TW202340250A - 標靶ｃｄ２５的抗體及其製備方法和應用 - Google Patents

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王遠東
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宏杰 潘
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Abstract

本發明揭示了一種標靶CD25的抗體或其變異體。本發明的標靶CD25的單株抗體是一種天然產生的抗體，具有與人CD25和食蟹猴CD25結合的活性。經Fc改造後具有更強的ADCC效應，體外實驗呈現很好的清除Treg和淋巴癌細胞作用；同時不阻斷IL-2的信號途徑，對Teff細胞的活性沒有影響；而且具有良好的內化活性，是潛在的適用於ADC藥物開發的抗體分子。

Description

標靶CD25的抗體及其製備方法和應用
本申請主張申請日為2022/1/17的中國專利申請2022100512339的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本申請涉及生物醫藥領域，具體涉及一種標靶CD25的抗體或其變異體，以及其製備方法和應用。
調節性T細胞(Treg)是一類控制體內自體免疫反應性的T細胞亞群，在維持身體免疫耐受，自體免疫和抗腫瘤免疫中起到關鍵的作用。已有的研究發現，腫瘤浸潤的Treg細胞增加與多種腫瘤的預後呈現負相關。另外，腫瘤微環境中效應T細胞(Teff)與Treg的比例的高低將影響腫瘤的進程和治療效果。儘管這些研究提示針對Treg的抗腫瘤治療方案具有潛在的價值，但在臨床上標靶Treg的抗腫瘤療法卻鮮有成功的例子，主要原因是，可用於設計特異性標靶Treg的標記分子尚不明確。在小鼠實驗中，抗CTLA-4的抗體表現出了清除腫瘤浸潤Treg細胞的效果，這一效應是透過活化Fc受體(FcRs)實現的。然而，在臨床的實驗中關於抗CTLA-4抗體對Treg的清除作用尚不明確。一些研究發現增強抗CTLA-4抗體與FcRs的親和力可以改善抗體臨床實驗的效果，但是並非所有CTLA-4抗體治療都會導致Treg細胞的減少。因此，仍然需要開發標靶Treg的特異性標記分子抗體，成為實現標靶Treg抗腫瘤治療。
CD25是介白素-2受體的α鏈(IL2Rα)，在Treg細胞中組成性的高表現，而在Teff細胞中CD25的表現量更低。這一特性使CD25成為能夠特異性標靶Treg細胞的潛在標的。然而由於缺乏對抗CD25抗體在小鼠及臨床實驗中的研究，使其發展受限。近期研究發現，在小鼠實驗中，透過增加抗CD25抗體與FcRs的親和力，從而增強抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC)能夠顯著提高抗體的體內的抗腫瘤活性。另外，研究發現經過Fc優化增強ADCC功能的抗CD25抗體能夠顯著提高抗PD-1抗體在體內的抗腫瘤活性。另一方面，CD25在霍奇金淋巴癌和多種非霍奇金淋巴癌中均有表現，在成人T-細胞白血病/淋巴瘤和毛細胞白血病中CD25的表現率接近了100%。基於CD25在血液腫瘤中的高表現，以CD25為標的的抗體偶聯藥物(ADC)的研究成為熱點。已有的抗CD25的ADC藥物ADCT-301在霍奇金淋巴癌的臨床研究中體現了較好的療效。基於CD25在Treg和淋巴癌細胞中的高表現，對這一標的抗體藥物的開發可以透過Fc優化增強ADCC功能實現抗腫瘤效果，另一方面也可以透過ADC的方法進行開發。
抗CD25抗體藥物的研發，早期都集中於對配體介白素-2的阻斷性抗體，包括單抗和ADC。近期的研究發現，不阻斷介白素-2的抗CD25抗體在小鼠實驗中體現出了更好的抗腫瘤活性，這可能是由於CD25在效應T細胞(Teff)上也有表現，阻斷性抗體抑制了介白素-2的信號途徑，從而抑制了Teff的活性。而Teff是腫瘤免疫過程中發揮主要功能的細胞，阻斷性抗體的這一特性減弱了其抗腫瘤的作用。而非阻斷性的抗CD25抗體將避免這一問題，具有更顯著的抗腫瘤活性。
在以抗CD25單抗為開發策略的領域，目前已有多家公司正在致力於開發抗CD25的介白素-2非阻斷性抗體，進展最快的是羅氏的RG6292，處於臨床1期的研究，適應症為固態腫瘤。在以ADC為開發策略的領域，同樣也有多家公司正在研究，進展最快的是ADCT-301，目前處於臨床2期，適應症為霍奇金淋巴癌。然而，臨床上尚未有一種高選擇性的抗CD25介白素-2非阻斷性抗體。
本發明提供一種高親和力、高選擇性，高生物活性的抗CD25介白素-2非阻斷性抗體或其變異體，且具備被細胞內吞的能力，適用於ADC藥物開發的抗體分子。
本發明第一方面提供一種標靶CD25的抗體或其變異體，其特徵在於，所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其中，所述抗體選自以下組： 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 96、111和133所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、44 和 74所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 104、111、127所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 22、46、76所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、110、134所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、48、78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 97、113和129所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 16、40 和 70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116和135所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、47 和 77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 95、111、127所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 14、38、68所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 98、114、130所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、41、71所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 99、115、131所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 18、42、72所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 100、113、132所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 14、43、73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 103、110、134所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 21、45、75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 105、111、136所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 18、42、80所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia (Chothia等人. (1989) Nature 342: 877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) ，基於抗體序列可變性的Kabat (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM (University of Bath), Contact (University College London)，國際ImMunoGeneTics database (IMGT) (萬維網imgt.cines.fr/)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。在本發明中，所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的(本發明的請求項中也是按照Chothia定義規則所示出的序列)。
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位至第bb位的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位至第bb位的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。
本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應理解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明的請求項中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的CDR定義規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
在某一具體實施例中，所述變異體為在標靶CD25的抗體的胺基酸序列上發生1~3個胺基酸殘基的增加、缺失或替換。
優選地，所述變異體為在所述抗體的重鏈可變區的HCDR1的第1位、HCDR2的第3位發生胺基酸殘基的替換，和/或，在所述抗體的輕鏈可變區的LCDR1的第10-11位、LCDR3的第1或4位發生胺基酸殘基的替換；
優選地，所述變異體的胺基酸序列與原胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體與目標抗原的結合；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性；更優選為至少95%、96%、97%或98%序列相同性；最優選為至少99%序列相同性。
更優選地，所述變異體選自以下組： 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 101、113、129所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 19、40、70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 101、113、139所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 19、40、70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 102、113、129所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 19、40、70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116、137、所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、50、77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116、138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、51、77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116、138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、50、77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。 