TWI788788B - 標靶EpCAM的抗體及其製備和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了標靶EpCAM的抗體及其製備方法和應用。所述標靶EpCAM的抗體包含VL和/或VH，所述VH包含如SEQ ID NO: 5的胺基酸序列所示的VH CDR1，如SEQ ID NO: 6的胺基酸序列所示的VH CDR2，和/或，如SEQ ID NO: 7的胺基酸序列所示的VH CDR3；所述VL包含如SEQ ID NO: 8的胺基酸序列所示的VL CDR1，如SEQ ID NO: 9的胺基酸序列所示的VL CDR2，和/或，如SEQ ID NO: 10的胺基酸序列所示的VL CDR3。本發明克服了本領域標靶EpCAM的抗體的缺陷，提供了一種全人源序列、親和力較高、跨種屬結合食蟹猴抗原的抗體及其製備方法和應用。

Description

標靶EpCAM的抗體及其製備和應用
本申請主張申請日為2020/2/25的中國專利申請202010114063.5的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本申請涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種抗EpCAM的抗體及其製備和應用。
上皮細胞黏附分子(EpCAM，CD326)，也稱為Trop-1、17-1A、ESA、EGP314、AUA1、EGP40和GA733-2等，其為由314個胺基酸組成的約40 kD的跨膜糖蛋白，由242個胺基酸的大胞外結構域(N-末端)、23個胺基酸的單次跨膜結構域和26個胺基酸的短細胞質結構域(C-末端)組成。
EpCAM的主要功能是細胞間的相互作用，它與幾個重要的細胞黏附分子(CAMs)相互作用，也調節細胞和細胞基質之間的結構。它還透過與Claudin -7和E-cadherin形成複合物提供額外的拉力，以平衡皮質張力來保持細胞-細胞連接。據報導，EpCAM表現異常與上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transmition, EMT)相關，因此可作為CTC的標記物。EpCAM還轉導3種獨立的細胞信號途徑，包括nPKC依賴途徑、Wnt和eRAS/RAC/AKT途徑。EpCAM的胞內結構域(EpICD)也可以在切割後轉位至細胞核，並以FHL-2和β-連環蛋白依賴的方式誘導c-myc和e-FABP表現。
人EpCAM的胺基酸序列(NCBI登錄號：P16422)與獼猴(Rhesus Macaque或Macaca mulatta ) EpCAM (NCBI登錄號：Q1WER1)的相同性為93%，與小鼠EpCAM (NCBI登錄號：Q99JW5)的相同性為81%，與食蟹猴(Cynomolgus Monkey或Macaca fascicularis ) EpCAM (NCBI登錄號：XP_005576740.1, predicted)的相同性為84%。
EpCAM在不同類型的上皮細胞中特異性表現。在健康的成人組織中，EpCAM在簡單、假分層和移行上皮的基底外側細胞膜上表現。EpCAM也在主要類型的人類惡性腫瘤中高度表現，如結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、子宮頸癌和卵巢癌。EpCAM已成為癌症治療包括疫苗、鼠或人單株抗體，以及與細菌毒素或化療藥物結合的抗體如EpCAM特異性抗體I G-1、阿德木單抗、依決洛單抗等中的熱點目標。
目前針對人EpCAM的抗體有很多，其中NR-LU-10 (nofetumomab merpentan)為一種放射性同位素偶聯物，用於肺癌及其他EpCAM高表現的癌症及轉移和/或復發灶的診斷；Removab (catomaxomab)作為第一個上市的雙抗藥物，針對的適應症為腹腔轉移癌，但由於副作用和鼠源抗體等一系列問題已經下市；目前在臨床III期的抗體研究只有Panorex (edrecolomab)，針對的適應症為乳腺癌和結直腸癌，其他抗體均處於臨床I/II期或臨床前研究階段。由於edrecolomab為人鼠嵌合抗體，存在免疫原性風險，且親和力並不是很好，並且不能與食蟹猴種屬抗原交叉反應，增加了潛在的毒性風險。因此本領域缺乏高親和力的標靶人EpCAM抗原的抗體，特別是全人源，並且與食蟹猴抗原交叉反應的抗體，以及ADCC活性，內吞活性等更好的抗體。
發明概要
為解決本領域標靶EpCAM的全人源抗體的親和力、ADCC活性和內吞活性不足的技術問題，本發明提供了一種標靶EpCAM的抗體及其製備方法和應用。
為解決上述技術問題，本發明的第一方面提供了一種標靶EpCAM的抗體，其包含輕鏈可變區(VL)和/或重鏈可變區(VH)，其中， 所述VH包含以下的VH互補決定區(HCDR)：如SEQ ID NO: 5的胺基酸序列所示的VH CDR1，如SEQ ID NO: 6的胺基酸序列所示的VH CDR2，和/或，如SEQ ID NO: 7的胺基酸序列所示的VH CDR3； 所述VL包含以下的VL互補決定區(LCDR)：如SEQ ID NO: 8的胺基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO: 9的胺基酸序列所示的LCDR2，和/或，如SEQ ID NO: 10的胺基酸序列所示的LCDR3； 或者，所述VH包含以下的CDR序列：在如SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸突變的HCDR1變異體，在如SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸突變的HCDR2變異體，和/或，在如SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸突變的HCDR3變異體；所述VL包含以下的CDR序列：在如SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸突變的LCDR1變異體，在如SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸突變的LCDR2變異體，和/或，在如SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸突變的LCDR3變異體。
