CN112195155A - 一种通用car-t细胞及其制备方法 - Google Patents

一种通用car-t细胞及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112195155A
CN112195155A CN202010802794.9A CN202010802794A CN112195155A CN 112195155 A CN112195155 A CN 112195155A CN 202010802794 A CN202010802794 A CN 202010802794A CN 112195155 A CN112195155 A CN 112195155A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human
antibody
cell
complex
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010802794.9A
Other languages
English (en)
Inventor
何安涛
张严冬
李相鲁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Wanhai Cell Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Wanhai Cell Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Wanhai Cell Biotechnology Co ltd filed Critical Guangdong Wanhai Cell Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010802794.9A priority Critical patent/CN112195155A/zh
Publication of CN112195155A publication Critical patent/CN112195155A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明涉及医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种通用CAR‑T细胞及其制备方法，该CAR‑T细胞中表达含胞内定位信号的抗人MHC‑I复合体抗体、抗人CD3‑TCR复合体的抗体和针对靶细胞表面抗原的嵌合抗原受体。本发明的通用CAR‑T细胞表达的MHC‑I复合体和CD3‑TCR复合体，在细胞内被病毒载体表达的连接有胞内定位序列的抗人MHC‑I复合体的抗体和抗人CD3‑TCR复合体的抗体结合留在细胞内，另外，通用CAR‑T细胞病毒转染后无需进行基因编辑，避免了基因编辑带来的脱靶效应和基因编辑电转实验带来的细胞损伤，简化了生产工艺，得到的通用CAR‑T细胞具有更高的CAR阳性率。

Description

一种通用CAR-T细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种通用CAR-T细胞及其制备方法。
背景技术
免疫细胞疗法作为一种新的癌症治疗方法，其治疗效果在临床上得到越来越多的证实，CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞)技术是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞免疫细胞疗法，有可能治愈急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)等血液癌症，治疗实体瘤也具有明显的效果，由于肿瘤免疫疗法在治愈肿瘤的同时又没有传统放疗、化疗的治疗毒性，所以免疫细胞疗法在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。
健康供体外周血T细胞数量多、活率高，用以制备CAR-T和细胞扩增相对比较容易；如果能用于替代肿瘤患者自体CAR-T细胞来治疗，即同种异体CAR-T 细胞(通用型CAR-T细胞)，将极大降低CAR-T细胞制备的周期和治疗的费用。同种异体细胞是指属于相同物种但在遗传上有所差异个体的细胞。同种异体 CAR-T细胞用于肿瘤治疗的缺点在于，免疫排异问题。在免疫活力的宿主中，同种异体细胞迅速收到排异，这是一种称为宿主抗原移植物排异(HvG)的过程，而这限制了转移细胞的效力。在免疫无活力的宿主中，能够植入同种异体细胞，但它们的内源性T细胞受体特异性可能将宿主组织识别为外来物，导致移植物抗宿主病(GvHD)，这可能会导致严重的组织损伤和死亡。
尽管CAR-T在临床效果上取得了巨大的成功，其商业化推广上仍有不小的问题：一、价格昂贵，KymriahTM上市定价高达47.5万美元，支付方式可以创新，生产制备成本却因无法规模化而高居不下；二、无法现取现用，自体CAR-T 需要提取患者自身的T细胞然后进行制备，周期约为一个月，而对该产品适用的三线及更后线的病人，等待周期中出现疾病迅速进展的风险很高；三、病人自身的T细胞通常存在数量和质量缺陷。因此，UCAR-T应运而生，该技术主要依赖于基因编辑平台，在基因组的特定位置(如TCR、HLA)产生位点特异性双链断裂 (Double strand break，DSB)，然后通过非同源末端连接(Non-homologous endjoining，NHEJ)或同源定向重组修复(Homology directed recombination repair， HDR)的方式进行修复，从而实现靶向敲除来自健康人血液中T细胞的基因(TCR 及HLA分子等)，以减弱或消除其引发的移植物抗宿主病(GvHD)。目前成熟的基因编辑技术有三种：锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs),转录激活子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector-based nucleases，TALENs)和规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR)。
传统的通用CAR-T细胞制备技术包括以下流程：
1)T细胞分选；
2)细胞激活；
3)T细胞进行病毒转染；
4)对T细胞进行基因编辑；
5)对基因编辑细胞进行分选；
6)冻存或者回输。
