JP2023503968A - Ｃａｒ－ｔ細胞の検出用モノクローナル抗体、キットおよび適用 - Google Patents

Ｃａｒ－ｔ細胞の検出用モノクローナル抗体、キットおよび適用 Download PDF

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Abstract

ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体は、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるようなＣＤＲ領域を含み、前記重鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～７に示されるようなＣＤＲ領域を含むことを特徴とする。前記モノクローナル抗体またはＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットを使用すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞検出の段階が簡単で、検出時間が短く、検出結果が安定する。ここで、ａｎｔｉ－ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖ抗体は、一般的なａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を検出するコストを大幅に低減させる。

Description

本発明は、分子生物学の分野に属し、具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出用モノクローナル抗体、キットおよび適用に関する。
ＣＤ１９分子は、Ｂ細胞の表面マーカーの一つであり、Ｂ４またはＬｅｕ－１２とも呼ばれ、ＣＤ１９は、膜貫通型糖タンパク質であり、ＣＤ１９分子は、骨髄Ｂ細胞から発現し、Ｂ細胞の全成熟期間を通して継続する。ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ、キメラ抗原受容体Ｔ）細胞は、人工的に操作されたＴ細胞であり、このような操作により、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲと呼ばれる遺伝子工学的修飾の方法によりＴ細胞の表面に発現するＣＤ１９を識別できるＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を作成し、それにより、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現する腫瘍Ｂ細胞を識別することができ、現在、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９が陽性を発現するＢ細胞血液悪性腫瘍の治療のために臨床で使用されている。
ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、臨床応用に存在する多くの困難に適用され、困難の一つは、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出コストが高すぎることであり、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ表面に発現されるａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９分子の識別のために使用され、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔの従来の検出は、ＣＤ１９分子によって検出されるが、ヒトＣＤ１９抗原を使用してＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞表面を検出するａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲの特異性は高くなく、試験条件が複雑であり、抗原タンパク質の添加量が高いという問題が存在する。このような方法に加えて、臨床ＣＡＲ－Ｔ細胞の感染効率を検出するためにも使用され、ＣＤ１９以外の標的は、すべてＱＰＣＲ検出法を使用し、当該方法が感染効率を正確に定量化できないため、新しいＣＡＲ－Ｔ細胞の検出試薬を必要とする。
既存の問題を解決するために、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出用モノクローナル抗体、キットおよび適用を提供する。
上記の目的を実現するために、本発明は、以下の技術的解決策によって実現される。
本発明の第１の態様は、モノクローナル抗体を提供し、前記モノクローナル抗体は、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるようなＣＤＲ領域を含み、前記重鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～７に示されるようなＣＤＲ領域を含む。
本発明の第２の態様は、前記ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域または全長アミノ酸をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の第３の態様は、構築体を提供し、前記構築体は、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニング部位に挿入することによって構築される。
本発明の第４の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、前記構築体を含むか、または染色体には前記ポリヌクレオチドが組み込まれている。
本発明の第５の態様は、前記モノクローナル抗体の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記モノクローナル抗体を発現させ、前記モノクローナル抗体を精製および分離する段階を含む、前記ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体の調製方法を提供する。
本発明の第６の態様は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出試薬の調製における、前記モノクローナル抗体の用途を提供する。
本発明の第７の態様は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットを提供し、前記検出キットは、捕捉リガンドおよび検出リガンドを含み、前記捕捉リガンドは、接続された第１のリガンドおよび第１のリガンド標識を含み、前記第１のリガンドは、前記モノクローナル抗体であり、前記検出リガンドは、第２のリガンドを含み、前記第２のリガンドは、前記捕捉リガンドを識別するために使用される。
本発明の第８の態様は、ＣＡＲ－Ｔ細胞検出における、前記ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体、ポリヌクレオチド、構築体、宿主細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットの適用を提供する。
本発明の第９の態様は、
１）試験サンプルに前記モノクローナル抗体またはキット中の捕捉リガンドを加え、インキュベートした後に遠心分離して、第１の沈殿物を得る段階と、
２）前記第１の沈殿物に前記モノクローナル抗体を識別するための検出リガンドまたはキット中の検出リガンドを加え、インキュベートした後に遠心分離して、第２の沈殿物を得る段階と、および
３）前記第２の沈殿物に対してフロー検出を行い、試験サンプル中のＣＡＲ－Ｔ細胞の含有量を獲得する段階とを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出方法を提供する。
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は次のとおりである。
本発明に記載のモノクローナル抗体またはＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットを使用すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞検出の段階が簡単で、検出時間が短く、細胞状態に対する要件が低く、感度が高く、分解能効果が良好で、検出結果が安定する。現在、市販の抗原検出ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲは、大量のタンパク質を使用することにより、コストが高く（約１２０中国元／試験（ｔｅｓｔ））、この特許によって発明されたａｎｔｉ－ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖ抗体は、一般的なａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出コストを大幅に低減させることができ、６分の１の２０中国元／試験（ｔｅｓｔ）に低減することができる。
実施例１に記載のモノクローナル抗体の調製のフローチャートを示す。 本発明の一実施例において、ａｎｔｉＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞への実験群抗体および対照群ＣＤ１９タンパク質結合を比較する特異的ＣｙｔｏＦｌｅｘ検出結果を説明する散布図を示す。ここで、左図は、実験群であり、右図は、対照群であり、下図は、同じタイプの対照群である。 本発明の一実施例において、ａｎｔｉＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞への実験群抗体および対照群ＣＤ１９タンパク質結合を比較する特異的ＣｙｔｏＦｌｅｘ検出結果を説明するヒストグラムを示し、ここで、左図は、実験群であり、右図は、対照群であり、下図は、同じタイプの対照群である。 本発明の一実施例におけるａｎｔｉＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞にそれぞれ３回結合した実験群抗体および対照群ＣＤ１９タンパク質のＣｙｔｏＦｌｅｘ検出の平均結果を示す。 本発明のモノクローナル抗体がＣＡＲ－Ｔ細胞をブロッキングした後の標的細胞の殺傷状況を示す。
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究および大量のスクリーニングの後、予期せずにＦＭＣ６３ ｓｃＦｖに対する抗体を獲得した。実験によると、本発明の抗体は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を効果的に検出でき、検出段階が簡単で、検出時間が短く、細胞状態に対する要件が低く、感度が高く、分解能効果が良好で、検出結果が安定する。また、本発明の抗体は、低濃度でＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して非常に優れたブロッキング効果を示し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果を阻害することができ、これは、本発明のモノクローナル抗体がより高い感度およびより良好なブロッキング性能を有することを示し、従って、ＣＡＲの細胞外結合ドメインがＦＭＣ６３ ＳｃＦｖであるＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷性能の検出、および品質管理により適する。これに基づいて、本発明を完成した。
以下、特定の具体的な例を通じて本発明の実施形態を説明し、当業者は、本明細書に開示された内容から、本発明の他の利点および効果を容易に理解することができる。本発明は、他の異なる具体的な実施形態を通じてさらに実施または適用することができ、本明細書の様々な詳細も、異なる観点および適用に基づいて、本発明の精神から逸脱することなく様々な方法で修飾または変更することができる。
本発明の具体的な実施形態をさらに説明する前に、本発明の保護範囲は、以下の特定の具体的な実施形態に限定されないことを理解されたく、本発明の実施例で使用される用語は、本発明の保護範囲を限定するためではなく、特定の具体的な実施形態を説明するためのものであることも理解されたく、本発明の明細書および特許請求の範囲において、文脈に特に明記しない限り、単数形「一つ」、「一」および「これ」は、複数形を含む。
実施例に数値範囲が示される場合、本発明に別の説明がない限り、各数値範囲の両方の端点および二つの端点の間の任意の数値は、すべて選択可能であることを理解されたい。特に明記しない限り、本発明で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。実施例で使用される具体的な方法、装置、材料に加えて、当業者による先行技術の知識および本発明の説明によれば、本発明の実施例に記載の方法、装置、材料と類似または同等である従来技術の任意の方法、装置および材料をさらに使用して本発明を実施することができる。
特に明記しない限り、本発明に開示される実験方法、検出方法、調製方法は、当技術分野の従来の分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術ならびに関連分野の従来の技術を使用する。これらの技術は、既存の文献で詳しく説明されている。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体（一次抗体）」という用語は、実質的に均質な集団から得られる抗体を指し、即ち、当該集団に含まれる個々の抗体は、存在し得るいくつかの天然に存在する突然変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して非常に特異的である。また、従来のポリクローナル抗体製剤（通常は、異なる決定クラスターに対する異なる抗体を有する）とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定クラスターに対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。修飾用語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示し、これは、抗体を生成するために特別な方法が必要であると解釈されるべきでない。
本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、一般に２対のポリペプチド鎖（各対には、一つの「軽」（Ｌ）鎖および一つの「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。一般的な意味で、重鎖は、抗体の分子量が大きいポリペプチド鎖であり、軽鎖とは、抗体の分子量が小さいポリペプチド鎖を指すと理解することができる。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖として分類することができる。重鎖は、通常、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖またはε鎖として分類することができ、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続され、重鎖は、約３個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で王政される。重鎖定常領域は、三つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬで構成される。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介する。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する変動性の高い領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））に細分されることもできる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４のジョン所で配置された三つのＣＤＲおよび四つのＦＲで構成される。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗体結合部位を形成する。各領域またはドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ プロテインｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の定義に従う。特に、重鎖は、三つ以上の
ＣＤＲ、たとえば、６、９または１２個を含むことができる。例えば、本発明の二重機能抗体において、重鎖は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端が別の抗体に接続されるＳｃＦｖであり得、この場合、重鎖は、９個のＣＤＲを含む。「抗体」という用語は、抗体を産生する特定の方法によって限定されない。例えば、それは、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている様々な方法によって得ることができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に提案された）または組換えＤＮＡ法（米国特許Ｎｏ．４８１６５６７）によって作製することができる。モノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから分離することによって得られることができる。
本明細書で使用されるように、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現できる場合、ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができ、それによって運ばれる遺伝物質要素を宿主細胞で発現させることができる。ベクターは、当業者によく知られており、プラスミド、ファージミド、コスミド、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１起源の人工染色体（ＰＡＣ）の中の人工染色体、例えば、λファージまたはＭ１３ファージおよび動物ウイルスの中のファージを含むが、これらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含むが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を制御する様々な要素を含むことができる。さらに、ベクターは、複製起点を含むこともできる。
本明細書で使用されるように、「特異的に結合」という用語は、抗体とそれが向けられる抗原との間の反応等、二つの分子間の非ランダムの結合反応を指す。特定の実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（またはある抗原に対して特異性を有する抗体）とは、抗体が約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはそれ以下の親和性（Ｋｄ）で当該抗原に結合することを指す。本発明のいくつかの実施形態において、「標的化」という用語は、特異的結合を指す。
本発明によって提供されるＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体において、前記モノクローナル抗体は、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるようなＣＤＲ領域を含み、前記重鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～７に示されるようなＣＤＲ領域を含む。
前記重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合によって接続されることができる。