優選地，所述VH還包括重鏈可變區框架區(HFWR)，和/或，所述VL還包括輕鏈可變區框架區(LFWR)；其中，所述HFWR為人抗體的重鏈可變區框架區，所述LFWR為人抗體的輕鏈可變區框架區； 更優選地，所述HFWR包括如SEQ ID NO: 11的胺基酸序列所示的HFWR1，如SEQ ID NO: 12的胺基酸序列所示的HFWR2，如SEQ ID NO: 13的胺基酸序列所示的HFWR3，如SEQ ID NO: 14的胺基酸序列所示的HFWR4； 所述LFWR包括如SEQ ID NO: 15的胺基酸序列所示的LFWR1，如SEQ ID NO: 16的胺基酸序列所示的LFWR2，如SEQ ID NO: 17的胺基酸序列所示的LFWR3，如SEQ ID NO: 18的胺基酸序列所示的LFWR4。
進一步更優選地，所述VH的胺基酸序列為如SEQ ID NO: 3或其突變所示的胺基酸序列；和/或，所述VL的胺基酸序列為如SEQ ID NO: 4或其突變所示的胺基酸序列；所述突變為所述VH和/或VL的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所述VH和/或VL的胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體與EpCAM的結合；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性，更優選為至少95%序列相同性，最優選為至少99%序列相同性。
在本申請中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域技術人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則[參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991)]和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見J Mol Biol 273:927-48,1997)。在本申請中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的胺基酸殘基範圍，詳見表1。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明請求保護的標靶EpCAM的抗體是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
優選地，所述標靶EpCAM的抗體還包括抗體重鏈恆定區和抗體輕鏈恆定區；
更優選地，所述重鏈恆定區選自人IgG1 (hIgG1)、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突變，所述輕鏈恆定區選自人源抗體輕鏈κ鏈或者λ鏈或其突變；
進一步更優選地，所述重鏈恆定區為hIgG1，且所述輕鏈恆定區為人源抗體的輕鏈κ鏈。
優選地，所述標靶EpCAM的抗體為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、scFv (single chain antibody fragment，單鏈抗體)、雙特異性抗體、多特異性抗體、單域抗體或單區抗體，或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。所述單株抗體可以由多種途徑和技術進行研製，包括融合瘤技術、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因選殖技術等，主流是透過融合瘤技術從野生型或基因轉殖小鼠製備單株抗體。
優選地，所述標靶EpCAM的抗體是全長抗體，所述全長抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈的胺基酸序列為如SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列或其突變；和/或，所述輕鏈的胺基酸序列為如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列或其突變；所述突變為所述VL和/或VH的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所述VL和/或VH的胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體與EpCAM的結合；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性；更優選為至少95%序列相同性；最優選為至少99%序列相同性。
為解決上述技術問題，本發明的第二方面提供了一種分離的核酸，其編碼所述的標靶EpCAM的抗體。
為解決上述技術問題，本發明的第三方面提供了一種表現載體，其包含所述的分離的核酸。
為解決上述技術問題，本發明的第四方面提供了一種宿主細胞，其包含所述的表現載體；優選地，所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞。所述宿主細胞的製備方法可為本領域常規的製備方法，例如為：將上述表現載體轉形至宿主細胞中製得。所述的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核酸可被有效表現即可。優選地，所述宿主細胞為E.coli TG1或BL21細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)，或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。其中所述轉形方法為本領域常規轉形方法，較佳地為化學轉形法，熱刺激法或電轉形法。
為解決上述技術問題，本發明的第五方面提供了一種標靶EpCAM的抗體的製備方法，其包含培養所述的宿主細胞，從培養物中獲得標靶EpCAM的抗體。
為解決上述技術問題，本發明的第六方面提供了一種免疫偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及所述的標靶EpCAM的抗體。
為解決上述技術問題，本發明的第七方面提供了一種藥物組成物，其包含所述的標靶EpCAM的抗體或所述的抗體藥物偶聯物。
為解決上述技術問題，本發明的第八方面提供了所述的標靶EpCAM的抗體、所述的免疫偶聯物和所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用；優選地，所述癌症為結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、子宮頸癌或卵巢癌。
此外，為解決上述技術問題，本發明第九方面的技術方案為：提供一種藥盒組合，其包括藥盒A和藥盒B；所述藥盒A包含本發明第一方面所述的標靶EpCAM的抗體、第四方面所述的宿主細胞、第六方面所述的免疫偶聯物和第七方面所述的藥物組成物；所述藥盒B包含其它抗體、雙特異性抗體、基因修飾的細胞或藥物組成物，所述其它抗體、雙特異性抗體、基因修飾的細胞或藥物組成物標靶CD3、B7H4、ROR1或其它標的。所述藥盒A和藥盒B的使用不分先後順序，或先使用藥盒A再使用藥盒B，或先使用藥盒B再使用藥盒A。
本發明所述的標靶EpCAM的抗體、所述的免疫偶聯物和所述的藥物組成物或所述的藥盒組合可施用於病人，用於治療相關腫瘤。
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如本領域技術人員知曉，或J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)中所述。
如本文使用的，術語“包括”或“包含”旨在表示組成物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根據上下文的理解，也包括“由……組成”的情況。
本發明所述的術語“抗體”包括免疫球蛋白(Ig)，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源的κ、λ鏈或其變異體。在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源的IgG1、2、3、4或其變異體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個互補決定區(CDR)和4個框架區(FWR)組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。輕鏈的3個CDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重鏈的3個CDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
術語“突變”包括胺基酸或核苷酸的取代、添加和/或缺失，“胺基酸的取代”是其中胺基酸殘基以另一種胺基酸殘基置換和以具有相似側鏈的胺基酸殘基置換。本發明中，所述突變可以包括目前如本領域技術人員公知的突變，例如在抗體的生產或者應用過程中，可能會對抗體進行的一些突變，例如對可能存在的，特別是CDR的轉錄後修飾(Potential post-translational modifications, PTMs)的位址進行突變，包括抗體的聚集、天門冬醯胺酸脫醯胺基敏感(asparagine deamidation)位址(NG、NS和/或NH等)、天門冬胺酸異構(DG、DP)敏感位址、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位址及氧化敏感位址等相關突變。本發明中，發生了胺基酸突變的抗體稱為變異體。
在“具有3、2或1個胺基酸突變”中的“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言，變異體的序列存在胺基酸的突變，包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的取代、添加和/或缺失。示例性的解釋是對互補決定區(CDR)的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變，這些CDR之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本文使用的術語“載體”或“表現載體”是包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部的組成物。在本領域中已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質體和病毒。因此，術語“載體”包括自主複製的質體或病毒。該術語還應被解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體等。
術語“轉染”是指將外源核酸引入真核細胞。轉染可以透過本領域已知的各種手段來實現，包括磷酸鈣-DNA共沉澱、DEAE-葡聚糖媒介的轉染、聚凝胺媒介的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、反轉錄病毒感染和生物彈道技術(biolistics)。
如本文中所使用的，術語EC50 是指半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect)，即能引起50%最大效應的濃度。
所述的免疫偶聯物的製備方法可為本領域常規，較佳地採用Doronina, 2006, Bioconjugate Chem.17, 114-124所記載的製備方法。優選地，所述的製備方法產生具有最低限度的低偶聯級分(LCF)小於10%的抗體藥物偶聯物。所述的免疫偶聯物能夠以本領域所知的任何物理形態而存在，較佳地為澄清溶液。
如本發明所用，術語“癌”、“癌症”、“腫瘤”意在包括全部類型的癌性生長物或致瘤過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，無論組織病理學類型或侵襲力階段是什麼。例子包括但不限於實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於： 本發明克服了本領域標靶EpCAM的抗體的缺陷，提供了一種全人源序列、親和力較高、跨種屬結合食蟹猴抗原且具有較高的ADCC活性和內吞活性的抗體及其製備方法和應用。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例 實施例 1. 抗原製備、小鼠免疫及融合瘤製備 a.   抗原製備
Human EpCAM (縮寫huEpCAM) / TROP1 Protein，Fc Tag，Gln24-Lys265-Fc，購自Acrobiosystems，Cat#：EPM-H5254， huEpCAM-ECD-His tag即Recombinant Human EpCAM / TROP1 / CD326 (C-6His)，Gln24-Lys265-6×His，購自novoprotein，Cat#：C339。
Cynomolgus EpCAM Protein，Recombinant (His Tag)，Met1-Lys265，C端偶聯多個His tag，購自Sinobiological，Cat#：90299-C08H，批次號：LC11JU2102， Rhesus macaque EpCAM / TROP1 Protein，His Tag，Gln24-Lys265，C端偶聯多個His tag，購自Acrobiosystems，Cat#：EPM-C5227，批次號：557-34A51-4A， 表1 本發明所用的不同來源的EpCAM抗原資訊
種屬 NCBI登錄號
人 P16422
獼猴 Q1WER1
鼠源 Q99JW5
食蟹猴 XP_005576740.1
b.   免疫
從用huEpCAM-ECD-Fc蛋白免疫的H2L2小鼠(和鉑醫藥，授權專利EP2379727B1)產生的融合瘤中鑒定出全人源抗EpCAM抗體。第一次注射50 μg上述融合蛋白，以CFA為免疫佐劑進行免疫，然後在第15、29、43、57、71和86天以25 μg蛋白和Ribi佐劑(Sigma-Aldrich; Sigma Adjuvant System; Cat#: S6322)再加強7次。在第50、78和107天採血測試，小鼠血清的結合親和力透過FACS使用表現人EpCAM的HEK293T細胞或腫瘤細胞株(HEK 293T-huEpCAM，購買自kyinno；Capan-2細胞，購自ATCC)進行檢測，同時平行使用huEpCAM-ECD-His tag蛋白進行ELISA檢測。根據免疫小鼠血清效價的檢測結果，挑選小鼠進行融合瘤融合，融合前3天，即第132天，以25 μg蛋白和Ribi佐劑進行最後一次加強。 c.  融合
融合瘤用常規方法產生和選殖，即透過電融合法，萃取小鼠脾臟和淋巴結，研磨粉碎萃取單細胞，裂解紅血球並洗滌後與sp2/0細胞混合。細胞懸浮液放入電融合槽電擊融合，靜置後換20% FBS的HT培養基，之後更換HAT培養基培養。
將收集的脾臟B細胞與小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0按2:1 (細胞數量比)的比例混合，混合後的細胞用電融合儀(BTX ECM2001)進行細胞融合，將融合後的細胞鋪在96孔細胞培養盤，在二氧化碳培養箱中37°C培養10天後進行融合瘤的初篩。過夜復原後，將融合細胞以極限稀釋法接種到96孔盤中，並用次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷進行篩選。透過ELISA試驗和流式細胞術檢測融合瘤培養上清液中抗EpCAM抗體的存在。實施例 2. 抗體篩選及定序 a.   ELISA篩選
在4℃下，將1 μg/ml新製備的huEpCAM-ECD-His tag蛋白添加到96孔盤(康寧9018)中過夜，然後丟棄上清液並用PBST洗滌3次。室溫下，用5%牛奶將培養盤封阻2小時，並用PBST清洗3次。加入100 μl/孔融合瘤上清液，室溫培育1小時，然後用PBST洗滌3次。加入100 μl/孔的二抗，並在洗滌後室溫培育1小時。然後在培養盤中加入100 μl/孔的TMB，在室溫下培育15分鐘，然後停止反應並讀取結果。ELISA篩選挑取陽性融合瘤，96孔培養盤中轉到24孔培養盤擴大培養，5天後對24孔培養盤孔中的上清液進行複篩，複篩採用FACS方法。 b.   FACS篩選
對於流式細胞術篩選，用TypLE消化黏附細胞3分鐘後，用含10% FBS的完全培養基終止消化。用FACS緩衝液清洗細胞並計數，然後稀釋至3-5×106 /ml密度。將細胞按100 μl/孔添加到96孔盤(Corning 3894)。阻斷3-4分鐘後，加入100 μl/孔融合瘤上清液，在4°C培育1小時。洗滌後加入二抗，在4°C培育1小時。然後洗滌細胞並進行FACS分析。 c.   次選殖及篩選
如上所述，透過極限稀釋法次選殖陽性融合瘤選殖至96孔盤，並透過FACS篩選方法(同上述步驟)鑒定和挑選陽性單選殖株。 d.   定序
挑選陽性單選殖株，萃取總RNA。RT-PCR產生cDNA，隨後重鏈和輕鏈分別用PCR擴增(RT-PCR來自賽默飛的SuperScript® 第一鏈合成系統，Cat#：11904018，具體操作見產品說明書。PCR使用的是NEB的高保真DNA聚合酶，Cat#：M0530L，具體操作見產品說明書)。然後將PCR產物構建到T載體上，並進行定序(北京擎科生物科技有限公司上海分公司)，同時進行抗體亞型測定。 e.   抗體序列資訊
抗體常用的編號體系有Kabat和Chothia等，本發明抗體的編號詳見下表2。由於上述兩種編號體系中，HCDR1和HCDR2有不重合的現象，因此本發明特將兩種編號體系結合(即Combined)，獲HCDR1和HCDR2在重鏈中的胺基酸殘基位置。 表2 不同編號體系下本發明CDR在抗體輕鏈或重鏈中的位置
CDR \ 編號體系 Kabat Chothia Combined
LCDR1 L24 - L34 L24 - L34 L24 - L34
LDR2 L50 - L56 L50 - L56 L50 - L56
LDR3 L89 - L97 L89 - L97 L89 - L97
HCDR1 H31 - H35 H26 - H32 H26 - H35
HCDR2 H50 - H65 H52 - H56 H50 - H65
HCDR3 H95 - H102 H95 - H102 H95 - H102
表3 本發明抗體CDR的胺基酸序列(基於Chothia體系)
  HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
本發明抗體 GFTFSRY WFDGSN EMAAAGFYL RASQSVSSYLA DASNRAT QQRSNWPPIT
序列編號 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
其中對比抗體1為edrecolomab，商品名Panorex，為鼠源單株抗體；對照抗體2的具體資訊參見WO2017157305 (anti-EpCAM Ab hIgG1)。 f.   抗體可變區的框架區序列
表4為對照抗體及本發明優選的框架區序列組合。 表4 框架區序列組合
框架區 \抗體 本發明H2L2抗體PR001081的序列 序列編號
HFWR1 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS SEQ ID NO: 11
HFWR2 WVRQAPGKGLEWVA SEQ ID NO: 12
HFWR3 RFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR SEQ ID NO: 13
HFWR4 WGRGTLVTVSS SEQ ID NO: 14
LFWR1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SEQ ID NO: 15
LFWR2 WYQQKPGQAPRLLIY SEQ ID NO: 16
LFWR3 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC SEQ ID NO: 17
LFWR4 FGQGTRLEIK SEQ ID NO: 18
本發明獲得的抗體及對照抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區如下表5所示。 表5 輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列
抗體\鏈 重鏈可變區 輕鏈可變區
對照抗體1 QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARDGPWFAYWGQGTLVTVSA NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20
對照抗體2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGPSWEQDYWGQGTLVTVSA QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDKGFGHRVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
本發明H2L2抗體PR001081的輕鏈可變區序列為： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO: 4)
本發明抗體的重鏈可變區序列為： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYDMNWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKYYADSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREMAAAGFYLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 3)實施例 3. 抗體生產、純化和驗證 a.   抗體輕鏈、重鏈的序列
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表現，得到重組抗體分子。本發明抗體的重鏈恆定區可選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4中的一種。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈。抗體輕鏈可變結構域序列(VL)透過基因合成並選殖到編碼人抗體Igκ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈。在本實施例中，由於從免疫的和鉑醫藥H2L2小鼠得到的單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列，因而本實施例也得到全人源的抗EpCAM重組IgG1抗體。
例如，本發明抗體輕鏈序列為： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 2)
例如，本發明抗體重鏈序列為： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYDMNWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKYYADSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREMAAAGFYLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 1) b.   抗體生產和純化
將編碼抗體重鏈的質體(Genscript US)和編碼抗體輕鏈的質體(Genscript US)同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。具體來說，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo，Cat#：A1383504)中擴充培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8×105 細胞/ml，於37°C 8% CO2 搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體以2：3 (質量比)的比例混合共計30 μg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo，Cat#：31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI (Polysciences，Cat#：23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS (pH7.4)平衡含有MabSelect ™ (GE Healthcare Life Science，Cat#：71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad，Cat#：7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱，再用pH 3.5的0.1 M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore，Cat#：UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。
取上述純化的樣品適量分別上樣至分析型SEC管柱TSKgel G3000SWxl (HPLC儀器型號：安捷倫1260 Infinity II)，檢測樣品的純度，保證均一樣品的純度在95%以上。該方法流動相為1×PBS，pH 7.4 (生工，Cat#：E607016)，室溫，流速1.0 ml/min，樣品濃度1 mg/ml，進樣體積20 μl，檢測波長280 nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關數據。 c.   重組抗體驗證
FACS驗證：重組抗體進行半對數稀釋，即1：3.16稀釋，濃度分別為100 nM、31.6 nM、10 nM、3.16 nM、1 nM、0.316 nM、0.1 nM、0.0316 nM、0.01 nM和0 nM。並在293T-huEpCAM、CHO-K1-CynEpCAM和Capan-2細胞株中培育1小時，加入二抗繼續1小時培育後進行驗證。
其中293T-huEpCAM購自康源博創生物科技(北京)有限公司，Cat#：KC-0994。CHO-K1-cynoEpCAM由實驗室製備，具體方法如下：在6孔盤中接種105 個/孔CHO-K1細胞，並補充F-12K (21127-022，Gibco)培養基至2 ml，37℃培育過夜。隔夜後在接種孔內加入1E6單位的cynoEpCAM病毒(Cat#：42579-1，吉凱基因)，以及終濃度為4 μg/ml的polybrene (Cat#：H9286，sigma)，37℃培育8小時後換液，並連續培養72小時。72小時後，以TrpLE (12605036，Gibco)消化細胞並計數，用含有8 μg/ml puromycin (A1113803，Gibco)的F-12K培養基稀釋細胞至5個/ml，並按100 μl/孔接種至10塊96孔盤，在37℃培養10天後挑取單選殖株，轉至24孔盤培養5天後以EpCAM抗體驗證，選取表現最高的單選殖株擴大培養及凍存。
Capan-2購自ATCC，Cat#：HTB-80。病毒訂購自吉凱基因，病毒相關資訊：Polybrene，Cat#：REVG0001，10 mg/ml，20 μl。病毒：LV-EPCAM，Cat#：42579-1，效價2e9/ml，50 μl/vial。穩定轉形株製備方法：按密度為50000/ml接種2 ml/孔CHO-K1細胞懸浮液到6孔盤，培育過夜後加入polybrene，使終濃度為4 μg/ml，混勻後加10 μl病毒，混勻後在37℃培育8小時，之後棄去上清液，更換為新鮮培養基，於37℃培養。24小時後消化重新懸浮細胞，以含8 μg/ml puromycin的完全培養基將細胞稀釋到5個/ml，以100 μl/孔接種至10塊96孔盤，37℃培養10天，挑取單選殖株進行FACS驗證後將驗證的選殖株繼續擴大培養，凍存。
實施例3b部分的驗證結果如圖1及表6所示。 表6 抗體和不同的細胞株結合的EC50 值及MFI值
  293T-huEpCAM CHOK1-cynoEpCAM Capan-2
抗體名稱 EC50 (nM) MFI EC50 (nM) MFI EC50 (nM) MFI
對照抗體 1 2.608 27434 ND 47 17.8 42444
對照抗體 2 1.859 29157 2.2 18184 2.228 81875
PR001081 2.741 72712 2.939 25970 2.371 115407
ND：未測得結合活性
在圖1的a中顯示，將PR001081結合至293T-huEpCAM穩定轉形細胞株後，最大MFI值(72712)顯著優於對照抗體(對照抗體1為27434，單價沒有結合活性；對照抗體2為29157，單價有結合活性)；
圖1的b中，PR001081與CHO-K1-cynoEpCAM的結合，PR001081顯示出與cynoEpCAM細胞株的交叉結合活性，其MFI值(25970)顯著高於對照抗體2 (18184)，對照抗體1完全沒有與食蟹猴或獼猴來源的EpCAM的交叉結合活性。
圖1的c中顯示了PR001081與Capan-2腫瘤細胞株的結合。PR001081顯示出與腫瘤細胞結合的活性，其MFI值(115407)顯著高於對照抗體1 (42444)和對照抗體2 (81875)，其EC50 (2.371 nM)也顯著高於對照抗體1。實施例 4. BIACORE 檢測 PR001081 與人 EpCAM 重組蛋白的親和力
整個測試使用HBS-EP + (10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA和0.05% P20，pH7.4，GE Healthcare，Cat#：BR-1006-69)作為運行緩衝液，系列S CM5 (GE Healthcare，Cat#：BR-1005-30)為實驗晶片，人EpCAM-His資訊見上文。 a.   抗原的偶聯
設置流速10 μl/min，在兩張CM5的4個通道上偶聯4種抗原：1)設置注入時間300 s，將50 mM NHS和200 mM EDC以1：1體積比新鮮混合後注入4個通道；2)用pH4.5的醋酸鈉(Cat#：BR-1003-50)將人EpCAM-His重組蛋白稀釋至1 μg/ml，分別注入晶片一的2、3、4和晶片二的2通道；3)注入1 M pH8.5乙醇胺300 s，以封阻晶片表面剩餘的活性羧基。封阻後繼續用1×HBS-EP+緩衝液平衡儀器兩小時。 b.   親和力測定
設置多循環動力學模式，每個循環包括對照抗體1、對照抗體2或PR001081的結合以及晶片的再生。將抗體兩倍梯度稀釋注入四個通道，流速為30 μl/min，設置結合時間180 s，解離時間400 s或600 s。最後以同樣流速注入10 mM甘胺酸-鹽酸pH1.5 (GE Life Sciences，Cat#：BR-1003-54) 60 s，以再生晶片。
用Biacore T200分析軟體對實驗結果進行分析，1通道作為參考通道扣除，分析模型選用1：1動力學擬合模型。
圖2為抗體結合EpCAM-His的親和力測定。圖2的a、b和c分別為對照抗體1、對照抗體2以及PR001081的親和力測定。PR001081的親和力(KD=6.372 E -9)顯著高於對照抗體1 (2.477 E -7)和對照抗體2 (6.527 E -7)。具體結果見下表7。 表7 抗體的親和力測定
抗原 抗體名稱 抗原濃度 (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
EpCAM 對照抗體 1 200-3.125 5.784E+05 1.432E-01 2.477E-07
對照抗體 2 400-25 5.854E+04 3.821E-02 6.527E-07
PR001081 100-3.125 1.529E+05 9.742E-04 6.372E-09
實施例 5. 利用 BLI 方法測定抗原結合蛋白結合 EpCAM 的表位競爭
使用Octet Red96e儀器(Fortiebio)對抗原結合蛋白PR001081、對照抗體1和對照抗體2進行表位競爭實驗。先用HIS1K傳感器捕獲帶有His標籤的人源EpCAM蛋白(Novoprotein，Cat#：C339)，捕獲高度為0.2 nm；再將傳感器浸入第一抗體(100 nM)中，時間180秒，把第180秒時的信號記錄為該抗體的100%信號；再將傳感器浸入第一抗體和第二抗體的混合物中(兩種抗體的終濃度均為100 nM)，時間180秒，將最終信號記錄為該第二抗體的信號。抑制率透過下式計算， 抑制率(%)=(A-B)/ A * 100 (註：A：某抗體的100%信號，B：該抗體作為第二抗體的信號)
若抑制率大於80%，則意味著兩種抗體具有非常相近的表位；若抑制率介於40-80%之間，則意味著兩種抗體具有比較接近但是不完全重疊的表位；若抑制率小於40%，則意味著兩種抗體具有不重疊的表位。
結果顯示，抗原結合蛋白PR001081和對照抗體1具有比較接近但是不完全重疊的表位，PR001081和對照抗體2具有非常相近的表位，見表8。
表8表位競爭實驗信號和抑制率。 表8-1 用Octet檢測binding時的二抗結合的nM數
第二抗體信號 (nM) 第二抗體
對照抗體 1 對照抗體 2 PR001081
第一抗體 對照抗體 1 0.0289 0.1482 0.1975
對照抗體 2 -0.0064 -0.0111 0.0270
PR001081 0.0015 0.0011 0.0300
表8-2 表位競爭實驗信號
  對照抗體 1 對照抗體 2 PR001081
100% 信號 (nM) 0.2479667 0.4177667 0.4561000
表8-3 抑制率
抑制率 (%) 第二抗體
對照抗體 1 對照抗體 2 PR001081
第一抗體 對照抗體 1 88.35 64.53 56.70
對照抗體 2 102.58 102.66 94.08
PR001081 99.40 99.74 93.42
圖3為本發明抗體與對照抗體針對人EpCAM-His抗原的結合表位檢測。
圖3的a、b和c分別以對照抗體1、對照抗體2和PR001081三種抗體為一抗，檢測其他抗體與一抗的抗原表位重疊程度。PR001081與對照抗體2的抗原表位相同，與對照抗體1相近，會部分影響結合，但並不完全一致。實施例 6. CTG 檢測 PR001081 在 Capan-2 細胞株中的內吞效果
使用CellTiter-Glo發光法細胞可活性檢測套組(Promega，Cat#：G7573)，針對Capan-2細胞，檢測EpCAM抗體與MMAF偶合的抗人IgG抗體(Moradec，Cat#：AH-102-AF) 共培養引發細胞毒殺的能力。細胞Capan-2於300 g離心5分鐘，然後用McCoy’s 5A (Capan-2細胞的培養基，Gibco，Cat#：16600108) + 10 % FBS血清培養基重新懸浮，將細胞的密度調整到2×104 細胞/ml。在96孔盤的各孔內加入90 μl細胞懸浮液，於37°C培育過夜。EpCAM抗體以培養基稀釋成不同濃度，在96孔盤的各孔內加入10 μl抗體稀釋液。MMAF偶合的抗人IgG抗體以培養基稀釋，在96孔盤的各孔內加入2 μl抗體稀釋液，終濃度為6.6 nM。細胞與抗體於37°C培育5天。將96孔盤於常溫靜置30分鐘，添加100 μl/孔之常溫CellTiter-Glo顯色液。之後樣品避光常溫培育10分鐘。用PE Enspire讀取孔盤。細胞存活率(%) = [(luminescent sample) / (luminescent mock control)] × 100。對照抗體1和對照抗體2作為陽性對照，human Iso IgG1 (全稱為Human IgG1 Isotype Control，CrownBio，Cat#：C0001-4)抗體作為陰性對照。圖4顯示出抗體與MMAF偶合的抗人IgG抗體共培養時標的細胞的存活率。PR001081與MMAF偶合的抗人IgG抗體共培養時，能以劑量依賴方式於Capan-2細胞產生較對照抗體1更強的細胞毒殺效應，但與對照抗體2效應類似。實施例 7. EpCAM 抗體的 ADCC 活性
使用OneGlo套組(Promega，Cat#：E6120)檢測EpCAM抗體針對EpCAM內源表現腫瘤細胞株Capan-2引發ADCC效應的活性。將標的細胞調整至4×105 /ml，每孔50 μl接種至96孔底透白盤(PerkinElmer，Cat#：6005181)，並在37°C下培養過夜。使用商品化Jurkat-CD16a-NFAT (Vazyme，Cat#：DD1301-01)或者自建Jurkat-CD16a-NFAT報導細胞株，調整細胞密度至3×106 /ml，以每孔50 μl接種於標的細胞盤。將待測抗體以培養基稀釋成不同濃度，每孔50 μl加入細胞盤。細胞盤在37°C培育6小時後，每孔加入75 μl OneGlo工作液，室溫平衡10分鐘後在Envision上進行化學發光檢測。圖5顯示無論是商品化報導細胞(a)還是自建報導細胞(b)系統中，PR001081抗體均顯著優於對照抗體1。
與基準相比，我們已經免疫並獲得了一種具有更高MFI的結合物，顯示了一種適用於CAR-T方法的有潛力的結合親和力。該抗體還具有良好的與cynoEpCAM的結合活性，這有助於進一步的毒性評估，因此可開發為多種用途，包括ADC和BiTEs。該分子同時具有優秀的ADC和ADCC效果。
