CN117069846A - 一种抗人cd8抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗体领域,具体涉及一种抗人CD8抗体及其制备方法和应用。所述抗人CD8抗体重链CDR区氨基酸序列选自SEQ ID NO:1‑3和/或SEQ ID NO:7‑9,轻链CDR区氨基酸序列选自SEQ ID NO:4‑6和/或SEQ ID NO:10‑12。通过验证证明了本发明表达纯化的抗体能够特异性识别人CD8抗原,抗体表达产量达到g/L级别,远远高于传统的杂交瘤细胞制备抗体的产量。且相较于市售抗体具有更高的亲和力,有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于抗体领域,具体涉及一种抗人CD8抗体及其制备方法和应用。
背景技术
CD8分子是一种白细胞抗原,为部分T细胞表面所具有的一种糖蛋白,用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导,又称为TCR的共受体。表达CD8的T细胞又被称为CD8+T细胞,通常在活化后分化为细胞毒性T细胞(CTL),能够特异性地杀伤靶细胞。
肿瘤组织中免疫细胞的数量、类型和空间分布的表征可以提供关于癌症诊断、预后、疗法选择和对疗法的反应的关键信息。因此,CD8+细胞毒性淋巴细胞在各种癌症中具有诊断和预后意义。目前检测CD8+细胞的方法需要从外周血或相关组织中检测细胞。但此类方法准确率底,并且不能反映体内CD8+细胞的数量或动态信息。现有技术中还使用放射性标记的示踪剂的正电子发射断层扫描(Positron Emission Tomography,PET)进行检测,但示踪剂的使用受到放射性同位素半衰期和细胞分裂的限制,导致体内探针稀释。因此,本领域仍然需要进一步开发用于监测体内CD8+细胞或CD8分子的方法和试剂。
抗人CD8抗体是当前较适于实际检测的手段,传统诊断检测抗体都是通过动物杂交瘤的方式制备,在制备这些抗体时,由于杂交瘤不稳定,抗体基因容易丢失。此外,传统的杂交瘤制备技术不会对目标抗体的基因序列及蛋白序列进行鉴定,不利于对目标抗体后续的生产,制备及研发工作。基因工程方法构建稳转细胞株并进行抗人CD8抗体的表达能能否明显提升CD8抗体的生产效率。通过基因工程制备CD8抗体,就需要更多地开发抗人CD8抗体的新序列类型。
现有技术中已经公开了一些关于CD8抗体的研究。如申请号为CN202211258082.0的中国专利申请中公开的一种抗CD8抗体及其应用,所述抗CD8抗体包括轻链恒定区、轻链可变区、重链恒定区和重链可变区;该发明的抗CD8抗体能够从人外周血单个核细胞中富集分选CD8+T细胞,即对CD8+T细胞起到检测作用。再如申请号为CN201880053140.1的中国专利中公开了抗CD8抗体、放射性标记的抗CD8抗体、荧光标记的抗CD8抗体,能够用于检测个体或样品中CD8蛋白的存在。
不断开发抗CD8抗体的种类可以使CD8分子相关的检测领域进一步发展。
发明内容
本发明提供了一种抗人CD8抗体,并对其多项性能进行了验证,以期提供抗体性能更好的产品。
术语:
本发明中,CDR(complementarity-determining regions,CDR)为互补决定区或互补决定簇,位于免疫球蛋白的超变区,超变区是抗体的抗原结合位,与抗原决定簇的结构互补,一般包括CDR1、CDR2、CDR3,抗体包括重链和轻链时,重链和轻链有各自的互补决定区。
本发明中,可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域。
本发明中,重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的链(H链);轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的链(L链)。
本发明中,相似性指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性和可取代氨基酸所占的比例。
本发明中,单克隆抗体一般理解为由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
本发明中,鼠源化抗体可以通过将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合,得到的鼠杂交融合细胞分泌的抗体。
一方面,本发明提供了一种抗人CD8抗体。
所述的抗人CD8抗体包括重链和轻链,所述的重链包括重链可变区,所述的轻链包括轻链可变区;所述的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中:
(1)HCDR1为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;
(2)HCDR2为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列;
(3)HCDR3为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列;
(4)LCDR1为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列;
(5)LCDR2为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列;
(6)LCDR3为SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
优选地,所述的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.13-14中的任一,或与SEQID NO.13-14任一具有80%以上序列相似性且CDR区不变的序列;
所述的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.15-16中的任一,或与SEQ IDNO.15-16任一具有80%以上序列相似性且CDR区不变的序列。
进一步优选地,所述的抗人CD8抗体重链氨基酸序列为SEQ ID NO.17-18中的任一,或与SEQ ID NO.17-18任一具有65%以上序列相似性且CDR区不变的序列;
所述的抗人CD8抗体轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.19-20,或与SEQ ID NO.19-20具有65%以上序列相似性且CDR区不变的序列。
优选地,所述的抗人CD8抗体为单克隆抗体;进一步优选为鼠源化抗体。
另一方面,本发明提供了表达前述的抗人CD8抗体的核酸。
本领域技术人员知晓,根据碱基简并原则,在知晓前述抗人CD8抗体氨基酸序列的情况下,实际上可能存在多种核酸序列,本发明所保护的范围涵盖这些可能的核酸序列,且本领域技术人员有能力对这些核酸进行设计。
作为优选,重链SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18对应的核酸序列分别为SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22,轻链SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20对应的核酸序列分别为SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24。
再一方面,本发明提供了包括前述的核苷酸序列的表达载体;还提供了包括前述的抗人CD8抗体或核苷酸序列或表达载体的细胞。
又一方面,本发明提供了一种CD8分子或CD8+T细胞检测方法。
所述的检测方法通过前述的抗人CD8抗体进行检测。具体地,依赖于抗体抗原结合能力进行检测。
又一方面,本发明提供了一种CD8分子或CD8+T细胞检测试剂盒。
所述的试剂盒中包括前述的抗人CD8抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞。
本发明所取得的的技术效果:
本发明提供了两种新的抗人CD8鼠单抗,并通过设计基因与蛋白序列,建立该基因的稳转CHO细胞株进行重组表达,经验证,表达纯化的抗体能够特异性识别人CD8抗原,抗体表达产量达到g/L级别,远远高于传统的杂交瘤细胞制备抗体的产量。且相较于市售抗体具有更高的亲和力,有很好的应用前景。
附图说明
图1为鼠抗人CD8外购和自制纯抗SDS凝胶电泳图。
图2为外购Biolegend鼠抗人CD8[SK1]-PE流式检测图及外购Biolegend鼠抗人CD8[SK1]-FITC流式检测图。
图3为自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]-PE及CD8[ZXCloneHCD8-09]-FITC流式检测图。
图4为自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]-PE及CD8[ZXCloneHCD8-10]-FITC流式检测图。
图5为对照组的特异性检测结果。
图6为实验组自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]特异性检测图。
图7为实验组自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]特异性检测图。
图8为Biolegend鼠抗人CD8[SK1]效价检测图。
图9为自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]效价检测图。
图10为自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]效价检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明中,以“鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]抗体”为例,可以有其他指代形式,如:ZXCloneHCD8-09、鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-9]、CD8[ZXCloneHCD8-09]、CD8[ZXCloneHCD8-09]抗体、抗人CD8抗体CD8[ZXCloneHCD8-09]、ZXBIo鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]等,其均代表本发明中重链序列为SEQ ID NO.17、轻链序列1为SEQ ID NO.19的抗体。本说明同样适用于鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]抗体和外购抗体。
本发明中,当涉及荧光标记时,带有标记的荧光抗体可以在前述任意指代形式上增加荧光标记,如增加荧光标记“-PE”、“-FITC”等;具体如带有PE标记的鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]抗体的表述方式包括但不限于:ZXCloneHCD8-09-PE、CD8[ZXCloneHCD8-09]-PE、CD8[ZXCloneHCD8-09]-PE抗体,CD8[ZXCloneHCD8-09]抗体-PE、鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-9]-PE。
实施例1抗CD8抗体的制备方法
(1)鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]抗体:
重链序列1为:SEQ ID NO.17;
轻链序列1为:SEQ ID NO.19;
(2)鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]抗体:
重链序列2为:SEQ ID NO.18;
轻链序列2为:SEQ ID NO.20;
常规方法设计表达相应抗体的核苷酸序列。表达重链序列1的的基因为SEQ IDNO.21,表达轻链序列1的基因为SEQ ID NO.23,表达重链序列1的的基因为SEQ ID NO.22,表达轻链序列1的基因为SEQ ID NO.24。将核苷酸序列克隆至CHO稳转株后进行抗体稳转表达,进一步将构建载体导入CHO细胞。
转染和筛选:
(1)CHO细胞使用CHO CD培养基培养,2×105cells/mL接种,加4mM谷氨酰胺。细胞密度达到4×106cells/mL,活力大于95%,离心收集细胞,使用电转缓冲液重悬细胞,调整密度到1×107cells/mL。
(2)取无菌的EP管,加入0.8mL细胞悬液,加入5μg质粒,轻轻混匀,孵育15min,冰浴5min。电转仪设置参数为电压280V,脉冲次数3次,脉冲时间5ms,脉冲间隙0.784s,电转杯内径4mm。在每个电转杯中加入0.5mL细胞和质粒的混合液,放入电转仪启动电击程序,完成后迅速将电转杯中的细胞吸出,转移到装有20mL CHO CD培养基的125mL锥形瓶中,重复上述步骤电击第二个电转杯。轻轻混合摇瓶中的细胞,然后盖紧盖子置于37℃摇床中培养。
(3)48h后,将细胞转移到离心管中1000rpm离心5min。去掉上清,用20mL的含有2、5、20μM MSX的CHO CD培养基重悬细胞,计算细胞密度和活性。细胞密度在1.2×106cells/mL左右。
(4)将细胞转移到新的摇瓶中。从第七天开始,每两天观测细胞密度和活性。细胞密度从开始的1.2×106cells/mL往下降低,在第5-7天到达密度最低值,在第10-15天开始,细胞密度升高。当细胞密度升高到1×106cells/mL后,使用含有50μM MSX的CD OPM培养基将细胞传代到细胞密度3×105cells/mL,继续培养。
(5)当细胞密度增长到4×106cells/mL后,使用含有50μM MSX的CD OPM培养基将细胞扩增或传代,最低接种密度仍是3×105cells/mL,可以开始准备冻存或扩大培养。
(6)抗体收集方法:使用protein A亲和层析进行抗体纯化。
纯度检测:
(1)样本处理:分别取外购鼠抗人CD8[SK1](厂家:Biolegend,货号:344705)、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]10μg(样本:上样缓冲液体积比=4:1),100℃水浴30min,10000rpm室温离心1min后待用。其中,上样缓冲液购自上海天能生物科技有限公司(货号:180-8210D)。
(2)上样:取出预制胶安装于电泳槽内,注入电泳缓冲液,拨梳子,上样。蛋白Marker 10μL,样品的上样5μg。其中预制胶和电泳缓冲液均购自上海雅酶生物科技有限公司生产(货号:025C2010)。蛋白Marker购自上海天能生物科技有限公司(货号:180-60016)。
(3)电泳:电压80V,电泳时间90min。溴酚蓝指示带至底部时即可结束电泳。
(4)染色:取出凝胶放于适宜考马斯亮蓝染色30min,脱色液体脱色1h,重复5次后,拍照。
结果表明实施例1制备得到的抗体重轻链完整,条带清晰,纯度达到90%以上,结果见图1。
实施例2抗体标记
本实施例中,外购抗体信息如下:鼠抗人CD8[SK1]-PE(厂家:Biolegend,货号:980902),Biolegend鼠抗人CD8[SK1]-FITC(厂家:Biolegend,货号:980908)。使用PE或FITC标记CD8[ZXCloneHCD8-09]及CD8[ZXCloneHCD8-10]。
1、PE及FITC标记
按照“荧光蛋白和/或偶联蛋白单克隆抗体标记方法及其试剂盒(CN202010972671.X)”专利所述方法分别标记实施例1中制备得到的自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10],标记后的抗体记为自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]-PE、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]-PE、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]-FITC、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]-FITC。
2、标记荧光抗体效果检测
(1)于1.5mL离心管中加入100μL人外周血样本(湖州正熙医学检验所,样本编号:02-048)。
(2)分别取1μL的荧光标记抗体自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]-PE、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]-PE、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]-FITC、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]-FITC加入样本中;外购对照荧光抗体各取5μL。
(3)上述样品均避光反应15分钟。
(4)加入1mL溶血素,继续反应15分钟,溶血素选用正熙流式细胞仪用溶血素(溶血素:浙湖械备20200133号)。
(5)4000rpm离心2min,弃上清,加入500μL PBS重悬待检测样本。
(6)流式细胞仪(贝克曼DxFlex流式细胞仪)检测样本阳性细胞检测比例、图谱分群情况等指标,进而确定是否能标记上荧光染料PE以及标记的荧光抗体检测靶抗原的是否正确。
PE和FITC成功标记自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09]、自制鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]与外购鼠抗人CD8[SK1]-PE和CD8[SK1]-FITC比例相近,见图2-图4。
实施例3抗体特异性
本实施例中,所用抗体信息如下:
抗体(1):实施例1制备得到的抗人CD8抗体CD8[ZXCloneHCD8-09],记为ZXCloneHCD8-09;
抗体(2):实施例1制备得到的抗人CD8抗体CD8[ZXCloneHCD8-10],记为ZXCloneHCD8-10;
抗体(3):小鼠同型对照抗体(MOPC-21克隆号)(厂家:Biolegend,货号:400100),记为同型对照抗体MOPC-21;
荧光抗体(1):鼠抗人CD8[SK1]-PE(厂家:Biolegend,货号:980902),记为Biolegend CD8[SK1];
荧光抗体(2):共染抗体商品化荧光抗体CD3-FITC(厂家:隆洋正熙生物技术有限公司,货号:2022062500601);
荧光抗体(3):共染抗体商品化CD45-PercpCy5.5(厂家:隆洋正熙生物技术有限公司,货号:2022052400603)。
抗体特异性检测方法:
(1)淋巴细胞获取,取100μL人外周血样本(湖州正熙医学检验所,样本编号:02-048)。加入1mL溶血素,继续反应15分钟,溶血素选用正熙流式细胞仪用溶血素(溶血素:浙湖械备20200133号)。4000rpm离心2min,弃上清,加入100μL PBS重悬样本。
实验组:分别在样本中加入鼠抗人CD8抗体[ZXCloneHCD8-09]和CD8[ZXCloneHCD8-10]各3μL,避光反应15分钟后,加入500μL PBS重悬样本,4000rpm离心2min,弃上清,再加入100μL PBS重悬样本得到2个不同抗体封闭的封闭样本。在2个封闭样本中加Biolegend CD8[SK1]-PE检测特异性。具体地,在封闭样本中各加入5μL CD3-FITC、CD45-PercpCy5.5、Biolegend CD8[SK1]-PE。
对照组:在样本中加入小鼠同型对照抗体(克隆号:MOPC-21)纯抗3μL,避光反应15分钟后,加入500μL PBS重悬样本,4000rpm离心2min,弃上清,再加入100μL PBS重悬样本。在重悬样本分别加入5μL CD3-FITC、CD45-PercpCy5.5、Biolegend CD8[SK1]-PE。
实验组和对照组所有样本避光反应15分钟后。加入500μL PBS重悬样本,4000rpm离心2min,弃上清,再加入500μL PBS重悬样本。
流式细胞仪(贝克曼DXFLEX流式细胞仪)检测样本阳性细胞比例、图谱分群情况等指标,进而确定CD8[ZXCloneHCD8-09]和CD8[ZXCloneHCD8-10]是否能特异性识别CD8靶抗原。
由图5-图7可知,实验组中有CD3FITC信号,CD45-PercpCy5.5,无CD8[SK1]-PE荧光抗体的信号。对照组,同型对照抗体无法封闭有CD8[SK1]-PE的荧光信号。以此说明,两个由CHO制备所得的CD8抗体,克隆号ZXCloneHCD8-09和克隆号ZXCloneHCD8-10,能特异性识别封闭CD8靶抗原。
实施例4抗体效价
本实施例选用抗体为:
抗体(1):阳性对照,商品化Biolegend鼠抗人CD8[SK1](厂家:Biolegend,344705),记为Biolegend CD8[SK1];
抗体(2):实施例1获得的抗人CD8抗体CD8[ZXCloneHCD8-09],记为ZXBIo鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-09];
抗体(3):实施例1获得的抗人CD8抗体CD8[ZXCloneHCD8-10],记为ZXBIo鼠抗人CD8[ZXCloneHCD8-10]。
首先,将已知浓度抗体(1),抗体(2),抗体(3)先稀释为1mg/mL,然后用PBS按1:100,1:1000,1:3000,1:6000,1:12000,1:24000,1:48000,1:60000,1:96000比例再次对抗体进行稀释。CD8[ZXCloneHCD8-09],CD8[ZXCloneHCD8-10]抗体作为实验组,商品化CD8[SK1]抗体作为对照组。
