CN107446028A - 人工改造的PCV2 Cap蛋白、重组病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。人工改造的PCV2 Cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。人工改造的PCV2 Cap蛋白或重组病毒在PCV2免疫疫苗中的应用。本发明筛选获得一株重组杆状病毒，能有效表达Cap蛋白，表达的重组Cap蛋白具有良好的免疫原性，并能够自组装成病毒样粒子，为PCV2亚单位疫苗的研发打下了基础。

Description

人工改造的PCV2 Cap蛋白、重组病毒及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人工改造的PCV2 Cap蛋白，还涉及含有此蛋白编码基因的重组病毒，还涉及人工改造的PCV2 Cap蛋白及重组病毒的应用。
背景技术
猪圆环病毒1型和2型(PCV1和PCV2)非常小，直径只有17nm左右，呈球状，不具有囊膜。其基因组为单链环状DNA，大约由1760个核苷酸构成，至少编码两个开放阅读框，分别是ORF1和ORF2。其中ORF1编码Rep蛋白，与病毒DNA复制有关。ORF2编码Cap蛋白，与病毒粒子的装配相关。猪圆环病毒病(PCVD)在全球范围内广泛流行，给养殖业带来了巨大的经济损失。PCV2是导致该疾病的主要病原因子，对猪体进行PCV2疫苗免疫是较为有效的预防手段。
传统的疫苗种类包括弱毒苗和灭活苗，两者的制备都需要大规模地培养病原微生物，在生产应用上存在一定的风险。重组亚单位疫苗因不含有病原微生物及其遗传物质，所以不存在上述风险。杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)是一个高效的表达系统，能够表达具有生物活性的大分子蛋白质，已被广泛地用于生产病原微生物的抗原。近来，已有多种基于该平台的疫苗得到了商品化，比如Merck的猪瘟苗Porcilis和B.Ingelheim的圆环苗杆状病毒的宿主范围较窄，不能够在脊椎动物体内复制，具有较高的安全性。BEVS表达的蛋白容易自组装成病毒样颗粒，VLP能够被宿主细胞的TLRs和PRRs识别，进而激活先天性免疫机制。此外，由于VLP具有规则的表面结构，所以能够有效地使B细胞表面的免疫球蛋白分子相互交联，进而诱导强烈的B细胞反应。VLPs还有利于抗原递呈细胞(特别是树突状细胞)的抗原递呈作用，进而将抗原分子展示给免疫细胞。
Cap蛋白是PCV2的主要免疫原性蛋白，具有多个表位。最近，研究人员使用了多种表达系统来表达Cap蛋白，从而制备PCV2亚单位疫苗，比如大肠杆菌和重组病毒载体疫苗(杆状病毒和伪狂犬病毒)。尽管每种表达系统都具有独特的优势，但是也存在一些不足限制了重组亚单位疫苗的开发利用。比如大肠杆菌表达系统操作简单、产量高，但是表达的蛋白不能够正确的折叠和加工，而这些对抗原天然构象的形成是必不可少的。杆状病毒表达系统能够表达多种病毒的结构蛋白，进而形成病毒样颗粒(VLPs)。目前国外已有两种基于杆状病毒表达系统的PCV2亚单位疫苗得到了商品化，应用效果良好。我国也已有采用该表达系统表达PCV2 Cap蛋白的研究报道，但其表达水平较低，疫苗生产成本较高。
发明内容
为了解决以上现有技术中PCV2 Cap蛋白表达水平较低，疫苗免疫免疫效果不够理想的问题，本申请公开了一种人工改造的PCV2 Cap蛋白，还涉及含有此蛋白编码基因的重组病毒，还涉及人工改造的PCV2 Cap蛋白及重组病毒的应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。
人工改造的PCV2 Cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。
含有、所述的表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。
所述的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)以含有序列表中序列1的核苷酸序列的PCV2ORF2基因为模板，以下述的引物对中的一对进行PCR扩展，PCR产物经纯化后酶切克隆入pFastBac载体，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性质粒得到重组质粒；
(2)重组质粒转化感受态细胞DH10Bac，培养，进行蓝白斑筛选，按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的碱裂解法提取重组载体骨架Bacmid，转染昆虫细胞，出现病变的昆虫细胞即为重组病毒；
所述引物对的核苷酸序列如下：
Kozak and Mutation S:5’-CGCTCGAGATCAAAATGGCCTACCCCC-3’,
Kozak R:5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’。
或：Kozak S:5’-CGCTCGAGATCAAAATGACCTACCCCC-3’，
Kozak R:5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’。
所述的人工改造的PCV2 Cap蛋白或者所述的重组病毒在PCV2免疫疫苗中的应用。
从重组病毒中获取PCV2 Cap蛋白，制备成疫苗。
