CN117624362A - 一种抗人cd20抗体或其抗原结合片段及其制备方法与应用 - Google Patents
一种抗人cd20抗体或其抗原结合片段及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了一种抗人CD20抗体或其抗原结合片段，其轻链可变区具有如SEQ ID NO:1‑3所示的氨基酸序列，或与其相比具有至少1个氨基酸差异；重链可变区具有如SEQ ID NO:4‑6所示的氨基酸序列，或与其相比具有至少1个氨基酸差异。本发明提供的鼠抗人CD20抗体与商品化抗人CD20抗体亲和力接近，特异性良好，可特异性识别封闭CD20靶抗原。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗人CD20抗体或其抗原结合片段及其制备方法与应用。
背景技术
CD20作为抗体类药物中十分重要的靶点，是一种由279个氨基酸组成的跨膜磷蛋白，同时也是特有的、存在于人类B淋巴细胞表面的标识，相对分子质量为33000-37000，有4个跨膜结构域，其中，主要的抗原表位位于细胞质膜内侧的第三及第四跨膜区之间。CD20表达于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的B细胞)外的发育分化各阶段的B细胞表面，通过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起调节作用。B淋巴细胞抗原CD20是在B淋巴细胞表面表达的糖基化磷蛋白，是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，在95％以上的B细胞淋巴瘤中均有表达。
CD20在正常生理组织和肿瘤组织中的差异性表达使CD20可以作为一个辨识度良好的B细胞疾病的靶点。近30年来，已有针对约20个药物靶点的80多种抗体药物获批上市，其中有4个药物靶点研究较广、成药较多。靶向CD20抗体的抗肿瘤活性主要包括诱导凋亡作用、补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，型和 型CD20抗体作用于CD20的位点不同，其主要作用机制也不同。
中国专利申请201910991541.8公开了一种抗CD20抗体制剂及其应用，抗体制剂包含以下浓度的组分：15-80mg/mL抗CD20抗体，10-30mM缓冲剂，80-240mM稳定剂，0.1-0.4mg/mL表面活性剂，液体制剂的pH值为5.5-6.2。该抗体制剂具有良好的稳定性。
中国专利申请200610160713.X公开了一种功能人源化抗人CD20抗体及其应用。该功能人源化抗人CD20抗体，其特异于CD20。该功能人源化抗人CD20抗体具有较低的免疫原性，经实验证明具有跟其鼠源母抗体一样的特异性和亲和力。以本发明的功能人源化抗人CD20抗体及其衍生物为活性成分的药物可以在治疗患有CD20高度表达量的癌症或免疫系统疾病引起的疾病如风湿性关节炎，红斑狼疮等中得到广泛应用。
目前本领域需要更多的抗人CD20抗体。
发明内容
为了实现上述技术目的，本发明特此提出了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗人CD20抗体或其抗原结合片段，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；
其中轻链可变区具有：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的LCDR3；或
(2)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比具有至少1个氨基酸差异的LCDR1、与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的LCDR2和与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的LCDR3；
重链可变区具有：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的HCDR3；或
2)与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相比具有至少1个氨基酸差异的HCDR1、与SEQID NO:5所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的HCDR2和与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的HCDR3；
其中所述氨基酸差异通过氨基酸添加、取代、缺失、替换或修饰实现。
在一些实施方式中，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在一些实施方式中，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在一些实施方式中，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的轻链具有如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在一些实施方式中，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的重链具有如SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
SEQ ID NO:1：SASSFITYMH。
SEQ ID NO:2：DTSKLAS。
SEQ ID NO:3：QQWNSNPPT。
SEQ ID NO:4：SYNIH。
SEQ ID NO:5：AIYPGNGDTSHNQKFKG。
SEQ ID NO:6：SRRYDGDWSFDV。
SEQ ID NO:7：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSFITYMHWFQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGGGTKLEIKRA。
SEQ ID NO:8：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNG DTSHNQKFKGKATLTADRSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARSRRYDGDWSFDVWGAGT TVTVSS。
SEQ ID NO:9：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSFITYMHWFQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
