CN104694479A - 肠道病毒71型的vp2抗原的中和表位多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫生物学领域，涉及一种肠道病毒71型的VP2抗原的中和表位多肽及其用途。具体地，涉及一种抗原表位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1－7中任一序列所示。本发明还涉及所述中和表位多肽在制备治疗和/或预防和/或诊断手足口病的药物中的用途。本发明的中和表位多肽具有良好的中和活性和免疫原性，具有应用于治疗和/或预防和/或诊断手足口病的药物的潜力。

Description

肠道病毒71型的VP2抗原的中和表位多肽及其用途

本发明是申请号为201310291205.5的母案的分案申请，该母案的申请日为2013年7月12日，公开号为CN103539839A，优先权日为2012年7月13日，发明名称为“肠道病毒71型的VP2抗原的中和表位多肽及其用途”。

技术领域

本发明属于免疫生物学领域，涉及一种肠道病毒71型的VP2抗原的中和表位多肽及其用途。

背景技术

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。早期发现的手足口病的病原体主要为柯萨奇病毒A16型(以下简称CA16)，肠道病毒71型(以下简称EV71)最早是在1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离获得，但一直到1974年EV71才被鉴定并命名。此后EV71与CA16交替出现，成为手足口病的主要病原体。

EV71传染性强，易引起暴发或流行。自病毒发现以来在全世界已至少造成十多次爆发流行，波及到美洲、欧洲、澳洲和亚洲的四十多个国家和地区。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡。20世纪90年代后期，EV71开始东亚地区流行。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4－8月共有2628人发病，4－6月有29例病人死亡。1998年，我国台湾地区发生EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，监测哨点共报告129 106例病例，80％有手足口病和中枢神经症状。其中重症病人405例，死亡78例。

我国大陆地区自1995年武汉病毒研究所首次从手足口病人中分离出EV71病毒以来，全国很多地区均有报道。2008年3月在安徽阜阳地区流行的也是EV71。由于疫情的严重性和社会的广泛关注，卫生部已经将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病，并紧急成立了防控组。

EV71病毒颗粒大致呈球形，为正二十面体结构，无包膜和突起，直径约27nm，其蛋白外壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4构成，抗原决定因子基本上位于暴露在病毒颗粒表面的VP1、VP2、VP3上，VP4序列高度保守，包裹在衣壳内部。

近年来，EV71引起的手足口病，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此，开发针对手足口病的快速诊断试剂与安全有效的预防和治疗性药物(例如疫苗)具有重大意义。

发明内容

本发明人经过了深入的研究和创造性的劳动，例如利用不同时间、不同地点分离到的EV71不同的代表株免疫小鼠，进行单克隆抗体的制备，已制备出790株杂交瘤细胞株，其均能够产生对EV71有特异性反应的单抗(单克隆抗体)。本发明人进一步利用基于ELISPOT的EV71高通量中和实验方法对上述单抗的中和活性进行鉴定，发现有2株单抗对部分目前所用的EV71各代表株均有中和活性，说明EV71病毒可能存在高保守性的中和位点，这为EV71的中和表位鉴定提供了突破口，具有制备抗EV71抗体或疫苗的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种多肽，其氨基酸序列如下面的SEQ IDNO：1－8中任一序列所示：

本发明的另一方面涉及一种中和表位多肽，其氨基酸序列如上面的SEQ ID NO：1－8中任一序列所示。具体地，上述中和表位多肽是广谱中和表位多肽。

术语“广谱中和表位多肽”是指识别该表位多肽区段的单抗或多抗血清能够与不同基因型的病毒结合并能消除病毒感染，在杀灭细胞外的游离病毒中起主要作用，其作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；而一般地，识别抗原表位多肽的单抗或多抗血清只能识别结合不同基因型的病毒，不具有消除病毒感染的能力。

所述的多肽或中和表位多肽可以通过人工化学合成的方式得到，也可以本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到，例如参考下面的核苷酸序列SEQ ID NO：9－16，通过基因重组手段克隆到表达载体后转染宿主细胞进行蛋白表达。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。

本发明的再一方面涉及编码上述多肽或中和表位多肽的多核苷酸；具体地，所述多核苷酸的序列分别如SEQ ID NO：9－16中任一项所示：

本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明任一项所述的多核苷酸。

可以将本发明的任一项的核苷酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。

其中，术语“调控序列”定义为包括表达本发明的抗原表位所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。