重组病毒细胞中加入PBS溶液得到细胞悬液，吹下细胞，对细胞悬液进行超声波裂解，得到含有PCV2 Cap蛋白的细胞裂解液，以CP974S水佐剂为基础，配制佐剂，将佐剂与等体积的细胞裂解液混合，制备动物免疫用疫苗。
所述免疫疫苗为重组亚单位疫苗。
本发明的有益效果：
1)其中重组杆状病毒rBcapokm为研制PCV2亚单位疫苗奠定了重要基础。为了提高PCV2Cap蛋白表达水平和抗原性，本发明根据昆虫细胞密码子的偏嗜性对Cap蛋白的基因进行优化，设计了7种含Cap蛋白的基因分子，构建重组病毒，筛选获得两株重组杆状病毒，能有效表达Cap蛋白，具有良好的免疫原性，并能够自组装成病毒样粒子，为PCV2亚单位疫苗的研发打下了基础；
2)本发明构建成功的昆虫杆状病毒表达系统制备的PCV2亚单位疫苗，进行动物免疫试验。小鼠免疫试验表明，重组蛋白均可诱导产生高水平的ELISA抗体和中和抗体。该重组Cap蛋白具有较好的免疫保护效果，具有很好的开发和应用前景。
附图说明
图1为Cap基因扩增，
图2为目的基因的扩增结果，
A:M.DL5000DNA marker；1.pVax-cap双酶切产物(BamH I和Xho I)；2.pVax双酶切产物(BamH I和Xho I)；B:M.100bp DNA marker；1.Capom PCR产物；C:M.100bp DNAmarker；1.Capo/bNLS PCR产物；D:M.DL2000DNA marker；1.Capok PCR产物；2.Capokm PCR产物；
E:M.DL2000DNA marker；1.CapoEm PCR产物；2.Capo△NLS PCR产物，
图3重组载体质粒的鉴定，其中
A:M1.DL2000DNA marker；1.pFastBacHT B-Capo双酶切产物(BamH I和Xho I)；2.pFastBacHT B双酶切产物(BamH I和Xho I)；M2.DL15000DNA marker.B:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacHT B-Capom双酶切产物(BamH I和Xho I)；2.pFastBacHT B双酶切产物(BamH I和Xho I)；M2.DL15000DNA marker.C:M1.DL2000DNA marker；1.pFastBacDual-Capo/bNLS双酶切产物(Xho I和kpn I)；2.pFastBacDual双酶切产物(Xho I和kpn I)；M2.DL15000DNA marker.D:M1.DL2000DNA marker；1.pFastBacDual-Capok双酶切产物(XhoI和kpn I)；2.pFastBacDual双酶切产物(Xho I和kpn I)；M2.DL15000DNA marker.
E:M1.DL2000DNA marker；1.pFastBacDual-Capokm双酶切产物(Xho I和kpn I)；2.pFastBacDual双酶切产物(Xho I和kpn I)；M2.DL15000DNA marker.F:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacDual-Capo△NLS双酶切产物(EcoR I和Hind III)；2.pFastBacDual双酶切产物(EcoR I和Hind III)；M2.DL15000DNA marker.G:M1.DL2000DNA marker；1.pFastBacDual-CapoEm双酶切产物(EcoR I和Hind III)；2.pFastBacDual双酶切产物(EcoR I和Hind III)；M2.DL15000DNA marker.
图4重组Bacmid的PCR鉴定，其中
A:1,2:rBacmid-Capo PCR产物；M:DL5000DNA marker.B:1,2:rBacmid-Capom PCR产物(M13F and M13R).1,2:recombinant bacmid DNA amplified with M13primers；M:DL5000DNA marker.C:1～4:rBacmid-Capo/bNLS PCR产物(M13F and M13R)；M:1kb DNAmarker.D:1～2，5～6:rBacmid-Capok PCR产物(M13F and Kozak S)；3～4,7～8:rBacmid-Capokm PCR产物；M:DL5000DNA marker.E:1～3:rBacmid-Cap△NLS PCR产物；M:DL5000DNAmarker.F:1～4:
rBacmid-CapoEm PCR产物；M.DL2000DNA marker.
图5重组杆状病毒感染Sf9细胞的CPE
图6重组Cap蛋白的SDS-PAGE分析，其中A:M,protein marker；1,rBcapo；2,rBcapom；3,rBcapok；4,rBcapokm；5,vBac-Cap；6,lysates of cells；B:M,proteinmarker；1,rBcapo/bNLS；2,rBcapo△NLS；3,rBcapoEm；4,vBac-Cap；5,lysates of cells，
图7不同病毒感染的Sf9细胞中重组Cap蛋白的Western blot鉴定，其中A:1,rBcapo；2,rBcapom；3,rBcapok；4,rBcapokm；5,rBcapo△NLS；6,rBcap/bNLS；7,cellscontrol.B:1,rBcapoEm；2,cells control.