实验组为两组,对照组为一组,每组取100μL样本(湖州正熙医学检验所,样本编号:02-048)。向4组实验中分别加入1mL溶血素(溶血素:浙湖械备20200133号),继续反应15min。4000rpm离心2min,弃上清。
实验组分别加入按比例稀释的100μL CD8[ZXCloneHCD8-09],CD8[ZXCloneHCD8-10]抗体,对照组加入按比例稀释的100μL商品化抗人CD8[SK1]抗体,涡旋混匀,室温避光孵育15min。加入900μL PBS重悬混匀样本,4000rpm离心2min,弃上清。加入100μL PBS,涡旋混匀。向每组中加入1μL羊抗鼠IgG-PE商品化流式荧光抗体(厂家:Biolgend,货号:980902),涡旋混匀,室温避光孵育15分钟。加入900μL PBS重悬混匀样本,4000rpm离心2min,弃上清。再加入1000μL PBS重悬混匀样本,4000rpm离心2min,弃上清。加入500μL PBS重悬待检测样本,上流式细胞仪检测。
3种抗体的亲和力分别为:
CD8[SK1]抗体,其亲和力(kd)为:29.7(1mg/mL),见图8。
CD8[ZXCloneHCD8-09]抗体,其亲和力(kd)为:33.3(1mg/mL),见图9。
CD8[ZXCloneHCD8-10]抗体,其亲和力(kd)为:45.9(1mg/mL),见图10。
结果表明,CD8[ZXCloneHCD8-09]和CD8[ZXCloneHCD8-10]的亲和力与BiolegendCD8[SK1]抗体基本一致。
Claims (10)
1.一种抗人CD8抗体,其特征在于,包括重链和轻链,所述的重链包括重链可变区,所述的轻链包括轻链可变区;所述的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中:
(1)HCDR1为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;
(2)HCDR2为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列;
(3)HCDR3为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列;
(4)LCDR1为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列;
(5)LCDR2为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列;
(6)LCDR3为SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗人CD8抗体,其特征在于,所述的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.13-14中的任一,或与SEQ ID NO.13-14任一具有80%以上序列相似性且CDR区不变的序列;
所述的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.15-16中的任一,或与SEQ ID NO.15-16任一具有80%以上序列相似性且CDR区不变的序列。
3.根据权利要求1所述的抗人CD8抗体,其特征在于,所述的抗人CD8抗体重链氨基酸序列为SEQ ID NO.17-18中的任一,或与SEQ ID NO.17-18任一具有65%以上序列相似性且CDR区不变的序列;
所述的抗人CD8抗体轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.19-20,或与SEQ ID NO.19-20具有65%以上序列相似性且CDR区不变的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗人CD8抗体,其特征在于,为单克隆抗体;优选为鼠源化抗体。
5.表达权利要求1-4任一项所述的抗人CD8抗体的核酸。
6.根据权利要求5所述的核酸,其特征在于,重链SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18对应的核酸序列分别为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22,轻链SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20对应的核酸序列分别为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。
7.包括权利要求5-6任一项所述的核酸的表达载体。
8.包括权利要求1-4任一项所述的抗人CD8抗体或权利要求5-6任一项所述的核酸或权利要求7所述的表达载体的细胞。
9.一种CD8分子或CD8+T细胞检测方法,其特征在于,通过权利要求1-4任一项所述的抗人CD8抗体进行检测。
10.一种CD8分子或CD8+T细胞检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-4任一项所述的抗人CD8抗体或权利要求5-6任一项所述的核酸或权利要求7所述的表达载体或权利要求8所述的细胞。
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