在某一具體實施例中， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 171所示或與SEQ ID NO: 171具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 153所示或與SEQ ID NO: 153具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 173所示或與SEQ ID NO: 173具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 155所示或與SEQ ID NO: 155具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 175所示或與SEQ ID NO: 175具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 157所示或與SEQ ID NO: 157具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 165所示或與SEQ ID NO: 165具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 148所示或與SEQ ID NO: 148具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 174所示或與SEQ ID NO: 174具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 156所示或與SEQ ID NO: 156具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 163所示或與SEQ ID NO: 163具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 146所示或與SEQ ID NO: 146具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 166所示或與SEQ ID NO: 166具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 149所示或與SEQ ID NO: 149具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 167所示或與SEQ ID NO: 167具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 150所示或與SEQ ID NO: 150具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 168所示或與SEQ ID NO: 168具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 151所示或與SEQ ID NO: 151具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 172所示或與SEQ ID NO: 172具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 154所示或與SEQ ID NO: 154具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 177所示或與SEQ ID NO: 177具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 159所示或與SEQ ID NO: 159具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 169所示或與SEQ ID NO: 169具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 152所示或與SEQ ID NO: 152具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 180所示或與SEQ ID NO: 180具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 152所示或與SEQ ID NO: 152具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 170所示或與SEQ ID NO: 170具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 152所示或與SEQ ID NO: 152具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 178所示或與SEQ ID NO: 178具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 160所示或與SEQ ID NO: 160具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 179所示或與SEQ ID NO: 179具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 161所示或與SEQ ID NO: 161具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 179所示或與SEQ ID NO: 179具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 160所示或與SEQ ID NO: 160具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH。
在某一具體實施例中，所述抗體或其變異體包括嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。
優選地，所述抗體或其變異體的結構為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、IgG、Fd、dAb或包括所述抗體或其變異體的雙特異性抗體或多特異性抗體，或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體；所述Fv優選scFv；較佳地，具有所述IgG結構的抗體或其變異體包括輕鏈和重鏈： 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 207所示或與SEQ ID NO: 207具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 189所示或與SEQ ID NO: 189具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 209所示或與SEQ ID NO: 209具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 191所示或與SEQ ID NO: 191具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 211所示或與SEQ ID NO: 211具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 193所示或與SEQ ID NO: 193具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 201所示或與SEQ ID NO: 201具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 184所示或與SEQ ID NO: 184具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 210所示或與SEQ ID NO: 210具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 192所示或與SEQ ID NO: 192具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 199所示或與SEQ ID NO: 199具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 182所示或與SEQ ID NO: 182具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 202所示或與SEQ ID NO: 202具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 185所示或與SEQ ID NO: 185具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 203所示或與SEQ ID NO: 203具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 186所示或與SEQ ID NO: 186具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 204所示或與SEQ ID NO: 204具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 187所示或與SEQ ID NO: 187具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 208所示或與SEQ ID NO: 208具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 190所示或與SEQ ID NO: 190具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 213所示或與SEQ ID NO: 213具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 195所示或與SEQ ID NO: 195具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 205所示或與SEQ ID NO: 205具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 188所示或與SEQ ID NO: 188具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 216所示或與SEQ ID NO: 216具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 188所示或與SEQ ID NO: 188具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 206所示或與SEQ ID NO: 206具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 188所示或與SEQ ID NO: 188具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 214所示或與SEQ ID NO: 214具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 196所示或與SEQ ID NO: 196具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 215所示或與SEQ ID NO: 215具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 197所示或與SEQ ID NO: 197具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 215所示的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 196所示的胺基酸序列。
本發明中，“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。“Fc”區含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並透過CH3結構域的疏水作用保持在一起。“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab’)2片段由透過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。術語“Fv”意指向抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段，但缺少恆定區。
本發明中，所述的scFv(single chain antibody fragment，單鏈抗體)可為本領域常規的單鏈抗體，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區和15~20個胺基酸的短鏈胜肽。其中VL和VH結構域透過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子[參見，例如，Bird等人，Science 242:423-426 (1988) 和Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)]。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。合適的現有技術連接子由重複的G4S胺基酸序列或其變異體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(G4S)4或(G4S)3連接子，但也可使用其變異體。
本發明中，所述的Fd可為本領域常規的抗體片段，其包括Fab中除VL、CL部分，約含225個胺基酸殘基，包括VH、CH1和部分樞紐區。
本發明中，所述的dAb可為本領域常規：由VH或VL結構域組成，是一些最小功能性抗體片段，保留完整的抗原結合特異性。其分子量約為正常抗體分子量的十分之一。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的標的或同一個標的的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的標的或同一個標的的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙特異性抗體(diabodies)、和三抗體(triabodies)、共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
本發明的抗體或其變異體包括單株抗體。本發明所述的單株抗體或mAb或Ab，指由單一的選殖細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的選殖細胞株。
本發明第二方面提供一種嵌合抗原受體，其包含本發明第一方面所述的抗體或其變異體。
