。
在本实施例中，还对抗原表位序列(2C-136-145aa)依次进行单个氨基酸的突变，并用序列比对时有差异的其它病毒(如CVA-4/14、EVA-76/89/90/91/121/92/125)序列替换CVA10-2C在此处的氨基酸序列，用化学合成法合成各突变肽与替换肽后，4℃过夜包被ELISA板子，以M3-8mAb为一抗用ELISA寻找抗原表位的关键氨基酸。
结果如图3D所示。S136、L137和T139突变后，抗原抗体结合信号无明显变化；替换CVA14、EVA76/89和EVA90/91/121的病毒序列后，抗体识别信号亦无明显变化；这表明S136、L137、A138、T139和A143对抗体的识别基本无影响。而将G140、I 141、I 142和R144处的氨基酸突变为丙氨酸后，抗体识别信号显著降低；且用CVA4、EVA92和EVA125病毒序列替换后亦显著降低；这表明G140、I 141、I 142和R144对M3-8 mAb的识别至关重要。
实施例4：M3-8mAb对A组肠道病毒广谱性的验证
RD细胞接种12孔板，37℃培养箱过夜培养。用MOI＝1的传统型肠道病毒如CVA4、CVA6、CVA7、CVA8与CVA16感染7h(A)，或者用非传统型肠道病毒如EVA89与EVA91复制子体外转录的RNA转染12h(B)。以M3-8mAb为一抗，用免疫荧光实验验证抗体的广谱性。
结果如图4所示。从A图中可看出，除了CVA4与CVB3病毒感染的细胞为阴性，CVA6、CVA7、CVA8与CVA16病毒感染的细胞均为阳性。B图的结果显示非传统型肠道病毒EVA89与EVA91转染的细胞均为阳性，这说明M3-8 mAb能识别这两种非传统型肠道病毒。A、B两图结果与上述ELISA结果相一致，表明M3-8 mAb确实能广谱识别多种亚型的A组肠道病毒，具有广谱性。
实施例5：M3-8 mAb重组抗体的构建与表达鉴定
在本实施例中，构建了具有重组抗体重、轻链可变区的pcDNA3.4真核表达载体，其流程图如图5A所示。
用具有重链可变区和轻链可变区的编码序列的质粒共转染HD-293F细胞，6天后收集细胞上清。纯化重组抗体后用SDS-PAGE分析，结果如图5B所示。
并且，MOI＝1的CVA10病毒、EVA71病毒与CVB3病毒感染RD细胞，7h后收细胞。以M3-8重组抗体为一抗用蛋白免疫印迹(C)、免疫荧光(D)与细胞流式实验(E)检测重组抗体的效能，CVB3病毒作为阴性对照。
结果如图5所示。其中，蛋白免疫印迹的结果如图5C所示；免疫荧光的结果如图5D所示；细胞流式实验的结果如图5E所示。
B图结果表明M3-8重组抗体已成功制备。C图蛋白免疫印迹结果显示CVA10与EVA71的样本均出现了预期条带。D图免疫荧光结果显示，与阴性对照相比，CVA10与EVA71感染的细胞为阳性。E图细胞流式结果图显示，M3-8 mAb样本阳性率为22.0％，M3-8重组抗体样本阳性率为20.8％。这些数据表明重组抗体与杂交瘤技术制备抗体具有同等效能。
综上所述，本实验室成功克隆M3-8 mAb基因并将其表达，获得重组抗体并验证其活性，并且重组抗体可在体外大量的生产，对于抗体的可持续运用至关重要。
讨论
在本发明中，基于利用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。并且由于目前只有针对肠道病毒A71结构蛋白和非结构蛋白单克隆抗体的制备，而对于其它肠道病毒如CVA10非结构蛋白单克隆抗体的制备尚未见报导；因此，本申请提供了一株针对A组肠道病毒非结构蛋白2C的单克隆抗体，探究其在基础实验的运用，如蛋白免疫印迹，免疫荧光与细胞流式实验等，并探究其广谱性及鉴定抗原表位，为基础研究、临床诊断等提供有力的工具。
因此，在本发明中，一方面涉及采用传统的杂交瘤技术制备针对A组肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体，所述方法包括构建与表达CVA10-2C蛋白的原核表达质粒，并纯化2C蛋白免疫小鼠，随后用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体的效价，选取效价最高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞，并经过一系列亚克隆筛选产生高滴度抗体的杂交瘤细胞进行建株，编号为M3-8，M3-8细胞扩大培养后重新注射小鼠，收集腹水后纯化单克隆抗体(M3-8 mAb)，，蛋白免疫印迹实验检测结果表明单克隆抗体已成功制备。
另一方面，本研究涉及探究M3-8mAb在基础实验的运用，所述方法包括蛋白免疫印迹，免疫荧光与细胞流式技术，实验结果表明M3-8mAb均适用于这三种实验。
另一方面，本研究涉及鉴定抗原表位的方法，所述方法包括构建2C蛋白肽段的真核表达载体，蛋白免疫印迹检测肽段的表达与抗原表位区域，结果表明抗原表位位于2C-121-270aa区域；随后将该区域分成28个小肽段，用化学合成法合成，并用酶联免疫吸附实验检测表位的精准区域，发现抗原表位精准于2C-136-145aa区域；我们还将该区域进行单个氨基酸的突变与合成替换肽，用酶联免疫吸附实验检测发现了抗原表位的关键氨基酸残基；并通过比对A组肠道病毒2C蛋白的氨基酸序列发现该抗原表位序列高度保守。
另一方面，本研究涉及了M3-8mAb对A组肠道病毒广谱性的探究。所述方法包括用免疫荧光实验检测传统型肠道病毒对人横纹肌肉瘤细胞(RD)的感染以及非传统肠道病毒复制子体外转录的RNA转染RD细胞，检测结果表明M3-8mAb可识别大多数A组肠道病毒，即对A组肠道病毒具有广谱性。
另一方面，本研究还涉及了重组抗体的构建与鉴定。所述方法包括构建具有M3-8mAb重、轻链可变区的真核表达载体，并在HD-293F细胞高表达系统表达，收集细胞上清后纯化重组抗体，随后用蛋白免疫印迹、免疫荧光与细胞流式实验验证了重组抗体的效能，结果表明重组抗体具有与M3-8mAb一样的效能。
本发明所提供的M3-8 mAb的潜在应用前景如下：①基础实验应用：M3-8mAb可应用于蛋白免疫印迹、免疫荧光、细胞流式与酶联免疫吸附等基础实验，还可能应用于免疫共沉淀实验研究蛋白互作等；②临床诊断应用：M3-8mAb能广谱识别A组肠道病毒，可应用于临床样本的检测及免疫组织化学病理分析等，为快速鉴定手足口病病原体提供有力的工具；③潜在抗病毒治疗应用：2C蛋白在病毒的复制、感染与免疫逃逸中起着至关重要的作用，M3-8识别2C蛋白功能区，具有被研发成为广谱抗病毒制剂的潜在价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市公共卫生临床中心
<120> 广谱识别A组肠道病毒2C蛋白的单克隆抗体及其应用
<130> P2021-0233
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 329
<212> PRT
<213> 柯萨奇病毒(Coxsackievirus)
<220>
<223> CVA10 2C蛋白
<400> 1
Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys
1 5 10 15
Gly Leu Glu Trp Ile Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu
20 25 30
Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Lys Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn
35 40 45
Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu
50 55 60
Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Ile Phe Gly Asn Val
65 70 75 80
Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Phe Gln Pro Leu Tyr Ala Thr
85 90 95
Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Val Asn Asn Tyr Met
100 105 110
Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg
115 120 125
Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg
130 135 140
Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp
145 150 155 160
Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp
165 170 175
Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln
180 185 190
Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu
195 200 205
Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala
210 215 220
Ser Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg
225 230 235 240
Arg Phe Tyr Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr
245 250 255
Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu
260 265 270
Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys
275 280 285
Ala Ile Gln Leu Lys Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp
290 295 300
Thr Met Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg Ser Ala Val
305 310 315 320
Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln
325
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VH编码序列
<400> 2
caggttcaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc ctggggcttc agtgaaactg 60
tcctgcaagg ctttgggcta cacatttgct gacaatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgtgcatg gcctggaatg gattggaggt attcatccag gaagtggtgg tactgcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggaactca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct attattgtac aagagactac 300
tattggtatg acgaaggctt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VH
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Ala Asp Asn
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Tyr Tyr Trp Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VH CDR1
<400> 4
Asp Asn Glu Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VH CDR2
<400> 5
Gly Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VH CDR3
<400> 6
Asp Tyr Tyr Trp Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VL编码序列
<400> 7
gatattgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccagag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatattcct 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VL
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VL CDR1
<400> 9
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VL CDR2
<400> 10
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> M3_8 VL CDR3
<400> 11
Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Leu Thr
1 5

Claims (10)

1.一种抗人类肠道病毒(HEV)2C蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体特异性地靶向一抗原表位，所述的抗原表位包括对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第136-145位的区段。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括一重链，所述的重链中包括一重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
(i)如SEQ ID NO:4所示的CDR1，
(ii)如SEQ ID NO:5所示的CDR2，和
(iii)如SEQ ID NO:6所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留与所述抗原表位的结合亲和力的衍生序列。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括一轻链，所述的轻链中包括一轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
(i)如SEQ ID NO:9所示的CDR1，
(ii)如SEQ ID NO:10所示的CDR2，和
(iii)如SEQ ID NO:11所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留与所述抗原表位的结合亲和力的衍生序列。
4.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：如权利要求1所述的抗体，或如权利要求4所述的重组蛋白。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的载体或基因组中整合有如权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种抗体偶联物，其特征在于，抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白，或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
9.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、如权利要求8所述的抗体偶联物，其特征在于，所述活性成分被用于(a)制备人类肠道病毒病毒感染的诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗人类肠道病毒病毒感染的药物。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如权利要求1所述的抗体或如权利要求4所述的重组蛋白；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗权利要求1所述抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、如权利要求8所述的抗体偶联物。
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