CN111454337B

CN111454337B - 1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位及其应用

Info

Publication number: CN111454337B
Application number: CN202010142423.2A
Authority: CN
Inventors: 姜世金; 张瑞华
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111454337A

Abstract

本发明公开了一种1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位及其应用，属于基因工程表位疫苗技术领域。本发明对1型和3型鸭甲肝病毒的抗原表位进行了深入研究，得到了一组1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位。利用本发明的中和性模拟抗原表位可以制备对1型和3型鸭甲肝病毒进行预防和治疗的疫苗。实验发现，以本发明的中和性模拟抗原表位为基础制备的表位疫苗免疫雏鸭后，可提供80％以上的保护率，有效保护雏鸭免受1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒感染。该表位疫苗减少了普通疫苗的毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性，也有助于更好地认识鸭甲肝病毒在进入机体后感染和免疫的机制。

Description

1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程表位疫苗技术领域，具体涉及一种1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位及其应用。

背景技术

鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)是一种主要感染3周龄以下雏鸭的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)。该病毒有三个血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，其中DHAV-1和DHAV-3是危害我国大陆养鸭业的主要血清型。鸭甲肝病毒基因组全长7.8kb左右，包含5’非编码区(untranslated region,UTR)、一个大的开放阅读框(open-reading frame,ORF)和3′UTR(3’untranslated regions)和poly(A)尾。病毒的RNA指导合成一条完整蛋白，称为多聚蛋白。多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，分解成小片段蛋白，分别为结构蛋白(VP1，VP0，VP3)和非结构蛋白(2A1，2A2，2A3，2B，2C，3A，3B，3C，3D)。其中，VP1基因全长714bp，编码238个氨基酸的多肽。在小RNA病毒中，VP1蛋白是主要的保护性抗原蛋白，包含了主要的抗原位点并具有主要的特异性中和位点，能诱导机体产生保护性的中和抗体。

目前，临床上用于预防由鸭甲肝病毒引起的鸭病毒性肝炎的常规疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗两种，但由于病毒与宿主的相互适应，导致以天然病毒作为抗原制备的灭活疫苗和弱毒疫苗在免疫鸭体内引起的免疫应答强度较低。

病毒抗原表位分析一直是病毒学研究的热点，近年来随着分子生物学方法的广泛运用，病毒及蛋白抗原表位筛选、研究方法得到不断提高。现有研究结果已经确定了一定数量的鸭甲肝病毒的天然抗原表位，不同亚型之间的抗原表位有相类似的，也有亚型特异性的。对抗原表位的研究有助于明确病毒激发机体免疫应答的分子机制，是研究病毒亚型鉴别技术和研制新型合成肽疫苗的理论基础。与传统疫苗相比，用抗原表位制备的表位疫苗减少了疫苗毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性，是目前研制感染性疾病和疫苗最有发展前景的方向。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位。以本发明的中和性模拟抗原表位为基础制备的表位疫苗免疫雏鸭后，可提供80％以上的保护率，有效保护雏鸭免受1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒感染。该表位疫苗减少了普通疫苗的毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性，也有助于更好地认识鸭甲肝病毒在进入机体后感染和免疫的机制。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位，其氨基酸序列为GLTWKLPPSM。

本发明的第二方面，提供编码上述中和性模拟抗原表位的核酸序列。

本发明的第三方面，提供上述中和性模拟抗原表位或者编码上述中和性模拟抗原表位的核酸在制备防治鸭甲肝病毒的疫苗中的应用。

优选的，所述鸭甲肝病毒包括：1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒。

优选的，所有疫苗为含有上述中和性模拟表位的基因工程疫苗。所述基因工程疫苗包括：基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗、表位疫苗或者合成肽疫苗等。

本发明的第四方面，提供一种防治1型和3型鸭甲肝病毒的基因工程疫苗，所述基因工程疫苗以上述中和性模拟抗原表位为有效成分。

进一步的，所述基因工程疫苗还包括：与中和性模拟抗原表位偶联的载体蛋白。

优选的，所述载体蛋白为KLH。

本发明的有益效果：

本发明对1型和3型鸭甲肝病毒的抗原表位进行了深入研究，得到了一组1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位。利用本发明的中和性模拟抗原表位可以制备对1型和3型鸭甲肝病毒进行预防和治疗的疫苗。实验发现，以本发明的中和性模拟抗原表位为基础制备的表位疫苗免疫雏鸭后，可提供80％以上的保护率，有效保护雏鸭免受1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒感染。该表位疫苗减少了普通疫苗的毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性，也有助于更好地认识鸭甲肝病毒在进入机体后感染和免疫的机制。

附图说明

图1：a)合成肽Pep0可以和DHAV蛋白竞争结合到抗体4E6；b)合成肽Pep0可以和DHAV VP1竞争结合到抗体4E6。

图2：合成肽Pep0三免兔血清与DHAV病毒粒子发生免疫反应。

图3：a)Pep0关键氨基酸的dot-blotting鉴定；b)以anti-GST抗体为一抗鉴定各蛋白的成功表达；c)以anti-Pep0为一抗鉴定各蛋白的免疫反应性。

图4：a)雏鸭血清中的DHAV抗体检测；b)雏鸭攻毒后的死亡记录。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

抗原表位：抗原分子中决定抗原异性的特殊化学基团，是抗原分子上负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合的免疫活性区，又称抗原决定簇。

合成肽疫苗：用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽，与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。

表位疫苗：利用基因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，继而开发出预防性或治疗性疫苗。表位疫苗相对于传统疫苗拥有较多优势，表位肽短小，免疫原性强，可以克服主要组织相容性复合体(MHC)分子的遗传限制，本身安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应，其最大的优点是可以克服传统疫苗造成的毒力恢复或散毒的可能。

正如背景技术部分所介绍的，用抗原表位制备的表位疫苗减少了疫苗毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性，是目前研制感染性疾病和疫苗最有发展前景的方向。

目前对于抗原表位的研究方法主要有：表位肽扫描技术、免疫信息学预测法、蛋白质“切割”法、噬菌体展示技术、X射线衍射与核磁共振分析等。其中，噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。在抗原表位的研究方面，其简化了表位的定位过程，只需要以抗原的特异性单抗对肽库进行筛选，并对所筛选的重组噬菌体肽序列与抗原序列比较分析，找到存在于抗原肽段上的同源序列即可认为是抗原表位。

噬菌体展示随机肽库技术将随机短肽以融合蛋白形式表达在噬菌体基因GIII的N端。理论上该技术可筛选出与原始序列完全相同的线性抗原表位，也可以筛选出与抗体结合、与原始抗原序列不同但功能相似的模拟抗原表位。但这些模拟的抗原表位与原始抗原的序列不完全相同，研究表明，在抗原表位中通常只有几个氨基酸序列具有关键结合活性，完整蛋白质抗原表位中，大部分是构型依赖性抗原表位，只有少部分为线性抗原表位。当原始序列中含有大量构型依赖性抗原决定簇时，用噬菌体随机肽库筛选会遇到困难，有时很难筛选到一致序列。因此，虽然噬菌体展示技术有助于寻找和确认抗原表位，但是，在实际应用过程中仍存在极大的随机性和偶然性，发现效果优异的模拟抗原表位仍是当前抗原表位的研究难点所在。

为了筛选1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位，在本发明的一种实施方式中，所给出的技术方案为：

(1)利用单克隆抗体4E6从12-mer噬菌体展示肽库里筛选DHAV模拟抗原表位。

(2)人工合成步骤(1)中筛选到的12-mer抗原表位，用竞争ELISA方法检测其是否可以与DHAV病毒粒子竞争性结合抗体4E6。

(3)人工合成步骤(1)中筛选到的12-mer抗原表位，偶联钥孔血蓝蛋白(KLH,keyhole limpet hemocyanin)后免疫兔，检测模拟抗原表位的免疫原性。

(4)对从12-mer噬菌体展示肽库中筛选的表位进行缩短和变异突变，找出关键氨基酸序列。

(5)对最终确定的模拟抗原表位偶联KLH后作为表位疫苗免疫雏鸭，对此疫苗的保护效率进行测评。

步骤(1)中的单克隆抗体4E6能够同时抗DHAV-1和DHAV-3，该单克隆抗体为现有技术中已有的单克隆抗体，也可通过常规的单克隆抗体的制备方法制备得到。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：抗DHAV-1单克隆抗体的制备

用纯化的DHAV-1LY0801(ELD₅₀＝10^-5.7,0.2mL)株免疫适龄BALB/c小鼠，取免疫效果最佳的小鼠的脾脏和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，通过间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，经三次亚克隆后获得稳定分泌针对DHAV-1的单克隆抗体4E6。用间接ELISA检测连续传代和冻存复苏的细胞上清，发现其分泌抗体的能力无显著差异，证明其稳定性好；染色体数目100左右，呈现出典型的杂交瘤细胞染色体特征；经亚类鉴定，此单抗分泌的抗体类型为IgG1亚类、κ亚型；中和试验显示4E6可以有效中和DHAV-1和DHAV-3病毒粒子；间接免疫荧光试验和Western blotting试验显示4E6识别DHAV-1VP1和DHAV-3VP1上的构象表位。

表1：抗体4E6对10日龄鸭胚内DHAV-1和DHAV-3的中和试验

实施例2：DHAV-1模拟抗原表位的初步淘选与鉴定

采用固相亲和淘选的方法用实施例1所得抗DHAV-1和DHAV-3单克隆域抗体4E6从噬菌体展示肽库中进行筛选模拟表位。向每个酶标孔中加入100μL纯化后的4E6抗体(100μg/mL溶于0.1M pH 8.6的NaHCO₃溶液)，4℃包被过夜；吸出包被液，用TBST(含0.1％Tween-20)洗板5次，每孔加入200μL5％BSA溶液，37℃，封闭1h；TBST洗板5次，加入100μL噬菌体抗体文库(约含4×10⁸PFU)，室温孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用TBST洗板10次)；以100μL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH 2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用35μL Tris-HCl(1mol/L，pH8.0)中和洗脱物，取10μL用于滴度测定，其余125μL洗脱物扩增后用于下一轮淘选。在后两轮的淘洗中，铺板抗体浓度降为50μg/mL，TBST中的Tween-20含量升为0.5％。

经三轮淘选后，随机选取30个单个噬菌体，先用间接phage-ELISA测定噬菌体颗粒的结合活性和特异性，再对特异性显著的17个噬菌体提取DNA送生物技术服务公司进行序列测定。结果发现17个测序噬菌体中，有15个含有一致序列¹GLTWKLPPSMVH¹²，命名为Pep0(SEQ ID NO.1)。

实施例3：合成肽对DHAV-1和DHAV-3的竞争ELISA试验

人工合成实施例2中筛选的Pep0，另一个序列¹IGENITNPIKPN¹²(SEQ ID NO.6)作为阴性对照，命名为PepN。向每个酶标板中分别加入100μL DHAV-1病毒稀释液、DHAV-3病毒稀释液、DHAV-1VP1真核表达蛋白、DHAV-3VP1真核表达蛋白，4℃包被过夜；吸出包被液，用PBST(含0.1％Tween-20)洗板3次，每孔加入200μL 3％BSA溶液，37℃，封闭1.5h；将不同浓度的肽溶液分别与等体积4E6抗体预混，37℃，作用1h；PBST洗板3次，将肽-4E6混合液加到酶标板，37℃，作用1h；PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃，作用1h；PBST洗板3次，加入显色液显色，再以2M H₂SO₄终止反应。结果发现合成肽可以和DHAV或DHAV VP1蛋白竞争结合到抗体4E6，见图1。

实施例4：对Pep0免疫原性进行初步鉴定

人工合成实施例2中筛选的Pep0，偶联KLH后免疫适龄兔，免疫程序如下：200μL合成肽与弗氏完全佐剂混合后做初免，2周后再用200μL合成肽Pep0与弗氏不完全佐剂混合后做二次免疫，再2周后用200μL合成肽与弗氏不完全佐剂混合后做第三次免疫。在第三次免疫后7天采血清，用间接ELISA方法检测兔子血清抗体是否可以与DHAV发生免疫反应，具体反应步骤如下：将合成肽、DHAV-1和DHAV-3分别包板，4℃包被过夜；吸出包被液，用PBST(含0.1％Tween-20)洗板3次，每孔加入200μL 3％BSA溶液，37℃，封闭1.5h；将兔血清倍比稀释后加入酶标孔，37℃，作用2h；PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃，作用1h；PBST洗板3次，加入显色液显色，再以2M H₂SO₄终止反应。结果发现用合成肽免疫兔子的血清不但可以和合成肽Pep0发生免疫反应，还可以和DHAV病毒粒子发生免疫反应，见图2。这说明从噬菌体肽库中筛得的抗原表位具有良好的免疫原性。

实施例5：对12-mer抗原表位进行关键氨基酸鉴定

根据表2，人工合成一系列Pep0突变体(序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示)。将肽溶液滴1μL到硝酸纤维素膜上进行点杂交试验，结果如图3a所示。

把Pep1免疫兔血清(1：1000稀释液)孵育NC膜，37℃，作用1h，用PBST洗三次，用HRP标记的羊抗鼠二抗再次孵育1h；根据表2合成一系列核酸片段(序列分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.16所示)，将核酸片段分别插入Pgex-6P-1载体，表达的蛋白用GST纯化试剂盒进行纯化后进行蛋白质电泳和Western blotting分析。结果分别如图3b和图3c所示(图3b和图3c中的1-6分别表示SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的蛋白，其中，6为阴性对照)，结果发现从N端删掉¹²H or ¹¹V¹²H不会影响其与抗Pep0血清的免疫反应，而从C端删掉¹G或者从N端删掉¹⁰M¹¹V¹²H则会影响合成肽与抗Pep0血清的免疫反应，这说明¹GLTWKLPPSM¹⁰就是能引起兔机体免疫反应的抗原表位核心序列，命名为Pep1。

表2：用于抗原表位缩短的引物序列

实施例6：Pep1表位疫苗的雏鸭保护试验

将Pep1和PepN偶联KLH后作为表位疫苗分别免疫雏鸭，分别免疫90只雏鸭，免疫程序如下：合成肽与弗氏完全佐剂等体积混合后做对1日龄雏鸭肌注，25μg/只，7天后再用合成肽与弗氏不完全佐剂等体积混合后做二次免疫，25μg/只，第10天采集雏鸭血清并通过ELISA检测Pep1和PepN免疫组血清中是否产生了DHAV抗体，见图4a，图4a中的“Serum_Pep1-Pep1”表示Pep1免疫后，以Pep1包板进行ELISA检测；“Serum_Pep1-DHAV-1”表示Pep1免疫后，以DHAV-1包板进行ELISA检测；“Serum_Pep1-DHAV-3”表示Pep1免疫后，以DHAV-3包板进行ELISA检测；“Serum_PepN-Pep1”表示PepN免疫后，以Pep1包板进行ELISA检测；“Serum_PepN-DHAV-1”表示PepN免疫后，以DHAV-1包板进行ELISA检测；“Serum_PepN-DHAV-3”表示PepN免疫后，以DHAV-3包板进行ELISA检测。结果表明，Pep1免疫组血清中能够产生大量DHAV抗体。

针对Pep1和PepN表位疫苗分别免疫的90只雏鸭，第10天，分别对30只雏鸭肌肉注射DHAV-1FC16115，0.2mL/只，对30只肌肉注射DHAV-3JN1206，0.2mL/只，对剩余30只同时注射DHAV-1FC16115和DHAV-3JN1206，各0.1mL/只。观察雏鸭状态7天并记录攻毒后的每组雏鸭死亡数目，见图4b。结果表明，Pep1表位疫苗免疫组免疫鸭对病毒攻毒的保护率分别为：DHAV-1单独攻毒组，80％(24/30)，DHAV-3单独攻毒组，83.3％(25/30)，DHAV-1和DHAV-3混合攻毒组，80％(24/30)。而作为对照组的PepN表位疫苗免疫组免疫鸭对病毒攻毒的保护率分别为：DHAV-1单独攻毒组，13.3％(4/30)，DHAV-3单独攻毒组，16.7％(5/30)，DHAV-1和DHAV-3混合攻毒组，10％(3/30)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位及其应用

<130> 2020

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Leu Thr Trp Lys Leu Pro Pro Ser Met Val His

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Thr Trp Lys Leu Pro Pro Ser Met Val His

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Leu Thr Trp Lys Leu Pro Pro Ser Met Val

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Leu Thr Trp Lys Leu Pro Pro Ser Met

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Leu Thr Trp Lys Leu Pro Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Gly Glu Asn Ile Thr Asn Pro Ile Lys Pro Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcggatccg gtcttacttg gaagcttccg ccttcgatgg tgcattgaaa gcttgtcgac 60

gtc 63

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacgtcgaca agctttcaat gcaccatcga aggcggaagc ttccaagtaa gaccggatcc 60

gcg 63

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcggatccc ttacttggaa gcttccgcct tcgatggtgc attgaaagct tgtcgacgtc 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacgtcgaca agctttcaat gcaccatcga aggcggaagc ttccaagtaa gggatccgcg 60

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<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

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cgcggatccg gtcttacttg gaagcttccg ccttcgatgg tgtgaaagct tgtcgacgtc 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gacgtcgaca agctttcaca ccatcgaagg cggaagcttc caagtaagac cggatccgcg 60

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcggatccg gtcttacttg gaagcttccg ccttcgatgt gaaagcttgt cgacgtc 57

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

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<400> 14

gacgtcgaca agctttcaca tcgaaggcgg aagcttccaa gtaagaccgg atccgcg 57

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgcggatccg gtcttacttg gaagcttccg ccttcgtgaa agcttgtcga cgtc 54

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gacgtcgaca agctttcaca tcgaaggcgg aagcttccaa gtaagaccgg atccgcg 57

Claims

1.一种1型和3型鸭甲肝病毒共有的中和性模拟抗原表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为：GLTWKLPPSM。

2.编码权利要求1所述的中和性模拟抗原表位肽的核酸。

3.权利要求1所述的中和性模拟抗原表位肽或者权利要求2所述的核酸在制备防治鸭甲肝病毒的疫苗中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鸭甲肝病毒包括：1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所有疫苗为含有权利要求1所述的中和性模拟抗原表位肽的基因工程疫苗。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因工程疫苗包括：基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗、表位疫苗或者合成肽疫苗。

7.一种防治1型和3型鸭甲肝病毒的基因工程疫苗，其特征在于，所述基因工程疫苗以权利要求1所述的中和性模拟抗原表位肽为有效成分。

8.根据权利要求7所述的基因工程疫苗，其特征在于，所述的基因工程疫苗还包括：与中和性模拟抗原表位肽偶联的载体蛋白。

9.根据权利要求7所述的基因工程疫苗，其特征在于，所述载体蛋白为KLH。