圖1為本發明中的抗體分子與表現EpCAM的細胞株結合強度的測試結果。a. 抗體分子與過表現人源EpCAM分子的293T穩定轉形細胞株的結合強度測試結果，與對照抗體相比，PR001081的EC50 顯著優於對照抗體1，MFI值顯著優於對照抗體1和對照抗體2；b. PR001081與CHO-K1-cynoEpCAM的結合強度測試結果，PR001801顯示出與cynoEpCAM細胞株的顯著交叉結合活性，且結合MFI優於對照抗體1和對照抗體2；c. PR001081與Capan-2腫瘤細胞株的結合強度測試結果，顯示出PR001081與腫瘤細胞的結合活性顯著優於現有對照抗體。 圖2為以SPR方法對重組抗體的KD值測定結果。a. 對照抗體1與抗原結合的KD值測定；b. 對照抗體2與抗原結合的KD值測定；c. 重組抗體PR001081與抗原結合的KD值測定；其中，PR001081的ka值優於對照抗體2，kd值顯著優於對照抗體1和對照抗體2，KD值顯著優於對照抗體1和對照抗體2。 圖3為以octet方法對重組抗體結合表位的測定。a. 以對照抗體1為一抗，測定三種抗體結合位址的重疊程度；b. 以對照抗體2為一抗，測定三種抗體結合位址的重疊程度；c. 以PR001081為一抗，測定三種抗體結合位址的重疊程度；其中，PR001081與對照抗體2結合於相同的抗原表位，與對照抗體1接近但不完全相同。 圖4為本發明中抗體在腫瘤細胞Capan-2上的內吞效果測定；其中，PR001081的內吞效果顯著優於對照抗體1，與對照抗體2位準相同。 圖5為抗體在腫瘤細胞株Capan-2中誘導ADCC作用的檢測。a. 在商品化報導細胞系統中的測定結果；b. 在自建報導細胞系統中的測定結果；其中，PR001081誘導ADCC位準顯著優於對照抗體1。
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Claims (16)

  1. 一種標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，其包括重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)；其中， 所述VH包含如SEQ ID NO: 5的胺基酸序列所示的VH CDR1，如SEQ ID NO: 6的胺基酸序列所示的VH CDR2，和/或，如SEQ ID NO: 7的胺基酸序列所示的VH CDR3； 所述VL包含如SEQ ID NO: 8的胺基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO: 9的胺基酸序列所示的LCDR2，和/或，如SEQ ID NO: 10的胺基酸序列所示的LCDR3。
  2. 如請求項1所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，所述重鏈可變區還包括重鏈可變區框架區(HFWR)，和/或，所述輕鏈可變區還包括輕鏈可變區框架區(LFWR)，其中，所述HFWR為人抗體的重鏈可變區框架區，所述LFWR為人抗體的輕鏈可變區框架區。
  3. 如請求項2所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於， 所述HFWR包括如SEQ ID NO: 11的胺基酸序列所示的HFWR1，如SEQ ID NO: 12的胺基酸序列所示的HFWR2，如SEQ ID NO: 13的胺基酸序列所示的HFWR3，如SEQ ID NO: 14的胺基酸序列所示的HFWR4； 所述LFWR包括如SEQ ID NO: 15的胺基酸序列所示的LFWR1，如SEQ ID NO: 16的胺基酸序列所示的LFWR2，如SEQ ID NO: 17的胺基酸序列所示的LFWR3，如SEQ ID NO: 18的胺基酸序列所示的LFWR4。
  4. 如請求項1所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，所述VH包括如SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列，所述VL包括如SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，還包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
  6. 如請求項5所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈。
  7. 如請求項6所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，所述重鏈恆定區為hIgG1，且所述輕鏈恆定區為人源抗體的κ鏈。
  8. 如請求項1所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，其是全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、scFv、雙特異性抗體、多特異性抗體、單域抗體或單區抗體，或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
  9. 如請求項8所述的標靶EpCAM的抗體，其特徵在於，其是全長抗體，所述全長抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列，所述輕鏈包括如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
  10. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1~9中任一項所述的標靶EpCAM的抗體。
  11. 一種表現載體，其包含根據請求項10所述的分離的核酸。
  12. 一種宿主細胞，其包含根據請求項11所述的表現載體，其中所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
  13. 一種標靶EpCAM的抗體的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟：培養如請求項12中所述的宿主細胞，從培養物中獲得標靶EpCAM的抗體。
  14. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含如請求項1~9中任一項所述的標靶EpCAM的抗體。
  15. 一種如請求項1~9中任一項所述的標靶EpCAM的抗體和請求項14中所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用。
  16. 如請求項15所述的應用，其特徵在於，所述癌症為結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、子宮頸癌或卵巢癌。
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