编码SEQ ID NO:9的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示：
CAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGCCATCATGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAGGTGA
CCATGACCTGCAGCGCTAGCAGCTTCATCACCTACATGCACTGGTTTCAGCAGAAGAG
CGGCACAAGCCCTAAGAGATGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCTAGCGGCGTGCCT
GCTAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACAAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGG
AGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGTCAGCAGTGGAACAGCAACCCTCCTACCTT
CGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAGCCGACGCCGCCCCTACCGTGAGCAT
CTTCCCTCCTAGCAGCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCTAGCGTGGTGTGCTTCCTG
AACAACTTCTACCCTAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGA
CAGAACGGCGTGCTGAACAGCTGGACCGACCAAGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC
ATGAGCAGCACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGAGACACAACAGCTACACC
TGCGAGGCCACCCACAAGACAAGCACAAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAACAGAAACGAGTGC。
SEQ ID NO:10：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSHNQKFKGKATLTADRSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARSRRYDGDWSFDVWGAGTTVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK。
编码SEQ ID NO:10的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示：
CAAGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCACAAGCTACAACATCCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGCCAAGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCTGGCAACGGCGACACAAGCCACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGTTCAGCAGCCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAAGCAGAAGATACGACGGCGACTGGAGCTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGCCAAGACCACCGCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGTGTGCGGCGACACCACCGGCAGCAGCGTCACCCTCGGATGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACCCTGACATGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTGACAAGCAGCACCTGGCCTAGCCAAAGCATCACCTGCAACGTGGCCCACCCTGCTAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAGATCGAGCCTAGAGGCCCTACCATCAAGCCTTGCCCTCCTTGCAAGTGCCCTGCCCCTAACCTGCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCATCTTCCCTCCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCAGCCTGAGCCCTATCGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTGAGCGAGGACGACCCTGACGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACCGCTCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGAGCGCCCTGCCTATTCAGCACCAAGACTGGATGAGCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCCCCTATCGAGAGAACCATCAGCAAGCCTAAGGGCAGCGTGAGAGCCCCTCAAGTGTACGTGCTGCCTCCCCCTGAGGAAGAGATGACCAAGAAGCAAGTGACCCTCACCTGCATGGTGACCGACTTCATGCCTGAGGACATCTACGTGGAGTGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAGAAGAAGAACTGGGTGGAGAGAAACAGCTACAGCTGCAGCGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCAGAACCCCTGGCAAG。
第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码前述任一CD20抗体或其抗原结合片段。
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，其包含前述分离的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述重组表达载体包括真核表达载体、原核表达载体。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含前述重组表达载体。
第五方面，本发明提供了前述任一抗人CD20抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括以下至少一种步骤：
(Ⅰ)将前述的分离的多核苷酸或重组表达载体导入宿主细胞，培养细胞后纯化、收集抗人CD20抗体或其抗原结合片段；
(Ⅱ)培养前述的宿主细胞，培养细胞后纯化、收集抗人CD20抗体或其抗原结合片段。
第六方面，本发明提供了一种用于非诊断目的的CD20蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
Ⅰ)将待检测样品与前述任一抗人CD20抗体或其抗原结合片段、或包含前述任一抗人CD20抗体或其抗原结合片段的荧光标记抗体孵育；
Ⅱ)检测样品中是否有抗体-抗原结合物，或通过流式细胞检测是否存在荧光。
本发明提供的鼠抗人CD20抗体与商品化抗人CD20抗体亲和力接近，特异性良好，可特异性识别封闭CD20靶抗原。
附图说明
图1示出了商品化鼠抗人CD20抗体Biolengend[2H7]和本发明的ZXClone-HCD20-07抗体的SDS凝胶电泳图。
图2为商品化Biolegend鼠抗人CD20[2H7]-FITC流式检测图。
图3为本发明的鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]-FITC流式检测图。
图4为商品化Biolegend鼠抗人CD20[2H7]-PE流式检测图。
图5为本发明鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]-PE流式检测图。
图6和图7为商品化Biolegend鼠抗人CD20[2H7]效价检测图。
图8和图9为本发明的鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]效价检测图。
图10为对照组的特异性检测结果。
图11为本发明的鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]特异性检测图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)、Ausubel，F.M等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-lnterscience的出版中也进行了描述。
本文所用的术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单域抗体。术语“抗体”，是指包含由二硫键(S S)相互连接的重链(H)和轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为VH)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。轻链分为两类分别为kappa型轻链和lambda型轻链(例如本发明中轻链恒定区Cκ/λ表示轻链恒定区为kappa型轻链或者lambda型轻链)。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(也称互补决定区(CDR))，其间插有较保守的构架区或框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。
本文所用的术语抗体(“亲代抗体”)的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。
本文所用的术语“高变区”、“超变区”、“互补决定区”、“HVR”或“CDR”，是指在抗体可变结构域区域中序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR或CDR：三个存在于VH中(H1、H2、H3)，三个存在于VL中(L1、L2、L3)。基于Chothia定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L26-L32(L1)、L50-L52(L2)、L91-L96(L3)、H26-H32(H1)、H52-H56(H2)和H96-H101(H3)处(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。基于Kabat定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L24-L34(L1)、L50-L56(L2)、L89-L97(L3)、H31-H35(H1)、H50-H65(H2)和H95-H102(H3)处(Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,the fifth edtion,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))。基于IMGT定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L27-L32(L1)、L50-L51(L2)、L89-L97(L3)、H26-H33(H1)、H51-H56(H2)和H93-H102(H3)处(Honjo,T.和Alt,F.W.(1995)Immunoglobulin genes.Academic Press pp.3-443)。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于CDR移植的抗体人源化设计的参考工具(参见J MolBiol.273:927-48,1997)。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本公开请求保护的范围是基于Kabat定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
实施例1抗人CD20抗体的制备和检测
1.1抗人CD20抗体的制备
发明人制备了抗人CD20抗体，编号为ZXCloneHCD20-07。