本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明任一项所述的重组载体。

可将包含本发明之核酸序列的重组载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。

宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。

本发明的再一方面涉及一种中和表位多肽偶联物，包括中和表位多肽和偶联部分，其中，所述中和表位多肽为本发明任一项所述的中和表位多肽，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种；具体地，所述中和表位多肽偶联物为融合蛋白或类病毒颗粒；在一个实施方案中，所述偶联部分为HBcAg蛋白。

所述偶联可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。所述载体有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白等蛋白类载体，另有重组载体可以为多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。

本发明还涉及展示上述中和表位多肽的类病毒颗粒。所述中和表位多肽典型地通过与载体蛋白融合，经过蛋白纯化和组装后可形成类病毒颗粒，并将所述中和表位多肽展示在类病毒颗粒表面，使其仍保持诱导中和抗体产生的能力；其中所述载体蛋白优选地为HBcAg蛋白。

在本发明的一个实施方案中，所述HBcAg蛋白为HBcAg的1-149aa构成的蛋白。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求本发明任一项所述的中和表位多肽、和/或一种或多种本发明任一项所述的中和表位多肽偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的中和表位多肽或者本发明任一项所述的中和表位多肽偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防和/或诊断EV71病毒所致疾病特别是手足口病的药物或者抗EV71病毒的药物中的用途；具体地，所述药物为疫苗。

本发明的再一方面涉及一种杂交瘤细胞株A15B3，其保藏编号为CCTCC NO:C201226，保藏日期为2012年2月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学(邮编430072)。

本发明的再一方面涉及一种杂交瘤细胞株BB1A5，其保藏编号为CCTCC NO:C201228，保藏日期为2012年2月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学(邮编430072)。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的杂交瘤细胞株产生抗体。具体地，所述抗体为单克隆抗体。

本发明的再一方面涉及一种抗体，其能够特异性地结合本发明任一项所述的中和表位多肽或者本发明任一项所述的中和表位多肽偶联物；具体地，所述抗体为单克隆抗体或中和抗体；更具体地，为广谱中和单克隆抗体。

术语“广谱中和单克隆单抗”是指由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体，并且能与不同基因型的病毒结合后消除病毒感染，在杀灭细胞外的游离病毒中起主要作用，其作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖。

在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。

根据本发明任一项所述的抗体，其为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，例如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。

本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为本发明任一项所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防和/或诊断EV71病毒所致疾病特别是手足口病的药物或者抗EV71病毒的药物中的用途。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或诊断EV71病毒所致疾病特别是手足口病的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的中和表位多肽或者本发明任一项所述的中和表位多肽偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物或者本发明任一项任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物的步骤。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抗EV71病毒的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的中和表位多肽或者本发明任一项所述的中和表位多肽偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物或者本发明任一项任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物的步骤。

本发明中，术语“手足口病”，具体地，为肠道病毒71型(EV71)引起的手足口病。

在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。

在本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

发明的有益效果

本发明的中和表位多肽具有良好的中和活性和免疫原性，具有应用于治疗和/或预防和/或诊断EV71病毒所致疾病特别是手足口病的药物的潜力。

附图说明

图1：EV71-VP2分段融合GST标签表达的示意图。

图2：EV71病毒4个衣壳蛋白与广谱中和抗体A15B3之间的SDS-PAGE电泳图(泳道1-4)和蛋白印迹(Western Blotting)图(泳道5-8)，其中泳道1、5的样品为EV71-VP0；泳道2、6的样品为EV71-VP1；泳道3、7的样品为EV71-VP2；泳道4、8的样品为EV71-VP3。

图3：融合蛋白EV71-1-151aa-GST、EV71-140-254aa-GST样品与广谱中和抗体A15B3之间的SDS-PAGE电泳图(泳道1、2)和蛋白印迹(Western Blotting)图(泳道3、4)，其中泳道1、3的样品为EV71-1-151aa-GST的大肠杆菌全部溶胞产物；泳道2、4的样品为EV71-140-254aa-GST的大肠杆菌全部溶胞产物。

图4：显示合成肽EV71-1、2、3、4、5、6、7、8、9与广谱中和抗体A15B3之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度矩形图。

图5：pTO-T7-C149的质粒示意图。

图6：EV71-C149-141-155aa重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图(放大25,000倍)。

图7：显示EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3与广谱中和抗体A15B3之间的SDS-PAGE电泳图(泳道1、2、3)和蛋白印迹(Western Blotting)图(泳道4、5、6)，其中泳道1、4的样品为EV71-C149-1的大肠杆菌全部溶胞产物；泳道2、5的样品为EV71-C149-2的大肠杆菌全部溶胞产物；泳道3、6的样品为EV71-C149-3的大肠杆菌全部溶胞产物。

图8：展示肽免疫血清的体内治疗效果评价(小鼠生存曲线)。HBc(aa1-149)免疫对照组小鼠，出现消瘦症状，攻毒后6天出现后肢瘫痪症状，攻毒后7天大部分小鼠死亡。各展示肽(EV71-F1、EV71-F2、EV71-F3、EV71-F4、EV71-F5、EV71-F6)实验组体症正常，未见异常，20天内均为100％生存率(6条展示肽的曲线重合)。说明展示肽免疫血清可保护小鼠免受EV71的侵染。

涉及保藏的生物材料：

杂交瘤细胞株A15B3，其保藏编号为CCTCC NO:C201226，保藏日期为2012年2月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学(邮编430072)。

杂交瘤细胞株BB1A5，其保藏编号为CCTCC NO:C201228，保藏日期为2012年2月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学(邮编430072)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：广谱中和单抗的制备和鉴定

1.广谱中和单抗的制备

制备单抗的免疫原为热灭活的EV71毒株JS06-52-3，制备的方法步骤见参考文献Chen,Y.,et al.Broad cross-protection against H5N1avian influenza virus infection by means of monoclonal antibodiesthat map to conserved viral epitopes.The Journal of infectiousdiseases 199,49-58(2009).

制得970株能够产生EV71特异性单抗的杂交瘤细胞株。

2.广谱中和单抗的中和活性鉴定

利用基于ELISPOT的EV71高通量中和实验方法(参见中国专利申请200910143481.0)，对上面制得的970株能够产生EV71特异性单抗的杂交瘤细胞株的中和活性进行鉴定,中和活性鉴定的方法步骤如下：

(1)将培养在含10％FBS(PAA)的MEM(GIBCO)培养基密度的RD细胞以4×10⁵/mL的密度铺于96孔细胞培养板(NUNC)中，4×10⁴/孔；

(2)10小时后将单克隆抗体样品用无血清MEM进行连续稀释，以单抗原液起点，进行10倍比稀释，稀释5个梯度；

(3)各取50μL分别与50μL稀释于无血清MEM的EV71(JS-06-52-3)病毒(1500TCID50)混合，37℃混合孵育1小时；

(4)加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中；

(5)培养14小时后进行酶联免疫斑点反应：吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST(含有0.05％吐温-20的PBS溶液)溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标试剂，放置于37℃中反应1h，其中EV71单抗标记物为H5D6-HRP(1.9mg/mL，单抗的制备方法如上参考文献)，用酶稀稀释10000倍使用；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL TMB显色液(SIGMA)，放置在37℃中显色15min；15min后吸弃板中的显色液终止显色；启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器(美国CTL公司)的操作说明书；

(6)实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5个孔)和只进行EV71病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5个孔)；

(7)中和效价的判定方法：抗体中和效价的定义为：以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该单克隆抗体样品的中和效价；

(8)感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％，其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。)。

结果显示，其中2株对JS06-52-3毒株具有中和活性，分别命名为A15B3和BB1A5。

3.中和活性的进一步鉴定

进一步考察杂交瘤细胞株A15B3和BB1A5对不同亚型的5株代表性EV71毒株(如表1)的中和活性，鉴定方法参照上面“2.广谱中和单抗的中和活性鉴定”。

结果如表1所示。

表1：EV71特异性单克隆抗体对不同亚型代表性EV71毒株的中和活性

表1数值所表示为各单抗针对不同毒株EV71病毒的中和活性滴度。由表1可知，2株单抗(A15B3和BB1A5)对部分代表株(表1中的5株毒株)均有中和活性，故均为广谱中和活性单抗。

由此制得A15B3和BB1A5的单抗。

上述五种亚型病毒的GenBank登录号如下：

06-02203(B4)：JF420549。

TW08-05535(B5)：JN964686。

TW08-03149(C2)：JF420552。

JS06-52-3(C4)：FJ600325。

TW08-02969(C5)：JF420554。

实施例2：广谱中和抗体的治疗效果评价

本发明人利用EV71的鼠适应株攻毒模型(将B3亚型的原代EV71毒株pSVA(Genebank登录号：AB469182)通过颅腔注射方式感染新生BALB/c乳鼠，3日后取出脊髓，匀浆后在RD细胞中培养两代，再重新通过颅腔注射新生BAB/c乳鼠，如此反复四次获得四代鼠适应株pSVA-MP4。将pSVA-MP4在RD细胞中培养四代使滴度达到10⁷TCID₅₀以用于后续攻毒试验。)评价抗体的治疗效果，对1日龄新生BALB/c乳鼠采用腹腔攻毒方式感染10⁷TCID₅₀的pSVA-MP4，24h后通过腹腔注射60μg/g的BB1A5抗体，对照组注射同等体积的PBS缓冲液。每组设置两笼重复，攻毒后20天内每天监测乳鼠的体重变化及症状表现。结果显示，PBS对照组在攻毒后4天开始发病，并陆续表现出萎靡、肢体无力、瘫痪等症状并最终死亡；而BB1A5组在监测期内均没有出现任何异常症状及死亡。说明BB1A5在EV71攻毒后一天注射能够起到100％的治疗效果。

实施例3：广谱中和抗体的主动保护评价

在BB1A5的主动保护实验中，本发明人对1日龄新生BALB/c乳鼠通过腹腔注射60μg/g的BB1A5抗体，对照组注射等体积的PBS缓冲液，4h后通过腹腔攻毒方式感染10⁷TCID₅₀的pSVA-MP4。每组设置两笼重复，攻毒后20天内每天监测乳鼠的体重变化及症状表现。结果显示，PBS对照组在攻毒后4天开始发病，并陆续表现出萎靡、肢体无力、瘫痪等症状并最终死亡；而BB1A5组在监测期内均没有出现任何异常症状及死亡。说明提前注射60μg/g BB1A5对EV71攻毒能够起到完全预防效果。

实施例4：识别广谱中和抗体的多肽的筛选(1)

非融合地表达EV71病毒VP0、VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，并对VP2进行分段表达融合蛋白，用来考察A15B3和BB1A5中和单抗对亚基区段的定位。

其中，由于VP4亚基蛋白分子量较小，所以本发明人表达VP0(VP4+VP2)。其中，对EV71病毒VP2衣壳蛋白进行分段融合GST标签表达，分别为1-151aa和140-254aa肽段；其中由于分段表达区段的蛋白分子量较小，所以采用融合GST标签表达。

1.EV71病毒4个衣壳蛋白及VP2分段蛋白的表达质粒的构建

以EV71病毒VP2衣壳蛋白为例，其氨基酸序列(GenBank No.BAJ78276.1)如下：

SPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIIVGYGEWPSYCSDSDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLDTKLWEKSSKGWYWKFPDVLTETGVFGQNAQFHYLYRSGFCIHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVIGTVAGGTGTEDSHPPYKQTQPGADGFELQHPYVLDAGIPISQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYINALPFDSALNHCNFGLLVVPISPLDYDQGATPVIPITITLAPMCSEFAGLRQAVTQ(SEQ IDNO：17)

VP2衣壳蛋白的核苷酸序列参考EV71C4亚型(JS-06-52-3)毒株(GenBank No.FJ600325)。

其它衣壳蛋白的核酸序列亦见EV71C4亚型(JS-06-52-3)毒株(GenBank No.FJ600325)。

具体步骤如下：

从本实验室分离保存的EV71C4亚型(JS-06-52-3)毒株中提取RNA，进行反转录后得到的产物回收、纯化、鉴定后作为模板，分别使用表2所列引物(由上海博亚公司进行合成)进行PCR扩增。

PCR扩增体系和条件如下：

在50μL PCR反应体系中,ddH2O:39μL；10×反应缓冲液5μL；MgCl₂3μL；模板1μL；上下游引物0.5μL；下游引物0.5μL；dNTP0.5μL；Taq酶0.5μL。PCR反应条件为:94℃,5min；(94℃,30s；56℃,45s；72℃,45s)25个循环；72℃,10min。

PCR所用引物如表2所示。

扩增出的序列VP0、VP1、VP2和VP3经Nde I和Hind III双酶切以及EV71-VP2-1-151aa(克隆1)、EV71-VP2-140-254aa(克隆2)经BamHⅠ和EcoRⅠ(均购自日本TAKARA公司)双酶切后回收纯化得到片段。

同时以Nde I和Hind III双酶切载体pTO-T7(构建方法参考文献罗文新,张军,杨海杰等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报,2000,16(5):578-581.)，以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切载体pGEX-20T(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)，回收载体后与片段连接。

连接物转化大肠杆菌ER2566(购自NEB公司)进行表达鉴定及质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒即插入所需的目的片段，分别命名为EV71-VP0、EV71-VP1、EV71-VP2、EV71-VP3、EV71-VP2-1-151aa、EV71-VP2-140-254aa(示意图见图1)。

2.EV71病毒4个衣壳蛋白及VP2分段蛋白的表达

分别将含有上述六种表达质粒的ER2566菌种，接种于4mL含有硫酸卡那霉素(购自AMRESCO公司)的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按1:1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有硫酸卡那霉素)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG 500μL，37℃诱导5h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用10mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件为：工作时间：5min/瓶；脉冲：打2sec，停4sec；输出功率：60％。12000rpm离心10min，保留沉淀，得到表达的蛋白。

3.EV71病毒4个衣壳蛋白的电洗脱纯化

(1)配大板SDS-PAGE胶：①架板，并用夹子将两块玻璃板固定，同时用透明胶封底；②配胶70mL，加APS和TEMED前用吸管吸出5mL，加100μLAPS和25μLTEMED制成快胶以封底；③将剩余65mL制成分离胶，待胶凝后，将之灌入并用酒精或水封胶；④配上层胶12mL，待分离胶凝后，灌入并用酒精压胶；

(2)SDS-PAGE分离目的蛋白：将待分离蛋白制成SDS-PAGE样，上样分离(5-10mL样品/板)，先80V跑2h，再120V跑14-16h，待样品跑到底部后，取胶分离；

(3)切胶：①根据折光效果，用小刀轻划出目的蛋白带的下沿；②从胶中间延与划出下沿垂直的方向切出一小胶条，并尖切上角做方向标记，用CuCl₂染色(26.2g CuCl₂溶于500mL水中)；③将小胶条放回，并参照染色结果切下目的带；

(4)电洗脱：将切下的胶条放入洗净的培养皿中，用超纯水将残渣洗掉，然后切成小块，并装于透析袋中，加适量电解液，水平放入电泳槽中，1h后第一次收样，换新电解液，4h后第二次收样。

另外，由于采用表达空质粒的大肠杆菌诱导的全部溶胞产物作为阴性对照，VP2分段蛋白无需纯化。

4.EV71病毒4个衣壳蛋白及VP2分段蛋白的SDS-PAGE鉴定和蛋白印迹鉴定

将EV71病毒4个衣壳蛋白及VP2分段蛋白EV71-VP2-1-151aa(克隆1)、EV71-VP2-140-254aa(克隆2)经SDS-PAGE鉴定和蛋白印迹(Western Blotting)鉴定，步骤如下：

将上述融合蛋白样品分别进行SDS-PAGE电泳，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维膜上，35mA恒压转移30min。将膜用水稍做漂洗，按每平方厘米膜0.1ml加入封闭液，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h。按每平方厘米膜0.1ml加入用封闭液稀释的A15B3单克隆抗体鼠腹水纯化样品(1:1000)，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.1ml加入用封闭液稀释的酶标二抗，密封于干净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.1ml加入底物溶液，室温轻摇温育，待蛋白显色至一定程度时，立即将膜转移至PBS中终止反应，结果见图2和图3。

由图2，广谱中和单抗A15B3只能与EV71-VP0、EV71-VP2反应(泳道5、7)，说明中和表位位于EV71-VP2衣壳蛋白。

由图3，泳道1、2为SDS-PAGE电泳图，说明两个区段的蛋白表达量相当。泳道3、4为其对应的蛋白印迹鉴定，泳道4的带比泳道3强，即EV71-VP2-140-254aa区段反应活性较EV71-VP2-1-151aa区段强。因此，广谱中和表位可能存在于EV71病毒VP2的140-254aa区段。

实施例5：识别广谱中和抗体的多肽的筛选(2)

1.EV71-1、EV71-2、EV71-3、EV71-4、EV71-5、EV71-6、EV71-7、EV71-8、以及EV71-9的设计与合成

根据EV71-VP2的氨基酸序列，设计合成了横跨105-254aa肽段的9条合成肽(表3)，编号为:EV71-1、EV71-2、EV71-3、EV71-4、EV71-5、EV71-6、EV71-7、EV71-8、EV71-9(由上海博亚公司进行合成)。其氨基酸序列和在VP2上的位置分别如下面的表3所示。

将上述9条合成肽分别以1μg/孔的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用封闭液(20mM PB7.4含150Mm NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。

2.HRP对中和单抗的NaIO₄标记

将单克隆抗体A15B3(因为用一株单抗确定中和表位区段即可，所以本发明人只使用广谱中和单抗A15B3进行鉴定)于4℃透析至20MmCB溶液中，换液2次；用超纯水分别将HRP干粉和NaIO₄干粉溶解至20mg/ml，并按1：1混匀(动作要轻，上下颠倒即可，4℃，30min避光)；终止HRP，乙二醇缓慢滴入轻微振，室温，避光30min；将抗体加入HRP中，避光透析至CB缓冲液，换液2次；加入浓度20mg/ml的NaBH₄终止酶标过程，4℃静置2h，每30min摇动1次；最后用PBS(10mM，pH7.2)透析过夜。得到将广谱中和抗体酶标记物A15B3-HRP。

3.广谱中和表位或者含广谱中和表位的多肽的筛选

将上面得到的广谱中和抗体酶标记物A15B3-HRP以1:1000稀释(稀释液配方同封闭液)后加100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值，结果见图4。

由图4结果可知，所有肽段中仅EV71-2(VP2:120-149aa)和EV71-3(VP1：135-164aa)能识别广谱中和单抗A15B3，而且针对135-164aa肽的反应性明显较120-149aa肽为强，说明广谱中和表位可能存在于EV71病毒VP2的135-164aa区段，该区段的序列如下：

VAGGTGTEDSHPPYKQTQPGADGFELQHPY(SEQ ID NO：7)。

实施例6：识别广谱中和抗体的多肽的筛选(3)

一、EV71-3的分段蛋白(EV71-VP2表面多肽)与HBV cAg蛋白的融合表达

1.pTO-T7-C149表达载体的构建

本领域人员知悉，HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayor immunodominant region，78-83aa)的融合不会改变其颗粒的多聚特性、抗原活性和免疫原性，且可使外源表位暴露于颗粒表面(参考文献Fu,T.M.,K.M.Grimm,et al.(2009)."Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines inmice and monkeys."Vaccine 27(9):1440-1447；Jin,H.,W.Xiao,et al.(2007)."Protective immune responses against foot-and-mouth diseasevirus by vaccination with a DNA vaccine expressing virus-likeparticles."Viral Immunol 20(3):429-440；和Yin,Y.,J.Xu,et al.(2010)."[Hepatitis B virus core protein as an epitope vaccine carrier:a review]."Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 26(4):431-438.)。

HBcAg的1-149aa在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达，其氨基酸序列参见GenBank No.AF23323，具体如下：

HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQ ID NO：38)；

其对应的核苷酸序列如下：

catATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCTTTGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA(SEQ ID NO：39)。

利用HBcAg的1-149aa(其)在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本发明人将该149氨基酸插入大肠杆菌表达载体pTO-T7(此载体的制备步骤见参考文献罗文新，张军，杨海杰，等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报，2000，16(5):578-581)(也可以使用其它本领域常用的大肠杆菌表达载体)中，并以连接子(GGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGG，SEQ IDNO：40)替代HBcAg B细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸(其对应氨基酸为PA)，并在265nt－270nt处引入GGATCC，274nt－279nt处引入GAATTC(相对pTO-T7-C149)以引入两个限制性内切酶识别位点(BamHⅠ和EcoRⅠ)构建了突变型HBc表达质粒pTO-T7-C149。外源蛋白在C149第93个氨基酸处插入。如图5。

2.EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3蛋白序列的设计

以EV71病毒VP2的135-164aa区段为母区段，设计了3条多肽。将该3条多肽分别插入HBcAg蛋白中，得到的融合蛋白分别称为EV71-C149-1、C149-2、C149-3，插入片段的起止位点和所用PCR引物如表4。

3.表达EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3蛋白的重组宿主细胞的构建

将从EV71C4亚型(JS-06-52-3)毒株中提取的RNA进行反转录后得到的产物回收、纯化、鉴定后作为模板，分别应用表4所列引物(该引物合成由上海博亚公司进行)进行PCR扩增(克隆构建的具体方法步骤参照实施例4)，扩增出的序列经BamHⅠ和EcoRⅠ(均购自日本TAKARA公司)双酶切后回收纯化得到片段。同时以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切载体pTO-T7-C149，回收载体后与片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566，进行表达鉴定及质粒酶切鉴定(同时以pTO-T7-C149为空白对照)，鉴定正确的质粒即插入所需的目的片段，分别命名为C149-136-155、C149-136-150、C149-141-155。

以C149-141-155为例，相应融合蛋白的氨基酸序列为：HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSTEDSHPPYKQTQPGAEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQ ID NO：47，其中斜体为插入的片段)。

4.EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3融合蛋白的表达、纯化、及自组装

将分别含有上述三种表达质粒的ER2566菌以及含pTO-T7-C149空质粒的ER2566菌，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按1:1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有硫酸卡那霉素)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG 500μL，25℃诱导6h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用10mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件：工作时间：3min/瓶；脉冲：打2sec，停5sec；输出功率：60％。12000rpm离心10min，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白均为上清表达。

由于表达上清中含有很多杂蛋白，本发明人采用以下方式进行纯化并促进蛋白自发组装形成颗粒：将超声离心后得到上清至于65℃水浴中热变性30min，12000rpm离心10min。然后将纯化后的蛋白在20mM PB6.0含0.3M NaCl的条件下促进蛋白自发组装形成颗粒，再进行电镜观察，组装成功的颗粒呈均匀的空心球体，见图6(仅以EV71-C149-3为代表，其它融合蛋白与此类似)。

二、融合蛋白EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3的活性鉴定

将上面制得的三种融合蛋白样品(EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3)进行SDS-PAGE电泳，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维膜上，35mA恒压转移30min。将膜用水稍做漂洗，按每平方厘米膜0.1ml加入封闭液，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h。按每平方厘米膜0.1ml加入用封闭液稀释的相应融合蛋白的单克隆抗体腹水纯化样品(腹水纯化的A15B3鼠单克隆抗体)(1:1000)，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.1ml加入用封闭液稀释的酶标二抗，密封于干净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.1ml加入底物溶液，室温轻摇温育，待蛋白显色至一定程度时，立即将膜转移至PBS中终止反应，结果见图7。实验过程中都用没有插入外源蛋白的HBcAg作为对照，其没有活性。由图7的结果可知，仅EV71-C149-1(VP2:136-155aa)和EV71-C149-3(VP2：141-155aa)能识别上述两株广谱中和单抗，说明该广谱中和表位可能存在于EV71病毒VP2的141-155aa区段，该区段的序列为：TEDSHPPYKQTQPGA(SEQID NO：1)。另外，EV71-C149-1(VP2:136-155aa)也包含该区段，其氨基酸序列为AGGTGTEDSHPPYKQTQPGA(SEQ ID NO：8)。

实施例7：EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3融合蛋白 的免疫原性分析

将实施例6的经过纯化并组装的三种融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫5只(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂(购自Sigma)，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂(购自Sigma)，共加强三针，在第三针加强后的第11天采血，并采用ELISPOT的EV71高通量中和实验方法进行EV71C4亚型(JS-06-52-3)毒株中和检测。实验过程中都用没有插入外源蛋白的HBcAg作为对照(C149对照)，其没有活性。结果如下面的表5。

表5：EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3融合蛋白免疫鼠血清对EV71毒株的中和活性

结果显示，三种展示肽免疫的小鼠血清均对EV71毒株具有一定的中和活性，中和滴度在1/32-1/128之间。

实施例8：中和表位多肽与HBV cAg蛋白的融合表达及活性鉴定

以EV71病毒VP2的141-155aa(SEQ ID NO：1)区段为母区段，分别从N端和C端同时递增一个氨基酸，设计了6条多肽(表6)，用以鉴定中和表位的活性序列。将5条多肽分别插入HBcAg蛋白中，得到的融合蛋白分别称为EV71-F1、EV71-F2、EV71-F3、EV71-F4、EV71-F5、EV71-F6。上述融合蛋白的表达载体的构建方法与EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3融合蛋白表达载体的构建方法相同。通过PCR产物双酶切回收纯化后，连接构建的载体pTO-T7-C149，构建成表达质粒(具体方法参照实施例4和6)。

上述构建的6个融合蛋白表达和纯化与EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3融合蛋白的表达、纯化方法相同(具体方法详见实施例6)。

ELISA法检测EV71-F1、EV71-F2、EV71-F3、EV71-F4、EV71-F5、EV71-F6融合蛋白活性。

将上述6条展示多肽分别以1μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150Mm NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。将广谱中和抗体酶标记物A15B3-HRP以1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000四个10倍梯度稀释后(稀释液配方同封闭液)各加100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值，结果可知融合蛋白EV71-F1、EV71-F2、EV71-F3、EV71-F4、EV71-F5、EV71-F6对A15B3有较好的反应性。实验过程中都用没有插入外源蛋白的HBcAg作为对照，其没有活性。

实施例9：EV71-F1、EV71-F2、EV71-F3、EV71-F4、EV71-F5、 EV71-F6融合蛋白的免疫原性分析

将实施例8中经过纯化并组装(组装步骤参照实施例6)的六种融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫4只(以EV71-F1多肽为例，小鼠编号为：F11、F12、F13、F14)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂，共加强三针，在每次加强前均对小鼠采血(编号为S1-S4)，并在第三针加强后的第11天采血进行EV71中和检测(采用ELISPOT的EV71高通量中和实验方法)，展示肽免疫的小鼠血清对EV71毒株具有一定的中和活性。

同时，本发明人从EV71-F1融合蛋白免疫鼠中选取1-3的小鼠血清S4，对C2、C4和B5等不同亚型的EV71毒株进行中和检测。实验过程中都用没有插入外源蛋白的HBcAg作为对照，其没有活性，中和滴度结果如表7所示。

表7：EV71-F1融合蛋白免疫鼠血清对不同EV71毒株的中和活性

结果显示，各展示肽(EV71-F1、EV71-F2、EV71-F3、EV71-F4、EV71-F5、EV71-F6)免疫的小鼠血清对不同亚型的EV71毒株均具有一定的中和活性。

实施例10：展示肽免疫的小鼠血清的治疗效果评价

为了验证展示肽免疫母鼠产生的多抗血清的治疗效果，本发明人分别将实施例9中的六种融合蛋白的多抗血清，其中效价为1:32，通过腹腔方式注射1日龄新生BALB/c乳鼠，每只注射50μl体积，对照组则注射相同体积的HBc(aa1-149)血清；4h后通过腹腔攻毒方式感染10⁷TCID₅₀的pSVA-MP4。每组设置两笼重复，攻毒后20天内每天监测乳鼠的体重变化及症状表现。结果显示，HBc(aa1-149)对照组在攻毒后4天开始发病，并陆续表现出萎靡、肢体无力、瘫痪等症状并最终死亡；而展示肽免疫组在监测期内均没有出现任何异常症状及死亡，说明展示肽免疫的抗血清对EV71攻毒能够起到100％治疗效果，结果见图8。

实施例11：展示肽免疫的小鼠血清的主动保护评价

本发明人分别将实施例9中的六种融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫(具体方法参照实施例9)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂，共加强三针，在每次加强前均对小鼠采血(编号为S1－S4)，并在第三针加强后交配；对照组则按照相同程序免疫HBc(aa1-149)。待S6－S7期乳鼠出生，将10⁷TCID₅₀的pSVA-MP4通过腹腔攻毒方式感染1日龄新生BALB/c乳鼠。每组设置两笼重复(n＝8－12)，攻毒后20天内每天监测乳鼠的体重变化及症状表现。结果显示，HBc(aa1-149)对照组在攻毒后4天开始发病，并陆续表现出萎靡、肢体无力、瘫痪等症状并最终死亡；而融合蛋白组在监测期内均没有出现任何异常症状及死亡，说明展示肽免疫对EV71攻毒能够起到预防效果。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株BB1A5，其保藏编号为CCTCCNO:C201228，保藏日期为2012年2月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的抗体。

3.一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为权利要求2所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。

4.一种药物组合物，其包含权利要求2所述的抗体或者权利要求3所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

5.一种试剂盒，其包含权利要求2所述的抗体或者权利要求3所述的抗体偶联物。

6.权利要求2所述的抗体或者权利要求3所述的抗体偶联物或者权利要求4所述的药物组合物在制备治疗和/或预防和/或诊断EV71所致疾病特别是手足口病的药物或者抗EV71病毒的药物中的用途。

7.一种在体内或体外抗EV71病毒的方法，包括使用有效量的权利要求2所述的抗体或者权利要求3所述的抗体偶联物或者权利要求4所述的药物组合物的步骤。