本發明第三方面提供一種分離的核酸，其編碼如本發明第一方面所述的抗體或其變異體、或如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體。
本發明第四方面提供一種重組表現載體，其包含根據本發明第三方面所述的分離的核酸；優選地，所述重組表現載體為質體、黏粒、噬菌體或病毒載體，所述病毒載體優選反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
本發明第五方面提供一種轉形株，其在宿主細胞中包含如本發明第四方面所述的重組表現載體；優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞；更優選地，所述宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞；其中，所述哺乳動物細胞為，例如293細胞或CHO細胞。
本發明第六方面提供一種免疫細胞，其包含本發明第二方面所述的嵌合抗原受體；優選地，所述免疫細胞為T細胞或NK細胞；更優選地，所述NK細胞為周邊血液NK細胞、臍帶血來源NK細胞、乾細胞分化NK細胞或NK細胞株例如NK-92細胞株。
本發明第七方面提供一種標靶CD25的抗體或其變異體的製備方法，其包含培養如本發明第五方面所述的轉形株，從培養物中獲得標靶CD25的抗體或其變異體。
本發明第八方面提供一種抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及如本發明第一方面所述的標靶CD25的抗體或其變異體。
本發明第九方面提供一種藥物組成物，其包含如本發明第一方面所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第三方面分離的核酸、如本發明第四方面的重組表現載體、如本發明第五方面的轉形株、如本發明第六方面的免疫細胞和/或如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物，以及藥學上可接受的載劑；
較佳地，所述藥物組成物還含有由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
在一些實施方案中，本發明的藥物組成物或藥物製劑包含合適的藥學上可接受的載劑例如藥用佐劑，如本領域中已知的藥用載劑、藥用賦形劑，包括緩衝劑。如本發明所用，“藥學上可接受的載劑”或“藥用載劑”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。適用於本發明的藥用載劑可以是無菌液體，如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組成物時，水是優選的載劑。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載劑，特別是用於可注射溶液。合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”, 第五版, R.C.Rowe, P.J.Seskey 和S.C.Owen, Pharmaceutical Press, London,Chicago。若期望的話，所述組成物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組成物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準藥用載劑和/或賦形劑，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。可以透過將具有所需純度的本發明的抗體或其抗原結合片段與一種或多種任選的藥用佐劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A. 編(1980))混合來製備包含本發明所述的藥物製劑或藥物組成物，優選地以凍乾製劑或水溶液的形式。本發明的藥物組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分，所述活性成分是被治療的特定適應症所需的，優選具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它抗感染活性成分，例如其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑等。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有本發明的抗體或其抗原結合片段的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
如本發明第一方面任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或本發明第九方面所述的藥物組成物在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
本發明第十方面提供一種試劑盒，其包括如本發明第一方面所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、或如本發明第八方面中所述的抗體藥物偶聯物或如本發明第九方面所述的藥物組成物； 較佳地，所述試劑盒還包括(i)施用抗體或其變異體或嵌合抗原受體或免疫細胞或抗體藥物偶聯物或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
本發明第十一方面提供一種套裝藥盒，其包含藥盒A和藥盒B，其中： 所述藥盒A含有如本發明第一方面所述的標靶CD25的抗體或其抗原結合片段、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物； 所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物，和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
本發明第十二方面提供一種檢測CD25的方法，其包括使用如本發明第一方面所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第六方面所述的免疫細胞、如本發明第八方面中所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物。
優選地，所述檢測為非診斷和/或治療目的。
本發明第十三方面提供一種預防、治療或緩解受試者病症的方法，包含向所述受試者施用治療有效量的如本發明第一方面任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物。
一些具體實施方案中，所述受試者病症是增殖性疾病，例如腫瘤或癌症。一些實施方案中，上述受試者患有已形成的腫瘤，例如固態腫瘤。
一些實施方案中，提供減少受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性Treg的細胞數量方法；一些實施方案中，提供消除或抑制受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性的Treg的細胞活性的方法，均包括向所述受試者施用有效量的如本發明第一方面任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物。
一些實施方案中，提供增加受試者腫瘤內部Teff/Treg的比例的方法，包括向所述受試者施用如本發明第一方面任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物。
一些實施方案中，提供增強受試者體內針對腫瘤細胞的ADCC的方法，包括向所述受試者施用如本發明第一方面任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物。
一些具體實施方案中，受試者體內針對腫瘤細胞的ADCC效應增強。
一些實施方案中，提供如本發明第一方面任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如本發明第二方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第三方面所述的分離的核酸、如本發明第四方面所述的重組表現載體、如本發明第五方面所述的轉形株、如本發明第六方面所述的免疫細胞、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物用於製備預防、治療或緩解受試者病症的藥物的用途，用於製備減少受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性Treg的細胞數量的藥物的用途，用於製備消除或抑制受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性的Treg的細胞活性的藥物的用途，用於製備增加受試者腫瘤內部Teff/Treg比例的藥物的用途，用於製備增強受試者體內針對腫瘤細胞的ADCC的藥物的用途。
一些具體實施方案中，上述受試者的病症為增殖性病症(例如癌症或腫瘤)或患有增殖性病症(例如癌症或腫瘤)。所述腫瘤包括但不限於癌、淋巴瘤、白血病、胚細胞瘤和肉瘤。這類癌症的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、肝細胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多種骨髓瘤、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝臟癌、淋巴母細胞白血病、淋巴細胞白血病、結直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌和頭頸癌。
一些具體實施方案中，所述癌症或腫瘤可以是固態腫瘤，包括但不限於肉瘤(包括由組織(例如松質骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管、造血細胞或纖維結締組織)中的間充質來源的轉化細胞產生的癌症)、癌(包括由上皮細胞產生的腫瘤)、間皮瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等。涉及固態腫瘤的癌症包括但不限於，腦癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、乳腺癌、結腸和直腸癌、腎癌、膀胱癌、腎臟癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲狀腺癌、尿道癌、陰道癌、頸癌、淋巴瘤等。
一些具體實施方案中，所述癌症涉及表現CD25的腫瘤，包括但不限於淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤和淋巴細胞性白血病，例如慢性淋巴細胞白血病(CLL)。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：
本發明的標靶CD25的單株抗體是一種天然產生的抗體，具有與人CD25和食蟹猴CD25結合的活性。經Fc改造後具有更強的ADCC效應，體外實驗呈現很好的清除Treg和淋巴癌細胞作用；同時不阻斷IL-2的信號途徑，對Teff細胞的活性沒有影響；而且具有良好的內化活性，是潛在的適用於ADC藥物開發的抗體分子。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。 實施例 1. 抗 CD25 抗體分子的獲得
利用CD25重組蛋白對實驗動物進行免疫以獲得針對CD25特異性結合的抗體分子，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，基因轉殖技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，這種基因轉殖小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。 1.1. 小鼠免疫
用可溶的重組人CD25-his融合蛋白(Sino Biological，#10165-H08H)作為抗原對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後透過皮下經腹股溝注射或透過腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50微克抗原蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma, # F5881)以體積比1:1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25微克抗原蛋白與Sigma Adjuvant System佐劑(Sigma, #S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常為6到7輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70、84、98天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體效價。在進行H2L2小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25微克抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。 1.2. 血清效價檢測
在特定的時間點，收取小鼠血清，用FACS方法檢測血清中抗體結合CD25的效價。
將編碼人CD25(其Genebank號為NM000417)的cDNA透過基因合成獲得，並被選殖到表現載體pcDNA3.1中，然後將表現載體轉染至CHO細胞中，建構高表現人CD25的CHOK1-huCD25細胞。
梯度稀釋的鼠血清與CHOK1-huCD25細胞4℃培育1小時；細胞洗2次後，加入二抗anti-rat IgG (H+L) (Life technologies, A11006) 4℃培育1小時，洗2次後，重新懸浮細胞用流式細胞儀檢測(BD, CantoII)。CHOK1細胞作為背景對照。 1.3. 透過融合瘤技術篩選抗 CD25 的抗體
將編碼食蟹猴CD25 (其Genebank號為NM001283704)的cDNA透過基因合成獲得，並被選殖到表現載體pcDNA3.1中，然後將表現載體轉染至HEK293細胞中，建構高表現食蟹猴CD25的HEK293-cynoCD25細胞。
選擇血清效價高的免疫小鼠進行一次終免疫後處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞(ATCC, CRL-1581)進行電融合，細胞比例為4:1，電融合參數為V1:50V, t1:15s, V2:600V, t2:20 µs, t3: 0.5s, n:1, t4: 7s, V+/-: +, fade: on。細胞重新懸浮於含20%FBS和HT的DMEM的培養液中平盤培養1 × 10 5/100 µL/孔，24小時後再加100 µL/孔含20%FBS和2× HT的DMEM繼續培養。後續取上清液檢測抗體效價。一般在融合後9-15天，重組人CD25-his蛋白免疫的小鼠取上清液用ELISA進行初篩，檢測與重組人CD25-his蛋白的結合；陽性的選殖然後用FACS進一步確認，檢測與過表現人CD25的CHOK1細胞株(CHOK1-huCD25)、過表現食蟹猴CD25的HEK293細胞株(HEK293-cynoCD25)的結合能力。另外用FACS方法檢測陽性選殖對介白素-2與CHOK1-huCD25結合的阻斷作用。沒有阻斷作用且陽性的孔用有限稀釋法進一步亞選殖，再進一步用ELISA與FACS方法篩選。對人和猴CD25結合較好的選殖被挑選出來進行測序。在本實施例中，從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗CD25單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。 1.4. 製備全人重組抗體
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和對應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表現，得到重組抗體分子。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈。抗體輕鏈可變結構域序列(VL)透過基因合成並選殖到編碼人抗體Igκ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈。在本實施例中，由於從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗CD25單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列，因而本實施例也得到全人源的抗CD25重組IgG1抗體。
將編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的CD25重組抗體。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo ,#A1383504)中擴增培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8 × 10 5細胞/ml，於37℃ 8% CO 2搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2 ×10 6細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體以2:3的比例混合共計30 μg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, 31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI(Polysciences, Inc #23966-2) 120 μl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO 2搖床中培養5天。5天後觀測細胞存存活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelect ™(GE Healthcare Life Science,# 71-5020-91 AE)的重力柱(Bio-Rad ,#7311550)，2-5倍柱體積沖洗。將上清液樣品過柱；用5-10倍柱體積的PBS沖洗柱子，再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的CD25抗體溶液。最後用NanoDrop(Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。 1.5 透過 Fc 區突變來增強 ADCC 效應功能
將抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，並且在該IgG1重鏈恆定區的CH2區引入S239D和I332E突變(根據EU編號，第239位絲胺酸取代成天冬胺酸，和第332位異亮胺酸取代成麩胺酸)以增加ADCC效應功能。然後利用實施例1.4中所述方法將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的質體轉染哺乳動物宿主細胞來製備重組抗體蛋白。 1.6 透過去除岩藻糖來增強 ADCC 效應功能
本實施例透過去除抗體糖鏈(N297)上的岩藻糖組分來改變Fc構象進而增強ADCC效應功能。然後利用實施例1.4中所述方法，將編碼IgG1抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體同時轉染哺乳動物宿主細胞，並且加入2-fluoro peracetylated fucose (2FF) (Sigma-Aldrich，#344827)，然後按照實施例1.4中所述方法進行細胞培養、收集、純化等步驟。化合物2FF的加入會抑制糖苷酶活性並抑制糖鏈上的岩藻糖組分的產生。
本實施例產生的重組抗體與實施例1.4中產生的重組抗體具有相同的胺基酸序列，但是不同的糖鏈修飾。為了區分兩種方法產生的具有相同胺基酸序列的不同抗體蛋白樣品，本實施例使用“AF”作為抗體樣品名稱尾碼來說明該樣品是“低岩藻糖”或“無岩藻糖”的樣品。
例如，PR004639是含有正常IgG1恆定區的重組抗體，並用實施例1.4中所述方法製備對應的具有正常糖鏈結構的抗體蛋白樣品。PR004639AF是具有和PR004639相同的胺基酸序列，利用本實施例方法得到的去除岩藻糖修飾的抗體蛋白樣品。
在一些實施例中，同一個抗體的胺基酸序列既可以用實施例1.4中所述方法製備抗體樣品(編號為PRxxxxxx，其中xxxxxx為數位)，也可以用本實施例方法製備抗體樣品(編號為PRxxxxxxAF，其中xxxxxx為數字)，這些樣品在糖鏈結構上有差異。 1.7 抗 CD25 全人重組抗體的序列
表2-1 列出了本發明申請中CD25抗體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈全長胺基酸序列和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。
本發明申請的多個實施例中使用的對照抗體為RG6292，其序列來自專利申請US20190284287A1，其對應的重組IgG1抗體的編號為PR004639。利用實施例1.6中所述方法製備去除岩藻糖的抗體蛋白樣品PR004639AF，即RG6292的類似物。PR004639(PR004639AF，RG6292)的序列見表2-5。
本發明申請的實施例中使用的對照抗體為daclizumab(商品名Zenapax，Roche)，對應的重組IgG1抗體的編號為PR003689，其重鏈序列如SEQ ID NO.217所示，輕鏈序列如SEQ ID NO.218所示。
本發明申請的實施例中使用的對照抗體為HuMax-Tac(Genmab公司)，其序列來自專利申請WO2014057119A1，對應的重組IgG1抗體的編號為PR007722。 實施例 2 抗體的序列分析和序列優化
抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的生殖系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於輕鏈基因群的生殖系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件。基因重排和體細胞高頻突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同生殖系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign (http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)或者NCBI/IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的生殖系基因片段。將實施例1和表2-1中的抗體序列進行分析，其重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的生殖系基因V基因片段列於表2-2。
蛋白質或多肽胺基酸鏈在細胞中轉譯合成後有時會引入化學修飾，稱為轉譯後修飾(PTM)。對於抗體而言，一些PTM的位址是非常守恆的，例如，在人的IgG1抗體的恆定結構域的第297位(EU編號)的守恆的胺基酸天冬醯胺Asn通常會發生糖基化修飾形成糖鏈，而該糖鏈結構對於抗體結構和相關的效應子功能是至關重要的。但是，如果在抗體的可變結構域，尤其是抗原結合區域(如CDR)中存在PTM，那麼這些PTM的存在有可能會對抗原的結合有較大的影響，也可能對抗體的物理化學性質帶來變化。例如，糖基化、脫醯胺、異構化、氧化等都可能增加抗體分子的不穩定性或異質性，從而增加抗體開發的難度和風險。因而避免一些潛在的PTM對於治療性抗體的開發是非常重要的。隨著經驗的積累，人們發現一些PTM是和胺基酸序列的組成尤其是相鄰胺基酸組成的“模式”是高度相關的，這樣使得可以從蛋白質的一級胺基酸序列預測出潛在的PTM。例如，N-x-S/T (第一位是天冬醯胺，第二位是非脯胺酸以外的任意胺基酸，第三位是絲胺酸或者蘇胺酸)的序列模式預測出N-連接糖基化位址。引起PTM的胺基酸序列模式有可能來源於生殖系基因序列，例如人生殖系基因片段IGHV3-33天然地在FR3區域存在糖基化模式NST；也可能來源於體細胞高頻突變。表2-2列出了實施例1的抗體的可變結構域VH和VL的預測的PTM。具體說來，NSS或NLT可能是糖基化位址，NS或NT或NN可能是脫醯胺位址。
可以透過胺基酸突變來破壞PTM的胺基酸序列模式，從而降低或者去除特定PTM的形成。根據抗體序列和PTM序列模式的不同，有不同的突變設計方法。一種方法是將“熱點”胺基酸(如NS模式中的N或S)替換成物理化學性質相似的胺基酸(如把N突變為Q)，或者利用飽和突變的方法將其替換成其他任一胺基酸。如果PTM序列模式來源於體細胞高頻突變，而並不存在於生殖系基因序列中，那麼另一種方法可以是把該序列模式替換成對應的生殖系基因序列。實際操作中，對同一個PTM序列模式可能採用多種突變設計方法。
表2-3列出了對來自實施例1的具有潛在PTM位址的抗體的序列進行胺基酸突變得到的新的抗體分子(稱為PTM變異體)。表2-4列出了本實施例中這些PTM變異體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈(人IgG1)全長胺基酸序列，和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。所有設計出來的PTM變異體按照實施例1.4中描述的方法得到純化的重組抗體，並在後續的功能實驗中進一步驗證。 表2-1  篩選得到的抗CD25融合瘤單株及其重組抗體
選殖號 抗體 輕鏈 重鏈 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
113D5A1 PR006927 207 189 171 153 96 111 133 20 44 74
310D11F6 PR005436 201 184 165 148 97 113 129 16 40 70
171B2D12 PR006931 210 192 174 156 94 116 135 23 47 77
308B6F9 PR005433 199 182 163 146 95 111 127 14 38 68
245E10F1 PR005497 202 185 166 149 98 114 130 17 41 71
307B8G6 PR006110 203 186 167 150 99 115 131 18 42 72
189F2G11 PR006122 204 187 168 151 100 113 132 14 43 73
150G7E2 PR006928 208 190 172 154 103 110 134 21 45 75
170H1E12 PR006930 209 191 173 155 104 111 127 22 46 76
184B11A4 PR006932 211 193 175 157 94 110 134 23 48 78
111C1D7 PR007181 213 195 177 159 105 111 136 18 42 80
180F6E8 PR006984 212 194 176 158 94 110 134 24 49 79
308B6F9 PR005435 200 183 164 147 96 112 128 15 39 69
表2-2 CD25抗體序列的生殖系基因分析和轉譯後修飾位址(PTM)分析
選殖號 抗體 VH生殖系V 基因 VL生殖系V 基因 VH PTM VL PTM
310D11F6 PR005436 IGHV4-4 IGKV2-28 DG (HCDR1) DG (LCDR1)
171B2D12 PR006931 IGHV1-2 IGKV1-5 NS (HCDR2) NS (LCDR3)
表2-3 CD25抗體序列的突變位址設計
初始抗體 PTM變異體 突變點
PR005436 PR006769 VH:D26P; VL:G34V
PR008197 VH:D26P; VL:G34V,M94L
PR006771 VH:D26P; VL:D33R
PR006931 PR008014 VH:N54P, S60Y; VL:N92L
PR008016 VH:N54Q, S60Y; VL:N92M
PR008015 VH:N54P, S60Y; VL:N92M
表2-4 突變PTM後得到的抗體
初始抗體 PTM變異體 輕鏈 重鏈 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
PR005436 PR006769 205 188 169 152 101 113 129 19 40 70
PR008197 216 188 180 152 101 113 139 19 40 70
PR006771 206 188 170 152 102 113 129 19 40 70
PR006931 PR008014 214 196 178 160 94 116 137 23 50 77
PR008016 215 197 179 161 94 116 138 23 51 77
PR008015 215 196 179 160 94 116 138 23 50 77
表2-5  對照抗體
別名 抗體 輕鏈 重鏈 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
RG6292 PR004639 198 181 162 145 94 110 126 13 37 67
表2-6  抗體的具體序列
VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3
PR004639 13 GGTFSSL 37 IPIFGT 67 GGSVSGTLVDFDI
PR005433 14 GFTFSSY 38 SGRGGS 68 EGYSSSYYEYFQH
PR005435 15 GDRVSNINA 39 YYRSKWY 69 DPWEAFDY
PR005436 16 DGSISSSN 40 YHRGS 70 YYYDSSGYYYGY
PR005497 17 GDSVSNNNA 41 HYRSDRSKWY 71 DWDHDAFDI
PR006110 18 GGSISSSN 42 YHSGS 72 DRNYGSGNYPHYYHYYGMDV
PR006122 14 GFTFSSY 43 WYDGSN 73 AGKGELPFDY
PR006769 19 PGSISSSN 40 YHRGS 70 YYYDSSGYYYGY
PR006771 19 PGSISSSN 40 YHRGS 70 YYYDSSGYYYGY
PR006927 20 GGSIRSY 44 YYSGS 74 DILTGYSDWFFDL
PR006928 21 GFTFSNY 45 WYDGIN 75 EGAGDAFDI
PR006930 22 EFTFSSY 46 SGSGGN 76 EAYSSSWYEYFQH
PR006931 23 GYTFTGY 47 NPNSGG 77 EGEGDAFDI
PR006932 23 GYTFTGY 48 NSNSGD 78 EGAGDAFDF
PR006984 24 GFTFSKY 49 WFDGIN 79 EGVGDAFDI
PR007181 18 GGSISSSN 42 YHSGS 80 DRLVAVAGIFDY
PR008014 23 GYTFTGY 50 NPPSGG 77 EGEGDAFDI
PR008015 23 GYTFTGY 50 NPPSGG 77 EGEGDAFDI
PR008016 23 GYTFTGY 51 NPQSGG 77 EGEGDAFDI
PR008197 19 PGSISSSN 40 YHRGS 70 YYYDSSGYYYGY
VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
PR004639 94 RASQSISSWLA 110 KASSLES 126 QQYNIYPIT
PR005433 95 RASQSISSNLA 111 GASTRAT 127 QQYNYWPLT
PR005435 96 RASQSVSSNLA 112 AASTRAT 128 QQYNDWSIT
PR005436 97 RSSQSLLHRDGYNYVD 113 LGSNRAS 129 MQALQTPLT
PR005497 98 RASQSISGWLA 114 KASSLET 130 LQYNGYST
PR006110 99 RASQNISSYLN 115 AASSLQS 131 QQSYSIPYT
PR006122 100 RSSQSLLHSNGYNYLD 113 LGSNRAS 132 MQVLQTPYT
PR006769 101 RSSQSLLHRDVYNYVD 113 LGSNRAS 129 MQALQTPLT
PR006771 102 RSSQSLLHRRGYNYVD 113 LGSNRAS 129 MQALQTPLT
PR006927 96 RASQSVSSNLA 111 GASTRAT 133 QQYNNWIT
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PR006930 104 RASQSVSDTLA 111 GASTRAT 127 QQYNYWPLT
PR006931 94 RASQSISSWLA 116 EASSLKS 135 HQYNSYST
PR006932 94 RASQSISSWLA 110 KASSLES 134 QQYNSYST
PR006984 94 RASQSISSWLA 110 KASSLES 134 QQYNSYST
PR007181 105 RASQTVSSDLA 111 GASTRAT 136 QQSNDWPYT
PR008014 94 RASQSISSWLA 116 EASSLKS 137 HQYLSYST
PR008015 94 RASQSISSWLA 116 EASSLKS 138 HQYMSYST
PR008016 94 RASQSISSWLA 116 EASSLKS 138 HQYMSYST
PR008197 101 RSSQSLLHRDVYNYVD 113 LGSNRAS 139 LQALQTPLT
實施例 3. 預擴增的人 Treg 細胞和預活化的人 Teff 細胞的製備
預擴增的人Treg細胞製備，從新鮮的人PBMC中分離得到Treg細胞(EasySep™ Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit,#18063)，加入Treg擴增微珠(Miltenyi Biotec Treg Expansion Kit, human #130-095-345)和IL-2(peprotech，200-02)，放置於37℃含5% CO 2培養箱中培育10天，即為預擴增的人Treg細胞。
預活化Teff的製備方法，從新鮮人PBMC中分離T細胞(Miltenyi, #130096535)，加入OKT3(Invitrogen, #16-0037-85，2 µg/ml)塗佈的6孔盤中，密度為1×10 6細胞/ml，再加入anti-CD28抗體(Invitrogen, #16-0289-85，1 µg/ml)。放置於細胞培養箱中培養72小時後，加入IL-2(peprotech 200-02，10 ng/ml)培養72小時後，即為預活化的Teff細胞。 實施例 4. FACS 檢測抗 CD25 抗體結合 CD25 的能力
本實施例是為了研究抗人CD25的H2L2單抗體外結合人/食蟹猴CD25的活性。採用過表現人CD25的CHOK1細胞株(CHOK1-huCD25，和鉑醫藥)、過表現食蟹猴CD25的HEK293細胞株(HEK293-cynoCD25，和鉑醫藥)和高表現人CD25的細胞株SU-DHL-1( ATCC ®CRL-2955)，Karpas299(南京科佰CBP60271)，預擴增的人Treg細胞，預活化的人Teff細胞進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化CHOK1-huCD25細胞、HEK293-cynoCD25細胞、收集SU-DHL-1細胞，Karpas299細胞，Treg和Teff細胞，並用含2%BSA的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體以及陽性對照抗體RG6292。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL /孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-098, 1:1000稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2%BSA的PBS重新懸浮細胞，使用BD CantoII流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
抗體結合細胞表面的人CD25、食蟹猴CD25，以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas表面的CD25的匯總如下(表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9)。 表4-1 抗CD25抗體結合細胞表面的人CD25、食蟹猴CD25以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
CHOK1-huCD25 HEK293-cynoCD25 SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI
PR005433 8.19 22421 3.73 60515 4.90 44300 4.31 24893
PR005435 15.25 31673 4.15 154283 97.58 19516 65.41 16150
PR005436 0.86 49223 1.75 188922 1.40 33345 67.18 32125
RG6292 40.00 2665 40.00 2665 1.57 27996 14.29 20935
表4-2 抗CD25抗體結合細胞表面的人CD25、食蟹猴CD25以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
CHOK1-huCD25 HEK293-cynoCD25 SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50(nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI
PR005497 2.73 60862 6.40 241654 2.40 42418 2.81 33087
RG6292 45.78 4045 6.75 95048 1.35 21142 2.22 16596
表4-3 抗CD25抗體結合細胞表麵食蟹猴CD25以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
HEK293-cynoCD25 SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50(nM) 最大MFI EC50(nM) 最大MFI EC50(nM) 最大MFI
PR006927 17.47 90092 4.68 27285 20.34 10039
PR006930 3.25 145679 2.20 31989 2.12 16355
PR006931 6.25 151664 8.48 33717 40.00 9449
PR006932 3.92 150908 3.51 34355 2.91 12021
PR006122 1.63 82014 1.53 43865 1.21 18303
RG6292 4.33 124778 3.87 32914 30.00 11773
表4-4 抗CD25抗體結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI
PR007181 1.68 32548 5.81 10168
PR006928 1.85 34672 20.00 10602
PR006984 6.00 35251 55.00 8716
RG6292 1.40 30669 5.00 10110
表4-5 抗CD25抗體結合細胞表麵食蟹猴CD25以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
HEK293-cynoCD25 SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI
PR006769 3.53 132071 2.94 32166 39.26 16811
PR006771 5.35 136359 4.56 29821 40.00 8973
RG6292 20.92 89732 3.87 32914 30.00 11773
表4-6 抗CD25抗體結合細胞表麵食蟹猴CD25以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
HEK293-cynoCD25 SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50(nM) 最大MFI EC50(nM) 最大MFI EC50(nM) 最大MFI
PR008014 1.63 31472 1.36 32812 30.00 9513
PR008016 2.25 27895 4.02 34468 40.00 8600
RG6292 80.77 8591 1.28 29729 5.00 9555
表4-7 抗CD25抗體結合細胞表麵食蟹猴CD25以及結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
HEK293-cynoCD25 SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50(nM) 最大MFI EC50(nM) 最大MFI EC50(nM) 最大MFI
PR008197 2.25 25345 1.55 29019 8.00 9951
RG6292 80.77 8591 0.95 26261 3.41 11646
表4-8 抗CD25抗體結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI
PR008015 0.85 33925 20.00 10945
RG6292 1.28 29729 5.00 9555
表4-9 抗CD25抗體結合腫瘤細胞SU-DHL-1和Karpas299表現的CD25
SU-DHL-1 Karpas299
抗體 EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI
PR006110 1.95 38936 1.73 14589
RG6292 1.29 27519 11.82 9200
抗體結合到過表現人CD25的CHO-K1細胞的結果如圖1(圖1的A和圖1的B)、表4-1和表4-2所示，PR005433、PR005435、PR005436及PR005497與對照抗體相比有更強的結合活性。抗體結合到過表現猴CD25的HEK293細胞的結果如圖2(圖2的A-圖2的F)所示，結合表4-1、表4-2和表4-3，可知：初始抗體PR005433、PR005435、PR005436、PR005497、PR006122、PR006927、PR006930、PR006931及PR006932有較好的食蟹猴CD25交叉結合活性；結合表4-5和表4-7可知：PR005436經過PTM突變得到的突變體PR006769、PR006771及PR008197有較好的食蟹猴CD25交叉結合活性；結合表4-6可知：PR006931經過PTM突變得到的突變體PR008014、及PR008016有較好的食蟹猴CD25交叉結合活性。
抗體結合到內源性表現人CD25的腫瘤細胞株SU-DHL-1結果如圖3(圖3的A-圖3的I)所示，結合表4-1、表4-2、表4-3、表4-4和表4-9可知：初始抗體PR005433、PR005436、PR005497、PR006110、PR006122、PR006927、PR006928、PR006930、PR006931、PR006932、PR007181對SU-DHL-1有較強的結合活性；結合表4-1和表4-4可知：PR005435和PR006984結合活性較弱。結合表4-5和表4-7可知：PR005436經過PTM突變得到的突變體PR006769、PR006771及PR008197對SU-DHL-1有較強的結合活性；結合表4-6和表4-8可知：PR006931經過PTM突變得到的突變體PR008014、PR008015及PR008016對SU-DHL-1有較強的結合活性。
抗體結合內源性表現人CD25的腫瘤細胞株Karpas299結果如圖4(圖4的A-圖4的I)所示，結合表4-1、表4-2、表4-3、表4-4和表4-9可知：初始抗體PR005433、PR005497、PR006110、PR006122、PR006927、PR006928、PR006930、PR006932、PR007181對Karpas299有較強的結合活性；結合表4-1、表4-3和表4-4可知：PR005435、PR005436、PR006931和PR006984結合活性較弱。結合表4-5可知：PR005436經過PTM突變得到的突變體PR006769、PR006771對Karpas299的結合活性與對照抗體RG6292的結合活性相當；而根據表4-7可知：PR008197結合活性相較之下稍弱。結合表4-6和4-8可知：PR006931經過PTM突變得到的突變體PR008015對Karpas299有較強的結合活性；而PR008014和PR008016結合活性稍弱。
抗體結合人Treg細胞和Teff細胞的結果如圖5(圖5的A-圖5的F)所示，PR005436、PR008014、PR008016、PR008197、PR006927能與人Treg結合，對人Teff的結合強度較弱。 實施例 5. FACS 檢測抗 CD25 抗體對人介白素 -2 和 CD25 之間結合的阻斷作用
本實例是為了研究抗CD25抗體對人介白素-2和CD25之間結合的阻斷作用。採用過表現人CD25的CHOK1細胞株(CHOK1-huCD25，和鉑醫藥)或高表現人CD25的細胞株SU-DHL-1( ATCC ®CRL-2955)與生物素標記的人介白素-2(Acro，IL2-H82F3)透過FACS的方法檢測抗體的阻斷作用。簡言之，消化CHOK1-huCD25細胞或收集SU-DHL-1( ATCC ®CRL-2955)細胞，並用含2%BSA的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×10 6細胞/mL。以90 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體以及對照抗體RG6292或PR003689，再加入10 µL/孔含生物素標記的人介白素-2濃度為10 µg/ml的PBS。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(eBioscience #12-4317-87，1:200稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL /孔預冷含2%BSA的PBS重新懸浮細胞，使用BD CantoII流式細胞儀讀取螢光發光訊號值
利用FACS方法檢測抗體對人介白素-2與CHOK1-huCD25細胞的結合的阻斷作用結果如圖6(圖6的A-圖6的C)所示，PR005433、PR005435、PR005436、PR005497和PR006122不能阻斷介白素-2與CHOK1-huCD25細胞表面CD25的結合。
利用FACS方法檢測抗體對人介白素-2與SU-DHL-1(ATCC®CRL-2955)細胞的結合的阻斷作用結果如圖7 (圖7的A-圖7的D)所示，初始抗體PR006927、PR006930、PR006931和PR006932不能阻斷介白素-2與SU-DHL-1細胞表面CD25的結合，PR005436經過PTM突變得到的突變體PR006769、PR006771及PR008197不能阻斷介白素-2與SU-DHL-1細胞表面CD25的結合，PR006931經過PTM突變得到的突變體PR008014及PR008016不能阻斷介白素-2與SU-DHL-1細胞表面CD25的結合。 實施例 6. AlphaLisa(PerkinElimer ， #ALSU-PST5-B500) 檢測抗 CD25 抗體對 Teff 中人介白素 -2 誘導的下游信號分子 STAT5 的磷酸化位準的影響
預活化的Teff細胞用不含IL-2的培養基培養4小時後，收集細胞將細胞密度調整為2.5×10 7細胞/ml，以4 µL/孔接種於384孔盤中。再加入2 µL/孔4倍於終濃度的抗體以及對照抗體PR003689，在培養箱中培育1小時。然後加入2 µL/孔5倍於終濃度的IL-2，在培養箱中培育10分鐘。立即加入2 µL/孔的5×裂解液，室溫培育15分鐘。然後加入5 µL/孔Acceptor混合液室溫培育1小時，再加入5 µL/孔Donor混合液室溫培育1小時。使用PerkinElimer Envision讀取訊號值。
利用AlphaLisa的方法檢測抗體對人介白素-2信號途徑下游蛋白STAT5的磷酸化位準的影響結果如圖8所示，PR006122對Teff中人介白素-2信號途徑下游蛋白STAT5的磷酸化位準沒有抑制作用。 實施例 7. FACS 檢測抗 CD25 抗體對 Teff 中人介白素 -2 誘導的下游信號分子 STAT5 的磷酸化位準的影響
預活化的Teff細胞用不含IL-2的培養基培養4小時後，收集細胞將細胞密度調整為2×10 6細胞/mL。以50 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入50 µL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體以及對照抗體PR003689或RG6292，在培養箱中培育1小時。再加入1 µL/孔1 µg/ml的IL-2，在培養箱中培育10分鐘。立即加入100 µL/孔固定液(Biolegend，#420801)，37℃培育15分鐘後，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞，再於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。然後加入100 µL/孔穿膜緩衝液重新懸浮細胞(Biolegend ，#425401)，放置於-20℃冰箱培育過夜。第二天取出於1000 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液，加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞兩次，再於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。加入100 µL/孔抗磷酸化STAT5的抗體(Biolegend，#936904)，於4℃冰箱培育1小時。加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞兩次，再於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2%BSA的PBS重新懸浮細胞，使用BD CantoII流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
結果如圖9所示，PR008014、PR008016、PR008197和PR006927對Teff中人介白素-2信號途徑下游蛋白STAT5的磷酸化位準沒有抑制作用。 實施例 8. 利用報導基因細胞株檢測抗 CD25 抗體對腫瘤細胞株 SU-DHL-1 的 ADCC 作用
收集SU-DHL-1(ATCC®CRL-2955)細胞並調整到1.2×10 6細胞/mL，以25 µL/孔接種於96孔盤中（PerkinElmer，6005225）。將編碼人CD16a(其Genebank號為NM000569.8)和編碼人NFAT(其Genebank號為NM_145912.8)的cDNA透過基因合成獲得，並被選殖到表現載體pcDNA3.1中，然後將表現載體轉染至Jurkat細胞中，建構Jurkat/FCγRIII-NFAT穩定細胞株。
收集Jurkat/FCγRIII-NFAT細胞(和鉑醫藥)並調整到1.2×10 6細胞/mL，以25 µL/孔接種於同一塊96孔盤中。然後加入50 µL/孔2倍於終濃度的抗體以及對照抗體RG6292，放置於37℃含5% CO 2培養箱中培育6小時。加入60 µL/孔One-Glo(Promega，#E6120)，於室溫避光處放置10分鐘。使用PerkinElmer Envision讀取訊號值。
抗體對SU-DHL-1的ADCC結果匯總如下(表8-1、表8-2)。 表8-1 利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對SU-DHL-1細胞株的ADCC作用
SU-DHL-1
抗體 EC50 (nM) 最大MFI
PR006927AF 0.067 81.96
PR006931AF 0.658 58.71
RG6292 0.041 55.78
表8-2 利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對SU-DHL-1細胞株的ADCC作用
SU-DHL-1
抗體 EC50 (nM) 最大MFI
PR006769AF 0.087 53.42
PR006771AF 0.199 64.05
RG6292 0.041 55.78
結果如圖10 (圖10的A和圖10的B)所示，PR006927AF、PR006931AF、PR006769AF、PR006771AF對SU-DHL-1有強ADCC作用。 實施例 9. 利用報導基因細胞株檢測抗 CD25 抗體對預擴增人 Treg 細胞和預活化的人 Teff 細胞的 ADCC 作用
收集預擴增的人Treg細胞和預活化的人Teff細胞，並調整到1.2×10 6細胞/mL，以25 µL/孔接種於96孔盤中(PerkinElmer，6005225)。收集Jurkat/FCγRIII-NFAT細胞(和鉑醫藥)並調整到1.2×10 6細胞/mL，以25 µL/孔接種於同一塊96孔盤中。然後加入50 µL/孔2倍於終濃度的抗體，放置於37 oC含5% CO 2培養箱中培育6小時。加入60 µL/孔One-Glo(Promega，#E6120)，於室溫避光處放置10分鐘。使用PerkinElmer Envision讀取訊號值。
抗體對Treg和Teff的ADCC結果匯總如下(表9-1、表9-2、表9-3)。 表9-1 利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對Treg細胞和Teff細胞的ADCC作用
Treg Teff
抗體 EC50 (nM) 最大MFI 最大MFI
PR005433 3.60 96.40 24.00
PR005435 10.00 13.00 2.00
PR005436 0.95 82.85 14.00
表9-2 利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對Treg細胞和Teff細胞的ADCC作用
Treg Teff
抗體 EC50 (nM) 最大MFI 最大MFI
PR005497 0.05 88.90 30.19
表9-3 利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對Treg細胞和Teff細胞的ADCC作用