CD20[ZXCloneHCD20-07]的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。常规方法设计表达CD20[ZXCloneHCD20-07]的核苷酸序列，编码SEQID NO:9的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码SEQ ID NO:10的核苷酸序列如SEQ IDNO:12。将上述核苷酸序列克隆至CHO稳转株后进行抗体稳转表达，进一步将构建载体导入CHO细胞后，培养细胞后使用protein A亲和层析进行抗体纯化，得到CD20[ZXCloneHCD20-07]。
抗体具体的制备步骤如下所示：
(1)CHO细胞使用CHO CD培养基培养，2×105cells/mL接种，加4mM谷氨酰胺。细胞密度达到4×106cells/mL，活力大于95％，离心收集细胞，使用电转缓冲液重悬细胞，调整密度到1×107cells/mL。
(2)取无菌的EP管，加入0.8mL细胞悬液，加入5μg质粒，轻轻混匀，孵育15min，冰浴5min。电转仪设置参数为电压280V，脉冲次数3次，脉冲时间5ms，脉冲间隙0.784s，电转杯内径4mm。在每个电转杯中加入0.5mL细胞和质粒的混合液，放入电转仪启动电击程序，完成后迅速将电转杯中的细胞吸出，转移到装有20mL CHO CD培养基的125mL锥形瓶中，重复上述步骤电击第二个电转杯。轻轻混合摇瓶中的细胞，然后盖紧盖子置于37℃摇床中培养。
(3)48h后，将细胞转移到离心管中1000rpm离心5min。去掉上清，用20mL的含有2、5、20μM MSX的CHO CD培养基重悬细胞，计算细胞密度和活性。细胞密度在1.2×106cells/mL左右。
(4)将细胞转移到新的摇瓶中。从第七天开始，每两天观测细胞密度和活性。细胞密度从开始的1.2×106cells/mL往下降低，在第5-7天到达密度最低值，在第10-15天开始，细胞密度升高。当细胞密度升高到1×106cells/mL后，使用含有50μM MSX的CD OPM培养基将细胞传代到细胞密度3×105cells/mL，继续培养。
(5)当细胞密度增长到4×106cells/mL后，使用含有50μM MSX的CD OPM培养基将细胞扩增或传代，最低接种密度仍是3×105cells/mL，可以开始准备冻存或扩大培养。
(6)抗体收集方法：使用protein A亲和层析进行抗体纯化。
1.2抗体的检测
取商品化的CD20抗体(Biolengend，货号：302350)10μg。将上述制备的CD20[ZXCloneHCD20-07]10μg，与上样缓冲液混合(抗体与上样缓冲液的体积比为4：1)，100℃水浴30min，10000rpm室温离心1min后得到待测样品。取出预制胶安装于电泳槽内，注入电泳缓冲液，拨梳子，上样。其中，蛋白Marker上样10μL，待测样品上样10μg；电泳仪设置：电压80V，电泳时间90min，溴酚蓝指示带至底部时即可结束电泳；取出凝胶放于考马斯亮蓝染色30min，置于脱色液中脱色1h，重复5次后，拍照。
结果显示，本实施例制备得到的抗人CD20抗体重链、轻链完整，条带清晰，纯度达到90％以上，结果见图1。
实施例2抗人CD20抗体标记
分别使用FITC(异硫氰酸荧光素)、PE标记CD20[ZXCloneHCD20-07]。
2.1FITC标记
取CD20[ZXCloneHCD20-07]0.2mg于超滤管内，用浓度1mM的PBS洗涤抗体3次后。4000g，2min倒立离心超滤管，收集浓缩抗体，用浓度为1mM的PBS稀释至10mg/mL。
(2)取小分子染料FITC(按n(摩尔质量)抗体：n(摩尔质量)FITC＝1：15加染料)加入单克隆抗体反应液中，混匀。
(3)25℃室温，于振荡器上避光反应45min。
(4)转移反应液于超滤离心管内，用浓度1mM的PBS洗涤抗体5次后。4000g，2min倒立离心超滤管，收集浓缩抗体，用浓度1mM的PBS稀释抗体终浓度为0.5mg/mL。
标记后的抗体记为CD20[ZXCloneHCD20-07]-FITC。
2.2PE标记
按照“荧光蛋白和/或偶联蛋白单克隆抗体标记方法及其试剂盒(CN202010972671.X)”专利所述方法标记CD20[ZXCloneHCD20-07]，标记后的抗体记为CD20[ZXCloneHCD20-07]-PE。
2.3荧光标记抗体效果检测
1)于1.5mL离心管中加入100μL细胞质控品(Beckman Coulter，货号：6607077)；
2)取1μL的荧光标记抗体CD20[2H7]-FITC和CD20[2H7]-PE分别加入样本中；取5μL的对照荧光抗体CD20[2H7]-FITC(Biolegend，货号：302303)、CD20-[2H7]-PE(Biolegend，货号：980214)。
3)上述4个样品均避光反应15分钟。
4)加入1mL溶血素，继续反应15分钟，溶血素选用正熙流式细胞仪用溶血素( 溶血素：浙湖械备20200133号)。
5)4000rpm离心2min，弃上清，加入500μL PBS重悬待检测样本。
6)流式细胞仪(贝克曼DxFLEX流式细胞仪)检测样本阳性细胞检测比例、图谱分群情况等指标，进而确定CD20[2H7]-FITC和CD20[2H7]-PE是否能标记上荧光染料FITC和PE，以及标记的荧光抗体检测靶抗原的是否正确。
结果显示，FITC成功标记鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]，鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]与商品化CD20[2H7]-FITC比例相近(图2-图5)。
实施例3抗人CD20抗体效价测定
首先，将已知浓度的商品化CD20[2H7]抗体(Bioegend，货号：302350)，抗体CD20[ZXCloneHCD20-07]稀释为1mg/mL，然后用PBS按1：100，1：1000，1：3000，1：6000，1：12000，1：24000，1：48000，1：60000，1：96000比例再次对抗体进行稀释。CD20[ZXCloneHCD20-07]作为实验组，商品化CD20抗体作为对照组。
实验组为两组，对照组一组，每组取100μL健康人血或者企业参考品。向3组实验中分别加入1mL溶血素(溶血素：浙湖械备20200133号)，继续反应15min。4000rpm离心2min，弃上清。
实验组分别加入按比例稀释的100μL CD20[ZXCloneHCD20-07]，对照组加入按比例稀释的100μL商品化抗人CD20[2H7]抗体，
涡旋混匀，室温避光孵育15min。加入900μL PBS重悬混匀样本，4000rpm离心2min，弃上清。加入100μL PBS，涡旋混匀。向每组中加入1μL羊抗鼠IgG-PE商品化流式荧光抗体(Biolgend，货号：405307)，涡旋混匀，室温避光孵育15分钟。加入900μL PBS重悬混匀样本，4000rpm离心2min，弃上清。再加入1000μL PBS重悬混匀样本，4000rpm离心2min，弃上清。加入500μL PBS重悬待检测样本，上流式细胞仪检测。
结果显示，商品化CD20[2H7]抗体，其亲和力(kd)为：195.4(1mg/mL)，自制鼠抗人CD20[ZXCloneHCD20-07]抗体，其亲和力(kd)为：189.8(1mg/mL)，见(图6-图9)。
结果表明，CD20[ZXCloneHCD20-07]和商品化CD20[2H7]的亲和力相近。
实施例4抗人CD20抗体特异性测定
本实施例1选用的抗体为：
商品化CD20抗体(Biolegend，货号：302350)
实施例1制备的CD20[ZXCloneHCD20-07]；
小鼠同型对照抗体(Biolegend，货号：400100)
商品化荧光抗体CD20[2H7]-PE(厂家：Biolegend，货号：980214)
抗体特异性检测方法：
淋巴细胞获取，取100μL人外周血样本(湖州正熙医学检验所，样本编号：02-056)。加入1mL溶血素，继续反应15分钟，溶血素选用正熙流式细胞仪用溶血素( 溶血素：浙湖械备20200133号)。4000rpm离心2min，弃上清，加入100μLPBS重悬样本。
实验组：在上述的其中一个样本中加入CD20[ZXCloneHCD20-07]3μL，避光反应15分钟后，加入500μL PBS重悬样本，4000rpm离心2min，弃上清，再加入100μL PBS重悬样本。在经纯抗CD20[ZXCloneHCD20-07]封闭后的样本中加入5μL CD3-APC和5μL BiolegendCD20[2H7]-PE。
对照组：在上述的一个样本中加入小鼠同型对照抗体纯抗3μL，避光反应15分钟后，加入500μL PBS重悬样本，4000rpm离心2min，弃上清，再加入100μL PBS重悬样本。在重悬样本分别加入5μL CD3-APC和5μL Biolegend CD20[2H7]-PE。
所有样本避光反应15分钟后。加入500μL PBS重悬样本，4000rpm离心2min，弃上清，再加入500μL PBS重悬样本。
流式细胞仪(安捷伦NovoCyte流式细胞仪)检测样本阳性细胞比例、图谱分群情况等指标，进而确定CD20[ZXCloneHCD20-07]是否能特异性识别CD20靶抗原。
结果显示，实验组中有CD3-APC信号，无CD20[2H7]-PE荧光抗体的信号。对照组，同型对照抗体无法封闭，有CD20[2H7]-PE的荧信号。以此说明，两个由CHO制备所得的CD20抗体，克隆号CD20[ZXCloneHCD20-07]，能特异性识别封闭CD20靶抗原(图10-图11)。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种抗人CD20抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；
其中轻链可变区具有：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的LCDR3；或
(2)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比具有至少1个氨基酸差异的LCDR1、与SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的LCDR2和与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的LCDR3；
重链可变区具有：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的HCDR3；或
2)与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相比具有至少1个氨基酸差异的HCDR1、与SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的HCDR2和与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比至少具有1个氨基酸差异的HCDR3；
其中所述氨基酸差异通过氨基酸添加、取代、缺失、替换或修饰实现。
2.根据权利要求1所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与如SEQID NO:7所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
4.根据权利要求3所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的轻链具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
5.根据权利要求4所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的重链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1-5中任一所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段。
7.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求6所述的分离的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求7所述的重组表达载体。
9.一种根据权利要求1-5中任一所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下至少一种步骤：
(Ⅰ)将权利要求6所述的分离的多核苷酸或权利要求7所述的重组表达载体导入宿主细胞，培养细胞后纯化、收集抗人CD20抗体或其抗原结合片段；
(Ⅱ)培养权利要求8所述的宿主细胞，培养细胞后纯化、收集抗人CD20抗体或其抗原结合片段。
10.一种用于非疾病诊断目的的CD20蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
Ⅰ)将待检测样品与权利要求1-5中任一所述的抗人CD20抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求1-5中任一所述抗人CD20抗体或其抗原结合片段的荧光标记抗体孵育；
Ⅱ)检测样品中是否有抗体-抗原结合物，或通过流式细胞检测是否存在荧光。
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2023
- 2023-12-04 CN CN202311647142.2A patent/CN117624362A/zh active Pending
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