然而，这些技术无一例外需要对T细胞进行基因编辑，因现有的基因编辑工具(cas9，tallen，ZFNs等)普遍含有很长的基因片段，不利于病毒载体携带转导到T细胞，所以，基因编辑这一操作只能通过电击转导来完成，电击会造成T 细胞损伤，并且基因编辑工具含有潜在的脱靶风险，不同的基因编辑工具还面临编辑效率的问题，所以，对于通用CAR-T细胞制备的关键操作步骤，基因编辑过程面临多种风险与挑战。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种通用CAR-T细胞及该通用CAR-T细胞的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种通用CAR-T细胞，该CAR-T细胞中表达含胞内定位信号的抗人MHC-I复合体抗体、抗人CD3-TCR复合体的抗体和针对靶细胞表面抗原的嵌合抗原受体。
优选的，所述通用CAR-T细胞制备用病毒载体为慢病毒载体或者腺相关病毒载体。
优选的，所述抗人MHC-I复合体和抗人CD3-TCR的抗体可分开单独存在于细胞内，或可以通过特殊的短肽连接。
优选的，所述CAR-T细胞内表达含抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR 复合体的抗体，当抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体分开存在时，所述抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体的C端均含有内质网滞留肽。
优选的，所述CAR-T细胞内表达含抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR 复合体的抗体，当抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体之间通过短肽连接时，所述抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体的C 端均含有内质网滞留肽序列；更优选的，所述内质网滞留肽序列为内质网滞留信号(ER)短肽KDEL。
优选的，所述CAR-T细胞内表达抗人MHC复合体的抗体为抗人MHC-I抗体和抗人b2m抗体中的任意一个；所述CAR-T细胞内表达抗人CD3-TCR复合体的抗体为抗人TCR-α抗体、抗人TCR-β抗体和抗人CD3抗体中的任意一个。更优选的，所述CAR-T细胞内表达抗人MHC复合体的抗体为抗人MHC-I Fab或scFv或VHH 和抗人b2m Fab或scFv或VHH中的任意一个；所述CAR-T细胞内表达抗人 CD3-TCR复合体的抗体为抗人TCR-αFab或scFv或VHH、抗人TCR-bFab或scFv 或VHH和抗人CD3抗体中的任意一个；更优选的，所述CAR-T细胞内表达抗人MHC-I复合体抗体为anti-b2m scFv或VHH；所述CAR-T细胞内表达抗人CD3-TCR 复合体的抗体为抗人CD3或VHH。
所述CAR-T细胞表面嵌合抗原受体的靶点为CD19、CD22、BCMA、CD20、 CD30、Ig k、CD123、CD5、CD7、CD33、Lewis Y(LeY)、NKG2D配体、CD44v6、 FR、CD138、PSMA、NY-ESO、EGFR、CEA、HER2、Mesothelin、GD2、CD171、 GPC3、HIVgp120、HIV gp41、HBVsAg、HPV 16E7 11-19:HLA-A*0201中的至少一个。
本发明还提供了一种通用CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)病毒载体质粒构建；
2)使用载体进行病毒包装制备；
3)T细胞分选，活化；
4)病毒转染活化的T细胞；
5)分选出TCR-HLA-T细胞；
6)细胞冻存回输检测。
优选的，病毒载体质粒的构建包括如下步骤：使用CMV启动子或者EF-1A 启动子，启动两个不同的scFv(两个scFv之间由GGGGS序列连接，C端有内质网滞留肽序列)，CAR基因通过T2A序列与两个scFv序列连接在一起。
优选的，病毒包装制备采用使用设计的病毒载体质粒制备慢病毒或者腺病毒。
本发明的有益效果在于：本发明的优势在于该病毒载体转染T细胞后，无需进行基因敲除，后期只需直接进行细胞分选就能得到纯的通用CAR-T细胞；使用该载体进行通用CAR-T细胞制备的过程避免了基因编辑带来的脱靶效和电击作用对细胞产生的损伤，简化了生产工艺，节省了生产成本；而且得到的通用CAR- T相比其他技术制备的CAR-T细胞相比，CAR阳性率更高。
附图说明
图1为三种质粒载体插入序列设计的方案；
图2为磁珠分选前后细胞的表型变化。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-2对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
通用抗人CD19抗原的CAR慢病毒表达载体的制备：
基因合成和序列测定由上海生工生物工程有限公司完成，序列参照图1第一个序列，CD19 CAR基因序列见SEQ ID NO：1；抗人MHC-I复合体的抗体为 anti-b2m scFv，基因序列见SEQ ID NO：2；抗人CD3-TCR复合体的抗体anti-CD3 scFv，基因序列见SEQ ID NO：3；内质网滞留肽的核酸序列见SEQ ID NO：4和 SEQ ID NO：5；
将合成的插入序列插入到的Pcdh-ef1A质粒的多克隆位点，转化感受态细胞DH5a，将菌液铺板到含氨苄的琼脂平板上培养；
在琼脂平板上挑取多个克隆，分别接种到5ml液态LB培养基(含氨苄)中摇瓶培养6h，将各克隆菌液外送上海生工进行sanger测序，验证插入序列准确性；
根据测序公司反馈的测序数据，选择序列正确的克隆号菌液进行大量接种摇瓶培养；
使用qiagen公司的去内毒素质粒大提试剂盒提取载体质粒，使用分光光度计进行浓度、纯度测量；
使用qiagen公司的去内毒素质粒大提试剂盒提取三个包装质粒(pmdlg-prre，prsv-rev，pmd2.g)，使用分光光度计进行浓度、纯度测量；
复苏293T细胞，使其在100mm平皿中传代3-5代，使用lip2000将一定比例的包装质粒和载体质粒瞬间转染到293T细胞中，48h后收获病毒上清，放入离心瓶中进行高速离心65000g*2h，弃上清，加入PBS重悬，制备成慢病毒载体浓缩液，放入-80℃冰箱冻存；
滴度测定：病毒包装冻存后第二天(24小时)，准备48孔板，jurkat细胞2E+5/ 孔铺3个孔(200ul细胞悬液)，分别加入2.5ul、1.25ul、0.625ul病毒悬液，37℃过夜培养，72h后流式检测jurkat细胞CAR的表达情况；