图8不同病毒感染的Sf9细胞内重组Cap蛋白的IFA鉴定，其中
A:rBcapo；B:rBcapom；C:rBcapok；D:rBcapokm；E:normal cells，
图9VLPs的电镜观察，
图10小鼠免疫后ELISA抗体检测，
图11小鼠免疫后中和抗体检测，
图12小鼠免疫后淋巴细胞增殖反应的检测，
图13仔猪免疫后ELISA抗体检测(S/P)，
图14仔猪免疫后中和抗体检测，
图15攻毒后仔猪体温的测定，
图16攻毒后各组猪相对日增重测定。
图17肺脏及淋巴结显微病变(HE染色，100×)，其中
CPH(1),iPCV2(2)and challenge control(3)at 28dpc，
图18IHC检测结果(400×)，其中
CPH(1),iPCV2(2)and challenge control(3)at 28dpc。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
1材料与方法
1.1材料
昆虫杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression System,BEVS)由本实验室保存，包括pFastBacHT B、pFastBacDual质粒、DH10Bac菌株、Sf9昆虫细胞。大肠杆菌DH5α由本实验室保存，本实验中所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq酶均购自Takara公司。DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自鼎国公司。培养昆虫细胞的Grace培养基、Express Five无血清培养基和FBS为Gibco公司产品。转3染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG和FITC标记的SPA购自博士德公司。含有经密码子优化的PCV2 WG09毒株ORF2基因的pVax-cap质粒由本实验室构建和保存，pVax-cap质粒中含有序列表中序列1中的Capo基因序列，是经过优化的，针对PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体亦由本实验室制备和保存。
1.2方法
1.2.1PCV2 Cap基因片段克隆引物设计和合成
1.2.1.1序列优化的完整Cap基因的获得(Capo)
用质粒pVax-cap转化感受态DH5α。挑取单菌落于含有kna+抗性的液体LB培养基中，37℃振荡培养12h，收集菌体，提取质粒。利用限制性内切酶BamH I和Xho I对提取的pVax-cap质粒进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带并进行纯化。
1.2.1.2碱基突变的完整Cap基因的扩增(Capom)
根据质粒pVax-cap的碱基序列，设计如下引物，
PCV2-ORF2-s:5’-ATTGGATCCACGACCATGGCCTACCCTCGC-3’和
PCV2-ORF2-a:5’-CGCGCTCGAGTCACTTGGGGTTCAG-3’，扩增得到Capom。
1.2.1.3缺失核定位信号并添加分泌信号肽的Cap的扩增(Capo/bNLS)
根据质粒pVax-cap和蜜蜂分泌信号肽(Honeybee melittin secretion signalpeptide)的碱基序列，设计如下三个引物，S1:5’-CTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCCAACGGCATCTTCAACA-3’,S2:5’-GCCTCGAGACGACCATAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCG-3’和A:5’-ATTTGGTACCTCACTTGGGGTTCAGGG-3’，分两次扩增出Capo/bNLS。
1.2.1.4添加昆虫Kozak序列的完整Cap的扩增(Capok，见序列表中序列2)
根据质粒pVax-cap和果蝇的Kozak序列的碱基，设计如下一对引物，Kozak S:5’-CGCTCGAGATCACAATGACCTACCCCC-3’和Kozak R:5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’，扩增出Capok。
1.2.1.5添加昆虫Kozak序列和碱基突变的完整Cap的扩增(Capokm，见序列表中序列3)
根据质粒pVax-cap和果蝇的Kozak序列的碱基，设计如下一对引物，
Kozak and Mutation S:5’-CGCTCGAGATCACAATGGCCTACCCCC-3’和
Kozak R:5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’，扩增出Capokm。
1.2.1.6添加EcoR I序列的去NLS的Cap的扩增(Capo△NLS)
根据质粒pVax-cap和EcoR I序列的碱基，设计如下一对引物，
S-EcoR I(NLS):5’-GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACC-3’
和R-Hind III:5’-CGAAGCTTTCACTTGGGGTTCA-3’，扩增得到去除NLS的Cap，命名为Cap△NLS。
1.2.1.7添加EcoR I序列的碱基突变的完整Cap的扩增
根据质粒pVax-cap和EcoR I序列的碱基，设计如下一对引物，S-EcoR I:5’-GGATCCGAATTCATGGCCTACCCC-3’和R-Hind III:5’-CGAAGCTTTCACTTGGGGTTCA-3’，扩增得到CapEm。
1.2.2目的基因片段的扩增
以质粒pVax-cap为模板，利用前文所述的各对引物，通过PCR分别扩增各个对应的Cap基因片段。
PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，2×Mix 12.5μL；稀释质粒的模板1.0μL；TaqDNA聚合酶0.2μL；灭菌双蒸水补至25μL。循环参数：95℃5min；94℃45s,52-58℃45s，72℃45s，30次循环；最后72℃延伸10min。根据各对引物的Tm值，确定不同的退火温度，一般计算公式为：Tm＝4(G+C)+2(A+T)，退火温度＝Tm值-(5～10℃)。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收PCR产物，-20℃保存备用。
1.2.3PCR产物的克隆
1.2.3.1PCR产物的回收和纯化
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖胶块，参照DNA快速回收纯化试剂盒说明书回收目的片段。
1.2.3.2PCR产物酶切与纯化
酶切反应总体积为20.0μL。10×buffer 2.0μL，PCR回收片段10.0μL，酶各0.5μL，用无菌双蒸水补至总体积20.0μL。37℃作用4.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
不同Cap片段采用对应的限制性内切酶，酶切体系如下：10×Buffer 2μL,内切酶10.5μL,内切酶2 0.5μL,PCR产物10μL,dd H2O 7μL,总计20μL。
提取pVax-cap质粒，用限制性内切酶BamH I和Xho I对其进行双酶切，得到目的片段Capo。再以pVax-cap质粒为模板，利用上文中的引物进行PCR扩增，分别得到对应的PCR产物。经1％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR产物均在相应位置处出现特异性条带，与预期大小结果相符，如图2所示。然后切取含有目的片段的凝胶，回收纯化后备用。
1.2.3.3pFastBac载体的酶切与纯化
酶切反应总体积为20.0μL。10×buffer 2.0μL，质粒5.0μL，内切酶各0.5μL，用无菌双蒸水补至总体积20.0μL，具体为：pFastBacHT B用BamH I和Xho I双酶切，pFastBacDual分别用Xho I、Kpn I和EcoR I、Hind III双酶切。37℃作用4.0h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
酶切体系：10×Buffer 2.0μL，内切酶1 0.5μL，内切酶2 0.5μL，质粒5μL，dd H2O12μL，总计：20μL。
1.2.3.4目的基因克隆入pFastBac载体
通过酶切位点，将Capo和Capom基因分别克隆入供体质粒pFastBacTM HT B中，将Capo/bNLS、Capok、Capokm、CapoEm和Capo△NLS基因分别克隆入供体质粒pFastBacDual中。16℃下过夜连接，将连接产物转化感受态DH5α细胞，再涂布含有氨苄青霉素的LB平板培养，37℃培养12h后挑取单个菌落培养，常规的碱裂解法提取疑似重组质粒。
连接体系：10×T4DNA ligase Buffer 1.0μL，T4DNA ligase 0.5μL，酶切目的基因7.5μL，酶切质粒载体1μL，总计10μL。
1.2.3.5连接产物的转化
将全部连接产物加入到DH5α感受态细胞，冰浴30min后42℃水浴中热激90s，然后迅速冰浴5min；加入800μL LB液体培养基，37℃250rpm振摇培养50min；12000rpm离心30s后弃去大部分上清，剩余100μL上清重悬细菌沉淀，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的抗性平板上，37℃温箱中培养12h。
1.2.3.6重组质粒的小量提取
挑取连接产物转化后所涂布氨苄青霉素抗性平板上的单个菌落，接种于3mL的含50μg/mL Amp的LB培养基中，37℃250rpm振荡培养12h，按Axygen公司说明书提取质粒。
1.2.3.7重组质粒的酶切和测序鉴定
对提取的疑似阳性重组质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性质粒送由Invitrogen公司进行测序鉴定。最后将鉴定正确的重组质粒pFastBacHT B-Capo、pFastBacHT B-Capom、pFastBacDual-Cap/bNLS、pFastBacDual-Capok、pFastBacDual-Capokm、pFastBacDual-CapoEm和pFastBacDual-Cap△NLS用于后续试验。双酶切鉴定体系如下：10×Buffer 2.0μL，内切酶10.5μL，内切酶2 0.5μL，质粒5μL，dd H2O 12μL，总计20μL。
将Capo和Capom基因分别克隆入供体质粒pFastBacTM HT B中，将Capo/bNLS、Capok、Capokm、CapoEm和Capo△NLS基因分别克隆入供体质粒pFastBacDual中。经PCR鉴定为阳性后，再进行双酶切鉴定，结果都切出与目的基因大小一致的片段(图3)。测序结果进一步表明，各个基因均正确克隆入载体，符合原有的阅读框。
1.2.4重组Bacmid的构建与鉴定
1.2.4.1位点特异性转座
取冻存的DH10Bac菌液接种于含50μg/ml卡那霉素的3ml LB培养基中，37℃200rpm振荡培养12h；第二天取10μL新鲜菌液接种于新的含卡那霉素的LB培养基中，振荡培养。取3ml菌液制备感受态细胞，方法参见1.2.3.5。按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行转化，将阳性质粒转化感受态细胞DH10Bac，具体步骤如下：将1ul的重组质粒加入到100ul DH10Bac感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃水浴热激45s，迅速置于冰水混合物中冰浴2min，然后加入800ul的新鲜LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养4h，然后取10μL菌液稀释于200μL无抗生素的LB液体培养基中，涂布含10μg/mL四环素、50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的LB平板。37℃温箱避光培养48h，至出现显著蓝白菌落。
1.2.4.2重组载体骨架Bacmid的提取
在培养48h后，将LB平板置于4℃冰箱中2-3h，使菌落充分变蓝，然后挑取平板上较大的散在白色单菌落，重新划线接种于新的蓝白斑筛选平板上，进行第二次蓝白斑筛选，37℃培养过夜，第二天挑取单个白色单菌落接种于含10ug/ml的四环素、50ug/ml的卡那霉素和7ug/ml的庆大霉素的液体LB培养基中，37℃250rpm振荡培养12h以上，按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书中改良的碱裂解法提取重组载体骨架Bacmid。
1.2.4.3重组Bacmid的PCR鉴定
在用PCR来鉴定重组Bacmid时，以提取的Bacmid质粒作为模板，M13通用引物和Cap基因的上下游引物对各个重组Bacmid进行PCR鉴定。PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，2×Mix 12.5μL；稀释质粒的模板1.0μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；灭菌双蒸水补至25μL。PCR循环参数参照Bac-to-Bac表达系统说明书进行：94℃4min，94℃45s，55℃45s，72℃4min，30次循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的重组Bacmid用于后续转染实验。
用鉴定正确的重组载体质粒转化感受态DH10Bac，经2轮蓝白斑筛选后，挑取白色菌落进行培养，提取质粒用通用引物M13以及基因上下游引物进行鉴定，扩增出特定大小的条带，与预期结果一致(图4)。
1.2.5重组杆状病毒的获得与扩增
1.2.5.1重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞
重组Bacmid的转染按照Lipofectamine2000的使用说明来操作并稍加修改。
①转染前1天将2×105Sf9细胞接种于24孔培养板，并加入500μL不含抗生素的完全培养基，使细胞分布均匀，于27℃过夜培养，以保证转染时细胞汇合达90～95％。
②分别将2μL Lipofectamine2000和6μL Bacmid稀释于50μL无血清无抗生素的Grace’s培养液中并轻轻浑匀，室温孵育5min，将它们轻轻混合均匀，室温孵育20min。
③吸去24孔板中的培养基，将复合物(总体积100μL)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。
④将细胞放入27℃培养箱孵育6h后，吸去转染混合液，直接加入2mL含10％FBS的Grace’s完全培养基，27℃继续培养至Sf9细胞出现明显病变。
1.2.5.2重组杆状病毒的获得与扩增
每天观察转染细胞的病变情况，在转染后5天可以看到Sf9细胞出现明显病变，收获出现严重病变的Sf9细胞和培养上清。500g离心5min收集上清，4℃避光保存，即为F1代重组病毒。细胞沉淀用于鉴定蛋白的表达。
将第一代重组病毒按1:10的体积比感染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃培养3天至细胞出现明显病变时，500g离心5min，去除细胞和大的细胞碎片，收集上清4℃避光保存，即为第二代病毒，用同样的方法获得第三代病毒。
用鉴定正确的重组Bacmid转染Sf9细胞，27℃培养4d，可以见到明显的细胞病变，主要表现为细胞变大变圆，与正常的Sf9细胞差别明显(图5)。
1.2.6重组Cap蛋白在Sf9细胞中的表达与Western Blot鉴定
用重组杆状病毒感染Sf21细胞72h后，收集蛋白样品用于SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定。在图6A中可以看到，rBcapo、rBcapom、rBcapok和rBcapokm四个泳道可以观察到明显的目的蛋白条带，而WB结果表明，7种重组Cap蛋白能与PCV2 Cap蛋白单克隆抗体发生特异性反应，而正常Sf21细胞则没有反应(图7)。该结果表明，重组Cap蛋白在杆状病毒系统中得到了高效表达，表达产物能被特异性抗体识别(PCV2 Cap蛋白单克隆抗体5H7)。1.2.7间接免疫荧光鉴定(IFA)
将各个重组毒接种于96孔板中的单层Sf9细胞，同时设正常Sf9细胞作为阴性对照。27℃培养2天，细胞出现明显病变前，弃培养上清液，PBS洗涤细胞后用预冷的80％丙酮固定，4℃作用10min。PBS洗涤2次，每次5min，加入1:500稀释的PCV2单克隆抗体，37℃孵育1h。PBS洗3次，每次5min，再加入1:200稀释的羊抗鼠IgG-FITC，37℃孵育45min，PBS洗3次，于荧光显微镜下观察，记录结果。
重组杆状病毒感染Sf9细胞48h后，用PCV2单克隆抗体3E5对其进行间接免疫荧光鉴定，观察结果表明，rBcapo、rBcapom、rBcapok和rBcapokm感染的细胞内可见亮绿色的荧光(图8中A、B、C、D中白色部分)，而正常的Sf9细胞为阴性，没有特异性荧光(图8中E)。这进一步证明了PCV2 Cap蛋白在Sf9细胞中得到了表达。
1.2.8病毒样颗粒(VLP)的形成
将获得的重组杆状病毒接种于Sf9细胞，大量表达重组蛋白。接种后于27℃温箱培养96h，当细胞出现显著病变时，500g离心5min收集细胞。加适量PBS重悬细胞沉淀，于冰上超声裂解10min，4℃12000rpm离心15min收获上清。亲和层析法纯化上清中的Cap蛋白。将收获的蛋白经磷钨酸负染后透射电镜观察，检测是否有病毒样颗粒的形成。
之前已有文献报道杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白能形成病毒样颗粒(VLP)，本研究对表达的重组蛋白(rBcapokm)进行亲和层系，然后进行透射电镜观察，可以见到病毒样颗粒的形成，大小约20nm(图9)。
1.2.9双抗体夹心ELISA的测定
将获得的重组杆状病毒接种于Sf9细胞，接种后于27℃温箱培养96h，当细胞出现显著病变时，500g离心5min收集细胞。加适量200μL PBS重悬细胞沉淀，再反复冻融3次，4℃12000rpm离心15min收获上清，用双抗体夹心ELISA分析测定其抗原效价。
由表1中数据可知，重组杆状病毒rBcapokm在昆虫细胞中表达的重组Cap蛋白具有较好的抗原性。
表1夹心ELISA检测表达的重组Cap蛋白
实施例2：不同重组蛋白小鼠免疫特性
2.1主要材料与实验动物
表达Cap蛋白的重组杆状病毒rBcapo、rBcapom、rBcapok和rBcapokm均由本实验室构建并保存。High Five细胞(美国ATCC)由本实验室保存；PCV2单克隆抗体3E5由本实验室制备并保存。ISA 15A佐剂为法国SEPPIC佐剂。
5周龄清洁级ICR小鼠70只，经间接ELISA检测PCV2抗体阴性。
2.2疫苗制备
将相同滴度的重组杆状病毒(105.0TCID50/mL)接种High Five昆虫细胞，在感染后96小时收取发生病变的细胞。首先吸弃细胞培养上清，每瓶细胞(75cm2)加入1mL 0.01mol/L pH 7.2PBS溶液，吹下细胞，再对细胞悬液进行超声波裂解，得到含有PCV2 Cap蛋白的细胞裂解液。用夹心ELISA方法测定其Cap蛋白含量，调整目的蛋白浓度为30μg/mL。将目的蛋白抗原和ISA15A佐剂按4:1比例混合，以300r/min搅拌，充分混合10分钟，配置4种疫苗Capo、Capom、Capok和Capokm，保存于4℃备用。
2.3小鼠免疫试验
将60只清洁级小鼠随机分为7组，第1-4组为Capo、Capom、Capok和Capokm疫苗接种组，第5组为PBS对照组。小鼠适应2天后进行首免，免疫方法为背部皮下多点注射，疫苗免疫剂量是200μL。首免后14d进行加强免疫，加强免疫的剂量和方法与之前相同。首免后第28、42d，每组随机取5只小鼠眼球采血，分离血清，分别测定ELISA抗体和中和抗体滴度；无菌摘取小鼠脾脏，加灭菌PBS研磨后分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应。
2.4 ELISA抗体检测
包被抗原为本实验室制备纯化保存的CapC，此蛋白由大肠杆菌表达。用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5ug/ml，包被酶标板，100μL/孔，37℃作用2h后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μL的0.15％BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μL，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标羊抗鼠IgG(1:5000倍稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB显色，最后用2mM的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
结果见图10。Capo、Capom、Capok和Capokm疫苗首次免疫14天即可诱导产生PCV2抗体，首免后28天和42天，四个疫苗免疫组ELISA抗体水平无明显差异(P>0.05)。同时，阴性对照组则未检测到PCV2特异性抗体。
2.5中和抗体检测
待检血清于56℃水浴30min进行灭活，12000rpm离心10min除菌后，吸出上清到灭菌的EP管中。再将处理好的血清用维持液进行倍比稀释，依次是1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，……与此同时，将增殖的PCV2用维持液稀释到200TCID50/0.1mL，然后与不同稀释度的血清等体积混合，37℃水浴作用1h。弃掉长有PK15细胞的96孔板中的营养液，用纯DMEM洗涤细胞一遍，再将水浴作用后的血清病毒混合物加到孔中，每个血清稀释度设置3个重复，100μL每孔，37℃培养72h。同时设置阴性血清对照、阴性血清病毒对照和空白对照。72h后用间接免疫荧光法(IFA)测定血清中和抗体效价，以能够抑制50％PCV2感染的血清最大稀释度作为待检血清的中和抗体效价。
结果如图11。首免后28和42天，Capok和Capokm疫苗免疫组PCV2中和抗体水平明显高于Capo和Capom疫苗免疫组(P<0.05)。同时，阴性对照组则未检测到PCV2中和抗体。
2.6淋巴细胞增殖试验
将小鼠眼球采血，用颈椎脱臼法处死小鼠。无菌条件下，取出脾脏，并用剪子剪去与其相连的结缔组织和脂肪组织。将分离获得的脾脏放入200目的虑网膜中，加入3mLPBS后无菌研磨，将脾细胞悬液转移到含有淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心15min。用吸管吸取中间层的灰白细胞，放入另一只试管中，加红细胞裂解液5mL，混匀脾细胞，静置5min，待红细胞完全破碎，2000rpm离心10min，弃上清去除红细胞。加入5mL纯1640再次洗涤细胞沉淀，2000rpm离心10min，弃掉上清，用10％的1640稀释到5×106个/mL，加入96孔板，100μL每孔。将PCV2作为刺激抗原，ConA作为对照，终浓度10μg/mL，37℃下培养72h，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，每组3个重复，37℃下继续培养6h。弃掉96孔中的培养液，加入DMSO，100μL每孔，振荡融解紫色结晶，测定波长570nm的OD值，计算刺激指数(SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值)。
结果如图12。首免后28-42天，Capo和Capom疫苗免疫组均没有检测到PCV2特异性的淋巴细胞增殖；首免后28-42天，Capok和Capokm疫苗免疫组SI值明显高于PBS组(P<0.05)，表明Capok和Capokm疫苗可诱导小鼠产生PCV2特异性的细胞免疫应答反应。
重组杆状病毒rBcapo、rBcapom、rBcapok和rBcapokm表达的Cap蛋白亚单位疫苗，四种疫苗均可诱导小鼠产生PCV2ELISA抗体和中和抗体，但Capok和Capokm疫苗中和抗体和细胞免疫水平明显高于Capo和Capom疫苗，Capok和Capokm重组蛋白疫苗体液免疫和细胞免疫水平相似，具有重要应用前景。
应用SPSS软件对实验数据进行统计分析，并比较各组数值的差异，其中P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
实施例3仔猪免疫保护试验
筛选21头30日龄断奶仔猪，经检测PCV2和PRRSV抗原抗体均为阴性，随机分为4组，每组5～6只，各组隔离饲养。第一组接种PCV2亚单位疫苗(rBcapkm)，第二组接种PCV2灭活苗，第三组不接种作为攻毒对照组，第四组不接种作为空白对照组。一免后21天进行加强免疫，免疫后注意观察免疫组仔猪是否有不良反应。二免后14天对免疫组和攻毒组仔猪进行攻毒，每头仔猪滴鼻攻毒3mL(PCV2SH，105TCID50/mL)并刺激，具体方法是，攻毒后第4天和7天注射血蓝蛋白，2mL每头(1mg/mL)，同时腹腔注射巯基乙酸培养基，10mL每头，攻毒第14天和21天腹腔注射巯基乙酸培养基，10mL每头。攻毒后每天上午测量所有仔猪的体温，并观察仔猪的临床表现。在一免后21天和35天采血，分离血清用于ELISA抗体和中和抗体检测。攻毒后7、14、21、28天采血，分离血清用于病毒血症检测。二免后14天和攻毒后28天分别称量每头猪体重，计算相对日增重(RDWG)。攻毒后28天剖杀所有仔猪，观察每头猪肺脏和淋巴结等脏器病变情况，取淋巴结、肺脏于4％多聚甲醛中固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。
2.5.1 ELISA抗体检测
检测一免和二免猪血清中的PCV2特异性ELISA抗体，二抗为SPA-HRP，用封闭液稀释10000倍后使用。
根据小鼠免疫试验的结果，确定以CPH免疫仔猪，并评价比较其与PCV2灭活苗的免疫保护效果。用间接ELISA测定PCV2特异性抗体，结果以血清稀释100倍时的S/P值表示，具体结果见图13。首次免疫3周后，两个免疫组都有不同程度的PCV2抗体产生，其中灭活苗免疫组的抗体水平显著高于CPH组；首次免疫5周后，两个免疫组的抗体水平继续升高，差异任然存在。
2.5.2中和抗体检测
为了鉴定疫苗的免疫效果，测定二免后血清中和抗体效价。
此外，还测定了首次免疫5周后的血清中和抗体效价，结果如图14所示，CPH组平均血清中和抗体效价达到了1:102，而PCV2灭活苗组也达到了1:90，两者没有显著性差异。上述结果表明两种疫苗都能诱导机体产生一定水平的中和抗体，对机体产生保护作用。
2.5.3攻毒后仔猪临床表现及体温变化
首次免疫5周后，对两个免疫组和攻毒对照组进行攻毒，每天测量体温，连续三周，统计结果见图15。在相同时间点，各个组的体温没有明显的差异，也没有出现发热的现象(大于40℃)。但是从临床表现来看，攻毒组有两头猪出现消瘦、被毛粗乱和精神沉郁的现象，其中一头在攻毒后26天死亡。两个免疫组和空白对照组则表现正常，没有明显的临床症状。
2.5.4攻毒后仔猪体重的变化
攻毒前和剖杀前，称量每一头猪的体重，计算相对日增重，以此评价疫苗的免疫保护效果。具体结果见图16，免疫组的相对日增重分别达到了0.0137和0.0135，而攻毒组只有0.009,说明在攻毒之后两种疫苗都对仔猪产生了免疫保护作用，促进了仔猪的生长。
2.5.5病理变化观察
试验结束后，剖杀所有猪，观察淋巴结和肺脏的病变情况。空白对照组和CPH组的肺脏正常，攻毒对照组的肺脏出现间质增宽、出血和实变的现象，iPCV2组也有轻微的症状。除了攻毒组的淋巴结出现水肿外，免疫组和空白组都正常。
完成组织切片后，进行病理学观察，结果如图17所示。与免疫组相比，攻毒组出现了明显的间质性肺炎的症状，主要表现为肺泡壁增厚、间质增宽和肺泡缩小(图17中A3)，CPH组和iPCV2组则较为正常或者只有轻微的症状。攻毒组淋巴结的淋巴滤泡边界模糊，淋巴细胞缺失(图17中B3)，免疫组则基本正常。
上述病理观察结果表明，CPH疫苗和灭活苗类似，能够减轻由PCV2感染导致的肺脏和淋巴结病变。
2.2.6免疫组化
采用PCV2单克隆抗体对淋巴结组织进行免疫组化检测，检测结果见图18。攻毒组淋巴组织中存在较多的棕黄色细胞，而免疫组则没有特异性的着色细胞，表明CPH和iPCV2能够在很大程度上减轻PCV2在淋巴结中的增殖，从而对免疫猪提供保护作用。
本研究用杆状病毒表达PCV2 Cap蛋白，经鉴定可以形成VLPs，以此制备疫苗并免疫小鼠和仔猪，评价其应用前景。小鼠首免2周后即可检测到PCV2特异的ELISA抗体，首免4周后抗体达到了较高水平，首免6周后抗体水平继续攀升。中和抗体的产生规律与ELISA抗体类似，在首免4周和6周后，均能检测到高水平的中和抗体的存在。这表明制备的疫苗具有良好的抗原性，能够刺激小鼠产生高水平的体液免疫应答。在细胞免疫应答方面，结果与体液免疫有相同的趋势，与对照组存在差异。
仔猪免疫保护实验进一步验证了该亚单位疫苗的效果。首免3周后即可检测到ELISA抗体，2免2周后抗体水平进一步升高，与此同时，中和抗体水平达到了1:102，高于iPCV2组的1:90。攻毒实验结果表明，亚单位疫苗和灭活苗都能为攻毒仔猪提供免疫保护。
综上所述，本研究经过PCV2 Cap蛋白抗原分子设计，成功构建了高效分泌表达的重组杆状病毒。制备的PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗可以诱导机体产生PCV2特异性的ELISA抗体和中和抗体，对PCV2攻毒产生保护作用，比传统的灭活苗更加优异，显示出良好的开发应用前景，从而为国内PCV2新型疫苗的研究奠定了基础。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>江苏南农高科技股份有限公司
<120>人工改造的PCV2 Cap蛋白、重组病毒及其应用
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<212> DNA
<213>猪圆环病毒（Porcine circovirus）
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<213>人工合成
<400> 13
GCGAATTCAT GGGCATCTTC AACACC 26
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 14
CGAAGCTTTC ACTTGGGGTT CA 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 15
GGATCCGAAT TCATGGCCTA CCCC 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 16
CGAAGCTTTC ACTTGGGGTT CA 22

Claims (8)

1.表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。
2.人工改造的PCV2 Cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。
3.含有权利要求1中所述的表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。
4.一种权利要求3所述的重组病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）以含有序列表中序列1的核苷酸序列的PCV2 ORF2基因为模板，以下述的引物对中的一对进行PCR扩展，PCR产物经纯化后酶切克隆入pFastBac载体，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性质粒得到重组质粒；
（2）重组质粒转化感受态细胞DH10 Bac，培养，进行蓝白斑筛选，按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的碱裂解法提取重组载体骨架Bacmid，转染昆虫细胞，出现病变的昆虫细胞即为重组病毒；
所述引物对的核苷酸序列如下：
Kozak and Mutation S: 5’-CGCTCGAGATCAAAATGGCCTACCCCC-3’ ,
Kozak R: 5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’，
或：
Kozak S: 5’-CGCTCGAGATCAAAATGACCTACCCCC-3’ ，
Kozak R: 5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’。
5.一种权利要求2所述的人工改造的PCV2 Cap蛋白或者权利要求3所述的重组病毒或权利要求4构建得到的的重组病毒在PCV2免疫疫苗中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于从重组病毒中获取PCV2 Cap蛋白，制备成疫苗。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于重组病毒感染的细胞中加入PBS溶液得到细胞悬液，对细胞悬液进行超声波裂解，得到含有PCV2 Cap蛋白的细胞裂解液，以CP940S水佐剂为基础，按4:1比例将PCV2 Cap蛋白的细胞裂解液与佐剂混合，制备动物免疫用疫苗。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述免疫疫苗为重组亚单位疫苗。
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