Treg Teff
抗體 EC50 (nM) 最大MFI 最大MFI
PR006122 0.08 54.65 6.32
結果如圖11(圖11的A-圖11的C)和圖12(圖12的A-圖12的C)所示，PR005433、PR005436、PR005497和PR006122對人Treg細胞有較強的ADCC作用，而對人Teff沒有明顯作用。PR005435對人Treg的ADCC作用較弱。 實施例 10. 抗體內化實驗
本實例是為了研究抗體的內化作用。採用高表現人CD25的腫瘤細胞株SU-DHL-1( ATCC ®CRL-2955)和Karpas299(南京科佰CBP60271)，利用FACS方法檢測抗體的內化作用。實驗方法如下，收集SU-DHL-1細胞或Karpas299細胞，並用含2%BSA的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體以及對照抗體PR007722。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。用100µL 2%BSA的PBS重新懸浮細胞並放置於37℃含5% CO2的培養箱中培育4小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific，Jackson，#109-545-098，1:1000稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2%BSA的PBS重新懸浮細胞，使用BD CantoII流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
結果如圖13和圖14所示，人腫瘤細胞株Karpas299對PR005433、PR005497、PR006122、PR006930、PR006932有明顯內吞作用。
圖1為抗CD25 H2L2抗體結合到過表現人CD25的CHO-K1細胞。
圖2為抗CD25 H2L2抗體結合到過表現猴CD25的HEK293細胞。
圖3為抗CD25 H2L2抗體結合到內源性表現人CD25的腫瘤細胞株SU-DHL-1。
圖4為抗CD25 H2L2抗體結合到內源性表現人CD25的腫瘤細胞株Karpas299。
圖5為抗CD25 H2L2抗體結合人Treg細胞和Teff細胞。
圖6為抗CD25 H2L2抗體不阻斷人介白素-2與CHOK1-huCD25細胞的結合。
圖7為抗CD25 H2L2抗體不阻斷人介白素-2與SU-DHL-1細胞的結合。
圖8為AlphsLisa檢測抗CD25 H2L2抗體不抑制人介白素-2信號途徑下游蛋白STAT5的磷酸化位準。
圖9為FACS檢測抗CD25 H2L2抗體不抑制人介白素-2信號途徑下游蛋白STAT5的磷酸化位準。
圖10為利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對SU-DHL-1細胞株的ADCC作用。
圖11為利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對人Treg細胞的ADCC作用。
圖12為利用報導基因細胞株檢測抗CD25 H2L2抗體對人Teff細胞的ADCC作用。
圖13為Karpas 299細胞對抗CD25 H2L2抗體的內吞作用。
圖14為SU-DHL-1細胞對抗CD25 H2L2抗體的內吞作用。
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Claims (18)

  1. 一種標靶CD25的抗體或其變異體，其特徵在於，所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其中，所述抗體選自以下組： 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 96、111和133所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、44和74所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 104、111、127所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 22、46、76所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、110、134所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、48、78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 97、113和129所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 16、40和70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116和135所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、47和77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 95、111、127所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 14、38、68所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 98、114、130所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、41、71所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 99、115、131所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 18、42、72所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 100、113、132所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 14、43、73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 103、110、134所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 21、45、75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 105、111、136所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 18、42、80所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  2. 如請求項1所述的標靶CD25的抗體或其變異體，其特徵在於，所述變異體為在標靶CD25的抗體的胺基酸序列上發生1~3個胺基酸殘基的增加、缺失或替換；優選地，所述變異體為在所述抗體的重鏈可變區的HCDR1的第1位、HCDR2的第3位發生胺基酸殘基的替換，和/或，在所述抗體的輕鏈可變區的LCDR1的第10-11位、LCDR3的第1或4位發生胺基酸殘基的替換；更優選地，所述變異體選自以下組： 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 101、113、129所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 19、40、70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 101、113、139所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 19、40、70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 102、113、129所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 19、40、70所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116、137、所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、50、77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116、138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、51、77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94、116、138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 23、50、77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  3. 如請求項1或2所述的抗體或其變異體，其特徵在於， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 171所示或與SEQ ID NO: 171具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 153所示或與SEQ ID NO: 153具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 173所示或與SEQ ID NO: 173具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 155 所示或與SEQ ID NO: 155具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 175所示或與SEQ ID NO: 175具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 157所示或與SEQ ID NO: 157具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH ；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 165所示或與SEQ ID NO: 165具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 148所示或與SEQ ID NO: 148具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 174所示或與SEQ ID NO: 174具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 156所示或與SEQ ID NO: 156具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 163所示或與SEQ ID NO: 163具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 146所示或與SEQ ID NO: 146具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 166所示或與SEQ ID NO: 166具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 149所示或與SEQ ID NO: 149具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 167所示或與SEQ ID NO: 167具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 150所示或與SEQ ID NO: 150具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 168所示或與SEQ ID NO: 168具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 151所示或與SEQ ID NO: 151具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 172所示或與SEQ ID NO: 172具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 154所示或與SEQ ID NO: 154具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 177所示或與SEQ ID NO: 177具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 159所示或與SEQ ID NO: 159具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 169所示或與SEQ ID NO: 169具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 152所示或與SEQ ID NO: 152具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 180所示或與SEQ ID NO: 180具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 152所示或與SEQ ID NO: 152具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 170所示或與SEQ ID NO: 170具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 152所示或與SEQ ID NO: 152具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 178所示或與SEQ ID NO: 178具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 160所示或與SEQ ID NO: 160具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 179所示或與SEQ ID NO: 179具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 161所示或與SEQ ID NO: 161具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 179所示或與SEQ ID NO: 179具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VL；所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 160所示或與SEQ ID NO: 160具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的VH。
  4. 如請求項1-3任一所述的抗體或其變異體，其特徵在於，所述抗體選自下組：嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體；優選地， 所述抗體或其變異體的結構為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、IgG、Fd、dAb或包括所述抗體或其變異體的雙特異性抗體或多特異性抗體，或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體；所述Fv優選scFv； 較佳地，具有所述IgG結構的抗體或其變異體包括輕鏈和重鏈： 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 207所示或與SEQ ID NO: 207具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 189所示或與SEQ ID NO: 189具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 209所示或與SEQ ID NO: 209具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 191所示或與SEQ ID NO: 191具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 211所示或與SEQ ID NO: 211具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 193所示或與SEQ ID NO: 193具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 201所示或與SEQ ID NO: 201具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 184所示或與SEQ ID NO: 184具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 210所示或與SEQ ID NO: 210具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 192所示或與SEQ ID NO: 192具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 199所示或與SEQ ID NO: 199具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 182所示或與SEQ ID NO: 182具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 202所示或與SEQ ID NO: 202具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 185所示或與SEQ ID NO: 185具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 203所示或與SEQ ID NO: 203具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 186所示或與SEQ ID NO: 186具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 204所示或與SEQ ID NO: 204具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 187所示或與SEQ ID NO: 187具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 208所示或與SEQ ID NO: 208具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 190所示或與SEQ ID NO: 190具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 213所示或與SEQ ID NO: 213具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 195所示或與SEQ ID NO: 195具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 205所示或與SEQ ID NO: 205具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 188所示或與SEQ ID NO: 188具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 216所示或與SEQ ID NO: 216具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 188所示或與SEQ ID NO: 188具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 206所示或與SEQ ID NO: 206具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 188所示或與SEQ ID NO: 188具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 214所示或與SEQ ID NO: 214具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 196所示或與SEQ ID NO: 196具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 215所示或與SEQ ID NO: 215具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 197所示或與SEQ ID NO: 197具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；或， 所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 215所示或與SEQ ID NO: 215具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列；重鏈包括如SEQ ID NO: 196所示或與SEQ ID NO: 196具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸相同性的胺基酸序列。
  5. 一種嵌合抗原受體，其包含請求項1-4中任一項所述的抗體或其變異體。
  6. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-4中任一項所述的抗體或其變異體、或如請求項5所述的嵌合抗原受體。
  7. 一種重組表現載體，其包含根據請求項6所述的分離的核酸；優選地，所述重組表現載體為質體、黏粒、噬菌體或病毒載體，所述病毒載體優選反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
  8. 一種轉形株，其在宿主細胞中包含如請求項7所述的重組表現載體；優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞；更優選地，所述宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞；其中，所述哺乳動物細胞為，例如293細胞或CHO細胞。
  9. 一種免疫細胞，其包含請求項5所述的嵌合抗原受體；優選地，所述免疫細胞為T細胞或NK細胞；更優選地，所述NK細胞為周邊血液NK細胞、臍帶血來源NK細胞、乾細胞分化NK細胞或NK細胞株例如NK-92細胞株。
  10. 一種標靶CD25的抗體或其變異體的製備方法，其包含培養如請求項8所述的轉形株，從培養物中獲得標靶CD25的抗體或其變異體。
  11. 一種抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體。
  12. 一種藥物組成物，其包含如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如請求項6所述的分離的核酸、如請求項7所述的重組表現載體、如請求項8所述的轉形株、如請求項9所述的免疫細胞和/或如請求項11所述的抗體藥物偶聯物，以及藥學上可接受的載劑； 較佳地，所述藥物組成物還含有由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
  13. 如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如請求項5所述的嵌合抗原受體、如請求項6所述的分離的核酸、如請求項7所述的重組表現載體、如請求項8所述的轉形株、如請求項9所述的免疫細胞、如請求項11所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項12所述的藥物組成物在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
  14. 一種試劑盒，其包括如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如請求項5所述的嵌合抗原受體、如請求項6所述的分離的核酸、如請求項7所述的重組表現載體、如請求項8所述的轉形株、如請求項9所述的免疫細胞、或如請求項11中所述的抗體藥物偶聯物或如請求項12所述的藥物組成物； 較佳地，所述試劑盒還包括(i)施用抗體或其變異體或嵌合抗原受體或免疫細胞或抗體藥物偶聯物或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
  15. 一種套裝藥盒，其包含藥盒A和藥盒B，其中： 所述藥盒A含有如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其抗原結合片段、如請求項5所述的嵌合抗原受體、如請求項6所述的分離的核酸、如請求項7所述的重組表現載體、如請求項8所述的轉形株、如請求項9所述的免疫細胞、如請求項11所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項12所述的藥物組成物； 所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物，和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
  16. 一種檢測CD25的方法，其包括使用如請求項1-4中任一項所述的抗體或其變異體、如請求項5所述的嵌合抗原受體、如請求項9所述的免疫細胞、如請求項11所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項12所述的藥物組成物；優選地，所述檢測為非診斷和/或治療目的。
  17. 一種預防、治療或緩解患有癌症的受試者的方法，其包括向受試者施用治療有效量的如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如請求項5所述的嵌合抗原受體、如請求項6所述的分離的核酸、如請求項7所述的重組表現載體、如請求項8所述的轉形株、如請求項9所述的免疫細胞、如請求項11所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項12所述的藥物組成物。
  18. 一種減少受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性Treg的細胞數量方法，其包括向所述受試者施用有效量的如請求項1~4任一項所述的標靶CD25的抗體或其變異體、如請求項5所述的嵌合抗原受體、如請求項6所述的分離的核酸、如請求項7所述的重組表現載體、如請求項8所述的轉形株、如請求項9所述的免疫細胞、如請求項11所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項12所述的藥物組成物。
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