滴度计算方法：病毒滴度＝2*10^5*阳性率*1000/病毒悬液体积。
实施例2
抽取志愿者外周血，使用淋巴细胞分离液分离出PBMC并使用PBS洗涤，使用抗CD3磁珠分选出CD3阳性细胞，再使用抗CD3/CD28磁珠刺激CD3阳性细胞；
使用PBS洗涤T细胞，计数离心去除上清，加入慢病毒液转染T细胞，4h后补加完全培养基终止病毒转染；
病毒转染后的细胞在培养容器中扩增5-7天；
使用anti CD3 beads和磁力分选柱分选出CD3-细胞；流式染色分选前和分选后T细胞的CD3、HLA-I、CAR的表达情况；
流式染色APC抗人CD3和PE抗人HLA ABC,检测病毒转染后CAR-T细胞的 CD3和HLA-I表达情况见图2；
流式染色protein L-biotin后洗涤细胞复染APC streptavidin，检测病毒转染后CAR-T细胞的CAR阳性率(见图2)；
将CD3-细胞冻存，即为胞内抗体通用CAR-T细胞制品。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东万海细胞生物科技有限公司
<120> 一种通用CAR-T细胞及其制备方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3 .5
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaagtgc agctgctgga atctggcggc ggactggtgc agcctggcgg atctctgaga 120
ctgagctgtg ccgccagcgg agtgtccctg cctgattatg gcgtgtcctg ggtgcgccag 180
gcccctggaa aaggactgga atggctgggc gtgatctggg gctctgaggg caccacctac 240
tacaacagcg ccctgaaggg ccggttcacc atcagccggg acaacagcaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg cgccaagcac 360
tactactacg gcggcagcta cgccatggac tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 420
tctagcggag gcggaggatc aggcggcgga ggaagtggcg gagggggatc cgatatccag 480
atgacccaga gccccagcag cctgtctgcc agcgtgggcg acagagtgac aattacctgc 540
cgggccagcc aggacatcag caagtacctg aattggtatc agcagaagcc cggcaaggcc 600
cccaagctgc tgatctacca caccagcaga ctgcacagcg gcgtgcccag cagattttct 660
ggcagcggct ccggcaccga cttcaccttc accatcagct ccctgcagcc cgaggatatc 720
gccacctatt actgccagca gggcaacacc ctgccctaca cctttggcgg aggcaccaag 780
ctggaaatca ccaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 840
tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 900
acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 960
ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 1020
ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 1080
tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 1140
cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 1200
cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 1260
ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1320
aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1380
cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1440
atgcaggccc tgccgcctcg g 1461
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt agctacacca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc attagtagtg gtggtagttt cacctactat 180
ttagacagtg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca gtgccaagac caccctgtac 240
ctgcaaatgg gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attattgttc aagagaagga 300
ggtccctact acggtagtca ttactatgct ttggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct caggtggtgg tggatccgga ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgat 420
atccagatga cacagagtac atcctccctg tctgcctctc tgggagacgg agtcaccatc 480
agttgcaggg caagtcaaga cattaccaat tatttaaact ggtatcagca gagaccagat 540
ggagctgtta gactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 600