一実施形態において、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたとおりである。
一実施形態において、前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されたとおりである。
前記モノクローナル抗体は、マウス由来、ヒト由来またはキメラであり得、好ましくは、前記モノクローナル抗体は、マウス由来である。
前記モノクローナル抗体は、非ＣＤＲ領域を含む。
さらに、前記モノクローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃまたはＩｇＧ３である。
さらに、前記モノクローナル抗体は、ＣＡＲ分子のｓｃＦｖドメインに結合することができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、前記ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域または全長アミノ酸をコードする。
本発明によって提供される構築体は、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニング部位に挿入することによって構築される。
前記発現ベクターは、具体的には、当業者に周知の既存の一般的な発現ベクターであり得、具体的に使用できる発現ベクターは、ｐＥＴシリーズ発現ベクター、ｐＧＥＸシリーズ発現ベクター、ｐｃＤＮＡシリーズ発現ベクター等を含むが、これらに限定されない。
本発明によって提供される宿主細胞は、前記構築体を含むか、または染色体には前記ポリヌクレオチドが組み込まれている。
この特許に記載の抗体を発現するための発現ベクター（構築体）での使用に適した細胞は、すべて宿主細胞として使用されることができる。例えば、酵母、昆虫、植物などの細胞。好ましくは、前記宿主細胞は、真核細胞であり、抗体を産生しない哺乳動物宿主細胞株を使用することができ、具体的に使用できる細胞株は、中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯシリーズ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、ベビーマウスのセルトリ細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ ｃｅｌｌｓ）、サルの腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）によって形質転換されたサルの腎臓ＣＶＩ細胞、ヒトの胎児腎臓細胞（ＨＥＫ－２９３シリーズ）、サルの腎臓細胞（ＣＶＩ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）、アフリカングリーンモンキーの腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒトの子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）等を含むが、これらに限定されない。
本発明によって提供される前記ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体の調製方法は、前記モノクローナル抗体の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記モノクローナル抗体を発現させ、前記モノクローナル抗体を精製および分離する段階を含む。
本発明の抗体をコードする核酸配列を取得した後、以下の方法に従って目的の抗体を調製することができる。例えば、目的の抗体をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に直接導入し、細胞を適切な条件下で培養売ることにより、コードされた抗体の発現を誘導する。本発明で使用される発現ベクターおよび宿主細胞は、すべて既存の技術であり、商業的手段を介して直接取得することができ、培養に使用される１０％ＦＢＳの１６４０培地も、様々な従来の哺乳動物の細胞培地であり、当業者は、経験に応じて適切な１６４０培地を選択し、宿主細胞の成長に適した条件下で培養することができる。宿主細胞が適切な細胞密度に成長した後、適切な方法（例えば、温度の切り替えまたは化学的誘導）によって選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間培養する。上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内で、または細胞膜上で発現され得るか、または細胞外に分泌され得る。本発明で説明されるモノクローナル抗体を一度取得したら、その物理的、化学的および他の特性を使用して、様々な分離方法によって前記モノクローナル抗体を分離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超加工、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびに他の様々な液体クロマトグラフィー技術およびそれらの方法の結合を含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出試薬の調製における前記モノクローナル抗体の用途をさらに提供する。
本発明によって提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットは、捕捉リガンドおよび検出リガンドを含み、前記捕捉リガンドは、接続された第１のリガンドおよび第１のリガンド標識を含み、前記第１のリガンドは、前記モノクローナル抗体であり、前記検出リガンドは、第２のリガンドを含み、前記第２のリガンドは、前記捕捉リガンドを識別するために使用される。
さらに、前記捕捉リガンドは、ＣＡＲ分子のｓｃＦｖドメインに結合することができる。
一実施形態において、前記第１のリガンド標識は、ビオチンまたはアルカリホスファターゼから選択される。
一実施形態において、前記検出リガンドは、蛍光分子に結合する。
一実施形態において、前記第２のリガンドは、ストレプトアビジン、ＩｇＧ（ヤギ、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒトおよびサルなどの供給源を含むがこれらに限定されない）の一つまたは複数から選択される。
一実施形態において、前記キットは、１）支持体、２）停止溶液、３）希釈液、４）洗浄液、５）ブロッキング溶液、６）陰性対照、７）陽性対照の中の一つまたは複数をさらに含む。
前記キットにおいて、前記支持体は、事前に前記捕捉リガンドでコーティングされるか、または空白の支持体のみを提供することができ、検出する前に、オペレーターは、従来の方法を使用して支持体上に捕捉リガンドをコーティングすることができる。
ここで、前記支持体と試薬との接触面にミクロポーラスメンブレンが存在し得る。従って、前記支持体は、ミクロポーラスメンブレンプレートである。前記ミクロポーラスメンブレンプレートは、９６ウェルメンブレンプレート等、様々な一般的な仕様のミクロポーラスメンブレンプレートであり得る。より好ましくは、前記支持体は、ＰＶＤＦフィルムでコーティングされたマイクロウェル培養プレートである。ここで、好ましくは、前記支持体と試薬との接触面にＰＶＤＦ膜が存在する。
本発明に記載の停止溶液、希釈液、洗浄液、ブロッキング溶液、陰性対照、陽性対照は、すべて抗体検出の一般的な試薬であり、具体的な検出項目に限定されないため、必要に応じてキットに選択的に追加したり、オペレーターによって設定したり、別途購入したりすることができる。
前記洗浄液は、リン酸緩衝液の中の検出キットにおける一般的な洗浄液であれいる。必要に応じて、濃縮または非濃縮の洗浄液を使用することができる。
前記ブロッキング溶液は、ＰＢＳ、酢酸、メタノール、トゥイーン、スクロース、スキムエマルジョン、ＦＢＳ、ＢＳＡまたはカゼインの中のミクロポーラスメンブレンプレートをコーティングするための一般的なブロッキング溶液である。
前記陰性対照は、ｎｏｎ－ａｎｔｉＣＤ１９ ａｎｔｉｇｅｎの組換えタンパク質（メーカー：Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、製品番号：ＮＢＰ２－２５１９９）またはＩｇＧであり得る。
選択可能に、陰性対照の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたとおりであり、具体的には、次のとおりである。
ＭＰＴＰＬＶＨＰＨＬＰＩＳＳＰＲＶＳＰＦＰＰＰＡＦＱＫＡＳＳＩＶＹＫＫＥＧＥＱＶＥＦＳＦＰＬＡＦＴＶＥＫＬＴＧＳＧＥＬＷＷＱＡＥＲＡＳＳＳＫＳＷＩＴＦＤＬＫＮＫＥＶＳＶＫＲＶＴＱＤＰＫＬＱＭＧＫＫＬＰＬＨＬＴＬＰＱＡＬＰＱＹＡＧＳＧＮＬＴＬＡＬＥＡＫＴＧＫＬＨＱＥＶＮＬＶＶＭＲＡＴＱＬＱＫＮＬＴＣＥＶＷＧＰＴＳＰＫＬＭＬＳＬＫＬＥＮＫＥＡＫＶＳＫＲＥＫＡＶＷＶＬＮＰＥＡＧＭＷＱＣＬＬＳＤＳＧＱＶＬＬＥＳＮＩＫＶＬＰＴＷＳＴＰＶＱＰＭＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣＲＨＲＲＲＱＡＥＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳＥＫＫＴＣＱＣＰＨＲＦＱＫＴＣＳＰＩ
前記陽性対照は、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ組換えタンパク質（メーカー：Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、製品番号：ＮＢＰ２－５２６８８）またはＩｇＧである。
選択可能に、陽性対照の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたとおりであり、具体的には、次のとおりである。
ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ
通常、本発明のキットにおいて、各試薬は、別々に保存される。
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞検出における前記ＣＡＲ分子に特異的に結合するためのモノクローナル抗体、ポリヌクレオチド、構築体、宿主細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットの適用をさらに提供する。
本発明によって提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞の検出方法は、
１）試験サンプルに前記モノクローナル抗体またはキット中の捕捉リガンドを加え、インキュベートした後に遠心分離して、第１の沈殿物を得る段階と、
２）前記第１の沈殿物に前記モノクローナル抗体を識別するための検出リガンドまたはキット中の検出リガンドを加え、インキュベートした後に遠心分離して、第２の沈殿物を得る段階と、および
３）前記第２の沈殿物に対してフロー検出を行い、試験サンプル中のＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ＋細胞含有量を獲得する段階とを含む。
好ましくは、前記方法は、具体的には、
１）フロー緩衝液において、検出サンプルを第１のリガンド標識に結合した第１のリガンドと混合し、２～８℃下で１５～４５分間結合した後、最初の遠心分離を実行して、第１の沈殿物を得る段階と、
２）第１の沈殿物を洗浄した後、フロー緩衝液を使用して再懸濁し、蛍光分子に結合した検出リガンドを追加し、２～８℃下で１５～４５分間結合した後、第２回の遠心分離を実行して、第２の沈殿物を得る段階と、および
３）第２の沈殿物を洗浄した後に遠心分離し、得られた沈殿物をフロー緩衝液を使用して再懸濁した後にフロー検出する段階を含む。
[実施例１．ハイブリドーマ細胞株の取得およびモノクローナル抗体の調製]
調製プロセスは、図１に示されたとおりであり、具体的な調製方法は、次のとおりである。
一．タンパク質の生産
１．プラスミドの大量抽出
５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むｍＬＹＴ培地に２００ｕｌ細菌液を接種し、３７℃下でシェーカーで６時間培養した後に遠心分離により沈殿物を収集する。１２ｍｌのＲＥＳ緩衝液を使用して沈殿物を再懸濁し、よく混合し、１２ｍｌのＬＹＳ溶解緩衝液を加え、転倒させてよく混合し、室温下で２分間放置する。１２ｍｌのＮＥＵ中和液を加え、すぐに転倒させて混合する。メンブレンを含む平衡カラムに、３５ｍｌのＥＱＵ緩衝液を加える。緩衝液をメンブレンのエッジに加え、メンブレン全体が濡れられるようにする。ＥＱＵを重力下でろ過した後、転倒させて混合した溶解後の溶液を加えて、メンブレンの目詰まりを防止する。１０ｍｌのＥＱＵを使用してメンブレンをすすぐ。平衡カラム内の液体が流出した後、平衡カラムを反転させ、メンブレンを廃棄する。９０ｍｌのＥｎｄｏ緩衝液を使用して、初めてカラムを洗浄する。液体が流出した後に４５ｍｌのＷａｓｈ緩衝液を加え、カラムをもう一度洗浄する。カラムに４５ｍｌのＥＬＵ緩衝液を加え、溶出液を５０ｍＬの遠心分離チューブに収集する。室温下で１０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温下で５分間静置し、プラスミドＤＮＡを沈殿させる。上記の溶液をメンブレンでろ過し、５ｍｌの７０％エタノールを使用してメンブレンを洗浄する。エタノールをメンブレンから完全に除去した後、１ｍｌの水をメンブレンに加え、ＤＮＡを１．５ｍｌのクライオバイアルに溶解する。抽出されたプラスミドをシーケンシングする。
２．３Ｇ１１－ｓｃＦｖおよびＦＭＣ６３－ｓｃＦｖタンパク質の発現
ＦＭＣ６３は、従来のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲであり、３Ｇ１１は、突然変異したａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲである（特許出願番号２０１７１０３５７２１３．３）。
それぞれ１．５ｍｇのＫＬ２０６２９－２およびＫＬ２０７４３－１プラスミドを取って、ＰＥＩ法により２９３－６Ｅ細胞にトランスフェクトし、３７℃下でローラーボトルで７日間培養し、抗体精製のために細胞を収集する。
３．３Ｇ１１－ｓｃＦｖおよびＦＭＣ６３－ｓｃＦｖ抗体の精製
細胞培養産物３Ｇ１１－ｓｃＦｖ－ＦｃおよびＦＭＣ６３－ｓｃＦｖ－Ｆｃを遠心分離した後に上清を取り、ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過して細胞破片を除去し、ろ過した清澄液を収集する。１０ｍｌのＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅを使用して目的タンパク質を精製および収集する。収集した目的タンパク質をＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルターユニットＦｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）１５ｍｌ ３０Ｋで遠心分離して目的タンパク質を濃縮し、遠心分離したと、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰフィルターユニット０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｌｅでろ過し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００でＡ２８０を測定する方法でそれぞれ親和性および収量を決定する。４４０ｍｌのｓｕｐｅｒｄｅｘ２００モレキュラーシーブカラムを使用してさらに精製し、ピーク出力状況に従って主な目的タンパク質を収集し、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰフィルターユニット０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｌｅでろ過し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００でＡ２８０を測定する方法でそれぞれ最終抗体収量を決定する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＬＡＬメソッド（ｍｅｔｈｏｄ）を使用してＱＣを実行して、最終製品の品質を分析する。
二．マウスの免疫化および血清力価の検出
１．Ｈｏｃｋ免疫法
各マウスの抗原量は、１０ｕｇであり、抗原とＴｉｔｅｒＭａｘアジュバントとの比率は、１：１である。Ｇｒｏｕｐ２～３の１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスおよびＧｒｏｕｐ５～６の１０匹のＳＪＬマウスでｈｏｃｋ免疫を実施する。その後抗原の乳化を行う。カプセル型アマルガムブレンダーのスイッチを入れ、抗原、アジュバントおよびＰＢＳ混合物を含む１．５ｍｌの遠心分離チューブをカプセル型アマルガムブレンダーに入れ、ボルテックスして乳化し、抗原が完全に乳化して油中水の状態になるまで待つ。乳化した抗原およびアジュバントの混合物を１ｍｌの滅菌注射器に吸入し、７５％アルコールコットンボールを使用してマウスの両足の足首部位を拭き取り消毒し、注射器の針先は、目盛り付きの表面が上を向くように上向きに斜めにされ、針が足首と平行に挿入され、抗原およびアジュバントの混合物をゆっくりと注入する。免疫化が完了した後少なくとも２時間観察する。
２．腹腔内注射免疫法
免疫化プログラムに従って当該免疫化に必要な抗原の量を計算する。抗原とアジュバントとの比率は、１：１であり、必要に応じて抗原をＰＢＳで対応する濃度に希釈する。Ｇｒｏｕｐ１の５匹のＢａｌｂ／ｃマウスおよびＧｒｏｕｐ４の５匹のＳＪＬマウスを腹腔内注射して免疫する。その後抗原の乳化を行う。カプセル型アマルガムブレンダーのスイッチを入れ、抗原、アジュバントおよびＰＢＳ混合物を含む１．５ｍｌの遠心分離チューブをカプセル型アマルガムブレンダーに入れ、ボルテックスして乳化し、抗原が完全に乳化して油中水の状態になるまで待つ。気泡を取り除くように注意しながら、乳化した抗原およびアジュバントの混合物を２．０ｍｌの滅菌注射器に移す。右手でマウスの尻尾をつかみ、左手の親指および指し指でマウスの頭および首の皮膚を優しくつかみ、腹腔を上にして、７５％アルコールコットンボールでマウスの右腹部注射部位を拭く。事前に抗原薬を吸い上げた注射器の針先を、マウスの頭を下に向けて置き、皮膚を並行に刺した後、注射器を腹腔に対して４５度の角度でマウスの腹腔に挿入し、抗原およびアジュバントの混合物をゆっくりと注入し、免疫が完了した後に少なくとも４時間観察する。
３．マウス血清の収集
各マウスの対応する血清チューブ番号をマークし、マウスの耳のスタッド番号を確認し、片手でマウスをつかみ、マウスの上顎下静脈から約２００ｕｌの全血を収集し、収集した全血サンプルを室温で約１時間放置した後、遠心分離して遠心分離チューブ上部の血清を収集する。１週間以内に４℃の冷蔵庫に血清を保管して、抗体力価の中の関連実験の検出のために使用することができる。血清を長期間保存する場合、－８０℃の冷蔵庫に入れることができ、凍結融解を繰り返さないようにする。
４．ＥＬＩＳＡによる免疫マウスの血清力価の測定
実験開始前に、９６ウェルプレートに対応するマーカーを付け、１ｕｇ／ｍｌの抗原濃度、ウェルあたり５０ｕｌ、４℃冷蔵庫で一晩コーティングする。翌日、前日にコーティングした抗原プレートを取り出し、プレートウォッシャーで１回先勝する（洗浄液：１ｘＰＢＳＴ）。清洗後に１ＸＰＢＳＴで配置した１％ＢＳＡブロッキング溶液で３７℃下で１時間ブロッキングする。１ｘＰＢＳＴ洗浄液で３回プレートを洗浄した後、様々な希釈濃度の検出血清を加えて３７℃のインキュベーターに加えて１時間インキュベート１する。１ｘＰＢＳＴ洗浄液でプレートを３回洗浄した後、羊抗マウス二次抗体を加え、３７℃のインキュベーターで０．５時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液Ａ液およびＢ液を１：１の比率で混合して発色させる。１Ｎ塩酸で１５分間発色反応を停止させる。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５多機能プレートリーダーで４５０ｎｍの蛍光値を検出する。
５．免疫化されたマウスのＦＡＣＳ血清力価の測定
ＣＡＲＴおよびＰＢＭＣ細胞懸濁液を遠心分離した後に０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁してからカウントし、各グループの免疫化されたマウスから検出血清を加え、室温下で４０分間インキュベートした後に細胞を３回洗浄してからＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）－ＦＩＴＣ二次抗体を加え、室温下で暗所で３０分間インキュベートした後に細胞を３回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁し、マシンで検出する。
三．ハイブリドーマ細胞の融合およびスクリーニング
１．ＰＥＧ融合技術
融合の１週間前に、ＳＰ２／０を若返りについてスクリーニングし、１０％ＤＭＥＭ培地で増殖させる。犠牲にしたマウスの脾臓およびリンパ節を生物学的安全キャビネット取り出し、ペトリ皿で洗浄して粉砕し、混合して５０ｍＬの遠心分離チューブに収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去する。増殖させたＳＰ２／０を５０ｍＬの遠心分離チューブに収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去する。ＳＰ２／０およびリンパ球をそれぞれ無血清ＤＭＥＭ培地で再懸濁してからカウントし、ＳＰ２／０をＣｏｕｎｔ ｓｔａｒ自動セルカウンターでカウントし、リンパ球を血球計算盤でカウントする。ＳＰ２／０およびリンパ球を１：４の比率で混合し、１０００ｒｐｍで遠心分離して上清を除去する。細胞を分散させた後に３７℃で予熱した１．５ｍｌのＰＥＧを加え、添加しながら回転させながら１分以内に一定速度で添加を完了する。１．５分間静置した後、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで融合を停止し、５分間静置した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去する。１×ＨＡＴを含む２０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地で脾細胞の濃度を０．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングする。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し、細胞状態を毎日観察し、融合５日後に細胞融合率を統計する。融合したハイブリドーマ細胞を融合９～１４日後にスクリーニングし、陽性ウェル細胞を選択して２４ウェルプレートで増殖させる。
２．電気融合技術
融合１週間前に、ＳＰ２／０を若返りについてスクリーニングし、１０％ＤＭＥＭ培地で増殖させる。犠牲にしたマウスの脾臓およびリンパ節を生物学的安全キャビネット取り出し、ペトリ皿で洗浄して粉砕し、混合して５０ｍＬの遠心分離チューブに収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去する。２ｍｌの赤血球溶解液を加え、４℃下で３分間溶解した後に１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を５０ｍｌに加えてシストースを終結させる。状態が良好であるＳＰ２／０およびリンパ球を収集し、それぞれ５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、遠心分離し、上清を廃棄し、それぞれ無血清ＤＭＥＭに再懸濁した後にカウントし、ＳＰ２／０をＣｏｕｎｔ ｓｔａｒ自動セルカウンターでカウントし、リンパ球を血球計算盤でカウントする。ＳＰ２／０およびリンパ球を１：２の比率で混合し、１０００ｒｐｍで遠心分離して上清を除去する。インキュベートした１０ｍｌのＣｙｔｏｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃに細胞を再懸濁および混合し、３回洗浄した後、６ｍｌのＣｙｔｏｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃに細胞を再懸濁する。電気融合装置を始動し、設定されたプログラムに従って郵送させる。融合後、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃下で５％ＣＯ２インキュベーターで培養し、細胞状態を毎日観察し、融合５日後に細胞融合率を統計する。融合したハイブリドーマ細胞を融合９～１４日後にスクリーニングし、陽性ウェル細胞を選択して２４ウェルプレートで増殖させる。
３．限界希釈法による融合細胞のサブクローニング
１５％ＦＢＳを含むＨＴ培地を調製し、サブクローニングする必要のある細胞株を２４ウェル培養ウェルから再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ ＩＣ１０００型セルカウンターを使用して別紅カウントする。調製した２０ｍｌのＨＴ培地で各細胞株の細胞濃度を５～１０細胞／ｍｌに希釈し、希釈した細胞懸濁液を１５ｃｍの使い捨てペトリ皿に加え、９６ウェル培養プレートの各ウェルに０．２ｍｌを加え、各ウェルは、１～２個の細胞を含む。細胞のプレーティングした９６ウェルプレートを３７℃下、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて培養する。７～１０日後に、細胞の成長状況に応じてサブクローニングプレートを検出およびスクリーニングし、陽性クローンを２４ウェルに選択して要請をさらに確認する。
４．融合細胞のＥＬＩＳＡスクリーニング
１）抗原コーティング
ａ）二つのきれいな２５０ｍｌの低吸着リザーバーボトルを準備し、９６ウェルマイクロタイタープレートのように関連上を事前に記入する（例えば、アイテム番号、サンプル名称、濃度、日付およびオペレーター等）、
ｂ）それぞれピペットで１２．５ｍｌの２０ＸＰＢＳを二つの保管ボトルに入れ、２３７．５ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加えて１ＸＰＢＳに希釈し、
ｃ）サンプルチューブから２００ｕｌの３Ｇ１１－ｓｃＦｖ－ｈＦｃ（１．２５ｍｇ／ｍｌ）を取って保管ボトルの一つに追加し、１６１．３ｕｌのＮＣ－ｓｃＦｖ－ｈＦｃ（１．５５ｍｇ／ｍｌ）を別の保管ボトルに追加し、それぞれよく振って、最終濃度を１ｕｇ／ｍｌにし、
ｄ）できるだけ早く、上記の溶液をそれぞれ対応する９６ウェルマイクロタイタープレートに加え、４℃の冷蔵庫で一晩インキュベートする。
２）プレートの洗浄
ａ）２５０ｍｌの２０ＸＰＢＳを５Ｌの専用容器に入れ、４７５０ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加えて５Ｌの１ＸＰＢＳ溶液に希釈し、
ｂ）２．５ｍｌのトゥイーン２０を加え、０．０５％トゥイーン２０含有量を含む１ＸＰＢＳＴ洗液（１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に調製し、
ｃ）その後の使用のために、調製した１ＸＰＢＳＴ溶液を完全に混合した後にプレートウォッシャーに対応する保管ボトルに追加し、
ｄ）プレートウォッシャーの状態をチェックし、機器が正常に機能しかつ任意の目詰まりがないことを確認し、
ｅ）プレートウォッシャーの対応する禅譲プログラムを呼び出し、３００ｕｌ／ｗｅｌｌの１ＸＰＢＳＴでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを１回洗浄し、
ｆ）すべての洗浄が完了した後に機器の状態を再度確認し、目詰まりがないことを確認した後に、対応するメンテナンスプログラムを開始する。
３）ブロッキング
ａ）５０ｍｌの２０ＸＰＢＳをマークした１Ｌの保管ボトルに取り、９５０ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加えて１Ｌの１ＸＰＢＳ溶液に希釈し、
ｂ）天秤で１０．００ｇのＢＳＡを量り、保管ボトルに追加した後によく振ってＢＳＡを完全に溶解し、
ｃ）５００ｕｌのトゥイーン２０を吸引し、上記の溶液に加え、混合後、ブロッキング溶液および希釈緩衝液になり、後続の必要に応じて同じ方法で調製し（１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ）、
ｄ）ブロッキング溶液を２５０ｕｌ／ｗｅｌｌでＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃の恒温インキュベーターで１．５時間インキュベートし、ブロッキング終了後にブロッキング溶液を廃棄し、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートを－２０℃で保存することができる。
４）一次抗体の追加
ａ）ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートを３７℃の恒温インキュベーターに入れて解凍し、１回洗浄した後、対応するＥＬＩＳＡ検出プレートに融合プレートのクローン番号に応じた情報をラベル付け、
ｂ）１ｍｌの二つのチューブの同じ段階のハイブリドーマ細胞培地を取り、そのうちの１本のチューブには、１．００ｕｌのＦＢを陽性対照サンプルとして加え、別の１本の培地チューブは、陰性対照サンプルとし、
ｃ）５０ｕｌ／ｗｅｌｌの標準に従って、融合プレートハイブリドーマの上清液を対応するＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートに取り、予約ウェルにそれぞれ５０ｕｌの陰性対照サンプルおよび陽性対照サンプルに加え、
ｄ）上記のＥＬＩＳＡ検出プレートを３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした後、プレートウォッシャーで洗浄する。
５）プレートの洗浄
ａ）プレートウォッシャー状況をチェックし、機器が正常に機能しかつ任意の目詰まりがないことを確認し、ＰＢＳＴ洗浄液が足りない場合、段階２の調製を繰り返し、
ｂ）プレートウォッシャーの対応する洗浄プログラムを呼び出し、３００ｕｌ／ｗｅｌｌの１ＸＰＢＳＴでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、
ｃ）すべての洗浄が完了した後に機器の状態を再度確認し、目詰まりがないことを確認し、対応するメンテナンスプログラムを開始する。
６）二次抗体の追加
ａ）段階３の「ブロッキング」段階における調製した１００ｍｌの希釈緩衝液を取り、２０ｕｌのＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）－ＨＲＰ（１：５０００）を加え、ウェルあたり５０ｕｌの標準に従い、上記の二次抗体溶液を洗浄したＥＬＩＳＡ検出プレートに加え、
ｂ）３７℃の恒温インキュベーターに移して０．５時間インキュベートした後、プレートウォッシャーで洗浄する。
７）プレートの洗浄
ａ）プレートウォッシャーの状況をチェックし、機器が正常に機能してかつ任意の目詰まりがないことを確認し、ＰＢＳＴ洗浄液が足りない場合、段階２の「プレートの洗浄」段階における調製を繰り返し、
ｂ）プレートウォッシャーの対応する洗浄プログラムを呼び出し、３００ｕｌ／ｗｅｌｌの１ＸＰＢＳＴでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、
ｃ）すべての洗浄が完了した後に機器の状態を再度確認し、目詰まりがないことを確認し、対応するメンテナンスプログラムを開始する。
８）発色
ａ）洗浄したＥＬＩＳＡプレートを異なるコーティングサンプルに従って区別し、クローン番号のサイズに従って分類し、
ｂ）きれいな容器を取り、１：１の比率でＴＭＢ発色液を調製し、Ａ液ぷｐ簿Ｂ液をそれぞれ９０ｍｌを取って混合し、よく振とうし、
ｃ）ウェルあたり１００ｕｌの体積に応じて、調製したＴＭＢ発色液をＥＬＩＳＡ検出プレートに加え、１５分間発色させる。
９）終了
ａ）指定の試薬ボトルに８８０ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加え、８０ｍｌの塩酸を取り（ＡＲ．３６～３８％）、後で使用するために、ドラフト内で事前に希釈して１Ｎ塩酸溶液を取得し、後続の必要に応じて同じ方法で調製し（元の濃度は、１２Ｎである）、
ｂ）ウェルあたり５０ｕｌの体積に応じて、１ＮのＨＣｌをＥＬＩＳＡ検出プレートに加え、発色反応を停止する。
１０）プレートの読み取り
ａ）ＥＬＩＳＡプレートに対応するプレート番号またはクローン番号をマイクロプレートリーダーソフトウェアに事前に入力し、プレートを読み取るときにプレートを順番に配置しかつ注意深く確認し、
ｂ）発色反応終了後、すぐにマイクロプレートリーダーを使用して波長４５０ｎｍ下でプレートを読み取り分析を行い、必要なデータ結果をエクスポートし、アーカイブ用に指定された場所に保存またはアップロードする。
５．融合細胞のＦＡＣＳスクリーニング
１）細胞の収穫
ａ）１００ｕｌの細胞培養液を取り、細胞数のカウントに使用し、
ｂ）各実験に必要な量の細胞を含む細胞培養液を取り、遠心分離機を使用して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を捨て、
ｃ）等量のＦＡＣＳバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）（１ＸＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で細胞を再懸濁し（生細胞の濃度は、１．０２Ｅ６細胞／ｍｌ）、プレーティングの準備をする。
２）プレーティング
ａ）サンプル数に応じて配布し、対応するウェルにそれぞれ段階１）における１００ｕｌの細胞懸濁液を加え（ウェルあたりの最終的な生細胞数は、１．０２Ｅ５細胞である）、
ｂ）室温下で２０～３０分間ブロッキングした後、３００ｇ、４℃下で５分間遠心分離し、上清液を捨てる。
３）一次抗体の追加
ａ）１００ｕｌ／ｗｅｌｌの標準に従って、ハイブリドーマ上清液または対照サンプルを、対応するマイクロウェルプレートに取り、細胞を再懸濁し、
ｂ）上記の検出プレートを４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄する。
４）プレートの洗浄
ａ）２００ｕｌ／ｗｅｌｌのＦＡＣＳバッファーを加えて細胞を再懸濁し、遠心分離機を使用して３００ｇ、４℃下で５分間遠心分離し、上清液を捨て、
ｂ）上記の洗浄段階を繰り返す。
５）二次抗体の追加
ａ）３ｍｌのＦＡＣＳバッファーを取り、３ｕｌのＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）－Ａｌｅｘａ４８８（１：１０００）を加え、
ｂ）ウェルあたり１００ｕｌの標準に従って、上記の二次抗体溶液を、洗浄した検出プレートに加え、
ｃ）４℃の冷蔵庫に移して暗所で１時間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄する。
６）プレートの洗浄
ａ）２００ｕｌ／ｗｅｌｌのＦＡＣＳバッファーを加え、遠心分離機を使用して３００ｇ、４℃下で５分間遠心分離し、上清液を捨て、
ｂ）上記の洗浄段階を繰り返す。
７）オンボード
ａ）１００ｕｌの１ＸＰＢＳで段階６における細胞を再懸濁し、暗所でのオンボード分析を準備する。
四．特異的抗体の生産、精製およびマーカー
１．抗体の生産および精製
抗体の生産に必要な２．５％ＳＦＭ培養液を調製し（２．５％超低（ｕｌｔｒａ ｌｏｗ）ＩｇＧ ＦＢＳおよび１×Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含むＳＦＭ培養液）、顕微鏡下で抗体生産を必要とする細胞を観察し、≧７０％以上成長しかつ細胞の状態は良好であり、細胞を収集しかつＣｏｕｎｔｓｔａｒ ＩＣ１０００型セルカウンターでカウントする。調製したＳＦＭ培地で細胞濃度を１～５×１０５細胞／ｍｌに調節し、ローラーボトル（Ｒｏｌｌｅｒ Ｂｏｔｔｌｅ）に移す。移した細胞のローラーボトルを３７℃のローラーボトルインキュベーターに１０～１５日培養し、細胞の成長状況を毎日観察し、培養液がオレンジイエローに透明になったら、精製のために取り出す。
２．プロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａカラムによる細胞上清からの抗体精製
３．抗体ビオチンマーカー
ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）－ＮＨＳを無水ＤＭＦに溶解して、後で使用するために１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ溶液に調製する。マーカーする抗体を取り出し、それぞれ２本の１５ｍＬの遠心分離チューブに入れ、ＵＶ－ＮａｎｏｄｒｏｐのＩｇＧ作業モードを使用して抗体濃度を測定し、それぞれビオチン－ＮＨＳ（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を抗体に加え、２５℃の水浴に入れて３０分間反応させた後、１Ｍ塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を終了する。ビオチン結合抗体を透析バッグに入れ、４℃下で１×ＰＢＳ緩衝液で一晩透析する。最初の透析の４時間後に透析液を１回交換する。実験３日目の朝、ビオチン化抗体サンプルを透析バッグから取り出した後、２本のきれいな１５ｍＬの遠心分離チューブに入れ、ＢＣＡタンパク質濃度測定キットを使用してサンプル濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ方法を使用してビオチンマーカーの結果を検証する。
本発明のモノクローナル抗体も、当技術分野で知られている他の方法を使用してマーカーすることができる。
五．モノクローナル抗体の特性の検出
１．モノクローナル抗体サブクラスの同定
モノクローナル抗体サブクラスキットの説明書に従って、抗原媒介ＥＬＩＳＡ法を使用する。抗原コーティングマイクロタイタープレートにそれぞれ５０μＬ／ウェルの細胞培養上清を加え、３７℃下で１時間、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：１０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭサブクラス抗体５０μＬ／ウェルを毎回５分間加え、３７℃下で０．５時間インキュベートし、各モノクローナル抗体を各サブクラスの二つのウェルに加え、ＰＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄し、１：５０００に希釈したウサギ抗ヤギ酵素標識二次抗体５０μＬ／ウェルを加え、３７℃下で１５分間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、発色液ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）溶液５０μＬ／ウェルを加え、３７℃下で暗所で１０～１５分間発色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４５０μＬ／ウェルで反応を終了し、肉眼観察で他のウェルよりも色が有意に高い抗体に追加される抗体のサブクラスは、モノクローナル抗体のサブクラスである。
同定後、結果によると、モノクローナル抗体（３９８４－ｍａｂ００１－Ｈとして示される）の軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたとおりであり、具体的には、ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮである。
モノクローナル抗体の軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲ２）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであり、具体的には、ＹＴＳＲＬＲＳである。
モノクローナル抗体の軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたとおりであり、具体的には、ＱＱＧＤＴＬＰＹＴである。
モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたとおりであり、具体的には、ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＲＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＮである。
モノクローナル抗体の重鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されたとおりであり、具体的には、ＧＹＳＦＴＤＹである。
モノクローナル抗体の重鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲ２）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されたとおりであり、具体的には、ＤＰＹＮＧＧである。
モノクローナル抗体の重鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されたとおりであり、具体的には、ＴＹＤＮＹＥＦＡＹである。
モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されたとおりであり、具体的には、ＥＩＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＭＹＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＮＹＳＱＲＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＦＭＨＬＮＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＮＴＹＤＮＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡである。
[実施例２．抗体の調製]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に従って、モノクローナル抗体３９８４－ｍａｂ００１－Ｈ軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列を合成する。モノクローナル抗体３９８４－ｍａｂ００１－Ｈの重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡをリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を使用して接続した後、ｐＣＭＶベクターにクローニングし、モノクローナル抗体３９８４－ｍａｂ００１－Ｈの組換え発現プラスミドを得る。
組換えプラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培養上清液を収集し、アフィニティー精製後に検出する。前記モノクローナル抗体３９８４－ｍａｂ００１－Ｈを得る。
[実施例３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットの組立]
ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットの組立段階は、次のとおりである。
（１）ビオチンマーカーモノクローナル抗体（Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈとして示される）の調製：
実施例２で得られたモノクローナル抗体３９８４－ｍａｂ００１－Ｈを、標準的なビオチンマーカー法でマーカーして、ビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈを得る。２～１０ｍｇのモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈタンパク質を１ｍＬのリン酸塩緩衝液に溶解し、溶解したミリモルを計算し、ビオチンを室温に平衡化し、２ｍｇのＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ビオチンを１００μＬの超純水に加え、一定の濃度のビオチンを加え、室温下で３０分間または氷上で２時間置き、３０ｍＬのＰＢＳで精製カラムを前洗浄し、ローディングし、収集する同量の緩衝液を加え、単独のチューブに０．５ｍＬまたは１ｍＬを収集して、２８０ｎｍでの吸光値からモノクローナル抗体のタンパク質含有量を測定する。
（２）キットの組立
ミクロポーラスメンブレンプレート（例えば、９６ウェルメンブレンプレート）、ビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈ等の中の成分を、各キットにロードされたボトルの数に応じてキットのプラスチックブラケットに入れ、パッケージングしてキットに組み立て、キットに説明書を入れて、外側と側面のラベルを貼り付ける。
さらに、必要に応じて、キットには、希釈液、洗浄液（２０×）、ブロッキング溶液、陰性対照（例えば、完全１６４０培地）および陽性対照（ＦＭＣ６３ ｓｃｆｖ組換えタンパク質またはＩｇＧ）のうちの一つまたは複数が組み立てる。
キットにおいて、ミクロポーラスメンブレンプレート、ビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈは、ビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈでコーティングされたミクロポーラスメンブレンプレートに置き換えることもできる。
ビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈでコーティングするミクロポーラスメンブレンプレートの調製方法は、次のとおりである。
1)９６ウェルメンブレンプレート、２０μＬ／ウェル、３５％エタノール、プレウェットＰＶＤＦメンブレンを無菌的に開き、１分後に２５０μＬ／ウェル、１分／回、ＰＢＳで３回洗浄する。
2)９６ウェルメンブレンプレートに５μｇ／ｍＬのビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈを１００μＬ／ウェル加え、４℃下で一晩コーティングし、
3)コーティング液を捨て、滅菌済みＰＢＳでプレートを１分／回３回洗浄し、
4)１０％ウシ胎児血清を含む完全な１６４０培地、２００μＬ／ウェルを加え、３７℃下で２時間インキュベートおよびブロッキングし、
5)ブロッキング溶液を捨て、ＰＢＳでプレートを１回洗浄し、３７℃で２時間乾燥させ、乾燥剤を加え、９６ウェルメンブレンプレートを密封バッグに入れ、真空シールし、４℃下で保存される。
Figure 2023503968000001
[実施例４．ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲの発現の検出における本発明のモノクローナル抗体の効果]
１．実験材料：
１）対照群：市販製品は、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ会社から購入し、モデルは、ＣＤ１９－Ｈ８２５９である。
対照群製品の最初の実験方法：ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を蘇生させ（ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖである）、１００μｌのビオチン化ヒトＣＤ１９、Ｆｃタグ（５μｇ／ｍｌ）を加え、室温下で２０分間インキュベートした後、５μｌのＰＥ ａｎｔｉ－ビオチンを加え、室温下で暗所で２０分間インキュベートした後、１回洗浄し、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）で検出する。
対照群製品を最適化した後の実験方式：ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を蘇生させ（ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖである）、１００μｌのビオチン化ヒトＣＤ１９、Ｆｃタグ（１０μｇ／ｍｌ）を加え、４℃下で１時間インキュベートした後、５μｌのＰＥ ａｎｔｉ－ビオチンを加え、室温下で暗所で２０分間インキュベートした後、３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘおよびＡｔｔｕｎｅ）で検出する。
２）実験群：本発明のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ抗体群：ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を蘇生させ（ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖである）、本発明の実施例３で得られたキット中のビオチンマーカーモノクローナル抗体Ｂｉｏ－３９８４－ｍａｂ００１－Ｈを加え、２０分間染色し、５μｌのＰＥ ａｎｔｉ－ビオチンを加え、室温下で暗所で２０分間インキュベートした後、１回洗浄し、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘおよびＡｔｔｕｎｅ）で検出する。
前記各グループには、並行実験の三つのグループが設定される。
２．実験結果：
図２～４に示されるように、ようやく結果は、表２に示されるように、ＣＤ１９抗原タンパク質は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ発現（１４．２４±５．１５％、ＲＳＤ＝３６．２０％）を安定的に検出できなかったが、本発明のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ抗体は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ発現（４７．８８±０．６５％、ＲＳＤ＝１．３５％）を安定的に検出でき、両方ともＰ＝０．００４である。
Figure 2023503968000002
[実施例５．ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を効果的にブロッキングできる本発明のモノクローナル抗体]
それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの本発明のモノクローナル抗体（実施例２で得られたモノクローナル抗体３９８４－ｍａｂ００１－Ｈ）を使用してＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をブロッキングし（ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖである）、その後１：１および５：１のエフェクター：標的比下で、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞またはＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞に対する殺傷状況を検出する。具体的には、ＬＤＨの放出量を検出することにより、細胞が殺傷された比率を計算する。
結果は、図５および表３に示されるように、エフェクター：標的比が５：１であり、抗体濃度が５μｇ／ｍｌである場合、本発明のモノクローナル抗体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞の殺傷を顕著に阻害することができ、殺傷率は、５１．５％から３９．１％に低減し、抗体濃度が２５μｇ／ｍｌに増加される場合、殺傷率を３２％にさらに低減することができる。また、エフェクター：標的比が１：１であり、抗体濃度が２５μｇ／ｍｌである場合、本発明のモノクローナル抗体は、すでに低レベルにある殺傷率を１６．０％から６．５％に低減させることができる。上記の結果から、本発明のモノクローナル抗体は、低濃度でＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して優れたブロッキング効果を示し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果を阻害し、本発明のモノクローナル抗体がＣＤ１９ ＣＡＲ上のｓｃＦｖフラグメントを特異的に識別することができ、優れた検出感度を有することを示す。
Figure 2023503968000003
対照的に、同様の試験において、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖに対する現在知られている抗体は、５μｇ／ｍｌの用量および５：１のエフェクター：標的比の状況下で、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖである）を標的とする殺傷効果を効果的に阻断することはできない。これは、本発明のモノクローナル抗体がより高い感度およびより良好なブロッキング性能を有することを示し、従って、それは、ＣＡＲの細胞外結合ドメインがＦＭＣ６３ ＳｃＦｖであるＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷性能の検出、および品質管理に適する。
上記の実施例は、本発明で開示された実施形態を説明することを意図しており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。さらに、本明細書に記載の様々な愁傷、ならびに本発明の方法および組成物の変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明の様々な具体的な好ましい実施形態に関連して本発明を詳細に説明されてきたが、本発明は、これらの具体的な実施例に限定されるべきではないことを理解されたい。事実上、本発明を得るために当業者に明らかである上記のような様々な改変は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (12)

  1. 軽鎖および重鎖を含む、ＣＡＲ分子に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記軽鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるＣＤＲ領域を含み、前記重鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～７に示されるＣＤＲ領域を含む、モノクローナル抗体。
  2. 以下の特徴：
    １）前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたとおりである;
    ２）前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されたとおりである;
    ３）前記モノクローナル抗体は、マウス由来である;
    ４）前記モノクローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３から選択される
    の一つまたは複数をさらに有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 請求項１または２に記載のモノクローナル抗体の、重鎖および／もしくは軽鎖の可変領域または全長アミノ酸をコードする、ポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニング部位に挿入することによって構築される、構築体。
  5. 請求項４に記載の構築体を含み、または染色体に組み込まれた請求項３に記載のポリヌクレオチドを有する、宿主細胞。
  6. 請求項４に記載の構築体を宿主細胞にトランスフェクトすることによって構築される、請求項５に記載の宿主細胞。
  7. 請求項１または２に記載のモノクローナル抗体の調製方法であって、
    前記モノクローナル抗体の発現に適した条件下で、請求項５または６に記載の宿主細胞を培養することにより、前記モノクローナル抗体を発現させ、ならびに前記モノクローナル抗体を精製および分離する工程を含む、調製方法。
  8. ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出試薬の調製のための、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体の使用。
  9. 捕捉リガンドおよび検出リガンドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットであって、前記捕捉リガンドは、接続された第１のリガンドおよび第１のリガンド標識を含み、前記第１のリガンドは、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体であり、前記検出リガンドは、第２のリガンドを含み、前記第２のリガンドは、前記捕捉リガンドを識別するために使用される、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キット。
  10. 以下の特徴：
    ａ．前記捕捉リガンドは、ＣＡＲ分子のｓｃＦｖドメインに結合することができる;
    ｂ．前記第１のリガンド標識は、ビオチンまたはアルカリホスファターゼから選択される;
    ｃ．前記検出リガンドに蛍光分子が結合している;
    ｄ．前記第２のリガンドは、ストレプトアビジンおよびＩｇＧのうちの一つまたは複数から選択される;および
    ｅ．前記キットは、１）支持体、２）停止溶液、３）希釈液、４）洗浄液、５）ブロッキング溶液、６）陰性対照、および７）陽性対照の中の一つまたは複数をさらに含む
    の一つまたは複数をさらに含む、請求項９に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キット。
  11. ＣＡＲ－Ｔ細胞検出のための、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の構築体、請求項５に記載の宿主細胞または請求項９もしくは１０に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キットの使用。
  12. ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出方法であって、以下の工程:
    １）試験サンプルに請求項１もしくは２に記載のモノクローナル抗体または請求項９もしくは１０に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キット中の捕捉リガンドを加えて、インキュベートした後に遠心分離して、第１の沈殿物を得る工程;
    ２）前記第１の沈殿物に請求項１もしくは２に記載のモノクローナル抗体を識別するための検出リガンドまたは請求項９もしくは１０に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の検出キット中の検出リガンドを加え、インキュベートした後に遠心分離して、第２の沈殿物を得る工程;および
    ３）前記第２の沈殿物に対してフロー検出を行い、試験サンプル中のＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ＋細胞含有量を獲得する工程
    を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出方法。
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