CN101948510A - 一种o型口蹄疫病毒vp2抗原表位的分子模拟肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物传染病预防及疫苗研制领域。世界各国非常重视口蹄疫防控措施的研究，本发明公开了O型口蹄疫病毒VP2蛋白的一个模拟表位肽。本发明利用噬菌体表面展示技术筛选有效的口蹄疫病毒表位，提供了一种O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的一个分子模拟肽。它是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：序列表中的SEQ ID No：1。本发明还提供该模拟肽在制备免疫原、猪口蹄疫表位肽疫苗中的应用，能起到预防O型口蹄疫病毒感染的作用，具有良好的经济效益。

Description

一种O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽及其用途

技术领域

本发明涉及动物传染病预防和疫苗研制领域，具体涉及一种能模拟O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的短肽，以及该短肽在制备免疫原、猪O型口蹄疫疫苗上的应用。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播途径多、传播速度快，曾多次在世界范围内发生大流行。虽然该病的死亡率不高(幼畜除外)，但造成动物生产性能下降，扑杀动物花费大量的人力、物力和财力，影响国际贸易，经济损失惨重。如1997我国台湾、2000年日本和韩国、2001年英国暴发的口蹄疫可以说给这些地区或国家畜牧经济造成了致命的打击。为此，世界各国非常重视口蹄疫防控措施的研究。

该病的致病病原体为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)，属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型，各型之间无交叉保护反应。疫苗接种是特异性预防口蹄疫的可靠和有效手段。虽然目前使用的口蹄疫病毒弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制口蹄疫病毒的过程中发挥着重要作用，但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒在工厂制备时逃逸等不安全因素，世界上一些地区口蹄疫的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关，促使人们寻求一种更加安全有效的口蹄疫疫苗。

噬菌体表面展示技术是上世纪九十年代初发展起来的一种新的基因操作技术，它使表达的外源肽与噬菌体表面特定蛋白融合并展示于其表面，被展示的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物特性，借以研究多肽的性质、相互识别和作用，并据此从巨大的展示肽库中选择出具有特定功能的多肽(噬菌体展示肽库技术及其应用研究现状，中国病原生物学杂志，2007，2(2)：152-154)。

由于抗原在体内诱导免疫反应的过程中起决定作用的结构是抗原表位，而通常表位的长度不过几个到几十个氨基酸，因此以抗原表位为免疫原的疫苗设计是基因工程疫苗的一种重要形式。多肽表位使靶分子的抗原性与毒性作用分离，疫苗载体表面仅展示抗原表位肽段，不存在完整的靶分子结构，也不具有完整的靶分子功能。但是，传统的蛋白质抗原表位分析方法主要是通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段，并以此间接推测抗原表位分布区域及构成表位的关键氨基酸(Mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein of the severe acute respiratory syndrome coronavirus.J Clin Microbiol.2004 Nov；42(11)：5309-14.蛋白质B细胞抗原表位测定方法的研究进展，黑龙江畜牧兽医，2008，7：23-24)。此方法筛选出的表位为线性表位，而天然完整蛋白质的抗原表位中，仅10％为线性抗原表位，90％是构象型表位，因此传统方法筛选的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位，难以形成构象表位。而且这种方法存在工作量大，工作效率低，成本高等缺陷。

虽然，早在1982年，Bittle和Pfaff等就利用免疫原性多肽首次确定了位于FMDV结构蛋白VP1第140～160位氨基酸之间的G2H环内含有一个免疫原性位点，称之为siteA，是最主要的抗原位点；Krebs和Baxt等进一步研究发现，O型FMDV的VP1变异主要发生在140～160位和200～211位两段抗原表位区，这两个肽段是决定免疫原性的抗原决定簇，但是以这些抗原表位区构建或合成的表位疫苗均无法在仔猪体内诱导高效的免疫应答(Induction of an antigen-specific immune response and partial protection ofcattle against challenge infection with foot-and-mouth disease virus(FMDV)afterlipopeptide vaccination with FMDV-specific B-cell epitopes.JGen Virol.2003；84(Pt 12)：3315-24.)。另有报道位于VP2的70～78位氨基酸和131-134位氨基酸也是B细胞表位(Sequence analysis of monoclonal antibody resistant mutant s of type Ofoot2and2mouth disease virus：evidence for the involvement of the three surfaceexposed cap sid proteins in four antigen sites.J Virol，1990，179：26～34.)，但未有诱导有效免疫保护的报道。因此在口蹄疫病毒外壳蛋白(VP1、VP3、VP2和VP4)中筛选出能诱导有效免疫应答和保护效果的抗原表位将极大地促进口蹄疫疫苗的研制。

而噬菌体表面展示技术，是一种抗原多肽筛选的简便有效、成本低廉的方法。噬菌体展示技术筛选到的多肽与普通的线性多肽相比扩大了疫苗靶分子选择范围。因为该技术筛选的模拟抗原表位不仅可以模拟多肽、蛋白质的线性表位，还能模拟空间表位以及多糖、寡核苷酸等抗原性较弱的抗原位点，从而以此设计的表位疫苗可能诱导更为有效的免疫应答。

目前，基因工程疫苗在许多疫病的控制中已经发挥了重要作用。但是，可接近或超过口蹄疫灭活疫苗免疫保护效果的FMDV基因工程疫苗尚缺乏，若能筛选获得具有FMDV中和活性的FMDV模拟表位，将有利于研制更为有效的基因工程疫苗。

本申请人已于2008年10月28日申请了中国发明专利申请200810201859.3，发明名称为“一种O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽及其用途”，是针对O型口蹄疫病毒VP1抗原表位的。

发明内容

本发明的目的是筛选出一种O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽，并提供该短肽在制备免疫原、猪口蹄疫表位肽疫苗中的应用。

本发明利用噬菌体表面展示技术来筛选有效的FMDV表位，筛选的结果为本发明提供了一种O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽，所述肽的氨基酸序列如下所示：

KGYDQELATSPE(SEQ ID NO：1)

上述O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽为12个氨基酸的短肽。

本发明提供的是具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的短肽。

本发明的O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽，是用以下方法筛选得到的：

以O型FMDV感染的猪血清IgG为靶蛋白，从噬茵体展示的随机线形十二肽库(NewEngland Biolabs公司)中筛选到与VP2蛋白结合的短肽。

上述短肽可通过本发明技术领域中的常规技术如化学合成等方法制备。

将本发明公开的短肽序列与GeneBank中已公布的FMDV的蛋白序列进行比较，未发现有同源性，这些短肽可部分抑制天然抗原与多抗的结合，说明它们在结构上能模拟天然抗原表位，为一种新的抗原表位的分子模拟肽。

本发明还提供了上述O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽在制备免疫原上的应用。

本发明还提供了上述O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽在制备猪口蹄疫表位肽疫苗中的应用。

将上述分子模拟肽与乙肝病毒核心蛋白类病毒颗粒HBc-VLP融合表达。经原核表达纯化后做为免疫原，免疫接种小鼠，获得了特异识别O型FMDV的抗体，说明该表位肽构成免疫原后可以诱导机体免疫系统产生针对O型FMDV的抗体。利用本发明的短肽，可以提供一种研制新型FMDV疫苗的途径，该表位肽疫苗具有靶分子的抗原性而不具有毒性，十分安全，且大规模生产成本很低，具有良好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1阳性噬菌体抗原竞争抑制试验

图2重组表达载体pBAD-epitope的酶切鉴定

其中：1.DL 2000分子量标记；2.DL 15000分子量标记；3.重组质粒pBAD-epitope经Nco I和Xho I酶切

图3融合表位的HBc嵌合蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳结果及Western分析结果

其中：M是分子量标记；1～4是E.coli转入pBAD-epitope重组质粒后的诱导表达结果；C是阴性对照；W为Western分析结果

图4pBAD-epitope表达的重组嵌合蛋白形成病毒样颗粒的电镜下颗粒观察结果(放大倍数：×5,000)

图5重组蛋白免疫Balb/C小鼠诱导FMDV病毒特异性抗体的产生

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：猪O型口蹄疫病毒VP2抗原模拟表位的筛选及序列分析

一、实验材料

1.噬菌体随机肽库试剂盒

噬菌体表面衣壳蛋白III展示的线形12肽库试剂盒购自美国New England Biolabs公司。肽库的滴度4×10¹²pfu/ml，随机多样性1.9×10⁹；受体菌E.coli ER2537基因型为F’lac^qΔ(1acZ)M15proA+B+fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk^-mk^-McrBC)。

2.化学试剂

BSA购自Roche公司；IPTG、X-gal购自Bebco公司；PEG8000、PEG20000、ABTS、Tween20购自Sigma公司；口蹄疫ELISA检测试剂盒为中国农业科学院兰州兽药研究所生产；HRP标记的抗M13单克隆抗体、DEAE sephadex A50购自Pharmacia公司；猪O型FMDV-VP2核酸疫苗载体(pcDNA3-VP2)由本实验室构建，其中pcDNA3载体购自Invitrogen公司；VP2序列根据NCBI数据库中口蹄疫病毒NY00株的序列合成(AY333431)；猪O型口蹄疫阳性抗血清由本室经接种仔猪以O型口蹄疫病毒NY00株病毒后获得。

3.相关试剂的配制

PB缓冲液：0.02mol/L Na₂HPO₄，0.02mol/L NaH₂PO₄；

TBS缓冲液：50mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA，高压灭菌；

PEG/NaCl：20％(w/v)PEG 8000，2.5mol/L NaCl，高压灭菌；

碘化钠缓冲液：10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA，4mol/L NaI；

低盐LB培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g和NaCI 5g溶解于蒸馏水并定容至1L，高压灭菌；

顶层琼脂糖：LB培养基+1g/L MgCl₂·6H2O+7g/L琼脂糖，高压灭菌；

底层LB/IPTG/X-gal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃时，加入IPTG和X-gal(终浓度分别为50μg/ml，40μg/ml)，铺平板。

二、方法

1.IgG的分离与纯化

对仔猪接种pcDNA3-VP2疫苗质粒后的VP2抗血清和猪FMDV感染血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行IgG粗提，PBS(0.01mol/L，pH7.4)缓冲液透析48h后用PEG 20000进行浓缩。将浓缩后的IgG粗提产物上平衡好的DEAE sephadex A50柱，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)缓冲液洗脱，收集洗脱的IgG，透析除盐后，用PEG 20000进行浓缩，紫外分光光度法测定蛋白质浓度，并用ELISA法检测其生物学活性。

FMDV-VP2 IgG和FMDV感染血清的IgG经饱和硫酸铵粗提，DEAE sephadexA50纯化后，用紫外分光光度法测得蛋白质浓度分别为63.25mg/mL和58.66mg/mL；稀释200倍后，ELISA检测IgG与FMDV-VP2蛋白均呈阳性反应。

2.噬菌体随机肽库的筛选

吸取150μL 500倍稀释的纯化FMDV-VP2 IgG(稀释后浓度约100μg/mL)，加入到预冷的微孔板板孔中，parafilm膜封口，4℃过夜。倾掉板孔中的包被液，在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。加200μL封阻缓冲液[0.1mol/L NaHCO₃(pH 8.6)，5mg/mL BSA，0.02％NaN₃]，4℃作用1h。倾去封阻液，TBST洗板6次后，加入100μL TBS稀释的噬菌体文库(含1.8×10¹¹个病毒子和1μL纯化的FMDV感染阴性IgG)，室温孵育1h，倾去未结合噬菌体，TBST缓冲液洗板。加入100μL FMDV-VP2溶液(100μg/mL)，室温洗脱5min，弃去洗脱液，再加入100μL FMDV-VP2溶液，37℃洗脱30min。将洗脱物移入干净微量离心管中，取2μL用于滴度测定，其他用ER2738菌扩增、纯化后，用于下一轮筛选。筛选时设空白对照(记作N)，不包被IgG，其他同试验孔(记作P)。重复上述步骤，共筛选4轮，并通过降低靶分子浓度、延长结合时间、提高TBST中Tween20浓度的方法，逐轮增加选择压力。在第4轮筛选后，洗脱液不再扩增，随机挑取20个蓝色噬菌斑，进行扩增，制备噬菌体贮液，用于进一步研究分析。计算每一轮筛选的回收率和P/N值，分析富集效果。回收率计算方法：回收率(％)＝投入的噬菌体数/回收的噬菌体数×100％.噬菌体滴度测定、洗脱物扩增与纯化，按《PH.D-12^TMPhage Display Peptide Library Kit》操作手册进行。

经过4轮吸附2洗脱2扩增的富集筛选，结果显示，随着筛选轮次的增加，试验组的回收率逐轮提高(1.28×10^-7～3.34×10^-6)，对照组回收率逐轮降低(4.17×10^-8～1.48×10^-8)；而P/N值随着筛选轮次的增加显著提高(7.6～186.3)，表明目的克隆得到了有效富集，非目的克隆被有效剔除。

3.双抗体夹心ELISA鉴定噬菌体阳性克隆

取150μL 500倍稀释纯化的FMDV病毒感染IgG(稀释后浓度约100μg/mL)包被酶标板，为每个待鉴定的噬菌体克隆包被一个板孔，另外包被两个板孔作空白对照和阴性对照，在另一酶标板包被相同浓度的纯化的FMDV感染阴性IgG，置4℃过夜。各孔加满封阻液，4℃封阻1h，TBST洗板6次。将待鉴定的噬菌体贮液用TBS稀释至约10¹²个病毒子/mL，在包被好的酶标板孔中加入100μL，阴性对照板孔中加入含10¹¹个病毒子的原始肽库。37℃作用30min，TBST洗板6次，加入5000倍稀释的HRP标记的抗M13单克隆抗体，37℃作用30min，同样用TBST洗板6次，每孔加入ABTS底物溶液，室温避光放置10～20min后酶标仪测量405nm的OD值，测试样OD大于阴性对照2.1倍视为阳性，与阴性IgG反应呈阳性者视为假阳性。

在经4轮筛选得到的噬菌体克隆中，随机挑取30个蓝色噬菌斑进行扩增，制备噬菌体贮液，经双抗夹心ELISA鉴定结果显示有1个克隆(25#)与纯化后的病毒感染IgG呈OD值较高的阳性反应，且与阴性IgG无交叉凝聚(表1)。

表1双抗夹心ELISA鉴定噬菌体克隆结果

4.抗原竞争抑制ELISA

包被FMDV-VP2阳性IgG，方法同上。4℃过夜，封阻1h，洗板后加入上述步骤中经初步鉴定的含10¹¹病毒子的25#噬菌体贮液与5μg FMDV-VP2蛋白的混合液共100μL，其他ELISA方法同上。测定O.D值，计算抑制率。

公式为：抑制率(％)＝(OD未抑制-OD抑制)/OD未抑制×100％

结果表明25#阳性克隆的检测值表现出显著的受抑现象(图1)，抑制率73％。这种被特异性抗原所抑制的现象说明，在没有被抑制的情况下，阳性噬菌体克隆特异性地结合在IgG的H链可变区的抗原抗体结合部位，而不是非特异性结合。

5.阳性克隆DNA序列推定的短肽序列分析

将经过ELISA鉴定的25#阳性噬菌体克隆扩增，提取ssDNA进行DNA测序，推导出其编码的氨基酸序列，结果如下所示。

25#克隆：KGYDQELATSPE(SEQ ID NO：1)

实施例2：模拟表位肽在疫苗中的应用

一、实验材料：

1.实验动物6-8周龄豚鼠，体重约300克，购自第二军医大学实验动物中心。

2.菌株和基因工程载体：宿主菌为大肠杆菌DH5α和Top10，pcDNA3载体和pBAD/gIII A载体购自Invitrogen公司。

3.常用试剂

anti-HBcAg mAb购自Biodesign公司，HRP-conjugated Rabbit anti-mouseIgG和HRP-conjugated anti-guinea pig IgG购自Sigma公司。

PCR引物：由上海基康、博彩公司合成。

常用酶类：限制性内切酶Sac I、Bbe I、Nco I、Xho I，均为Takara公司产品。RNase为华舜公司产品。

分子生物学试剂盒：pGEM-T试剂盒为华舜公司产品；PCR试剂盒、T4连接酶试剂盒为Takara公司产品。

常用分子生物学试剂：DNA分子量Marker DL2000，为Takara公司产品。琼脂糖、Tris饱和平衡酚、EB等为Sigma公司或华舜公司产品。大肠杆菌培养用试剂胰蛋白胨、酵母提取物、SDS、Triton X-100、反转录试剂盒等为上海博彩公司产品。

常规化学试剂：NaCl，KAc，NaH₂PO₄，Na₂HPO₄，Tris，EDTA，NaOH，EB，HCl，NaAc，DMSO，无水乙醇，乙醚，异丙醇，柠檬酸纳，甘油，氯仿等分别为Sigma，Merck，Aldrich，Gibco等公司产品和国内分析纯产品。

4.主要仪器设备：

PCR仪：PE480和PE2400两种型号均为Perkin-Elmer(PE)公司产品；紫外分光光度计：Pharmacia Biotech，ULTRASPEC1000；TGL-台式高速离心机：MIKRO 12-24，HETTICH公司产品；细菌培养摇床：上海离心机械研究所；超纯水制备设备：Labconco Water pro^TMPS；生化培养箱：LDR-15B广东省医疗器械厂；细胞室离心机：TL-5.0台式离心机，上海市离心机械研究所；二氧化碳细胞培养箱：Heraeus产品；凝胶成像系统：Chemilmager^TM 5500；电穿孔仪：美国BioRad公司产品。

二、方法：

1.HBc-VLP疫苗载体的构建：

根据O型FMDV-VP2多抗猪IgG对线性12肽库的筛选结果，将带有模拟表位序列KGYDQELATSPE(SEQ ID NO：1)的噬菌体克隆命名为Phage-25。人工合成该肽段的编码碱基酸序列。将其插入原核表达载体pBAD表达HBc蛋白1-144位氨基酸的基因序列的主要免疫显性区域部位(第75位氨基酸)，使其展示于HBc类病毒颗粒的表面。重组质粒命名为pBAD-epitope。

基因片段的设计合成：人工合成编码目的肽段的互补碱基序列，并且在两端各加酶切位点，分别命名为P1、P2。按照原始Phage-25测序结果合成如下碱基序列，并在5’端加Bbe I，3’端加Sac I：

P1：GAGGCGCC AAG GGC TAC GAT CAG GAG CTC GCT ACC TCA CCT GAG GAGCTCGC

P2：GCGAGCTC CTC AGG TGA GGT AGC GAG CTC CTG ATC GTA GCC CTT GGCGCCTC

将上述DNA片段退火后用相应的限制性内切酶酶切目的片段和pBAD载体，进行连接、转化。小量快速抽提质粒并酶切鉴定。

重组子分别经相应的内切酶酶切，切出2条片段，大片段约5.0kb，为线性载体，小片段约为0.5kb，与设计值相符(图2)。测序结果表明，含目的表位的全基因合成片断正确地插入到HBc的第75位形成嵌合基因，序列与设计的完全相符。

2.原核表达质粒pBAD-HBc-multiepitope嵌合抗原的表达与纯化

诱导表达原核表达所用的宿主菌为E.coli TOP10，将含有目的基因的原核表达重组质粒的甘油菌10μl接种至3ml含氨苄青霉素的LA培养基中(LA)，37℃摇床培养过夜，然后以1％的接种量接种至另一含有LA培养基的三角烧瓶中，37℃培养至OD值约为0.4～0.6后，加入合适浓度的阿拉伯糖，继续培养4h，离心收集菌体，每3g大肠杆菌重悬于20ml缓冲液A中；经超声破碎后，离心收集超声上清和沉淀，进行15％的SDS-PAGE电泳，观察有无蛋白的表达及表达产物存在于上清中还是包涵体中。结果显示，与空载体诱导物相比，抗原均获得了表达，分子量约27kDa，与推测的分子量相符，在诱导剂L-阿拉伯糖的浓度为0.02％时，目的蛋白约占菌体总蛋白的15％以上(图3)。

包涵体的变性、亲和层析及复性。将收集的菌体超声后，12000rpm 4℃离心20min。再将沉淀重悬于9倍体积的含0.5％TritonX-100的缓冲掖A中，用研磨棒研磨充分，室温放置10min，13000rpm，4℃离心10min，重复3遍。加含有变性剂(0-8M尿素)的NTA缓冲液(3g湿菌加入20ml液体)，室温在磁力搅拌器上搅拌30min，13000rpm 4℃离心10min，分别收集上清和沉淀；进行15％SDS-PAGE电泳，观察溶解包涵体的变性剂的浓度。用该浓度的变性剂尿素溶解包涵体，加到NTA亲和层析柱上，分别用含NTA洗脱缓冲液(含20mmol/L-1000mmol/L咪唑和尿素)洗脱，收集洗脱的蛋白，15％SDS-PAGE电泳观察。结果显示，当洗脱液中的咪唑浓度1mol/L时，大部分目的蛋白被洗脱下来，变复性后蛋白的纯度约有95％以上。

稀释目的蛋白(至终浓度约为0.1mg/ml)，装入透析袋中透析复性，透析液中加入氧化型和还原型的谷胱甘肽(2mmol/L)，复性72h。将复性后的蛋白用PEG浓缩，再用缓冲液A进行透析，13000rpm 4℃离心20min，收集上清待用。

3.表达产物的Western blot鉴定

将表达产物经15％的SDS-PAGE电泳，切10张大小与凝胶一样的3mmWhatman滤纸和1张硝酸纤维素膜，凝胶在阴极，硝酸纤维素膜在阳极，根据凝胶面积按0.65mA/cm²的电流量进行转移，转移时间为2～3h。转移完毕后，取膜，用洗膜液洗3次，以0.1ml/cm²的封闭液I 37℃封闭1h，加入用封闭液I稀释的一抗，37℃孵育1h，用洗涤液I洗膜3次，用洗涤液II洗1次后加入用封闭液II稀释二抗(1∶100)37℃孵育1h，用洗涤液II洗3次，以免疫印迹化学发光试剂Supersignal CL-HRP底物溶液显示特异蛋白信号并曝光显影。Western结果显示，变复性后的目的蛋白能被抗HBc单抗特异性地识别，说明抗原经纯化、复性后保持了原来的免疫原性(图3)。

4.电镜观察颗粒样蛋白的形成

将纯化得到的HBc-epitope嵌合蛋白(HBc 1-76-epitope-HBc76-144)吸附到400目铜网上进行负染，透射电镜观察。发现重组嵌合蛋白具有明显的颗粒样结构(图4)。

5.疫苗免疫及免疫应答检测

18只豚鼠随机分为3组。每组6只，间隔21d进行两次免疫接种，接种方法均为肌肉注射。组1为VLP不含表位的对照组，并加弗氏佐剂(HBc对照+佐剂)；组2为VLP融合表位免疫组(HBc-模拟表位+佐剂)，分别用200μg的疫苗蛋白颈背部皮下多点注射；组3为商品化FMDV灭活疫苗(HBc-模拟表位+佐剂)。免疫分组及剂量见下表。

表2豚鼠实验分组及免疫剂量

免疫接种共2次，免疫间隔3周，第3次免疫后7天取血，检测病毒特异性抗体和肽特异性抗体。结果发现，灭活疫苗阳性对照组和HBc-模拟表位的实验组均诱导了病毒特异性抗体(图5)，而HBc对照组未检测到病毒特异性抗体。

6.血清中和抗体检测

分别于首次免疫后21d和35d血清，测定中和抗体效价。56℃灭活30min后，在96孔细胞培养板上。用无血清MEM做倍比稀释，每个稀释度设4孔。每孔加入100TCID₅₀NY00病毒，37℃作用1h后，每孔加入2×10⁵个BHK-21细胞，置37℃，5％CO₂温箱中培养，自48h观察至96h终判。同时设置阳性和阴性血清对照、病毒回归试验、血清毒性对照、正常细胞对照。最后，按照Spearman-Karber方法，计算能保护50％细胞孔不出现细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该血清的中和抗体效价。由表3可见，实验组和FMDV商品化疫苗组在免疫后21d均出现特异性的中和抗体，加强免疫后中和抗体效价又进一步升高。其中灭活疫苗组最高，HBc-模拟表位组其次。

表3免疫豚鼠血清FMDV中和抗体效价测定

Claims (3)

1.一种O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽在制备免疫原上的应用。

3.如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模拟肽在制备猪口蹄疫表位肽疫苗上的应用。

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