ttcagtggca gtgggtctgg aacaaattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 660
gatattgcca cttacttttg ccaacaggga aatacgcttc ctccgacgtt cggtgggggc 720
accaagttgg aaatcaaa 738
<210> 3
<211> 708
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcagcaga gcggcgccga gctggccagg cccggcgcca gcgtgaagat gagctgcaag 60
gccagcggct acaccttcac caggtacacc atgcactggg tgaagcagag gcccggccag 120
ggcctggagt ggatcggcta catcaacccc agcaggggct acaccaacta caaccagaag 180
ttcaaggaca aggccaccct gaccaccgac aagagcagca gcaccgccta catgcagctg 240
agcagcctga ccagcgagga cagcgccgtg tactactgcg ccaggtacta cgacgaccac 300
tactgcctgg actactgggg ccagggcacc accgtgaccg tgagcgccgg cggcggcggc 360
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcagc agccagatcg tgctgaccca gagccccgcc 420
atcatgagcg ccagccccgg cgagaaggtg accatgacct gcagcgccag cagcagcgtg 480
agctacatga actggtacca gcagaagagc ggcaccagcc ccaagaggtg gatctacgac 540
accagcaagc tggccagcgg cgtgcccgcc cacttcaggg gcagcggcag cggcaccagc 600
tacagcctga ccatcagcgg catggaggcc gaggacgccg ccacctacta ctgccagcag 660
tggagcagca accccttcac cttcggcagc ggcaccaagc tggagatc 708
<210>
<211> 12
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggacgagc tg 12
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacgacgaga tc 12

Claims (9)

1.一种通用CAR-T细胞，其特征在于：该CAR-T细胞中表达含胞内定位信号的抗人MHC-I复合体抗体、抗人CD3-TCR复合体的抗体和针对靶细胞表面抗原的嵌合抗原受体。
2.根据权利要求1所述的一种通用CAR-T细胞，其特征在于：通用CAR-T细胞制备用病毒载体为慢病毒载体或者腺相关病毒载体。
3.根据权利要求1所述的一种通用CAR-T细胞，其特征在于：所述抗人MHC-I复合体和抗人CD3-TCR的抗体可分开单独存在于细胞内，或可以通过特殊的短肽连接。
4.根据权利要求1所述的一种通用CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞内表达含抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体，当抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体分开存在时，所述抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体的C端均含有内质网滞留肽。
5.根据权利要求1所述的一种通用CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞内表达含抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体，当抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体之间通过短肽连接时，所述抗人MHC-I复合体的抗体和抗人CD3-TCR复合体的抗体的C端均含有内质网滞留肽序列，内质网滞留肽的核酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。
6.根据权利要求1所述的一种通用CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞内表达抗人MHC-I复合体的抗体为抗人MHC-I抗体和抗人b2m抗体中的任意一个；所述CAR-T细胞内表达抗人CD3-TCR复合体的抗体为抗人TCR-α抗体、抗人TCR-β抗体和抗人CD3抗体中的任意一个。
7.根据权利要求6所述的一种通用CAR-T细胞，其特征在于：所述抗人MHC-I复合体的抗体为anti-b2m scFv，anti-b2m scFv基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述抗人CD3-TCR复合体的抗体为anti-CD3scFv，anti-CD3 scFv的基因序列如SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求1所述的一种通用CAR-T的病毒载体，其特征在于：所述CAR-T细胞表面嵌合抗原受体的靶点为CD19、CD22、BCMA、CD20、CD30、Ig k、CD123、CD5、CD7、CD33、Lewis Y(LeY)、NKG2D配体、CD44v6、FR、CD138、PSMA、NY-ESO、EGFR、CEA、HER2、Mesothelin、GD2、CD171、GPC3、HIVgp120、HIV gp41、HBVsAg、HPV 16E7 11-19:HLA-A*0201中的至少一个。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的通用CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)病毒载体构建；
2)使用载体进行病毒包装制备；
3)T细胞分选，活化；
4)病毒转染活化的T细胞；
5)分选出TCR-HLA-T细胞；
6)细胞冻存回输检测。
CN202010802794.9A 2020-08-11 2020-08-11 一种通用car-t细胞及其制备方法 Pending CN112195155A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010802794.9A CN112195155A (zh) 2020-08-11 2020-08-11 一种通用car-t细胞及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010802794.9A CN112195155A (zh) 2020-08-11 2020-08-11 一种通用car-t细胞及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112195155A true CN112195155A (zh) 2021-01-08

Family

ID=74006074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010802794.9A Pending CN112195155A (zh) 2020-08-11 2020-08-11 一种通用car-t细胞及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112195155A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023011651A1 (zh) * 2021-08-06 2023-02-09 上海驯鹿生物技术有限公司 Cd5和cd7双靶点的全人源嵌合抗原受体（car）及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107709548A (zh) * 2015-02-06 2018-02-16 新加坡国立大学 用于增强治疗性免疫细胞的功效的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107709548A (zh) * 2015-02-06 2018-02-16 新加坡国立大学 用于增强治疗性免疫细胞的功效的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENJAMIN D GRIMSHAW等: "Creating a ’null’ T cell for use in adoptive immunotherapy", 《HUMAN GENE THERAPY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023011651A1 (zh) * 2021-08-06 2023-02-09 上海驯鹿生物技术有限公司 Cd5和cd7双靶点的全人源嵌合抗原受体（car）及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107827990B (zh) 一种多肽、编码其的核酸、其修饰的t淋巴细胞及其应用
US11026975B2 (en) Chimeric antigen receptor (CAR) binding to BCMA, and uses thereof
KR101950747B1 (ko) Cld18a2를 표적으로 하는 면역 작동 세포 및 그 제조방법과 용도
IL285286B1 (en) Transpase polypeptides and uses thereof
CN107337737B (zh) 一种嵌合抗原受体及其应用
CN110734931A (zh) 一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用
CN105925536B (zh) Trop2嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其应用
KR20210100624A (ko) 유전적으로 조작된 ｔ 세포를 제조하는 방법
CN109844125A (zh) 人pd-1基因敲除的cldn18．2特异性嵌合抗原受体t细胞的制备方法以及应用
WO2018233589A1 (zh) 一种微环dna转染t细胞制备临床级car-t细胞制剂的方法
KR20230129979A (ko) 수지상 세포 활성화 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CN115175695A (zh) 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
CN114163537B (zh) 分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN113122503B (zh) 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
CN111303287B (zh) 一种anti-CD19的全人源抗体或抗体片段及其嵌合抗原受体和应用
CN112195155A (zh) 一种通用car-t细胞及其制备方法
CN110093376B (zh) 一种lrfft1细胞的构建方法
JP2023500318A (ja) 細胞選択および／または細胞刺激デバイスならびに使用方法
WO2023104168A1 (zh) 同时靶向gpc3和cd276的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN113980143A (zh) 靶向cd276的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及制备方法和制药应用
US11718827B2 (en) LRFFT2 cell
CN109294997B (zh) 一种lrfft1细胞
JP2023516538A (ja) Ｕｃａｒｔ細胞を精製する方法及び応用
CN114891123B (zh) 一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用
US20230181641A1 (en) Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination